Experimentelle Studie von in 5-Fluorouracil eingekapselten Ethosomen in Kombination mit CO2-fraktioniertem Laser zur Behandlung hypertropher Narben

Hintergrund

Hypertrophe Narbe ist eine Hauterkrankung, die durch übermäßige Kollagenablagerungen gekennzeichnet ist, die zu einer erhabenen Narbe führen, aber nicht den beobachteten Grad von Keloiden erreichen [1]. Insgesamt 100 Millionen Patienten entwickelten in den Industrieländern jedes Jahr Narben infolge von 55 Millionen elektiven Operationen und 25 Millionen Operationen nach Traumata [2]. Nach der Operation entwickelten etwa 60 % der Patienten postoperativ hypertrophe Narben, typischerweise während der ersten 3 Monate. Die meisten hypertrophen Narben sind auch 12 Monate nach chirurgischen Eingriffen noch hypertroph [3]. Zu den gängigen Behandlungsmethoden gehören derzeit chirurgische und nicht-chirurgische Behandlungen. Druck, Strahlentherapie, Chemotherapie und andere medikamentöse chirurgische Behandlungen sind die wichtigsten Therapiebehandlungen. Bisher konnten diese Therapien aufgrund ihrer Defekte nicht den gewünschten therapeutischen Effekt erzielen [4, 5]. Die medikamentöse Therapie ist eine der häufigsten nicht-chirurgischen Behandlungen von pathologischen Narben bis zur äußeren Bemalung auf der Grundlage lokaler Injektionen. Aufgrund von Arzneimittelnebenwirkungen sind lokale Injektionen oft auf eine kleinräumige und niedrig dosierte Behandlung beschränkt. Darüber hinaus konnten aufgrund der kurzen Halbwertszeit des Arzneimittels lokale Arzneimittelinjektionen immer keine lang anhaltenden hohen Konzentrationen auf der Narbe aufrechterhalten; daher sind häufig wiederholte Injektionen erforderlich [6]. In Anbetracht der Dichte des Narbengewebes und der starken Schmerzen ist eine Injektion für Patienten im Allgemeinen nicht akzeptabel. Trotz der Vorteile wie schmerzfrei, nicht nebenwirkungsfrei für die Leber und bequem für die langfristige äußerliche Anwendung [7, 8] konnten Medikamente aufgrund der besonderen Organisationsstruktur pathologischer Narben nicht in die Narbe eindringen. Neuere Berichte zeigten auch, dass topische Medikamente das Narbengewebe nur schwer durchdringen [9]. Daher ist die externe Verwendung für Medikamente derzeit eingeschränkt.

Ethosomen sind ein neuartiger Lipidträger, der von Touitou im Jahr 2000 verwendet wurde [10], der wirksam Medikamente durch die Haut transportiert. Der Hauptbestandteil von Ethosomen ist Ethanol, das die enge Anordnung der Lipidmoleküle der Kutikula verändern, die Lipidfluidität verbessern und die Flexibilität und Mobilität der Ethanol-Liposomenmembran fördern kann. Ethanol aus Ethosomen kann auch die Verformung des Stratum corneum beschleunigen und seine Aufnahme- und Penetrationsfähigkeit des Arzneimittels durch ungeordnetes Stratum corneum in der Haut verbessern [11,12,13]. Anders als bei normalem Hautgewebe hat Narbengewebe jedoch eine besondere Struktur. In unserer vorherigen Studie haben wir gezeigt, dass Ethosomen ein hocheffizienter Wirkstoffträger in menschlichen Narben sind [14]. Es ist unabdingbar, dass der Wirkstoff im Narbengewebe nicht gut verteilt wird, sondern von außen nach innen in der Haut deutlich reduziert wird. Das Medikament wird hauptsächlich in der Epidermis und der oberflächlichen Schicht der Dermis angesammelt, aber nicht in allen Schichten der Dermis, was die narbenhemmende Wirkung verringert.

