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Anti-Epcam-Aptamer (Syl3c)-funktionalisiertes Liposom zur gezielten Abgabe von Doxorubicin:In-vitro- und In-vivo-Antitumorstudien bei Mäusen mit C26-Kolonkarzinom

Zusammenfassung

In dieser Studie haben wir oberflächenfunktionalisiertes PEGyliertes-nanoliposomales Doxorubicin (DOX) mit Anti-EpCAM (Epithelial Cell Adhäsionsmolekül) Aptamer über die Postinsertion von Anti-EpCAM Aptamer-konjugiertem DSPE-mPEG2000 in Caelyx® (ED-Lippe). Die Größe, Ladung, Freisetzungsprofil und Zytotoxizität und zelluläre Aufnahme der Formulierung wurden bestimmt. Die Charakterisierung der ED-Lippe zeigte die leichte Zunahme der Größe und des PDI zusammen mit der Abnahme des Zetapotentials, was darauf hinwies, dass die Postinsertion effizient durchgeführt wurde. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie und der Fluoreszenzmikroskopie haben gezeigt, dass ED-lip die Zellaufnahmerate der C26-Zelllinie im Vergleich zu Caelyx® erhöht. Die ED-Lippe hatte auch stärker zytotoxische Wirkungen als Caelyx®, was auf die Wirksamkeit von Anti-EpCAM-Aptamer als Targeting-Ligand hinweist. Die Pharmakokinetik und die Gewebebioverteilung von Formulierungen bei Mäusen mit C26-Tumoren zeigte, dass ED-lip das Verteilungsprofil von DOX im Vergleich zu Caelyx® im Tiermodell nicht beeinflusste. Darüber hinaus verbesserte ED-lip effektiv die Tumorakkumulation von DOX und förderte das Überleben der Tiere im Vergleich zu Caelyx®. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Funktionalisierung von Caelyx® mit Anti-EpCAM-Aptamer in der Krebsbehandlung vielversprechend ist und weitere Untersuchungen verdient.

Einführung

Nano-Drug-Delivery-Systeme (NDDS) mit einer Größe von 100–200 nm werden durch einen verbesserten Permeabilitäts- und Retentionseffekt (EPR) passiv in der Tumormikroumgebung akkumuliert. Dies geschieht durch die lockere Endothelauskleidung und eine schwache Lymphdrainage. Neuere Daten zeigten jedoch, dass nur weniger als 1% des verabreichten Arzneimittels die Tumorstelle erreichen konnte [1]. Mangelnde Fähigkeit, in die dichte extrazelluläre Matrix (ECM) des Tumors einzudringen, die Rückkehr des freigesetzten Arzneimittels in den Kreislauf und die Heterogenität der Tumoren sind die Gründe für dieses Versagen [2]. Es wurden verschiedene Strategien verwendet, um die Tumorakkumulation von NDDSs unter Verwendung endogener und exogener Stimuli zu verbessern [3]. Diese NDDSs könnten auf exogene Stimuli wie Licht reagieren und können in der Tumorbildgebung verwendet werden [4]. Es gibt viele verschiedene anorganische Nanomaterialien, die als Antikrebsmittel eingesetzt werden können [5, 6]. Bei anorganischen Nanomaterialien muss jedoch auf deren Toxizität und Umweltsicherheit geachtet werden [7,8,9,10,11].

Die aktive zielgerichtete Abgabe ist ein wichtiger Ansatz, der NDDSs hilft, Therapeutika effizienter an die Tumore zu verabreichen und die Exposition gegenüber Nicht-Zielgeweben zu minimieren [12, 13]. Ein ideales Targeting-Agens für eine gezielte Abgabe ist ein Molekül, das eine Affinität zu den Zelloberflächenproteinen oder Rezeptoren aufweist, die von bestimmten Zellen oder Gewebekomponenten hochreguliert werden [14].

Das Epithelzelladhäsionsmolekül (EpCAM) ist ein Transmembran-Glykoprotein, das als Ligandkandidat für aktives Targeting gilt. Jüngste Ergebnisse zeigten, dass die EpCAM normale gesunde Epithelzellen mit niedriger Expression aufweist, während ihre Expression in Krebszellen in höherem Maße (bis zu 1000-fach) ansteigt [15,16,17]. Während der Krebsentwicklung ändert sich das Expressionsmuster von EpCAM von der basalen und basolateralen Membran im normalen Epithel zur apikalen Oberfläche in Tumorepithelzellen [18]. Diese unterschiedliche Expression macht EpCAM zu einem sehr interessanten Liganden für die Wirkstoffabgabe, der den therapeutischen Index des Wirkstoffs verbessern könnte [19].

EpCAM wird als Marker für Krebsstammzellen (CSC) oder Tumor initiierende Zellen (TIC) nachgewiesen, dessen Expression bei Krebs mit der schlechten Prognose zusammenhängt [20]. CSC oder TIC sind Zellen mit Selbsterneuerung, der Fähigkeit, mehr Zellen des gleichen Typs zu produzieren, die eine Schlüsselrolle bei der Tumorentwicklung und Metastasierung spielen [21]. Die Überexpression von EpCAM wurde bei CSC verschiedener solider Tumoren berichtet [22]. In jüngster Zeit haben Aptamere in weiten Bereichen viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen und haben sich als potenziell leistungsfähige Moleküle erwiesen, die in NDDSs als Targeting-Ligand verwendet werden können [23, 24]. Aptamere sind DNA- oder RNA-basierte Oligonukleotidsequenzen, die Sekundär- und Tertiärstrukturen besitzen, die eine Affinität zu ihren Zielen wie Zelloberflächenrezeptoren aufweisen [23, 24]. Aptamere haben auch mehrere Vorteile gegenüber dem, sie sind zum Beispiel nicht immunogen und haben ein niedriges Molekulargewicht (8–25 kDa) mit chemischer und thermischer Stabilität. Darüber hinaus ist ihre Synthese und chemische Modifikation kostengünstig und skalierbar [25]. Das selektive Targeting der NDDS durch Anti-EpCAM-spezifisches Aptamer könnte als wirksame Targeting-Option angesehen werden, um Chemotherapeutika in die Tumormikroumgebung zu transportieren [19, 26]. In dieser Hinsicht zeigten verschiedene Studien, dass Anti-EpCAM-Aptamer-funktionalisierte Nanoträger die Abgabe von Krebsmedikamenten an Tumorzellen effektiv verbessern könnten [15, 27, 28].

Das Ziel dieser Studie ist die Entwicklung eines Anti-EpCAM-DNA-Aptamers (SYL3C)-PEGylierten-Nanoliposomen, beladen mit Doxorubicin (DOX) (ED-lip) als Modell für NDDS. Eine solche Funktionalisierung wurde durch EDC/NHS-Kopplungschemie zwischen der Amingruppe des Aptamers und der Carboxylgruppe von DSPE-mPEG2000 . durchgeführt , das wie in Fig. 1 gezeigt in das Liposom nachinseriert wird. Die ED-Lippe charakterisiert hinsichtlich Größe, Zeta-Potential und Prozentsatz der Doxorubicin-Einkapselung, Freisetzungsprofil und Zytotoxizität. Dann untersuchten wir, ob diese ED-Lippe die Zellaufnahme in vitro verbessern und DOX über das Targeting in den Tumor an Mäuse mit C26-Kolonkarzinom-Tumoren abgeben könnte.

Herstellung von anti-EpCAM-funktionalisiertem Caelyx® (ED-Lippe). a Verknüpfung von Anti-EpCAM-Aptamer mit DSPE-mPEG2000 durch kovalente Bindung der primären Amine (-NH2) des Anti-EpCAM-Aptamers an die Carboxylgruppe (-COOH) von DSPE-mPEG2000 . b Postinsertionsverfahren zur Herstellung von anti-EpCAM-funktionalisiertem Caelyx® (ED-lip)

Ergebnis und Diskussion

Caelyx®, PEGyliertes liposomales Doxorubicin, ist eines der am häufigsten verwendeten Chemotherapeutika und der erste von der FDA zugelassene Nanopartikel, der zur Behandlung von Eierstockkrebs, AIDS-bedingtem Kaposi-Sarkom und multiplem Myelom indiziert ist. Caelyx® drang über den EPR-Effekt passiv in die Tumorstelle ein [29]. Caelyx® hat jedoch eine signifikant verbesserte Pharmakokinetik und Halbwertszeit von DOX; Die Haupteinschränkungen von Caelyx® sind jedoch eine unzureichende zelluläre Aufnahme und eine geringe Freisetzungsrate des Arzneimittels an der Tumorstelle [29]. Hier haben wir SYL3C-Aptamer als Targeting-Ligand verwendet, um liposomales Doxorubicin (ED-lip) so zu funktionalisieren, dass es auf das EpCAM-Molekül in der Oberfläche von Krebszellen abzielt, was die Abgabe von DOX an eine bestimmte Zielstelle durch den Prozess des aktiven Targetings ermöglicht.

Konjugation von DSPE-mPEG2000 zu Aptamer

In der vorliegenden Studie verwendeten wir EDC/NHS-Kopplungschemie zur Konjugation von Amin-funktionalisierten Anti-EpCAM-Aptameren an die aktive Carboxylgruppe von DSPE-mPEG2000 -COOH. Der Vorteil dieser Kupplungsreaktion unter Verwendung der EDC/NHS-Kupplungschemie und der Bildung der Amidbindung ist ihre Stabilität und die Verringerung unspezifischer Wechselwirkungen zwischen Aptameren [30]. Aptamere könnten mit einer primären Amin- oder Thiolgruppe modifiziert und kovalent konjugiert werden, um die Carboxyl- bzw. Pyrrolgruppe von Maleimid zu aktivieren [31]. Mit Thiolgruppen modifizierte Aptamere wurden an die funktionelle Maleimidgruppe von DSPE-PEG2000 . konjugiert . Dann DSPE-PEG2000 -Aptamer postinseriert in eine Liposomenstruktur, um die äußere Oberfläche von Liposomen zu dekorieren [32]. Eine wichtige Einschränkung bei der Maleinimid-Thiol-Chemie besteht darin, dass während der Lagerung die Thiolgruppe von Aptameren durch Oxidation beeinflusst werden kann und zur Bildung einer Disulfidbindung (S-S) zwischen zwei thiolmodifizierten Aptameren führt. Diese dimeren Aptamere sind nicht in der Lage, an der Konjugationsreaktion mit der funktionellen Maleimidgruppe von DSPE-PEG2000 . teilzunehmen [30]. Daher erhöht die Verwendung von EDC/NHS-Reaktionen die Produktausbeuten und verbessert das Verfahren nach der Einfügung.