Die ablative fraktionierte Lasertherapie, eine kosmetische Technologie, ist derzeit eine sehr beliebte und weithin akzeptierte Modalität und wird hauptsächlich zur klinischen Behandlung von Gesichtsfalten, oberflächlichen Narben, Pigmentstörungen und zur Verbesserung der Hautstruktur verwendet [15,16,17]. Basierend auf der Theorie der Punktmatrix-Photothermolyse [18] erzeugt ein ablativer fraktionierter Laser eine Array-ähnliche Anordnung eines winzigen Laserstrahls und durchbricht die Hautbarriere, indem er ablative mikroskopische vertikale Kanäle erzeugt, die von einer Zone thermischer Schädigung umgeben sind, was eine Wundheilungsreaktion bei mäßiger Haut induziert Aussehen [19,20,21,22]. Es wurde berichtet, dass die Hauptbarriere der perkutanen Aufnahme von Arzneimitteln das Stratum corneum ist [23, 24]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass einer der am häufigsten verwendeten klinischen ablativen fraktionierten Laser, CO₂ Der fraktionierte Laser kann das Stratum corneum aufbrechen und dichte mikroporöse Kanäle bilden, wodurch die Hauptbarriere der Verhinderung der perkutanen Wirkstoffaufnahme untergraben wird und gute Aussichten zur Förderung der transdermalen Wirkstoffpenetration bestehen [25,26,27,28].

In dieser Studie haben wir CO₂ . untersucht fraktioniertes laservermitteltes ethosomales Gel, das das narbenhemmende Medikament 5-Florouracil (5-FU) in menschlichen Narbenproben und einem hypertrophen Narbenmodell aus Kaninchenohren trägt. Mit diesem neuen Ansatz konzentrierten wir uns darauf, die Effizienz der Verabreichung von Medikamenten gegen Narben zu verbessern, um den langen Narbenbehandlungsprozess zu verkürzen. Zum ersten Mal wurde das hypertrophe Narbenmodell des Kaninchenohrs angewendet, um CO₂ . zu bestimmen fraktionierte laservermittelte nanoskalige Ethosomen, die 5-FU auf hypertrophen Narben und Arzneimittelpenetrationseffekt tragen. Zusammen wurde vorgeschlagen, dass CO₂ fraktionierter Laser in Kombination mit topischen Medikamenten bietet eine neuartige Therapiemethode für humane hypertrophe Narben.

Methoden

5-FU eingekapselte Ethosomen

Die Methode von Touitou [10] wurde als Vorbereitung für 5-FU-verkapselte Ethosomen verwendet. Die Partikelgrößenverteilung von 25 °C und der Polydispersitätsindex (PDI) wurden mit einem Laser-Partikelgrößenanalysator (λ = 632,8 nm). PDI <0,1 weist auf eine gleichmäßige Partikelgrößenverteilung hin und PDI> 0,3 weist auf eine inhomogene Partikelgrößenverteilung hin. Zur Beobachtung der Morphologie von Ethosomen wurde Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) verwendet. Die Ultrazentrifugationsmethode [29] wurde zur Messung der Verkapselungseffizienz (EE) von Ethosomen in dieser Studie verwendet.

Hochleistungs-Flüssigchromatographie

Die Konzentration von 5-FU im Rezeptorkompartiment der Franz-Zellen wurde mit einem Waters 2695 HPLC-System (Meadows Instrumentation, Illinois) und einem 2487 Ultraviolett-Detektor mit einer Umkehrphasen-Diamonsil TM C18-Säule (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) bestimmt ). 5-FU wurde bei 265 nm mit einer mobilen Phase von Methanol – H₂ . nachgewiesen O (5:95 v /v ) bei einer Flussrate von 1 ml/min. Die Daten wurden nach Peakfläche und der externen Standardmethode unter Verwendung eines Waters Empower Systems analysiert.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

Humanes hypertrophes Narbengewebe wurde durch konfokale Laserscanningmikroskopie (CLSM) in Schritten von 10 μm analysiert. Die Fluoreszenzintensität wurde unter Verwendung eines Laser Scanning Microscope LSM 510 (Zeiss, Jena, Deutschland) mit einer Fluar 10×, 0,5 numerische Apertur-Objektivlinse analysiert. Die optische Anregung wurde mit einem 543-nm-HeNe-Laser durchgeführt und für Rhodamin 6GO (Rho) wurde eine Fluoreszenzemission oberhalb von 560 nm nachgewiesen. Die Bilder wurden mit der Bildanalysesoftware Release Version 4.0 SP2 analysiert, um die Fluoreszenzverteilung und die Fluoreszenzintensität von Narbengewebe zu berechnen. Im 10 × 10-fachen des Sichtfeldes, der Größe und Verteilung der Pixelwerte war die Bestimmung des 5-FU EG (mit Rho gekennzeichnet) Penetrationsbereichs und durch halbquantitative Methode zu bestimmen.