Aptamer hat einige Vorteile gegenüber den Antikörpern, einschließlich der einfachen Synthese und des Scale-up, der geringen systemischen Toxizität und der fehlenden Immunogenität [33]. Hier wurde nach Aptamer-Konjugation an das Lipid die Post-Insertion-Methode rekrutiert, um Anti-EpCAM-Aptamer-dekoriertes Caelyx® (ED-lip) herzustellen. Im Allgemeinen ist die Post-Insertion-Technik eine einfache und effektive Methode zur Anlagerung von Aptameren an die Oberfläche von Liposomen und bietet eine höhere Rate des Aptamereinbaus in die Liposomen [34].

Wir verwendeten einen Gelelektrophorese-Mobilitäts-Shift-Assay zur Bewertung der Postinsertion von Anti-EpCAM-Aptamer auf Liposomen. Wie in Fig. 2 gezeigt, wanderten die negativ geladenen Aptamere in das Gel und ihre Bande wurde beobachtet, während es keine Gegenbande für die ED-Lippenformulierung gab, da die ED-Lippe in der Vertiefungslinie eingeschlossen war und sich nicht durch das Gel bewegen konnte. Diese Ergebnisse zeigten, dass Aptamere-konjugierte Micellen erfolgreich in die Oberfläche von Liposomen nachträglich eingefügt wurden.

Agarosegel-Elektrophorese der ED-Lippenformulierung. Proben werden auf das Agarosegel geladen. UV-Licht visualisierte das Gel. Die Wells, die der Leiter, dem freien Aptamer und den PL-konjugierten Aptameren entsprechen, sind angegeben. Das Fehlen einer entsprechenden Bande im Liposom-Aptamer zeigte die Bestätigung nach der Insertion an

Physikochemische Charakterisierung der ED-Lippe

Die physikalisch-chemische Charakterisierung von Caelyx® und ED-lip wurde in Tabelle 1 gezeigt. Die Größe und Ladung der hergestellten Formulierungen zeigten, dass die Modifikation von Caelyx® mit Anti-EpCAM-Aptamer keinen signifikanten Einfluss auf die Partikelgröße hatte (p> 0,05). Die Liposomengröße vor der Insertion von Aptamer (Caelyx®) betrug etwa 96 nm mit einem PDI von 0,11, nach der Postinsertion (ED-Lippe) erhöhte sich die Größe der Liposomen teilweise auf 117 nm mit einem PDI von 0,14, die eine wünschenswerte Größe für die Abgabe an . haben Tumor. Die Ergebnisse früherer Studien zeigten auch, dass der Einbau von Targeting-Liganden zu einer Zunahme der Größe und des PDI von Liposomen führt [35, 36]. Darüber hinaus wurde das Zetapotential der ED-Lippe (− 19.25) negativer als bei Caelyx® (− 12). Es wurde gezeigt, dass die RNA-Aptamer-Konjugation in das Liposom zu einer Abnahme des Zetapotentials des Liposoms führte [37]. Die Größenzunahme und das negative Zetapotential der ED-Lippe könnten ein Hinweis auf eine erfolgreiche Postinsertion konjugierter Aptamere auf der Liposomenoberfläche sein [38]. Diese Ergebnisse stimmen mit unserer vorherigen Studie überein, die darauf hinwies, dass die Anlagerung von Aptamer an die Oberfläche von Caelyx® zu einer leichten Zunahme der Partikelgröße und dem negativeren Zeta-Potential im Aptamer-funktionalisierten Caelyx® führte [38, 39]. Die Wirksamkeit der Postinsertion sollte jedoch in Bezug auf Inkubationszeit und Temperatur getestet werden, um ein wirksameres Liposom nach der Insertion mit besserer Größe und PDI zu erreichen. Die Einkapselungseffizienz von Caelyx® und ED-lip betrug 100 % (siehe Tabelle 1).

Die Zahl der Aptamere, die nach der Insertion in die Oberfläche des Liposoms inseriert wurden, wurde wie beschrieben bestimmt [6]. Der Gesamtgehalt an Phospholipiden der liposomalen Formulierung, bestimmt durch Phosphatassay, betrug 14 mM. Da beträgt die durchschnittliche Anzahl von Lipidmolekülen in Liposomen mit einer durchschnittlichen Größe von 100 nm 8 × 10 4 die Anzahl der Liposomen pro Milliliter beträgt fast 10 14 [38]. Das Molekulargewicht des Aptamers betrug g/mol. Die Anzahl der DSPE-mPEG2000 -Aptamer wurde basierend auf Phosphat-Assay-Verfahren bestimmt, bei denen Mole von Phosphatmolekülen Molen von konjugierten Molekülen entsprechen. Basierend auf diesen Daten beträgt die Anzahl der Aptamermoleküle pro ml aliquoter Lösung 10 15 .

DOX-Release-Profil

Die Insertion von Aptamer-konjugierten Micellen in die äußere Oberfläche von Caelyx® kann das Freisetzungsprofil von DOX beeinflussen. Daher haben wir die Freisetzung von DOX-Form ED-lip im Vergleich zu Caelyx® in 5% Dextrose mit 50% FBS untersucht. Dieses Medium könnte das Freisetzungsverhalten der Formulierungen im Plasma nachahmen [40]. Abbildung 3 zeigte, dass es während der 24-stündigen Studie keinen signifikanten Unterschied in der DOX-Freisetzung von Caelyx® und ED-Lippenformulierungen gab und nur die vernachlässigbaren Mengen an DOX freigesetzt wurden. Dies steht im Einklang mit unseren früheren Studien, die darauf hindeuteten, dass die Insertion von Aptamer an die Oberfläche von Liposomen die Membranstabilität und das Freisetzungsprofil von DOX nicht beeinflusste [38, 39]. Dies ist hauptsächlich auf die Stabilität der Caelyx®-Formulierung zurückzuführen, die mit einer pH-Gradienten-gesteuerten Remote-Loading-Methode formuliert wurde [41].

Studie freigeben. Leckageprofil des DOX-Gehalts von Caelyx® und ED-lip bei 37 °C in Gegenwart von 50 % FBS in Dextrose während 24 Stunden der Studie. Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SEM) (n =3)

Zellinteraktion und Zellaufnahme durch Fluoreszenzmikroskopie

Die Zellinteraktion und Zellaufnahme von liposomalen Formulierungen wurde bei 4 °C und 37 °C bewertet und ist in Abb. 4 gezeigt. Die Bewertung der zielgerichteten Wirksamkeit von ED-lip zeigte, dass es keine Unterschiede zwischen den mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFIs) gab. von CHO-K1-Zellen, die mit Caelyx® und ED-lip bei 4 °C und 37 °C behandelt wurden (Abb. 4a, c). Die Daten zeigten jedoch, dass die gezielte ED-Lippe im Vergleich zu Caelyx® bei 4 °C und 37 °C eine deutlich höhere Aufnahme durch C26-Zellen aufwies (Abb. 4b, d), die bei 37 °C statistisch signifikant war (p <0,0001). Die ED-Lippe hatte die signifikante Aufnahme im Vergleich zu Caelyx® (p <0,001). Diese Ergebnisse zeigten, dass die ED-lip-verstärkte Zielspezifität aufgrund von Anti-EpCAM-Aptamer im Vergleich zu CHO-K1-Zellen eine höhere Affinität zur C26-Zelllinie aufweist. Freies DOX wird ungehindert durch die Lipiddoppelschicht geleitet und dringt in die Zelle ein, hat also die höchste Zellaufnahme unter den Formulierungen und hat daher die höchste Zytotoxizität. Im Fall von Caelyx® begrenzt die PEGylierung die Endozytoserate und führte zu einer verringerten Zytotoxizität. Das Vorhandensein von Anti-EpCAM-Aptamer auf der Oberfläche von Liposomen (ED-lip) erhöht jedoch die Internalisierungsrate der Formulierung in die Zellen und erhöht ihre Zytotoxizität im Vergleich zu Caelyx® [38]. Die Daten der Fluoreszenzmikroskopie zeigten, dass der Unterschied zwischen der zellulären Aufnahme von ED-Lippe und freiem DOX in der C26-Zelllinie bei 37 °C nicht signifikant war (Fig. 5). Die Skalierung basierend auf der Intensität von internalisiertem DOX ist in Tabelle 2 dargestellt, wobei sowohl ED-lip als auch DOX statistisch signifikante Unterschiede mit Caelyx® in der zellulären Aufnahme von C26 gezeigt haben (p <0,001). Obwohl C26-Zellen ein geringes Maß an EpCAM auf ihrer Oberfläche exprimieren [42], deuten die Daten dieser Studie darauf hin, dass die Anwesenheit von Anti-EpCAM-Aptamer die Internalisierungsrate von Liposomen erhöhen könnte [43].

Zellinteraktion und Zellaufnahme von liposomalen Formulierungen bei 4 °C und 37 °C bewertet. a Die CHO-K1-Zellinteraktion der Formulierungen bei 4 °C und 37 °C. b Die Wechselwirkung von Formulierungen mit C26-Zellen bei 4 °C und 37 °C. c Der Graph zeigte den mittleren MFI der Formulierungen auf CHO-K1- und C26-Zellen. Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SEM) (n =3). ****p <0,0001

Fluoreszenzmikroskopie. Die Ergebnisse der Zellinternalisierung von DOX auf C26-Zelllinien, visualisiert durch Fluoreszenzmikroskopie. Mit DAPI gefärbte Zellen. Sowohl freies DOX als auch ED-lip haben im Vergleich zu Caelyx® eine höhere DOX-Internalisierung. Zellen inspiziert unter × 200-Vergrößerung