5-FU Ethosomen Permeabilitätsassay in menschlichem Narbengewebe

Humane hypertrophe Narbenproben aus dem an der Shanghai Jiaotong University angeschlossenen Neunten Volkskrankenhaus für Plastische Chirurgie stammen von der Narbenentfernung bei Patienten mit drei Fällen, alle Frauen im Alter von 21–35 Jahren; die Narbe befindet sich an der Schulter und am Rücken; hypertropher Narbenverlauf von 6 Monaten bis 1 Jahr; Integrität des Narbengewebes; keine Geschwüre; keine Infektionsläsionen; und die unterste Narbe muss auch höher als die Haut sein, und der Patient hat seit der Krankheit keine Behandlung erhalten. Eine Vollnarkose wurde verwendet, um die Wirkung von Lokalanästhetika auf das Narbengewebe zu beseitigen. Die erhaltenen Proben wurden sofort aus dem subkutanen Gewebe entfernt, die Epidermis geschützt, in eine Dicke von 4,0 mm gebracht, eine Fläche von 3 cm × 3 cm Narbengewebeproben, mit Kochsalzlösung bei Raumtemperatur gewaschen, mit Mull trockener Oberflächenfeuchtigkeit getrocknet, eingewickelt mit Aluminiumfolie und im Kühlschrank bei − 20 °C aufbewahren. Humanes hypertrophes Narbengewebe wurde entfernt und vor der Verwendung in einem Gefrierschrank von – 20 °C gelagert. Humanes hypertrophes Narbengewebe wurde 2 h lang bei 25 °C in PBS mit einem pH-Wert von 7,4 eingetaucht, und das Wasser auf der Gewebeoberfläche wurde vorsichtig mit trockener Gaze entfernt. Alle epidermalen Geweberegionen von hypertrophem Narbengewebe waren CO₂ fraktionierte Laserbestrahlung. Auf die Laserparameter folgt unmittelbar der DeepFX-Modus, 25 mj Energiedichte, 20 % Abdeckung, 300 Hz Emissionsfrequenz, auf der 10. Spotgröße und ohne Überlappung. Alle bestrahlten Proben wurden unter Verwendung von HPLC-Detektion gesammelt, um den Narbengewebegehalt von 5-FU zu bestimmen. Histopathologische Schnitte werden sofort für den CLSM-Assay verwendet.

Modell mit hypertrophen Narben im Kaninchenohr

Die Methode des hypertrophen Narbenmodells des Kaninchenohrs wurde unten kurz beschrieben:12 weiße Neuseeland-Kaninchen, männlich und mit einem Gewicht von 2 kg (SLAC, Shanghai) wurden 2 Wochen lang getrennt gehalten. Für die Kaninchenanästhesie wurde Lumianning mit 1,5 mg Ketamin pro 100 g Gewicht durch intramuskuläre Injektion gemischt. Alle Wunden waren vom zentralen Punkt der Hasenohren umgeben. Jede runde Wunde mit einem Durchmesser von 1 cm war defekt, und dann wurde das Perichondrium entfernt. Achtundzwanzig Tage nach der Operation löste sich der Hasenohrschorf von der Wunde und heilte vollständig, mit einem sichtbaren Durchmesser von etwa 0,9 cm hypertrophen Narben. Die Narbe war leuchtend rot, die Haut war um die offensichtliche Hyperplasie herum beulen und die Narbe war dick und hart.

Bestimmung der Mikrokanal-Öffnungsraten

Verschiedene Zeitpunkte nach CO₂ fraktionierte Laserbehandlung im hypertrophen Narbenmodell des Kaninchenohrs, rote Fluoreszenz Rodanmin 6GO mit Ethosomen wurde auf Narbengewebe angewendet. Drei Stunden später wurde CLSM zur Bestimmung der Kanalöffnungsrate verwendet. Kanalöffnungsrate =offene Kanalnummer/(offene Kanalnummer + geschlossene Kanalnummer) × 100 %. Der Prozentsatz der Kanalöffnungsrate spiegelt die Wirkung von CO₂ . wider fraktionierte Laserdurchdringungseffektivität.