Zytotoxizitätsstudie

Die Zytotoxizitätswirkungen von freiem DOX, Caelyx® und ED-Lippenformulierungen sind in Fig. 6 angegeben. Verschiedene Konzentrationen von Formulierungen, die zur Behandlung von Zellen für 1, 3 und 6 h verwendet und für die nächsten 72 h inkubiert werden gelassen. Die Daten zeigten, dass alle Formulierungen zeit- und dosisabhängig Wirkungen auf Zellen haben. Die Lebensfähigkeit von C26-Zellen, die mit ED-Lippenformulierung behandelt wurden, nahm im Vergleich zu mit Caelyx® behandelten Zellen ab. Da CHO-K1-Zellen als EpCAM-negative Zellen im Vergleich zu C26-Zellen eine geringere Reaktion auf ED-lip zeigen, scheint es, dass Anti-EpCAM-Aptamer die spezifische Abgabe von Caelyx® an Zielzellen erhöht. Diese Ergebnisse könnten die spezifische zelluläre Aufnahme von ED-lip durch C26-Zellen bestätigen. Diese Ergebnisse unterstrichen die Bedeutung der gezielten Wirkstoffabgabe mit spezifischen Targeting-Agenzien für die selektive Abgabe von Wirkstoffen an die Zielzellen, wobei die Nebenwirkungen des Wirkstoffs durch Vermeidung von Off-Targets reduziert werden [44]. Wie bereits berichtet, führt das aktive Targeting von Caelyx® mit spezifischen Targeting-Liganden wie Aptamer und Antikörper zu einem verstärkten aktiven Tumor-Targeting und einer spezifischen Wirkstoffabgabe an die Zielzellen, was wiederum die therapeutische Wirksamkeit von DOX steigert [35, 39].

In-vitro-Zytotoxizitätswirkung (IC50) von ED-lip, Caelyx® und freiem Doxorubicin gegen CHO-Zellen und C26-Zellen nach unterschiedlichen Expositionszeiten. Daten dargestellt als μg/ml ± Standardabweichung (SEM) (n =3). *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001, ****p <0,0001

Bioverteilung und Pharmakokinetik

Um zu bewerten, wie Anti-EpCAM-Aptamer die Bioverteilung von DOX beeinflusst, injizierten wir Mäusen mit subkutanen C26-Darmkrebstumoren eine Dosis von 10 mg/kg ED-lip und Caelyx®. Die DOX-Konzentration im Plasma 3, 12, 24, 48 und 72 h nach der Injektion mit Caelyx® und ED-lip ist in Abb. 7 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass das Verhalten der Plasma-DOX-Konzentrationen in beiden Gruppen ähnlich war Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen beiden Formulierungen. Wie in Tabelle 3 gezeigt, verringerte die Konjugation von Anti-EpCAM-Aptamer an die liposomale Oberfläche leicht die Halbwertszeit der Zirkulation von 39,3 Stunden auf 34,2 Stunden und die MRT von 47,6 auf 42,9 Stunden (siehe Tabelle 3). Die pharmakokinetischen Parameter zeigten, dass die Konjugation von Anti-EpCAM-Aptamer auf dem Liposom t½ . leicht verringerte und MRT, die mit früheren Berichten übereinstimmten, zeigten, dass die Konjugation von Aptamer auf der liposomalen Oberfläche die Clearance von Liposomen beschleunigt [38]. Proteinadsorption und nachfolgende Entfernung durch das mononukleare Phagozytosesystem (MPS) könnten der Grund für die Beschleunigung der Blutclearance von ligandenkonjugierten Nanopartikeln sein [45].

Plasmaspiegel von DOX. Die Ergebnisse der Konzentration gegen die Zeit der DOX-Menge im Blut 3, 12, 24, 48 und 72 Stunden nach der Injektion. Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SEM) (n =3)

Wie in 8 gezeigt, wurden die Konzentrationen von DOX in den wichtigsten entnommenen Organen in Gruppen verglichen, die Caelyx® und ED-lip erhielten. Die wichtigste Nebenwirkung von freiem DOX ist die Kardiotoxizität, wodurch Caelyx® das Risiko dieser Nebenwirkung deutlich senkt [46]. Die Bioverteilung von ED-lip in Leber, Lunge und Milz ist zum Zeitpunkt 3 h signifikant höher als bei Caelyx®. Das Vorhandensein undichter Blutgefäße und die Zunahme der Größe und des PDI der ED-Lippe nach dem Einsetzen können die Gründe für eine frühere Ansammlung von ED-Lippe in diesen Geweben sein. Es wurde gezeigt, dass die Vergrößerung der Nanopartikel auf 150 nm die Ansammlung von Nanopartikeln in Leber, Lunge und Milz verstärkt [47]. Inzwischen zeigen die Ergebnisse der Biodistributionsstudie deutlich den EPR-Mechanismus bei der Ansammlung von Nanopartikeln im Tumor. Abbildung 8 zeigt deutlich, dass sich sowohl ED-lip als auch Caelyx® allmählich an der Tumorstelle anreichern und nach etwa 12 h ein Maximum erreichen, bis zu 24 h auf einem Plateau bleiben und dann nach 48 und 72 h allmählich abfallen. Es ist in allen Zeitpunkten von 3, 12, 24, 48 und 72 Stunden interessant; die Akkumulation von ED-lip im Tumor ist signifikant höher als bei Caelyx®, was auf die Wirksamkeit des aktiven Targetings mit Anti-EpCAM-Aptamer zurückzuführen sein könnte. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Anlagerung von Aptamer an der Liposomenoberflächendosis die DOX-Verteilung in der Niere nicht beeinflusste. Daher scheint es, dass Anti-EpCAM-Aptamere die tumorspezifische Penetration von Liposomen effektiv fördern, was auch auf die Überexpression von EpCAM-Molekülen in vaskulären Endothelzellen von Tumoren zurückzuführen sein könnte [48]. Zuvor wurde darauf hingewiesen, dass Anti-EpCAM-Aptamere die Tumorpenetration in Xenotransplantat-Tumoren verbessern können [49]. Die CSCs oder TICs sind auch Ziel der Anti-EpCAM-Therapie. Die Gabe von Anti-EpCAM-Aptameren als Targeting-Ligand zum Targeting von EpCAM zeigte vielversprechende Effekte beim Targeting von CSCs [22, 50]. Hier könnte vorgeschlagen werden, dass ein Teil der effizienten Antitumorwirkung von ED-lip auf das erfolgreiche Targeting von CSCs zurückzuführen ist.

Bioverteilung im Gewebe. Die Ergebnisse der DOX-Bioverteilung in Herz, Tumor, Leber, Lungenmilz und Niere. Die Konzentrationen (μg/g), die 3, 12, 24, 48 und 72 Stunden nach der Injektion für jedes Organ angegeben wurden. Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SEM) (n =3). *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001, ****p <0,0001

In Vivo Anti-Tumor-Aktivität

Die therapeutische Wirksamkeit von ED-lip wurde im C26-Kolonkarzinom-Tumormodell untersucht. Tumorgröße, Körpergewicht und Überleben wurden während fast 2 Monaten überwacht und die Ergebnisse sind in Abb. 9 und Tabelle 4 zusammengefasst. Die Daten zeigen, dass ED-lip keinen offensichtlichen Einfluss auf das Körpergewicht von Mäusen sowie Caelyx® hat (siehe Abb. 9a .). ). Wie in Abb. 9b gezeigt, wird nach intravenöser Injektion von Caelyx® und ED-lip die Tumorwachstumsrate bis zum 30. Tag nach der Injektion wirksam gehemmt, und es gibt keinen signifikanten Unterschied in den liposomalen Gruppen. 30 Tage nach der Injektion beschleunigte sich die Tumorwachstumsrate, jedoch war die Wachstumsrate in den Gruppen, die Medikamente erhielten, immer noch langsamer als in der Gruppe, die PBS erhielten. Der Unterschied zwischen der Caelyx®-Gruppe und der ED-Lippe war während der 30 Tage nach der Injektion nicht signifikant. Die Überlebensergebnisse werden in einem Kaplan-Meier-Plot dargestellt. Abbildung 9c zeigt, dass ED-lip die Überlebenskurve im Vergleich zu PBS oder Caelyx® verbessert. Die Hauptindikatoren der Überlebensstudie sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Die Tumoren bei drei Mäusen der ED-Lippengruppe waren vollständig geheilt, so dass der MST für diese Gruppe nicht definiert ist. Die Behandlung mit ED-lip erhöhte die TTE von 41,1 auf 49,7 Tage und führte zu einer wirksamen Antitumoraktivität mit 90,27 % TGD mit undefiniertem MST aufgrund der vollständigen Entfernung des Tumors bei drei Mäusen (siehe Tabelle 4).

Therapeutische In-vivo-Wirksamkeit von Formulierungen bei weiblichen BALB/c-Mäusen, die C26-Kolonkarzinom tragen. Mäuse erhielten eine IV-Injektion einer Einzeldosis der Formulierungen (10 mg/kg). a Stellt das jeweilige Gewichtsprozentprofil des BALB/c in jeder experimentellen Gruppe dar. b Zeigt die Tumorgrößen-Follow-ups bei BALB/c-Mäusen. c Zeigt das Überlebensdiagramm für BALB/c. Daten dargestellt als Mittelwert ± SD (n =5)

Daten zur Tumorgröße zeigten, dass ED-lip das Tumorwachstum dramatisch hemmen könnte. Die Ergebnisse der Überlebensanalyse zeigten, dass die Behandlung mit ED-Lippe MST und TTE erhöhte. Die Gruppe, die ED-lip erhielt, hatte einen höheren TGD% und war im Vergleich zu Caelyx® wirksamer. Unsere Ergebnisse stimmen mit der hohen DOX-Konzentration im Tumorgewebe der mit ED-Lippe behandelten Gruppe überein. Daher verbessert Aptamer-konjugiertes liposomales DOX ihre Penetration und erhöht folglich die Wirkstoffakkumulation an der Tumorstelle, was wiederum zu einer Steigerung der Wirksamkeit von Caelyx® und höheren TGD% in den Überlebensdaten führt. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Anti-EpCAM-Aptamere als wichtiges Targeting-Agens für die Wirkstoffabgabe dienen könnten.

Schlussfolgerung

Hier haben wir Caelyx® mit Anti-EpCAM (SYLC3) Aptamer per Post-Insertion (ED-Lippe) oberflächenfunktionalisiert. Die Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie zeigten eine hohe DOX-Aufnahme in C26-Zellen, was darauf hinwies, dass Aptamer die Internalisierungsrate der ED-Lippe erhöhen könnte. Die pharmakokinetischen Daten zeigten, dass die Postinsertion von DSPE-mPEG-EpCAM die Pharmakokinetik von DOX im Vergleich zu Caelyx® nicht veränderte. Die Gewebebioverteilung zeigte jedoch, dass die Tumoransammlung von ED-lip im Vergleich zu Caelyx® auch nach 72 h nach der Injektion stärker war. Wir zeigten, dass ED-lip eine verbesserte therapeutische Wirkung bei Mäusen mit C26-Tumoren hatte. Die verbesserten Überlebensparameter bei Mäusen, die mit ED-lip behandelt wurden, legen nahe, dass das auf EpCAM gerichtete DOX-Liposom ein vielversprechender Wirkstoffträger für die Behandlung von Krebs ist und weitere Untersuchungen verdient.

Materialien und Methoden

Materialien

Das 5'-Amin-anti-EpCAM-DNA-Aptamer (Sequenz von 5'-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3') (SYL3C) wurde von BIONEER (Biotechnologiefirma, Daejeon, Südkorea) bezogen. DSPE-mPEG2000 -COOH wurde von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) bezogen. Dowex®, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), N-Hydroxysuccinimid (NHS), Penicillin-Streptomycin und Fluoroshield™ mit DAPI wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) bezogen. Kommerziell erhältliches caelyx® wurde von Behestan Darou Company (Teheran, Iran) bezogen.

Konjugation von DSPE-mPEG2000 zu Aptamer

Anti-EpCAM-Aptamer wurde mit DSPE-mPEG2000 verknüpft durch kovalente Bindung der primären Amine (-NH2) des Anti-EpCAM-Aptamers an die Carboxylgruppe (–COOH) von DSPE-mPEG2000 (Abb. 1). Die Konjugation erfolgte über die EDC/NHS-Kopplungschemie [51]. Kurz gesagt, DSPE-mPEG2000 wurde in 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)-Puffer (pH 6,5) dispergiert und EDC/NHS 400 mM EDC und 100 mM NHS wurden zu der Dispersion gegeben. Die Dispersion ließ 15 min Rühren zu, um die Carboxylgruppen des Lipids zu aktivieren. Dann wurde der Dispersion Anti-EpCAM-Aptamer zugesetzt und die nächsten 2 h bei Raumtemperatur im Dunkeln gerührt. Das Molverhältnis von Lipid:Anti-EpCAM-Aptamer betrug 1:1 und das Molverhältnis von EDC/NHS war das 10-fache des Lipids.

Modifikation von Caelyx® mit DSPE-mPEG-Anti-EpCAM-Aptamer

ED-lip wurde durch die Post-Insertion-Methode synthetisiert. Um die Postinsertion durchzuführen, wurden DSPE-mPEG-anti-EpCAM-Aptamer-Micellen zu 1 ml caelyx® für 30 min bei 60 °C gegeben. Die Mengen an DSPE-mPEG-EpCAM-Aptamer wurden nach dem Bartlett-Phosphat-Assay bestimmt [52]. Basierend auf einer ungefähren Anzahl von Liposomen pro Milliliter caelyx®, die etwa 10 14 . beträgt , wurde das Volumen von DSPE-mPEG-anti-EpCAM auf 10 Aptamer pro Liposom eingestellt [36]. Agarosegelelektrophorese zur Bestätigung nach der Insertion [39].

Physikochemische Charakterisierung

Die Partikelgröße, der Polydispersitätsindex (PDI) und die Oberflächenladung wurden mit dem Dynamic Light Scattering Instrument (DLS) (Nano-ZS; Malvern, UK) bestimmt. Um freies DOX zu entfernen, wurden Liposomen mit Dowex®-Harz gemischt und 60 min rotiert und durch Poly-Prep-Säulen (Bio-Rad Laboratories Inc.) laufen gelassen, um das Dowex® zu entfernen [53]. Die DOX-Mengen in liposomalen Formulierungen wurden unter Verwendung eines LS-45-Fluoreszenzspektrophotometers (Perkin-Elmer, UK) bestimmt (Anregung:Emission 485:590 nm).

Studie veröffentlichen

Um die Freisetzung von DOX zu bewerten, wird 1 ml der Formulierung zu den 9 ml Dextrose (mit 50% fötalem Rinderserum (FBS)) und in bestimmten Zeitintervallen (0, 1, 2, 4, 6, 12 und 24 h) wurden Proben entnommen. Nach Entfernung von freiem DOX mit Dowex®-Harz wurden die in den Liposomen verbliebenen Arzneimittelmengen durch Fluoreszenzspektrophotometer bestimmt und der Prozentsatz der Freisetzung berechnet [39].

Zellkultur

C26-Kolonkarzinom- und Chinesische Hamster-Eierstock-(CHO-K1)-Zelllinien wurden vom Pasteur Institute of Iran bezogen. Zelllinien wurden in RPMI1640-Medium kultiviert, das mit 10 % FBS von Gibco (Thermos Fisher Scientific, USA) und 100 IU/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin ergänzt war. Die Zellen wurden bei 37 ° . inkubiert C mit 5 % CO2 und 95% luftbefeuchtete Atmosphäre.

Zellinteraktions- und Zellaufnahme-Assay

Die Zellinteraktion und die Zellaufnahme der Formulierungen wurden bei 4 °C bzw. 37 °C bewertet. In diesem Test wurden zwei Zelllinien, CHO-K1 und C26, selektiert. The cells seeded in each well of 12-well plates (2.5 × 10 5 per well). After overnight incubation in 37 °C, treatments added to the cells and plates were placed at 4 °C and 37 °C and incubate for another 3 h. Then cells washed with PBS, and trypsinized. The fluorescence intensity for DOX was determined using flow cytometry (BD FACSCalibur cytometer). The data were analyzed with FlowJo version 7.0 software.

Fluorescent Microscopy Evaluation

The number of 1 × 10 6 cells per well C26 Cells were seeded into 6-well plates in which sterile microscopic cover glass were already inserted. After overnight incubation in 37 °C and 5% humidity, cells were treated with free DOX, Caelyx® and ED-lip for 24 h for complete cell uptake [54]. Then cells washed with PBS and fixed with 4% formaldehyde. Cover glasses stained with Fluoroshield™ with DAPI and were mounted on the glass slides. Treatments were performed in triplicate. From each slide, six zones were selected under × 200 magnification field. Intrinsic fluorescent of DOX was used for evaluation of drug cell uptake. Scaling was performed based on the percentages of cells which shown DOX cell uptake in each microscopic filed:

1:0–20%, 2:20–40%, 3:40–60%, 4:60–80%, and 5:80–100%

Evaluation of Cytotoxicity

The IC50 values of free DOX, caelyx®, and ED-lip were determined by MTT assay. In order to do this, CHO-K1 and C26 cells were seeded at density of 5 × 10 3 cells per well in 96-well plates at 37 °C. After overnight incubation liposomal formulations and free DOX solution were serially diluted in FBS-free medium and added to cell cultures and incubated 1, 3, and 6 h at 37 °C. Then, cells were washed and allowed to incubate 72 h. The optical densities (ODs) were measured using a spectrometric absorbance of 570 nm against a background of 630 nm on Stat-Fax 2100 microplate reader (Awareness Technology Inc. USA). Then the IC50 values were calculated.

Animal Study

Female BALB/c mice (4–6 weeks, 18–20 g) were kept in separate cages at 22 ± 2 °C and maintained on standard pellet diet and water ad libitum. Intraperitoneal (i.p) injection of ketamine and xylazine (100 mg/kg ketamine and 10 mg/kg xylazine) used to anesthetize the animals [55]. The number of 3 × 10 5 C26 cells per mouse in 60 μl PBS injected at the right flank, subcutaneously. Two weeks after inoculation when tumor sizes grew about 5 mm 3 , mice were randomly divided into 3 groups (n =3 for biodistribution and n =5 for antitumor study mice per group). All of the experimental protocols were approved by the Mashhad University of Medical Sciences committee for animal ethics and were performed according to the international rules considering the animal rights.

Biodistribution and Pharmacokinetic Studies

Fourteen days after tumor inoculation, mice were treated with dose of 10 mg/kg of caelyx® and ED-lip intravenously (i.v.) via the tail vain. Control group received 200 μl PBS solution. At certain time-intervals (3, 12, 24, 48, and 72 h) post-injection mice were euthanized and blood samples and tissue samples (liver, spleen, kidney, lung, heart, and tumor) were collected. Then, the concentration of doxorubicin in each sample measured based on fluorescent intensity of each samples using LS-45 fluorescence spectrophotometer (Perkin-Elmer, UK). Doxorubicin concentration of each sample was measured and non-compartmental analysis of the pharmacokinetic parameters were calculated from blood concentration vs. time profiles. Then the parameters including under the concentration-time curve (AUC) and area under the first moment curve (AUMC), half-life (t 1/2 ), volume of distribution (V d ), C max , T max,, mean residence time (MRT), and clearance (Cl) were calculated.

In Vivo Antitumor Activity

In order to evaluate antitumor activity, 10 days after tumor inoculation, mice with palpable tumor size were received single i.v. dose of 10 mg/kg Caelyx® and ED-lip. PBS injected in mice which considered as negative control. The parameters including time to reach the endpoint (TTE), percentage of tumor growth delay (TGD), median survival time (MST), and survival were determined. During the study, mice were observed for health and body weight changes. The tumor volume was also measured using a digital caliper and calculated as follows:

$$ \mathrm{Tumor}\ \mathrm{Volume}=\left(\mathrm{Height}\times \mathrm{Length}\times \mathrm{Width}\right)\times 0.52 $$

Considering ethical aspects, mice were removed in case tumor growth was> 1000 mm 3 , or> 20% weight loss or sign of weakness was observed.

Statistical Analysis

Data were analyzed using GraphPad Prism 6.0 (GraphPad software, Inc., San Diego, CA, USA). Data were demonstrated as mean ± SEM of at least three independent experiments. The t test was used in order to evaluate the results of release study, flow cytometry, and biodistribution of the formulations. ANOVA was employed to evaluate the results of fluorescent microcopy and tumor volumes. The Kaplan–Meier method used to calculate the survival parameters include TTE, MST and TGD%. P <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels unterstützen, sind im Artikel enthalten.

Abkürzungen

EpCAM:

Epithelial cell adhesion molecule

NDDSs:

Nano drug delivery systems

DOX:

Doxorubicin

EPR:

Verbesserte Durchlässigkeit und Retention

ECM:

Extra cellular matrix

CSC:

Cancer stem cell

TIC:

Tumor initiating cell

MFI:

Mean fluorescent intensities

MPS:

Mononuclear phagocytic system

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid

NHS:

N-Hydroxysuccinimid

PDI:

Polydispersitätsindex

DLS:

Dynamic light scattering instrument

FBS:

Fötales Rinderserum

OD:

Optische Dichte

AUC:

Area under the concentration-time curve

AUMC:

Area under the first moment curve

t ½ :

Half-life

V d :

Volume of distribution

MRT:

Mittlere Verweilzeit

Cl:

Clearance

TTE:

Time to reach the endpoint

TGD:

Percentage of tumor growth delay

MST:

Median survival time

i.p.:

Intraperitoneally

i.v.:

Intravenously


Nanomaterialien

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