H&E-Färbung

Im Allgemeinen werden Kaninchen unter Verwendung von 10 % Pentobarbital i.v. getötet. Injektion (Dosis des Fünffachen der normalen Dosis für die Anästhesie, 35 mg/kg). Entfernen Sie sofort die Proben und fahren Sie mit dem Schritt der H&E-Färbung fort. Die Hämatoxylin- und Eosin-Färbungsmethode entspricht dem Standard-H&E-Färbeprotokoll.

Narbenhöhenindex und Bestimmung der relativen Dicke

28 Tage nach Induktion hypertropher Narben im Kaninchenohr werden vier Interventionsgruppen durchgeführt:5EL-Gruppe:Enthosomale Gele, verkapselt mit 5-FU, kombiniert mit CO₂ fraktionierter Laser; 5E-Gruppe:die mit 5-FU verkapselten enthosomalen Gele; CO₂ Gruppe:CO₂ fraktionierte Laserbehandlung; und Kontrollgruppe. Wir definierten A als Dicke des dicksten Teils des hypertrophen Narbengewebes des Kaninchenohrs und B als Dicke von 1,0 cm entfernt vom dicksten Teil des hypertrophen Narbengewebes des Kaninchenohrs (nahe dem Mittelpunkt). Die relative Dicke wird nach A/B berechnet. Dermale Narbenhypertrophie wurde durch das SEI illustriert. SEI =die Fläche der neu gebildeten Dermis/die Fläche der unverwundeten Dermis. SEI> 1,5 zeigt eine hypertrophe Narbe.

Statik

Alle Experimente wurden dreimal wiederholt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit SPSS Version 19.0 (SPSS Inc., Chicago, USA) durchgeführt. Schüler t Test wurde verwendet, um die Signifikanz zu berechnen. *p Wert <  0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen; **p Wert <  0,01 wurde als statistisch sehr signifikant angesehen; ***p Wert < 0,001 wurde als statistisch äußerst signifikant angesehen und ****p Wert < 0,0001 wurde als statistisch hochgradig signifikant angesehen.

Ergebnisse

Qualitätsbewertung von Ethosomen, die mit 5-Florouracil(5E) verkapselt sind

Um die Qualität des mit 5-Florouracil (5E) verkapselten ethosomalen Gels zu validieren, wurden zunächst die Morphologie und der Durchmesser durch Beobachtung mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) nachgewiesen. Ethosomen im Suspensionszustand bildeten einen vollständigen Kreis oder ein oval-sphärisches Vesikel von universeller Größe, das unter dem Mikroskop weniger als 100 nm groß ist (Abb. 1a–b). Nach der Gelformulierung blieben die Ethosomen intakt (Abb. 1c–d). Unter Verwendung eines Laser-Partikelgrößenanalysators scheinen Ethosomen im Suspensionszustand einen Durchmesser von 87,72 ±   9,27 nm zu haben und der PDI betrug 0,10 ± ± 0,01. In der Zwischenzeit betrug die Partikelgröße der Ethosomen 98,78 ± 10,88 nm und der PDI 0,11 ± 0,02. Ein statischer Vergleich zeigt, dass die Partikelgröße keinen signifikanten Unterschied hat (p> 0,05). Außerdem hatten beide PDIs keinen signifikanten Unterschied (p> 0,05). Darüber hinaus zeigten die vom Laser-Partikelgrößenanalysator und TEM erhaltenen Daten vergleichbare Ergebnisse. Darüber hinaus wurde die Einschlusseffizienz (EE) auch mit der Ultrazentrifugationsmethode bestimmt (Tabelle 1). Die Ergebnisse zeigten, dass der EE der ethosomalen Suspension 10,47 ± 1,47 % und der EE des ethosomalen Gels 11,56 ± 1,12 % betrug (n = 6), ohne Bedeutung (p> 0,05). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass keine Veränderungen der Morphologie und Partikelgröße im Suspensionszustand und im Gelzustand der Ethosomen gefunden wurden.

Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von 5-FU-Ethosomen. Ethosomen von Lösungen (a und b ) und Gel-Ethosomen (c und d )

CO₂ Fractional Laser fördert die 5E-Permeabilität durch hypertrophe Narben in vitro

Nach der Bewertung der Qualität der mit 5-Florouracil (5-FU) verkapselten Ethosomen untersuchten wir deren Durchlässigkeit in humanen hypertrophen Narben mit oder ohne CO₂ fraktionierter Laser in vitro. Humanes hypertrophes Narbengewebe wurde mit CO₂ . bestrahlt fraktionierter Laser und dann wurde 5E gleichmäßig aufgetragen. Die kumulativen Konzentrationen von 5-FU wurden nach 1, 3, 6, 10, 16 und 24 h durch HPLC bestimmt (2). Wir haben die kumulativen 5-FU-Konzentrationen von CO₂ . verglichen fraktionierter Laser kombiniert mit Ethosomen, eingekapselt mit 5-Florouracil (5EL)-Gruppe und 5E-Gruppe zu verschiedenen Zeitpunkten. Nach 1 h betrug die kumulative 5-FU-Konzentration der 5EL-Gruppe 4,15 ± 2,22 μg/ml/cm ² , die höher war als die Konzentration der 5E-Gruppe (0,73 ± 0,33 μg/ml/cm ² , p < 0,001). In der Langzeitbehandlung (24 h) kumulierte 5-FU-Permeationskonzentration der 5EL-Gruppe (107,61 ± 13,27 μg/ml/cm ² ) war auch höher als in der 5E-Gruppe (20,73 ± 3,77 μg/ml/cm ² , p < 0,0001). Zu den früheren Zeitpunkten 3, 6, 10 und 16 h zeigten die 5EL-Gruppen immer eine höhere kumulative 5-FU-Permeationskonzentration als die 5E-Gruppen (Abb. 2a). Darüber hinaus betrug die Retentionsmenge von 5-FU in der 5EL-Gruppe 24,42 ± 4,37 μg/cm ² . , was höher ist als die 5E-Gruppe (12,45 ± 1,64 μg/cm ² , p < 0.01, n = 6) (Abb. 2b). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass CO₂ Die fraktionierte Laserbestrahlung kann in vitro das 5-FU enthaltende Liposom durch humanes hypertrophes Narbengewebe signifikant fördern und die 5-FU-Retention in hypertrophem Narbengewebe unterstützen.

CO₂ fraktionierter Laser fördert die 5E-Permeabilität durch hypertrophe Narben in vitro a Vergleich der Permeation der 5E- und 5EL-Gruppe in einer 24-Stunden-Studie an humaner hypertropher Narbe in vitro. Die Werte wurden als Mittelwert  ± SD ausgedrückt. n = 6. b Die kumulative Retention von 5-FU in hypertropher Narbe in vitro nach Anwendung für 24 Stunden. n = 6.***p Wert < 0,001 wurde als statistisch äußerst signifikant angesehen, ****p Wert < 0,0001 wurde als statistisch hochgradig signifikant angesehen

Die Tiefe und das Ausmaß der 5-FU-Penetration wurden unter Verwendung von mit Rho markiertem 5E bestimmt, um den verstärkenden Penetrationseffekt von CO₂ . zu bewerten fraktionierter Laser in vitro. Der Fluoreszenzassay wurde verwendet, um die Intensität der 5E- und 5EL-Gruppen 1, 6 und 24 h nach der 5-FU-Behandlung anzuzeigen (Abb. 3a). Die Ergebnisse zeigten, dass nach 1-stündiger 5EL-Behandlung die Rho-Fluoreszenz in der flachen Epidermis- und Dermisschicht verteilt war, insbesondere um CO₂ . herum fraktionierte laserinduzierte Vergasungszone. Im Gegensatz dazu ohne CO₂ fraktionierte Laserbestrahlung, Rho-Fluoreszenzverteilung war auf den Epidermisbereich in der 5E-Gruppe beschränkt. Nach 6 h Behandlung in der 5EL-Gruppe breitete sich die Rho-Fluoreszenz bis in die tiefe Dermis aus und zeigte eine stärkere Akkumulation. Obwohl die Fluoreszenzverteilung der 5E-Gruppe in der Dermis zu erscheinen begann, nahm die Fluoreszenzintensität von der Dermis zur Epidermis allmählich ab. Nach 24 h Behandlung war die Fluoreszenz von zwei Gruppen im gesamten Hautgewebe breit verteilt, jedoch war die Fluoreszenzintensität in der 5EL-Gruppe signifikant höher. Außerdem wurde die Bildanalysesoftware Release Version 4.0 SP2 für die quantitative Analyse verwendet, um die Fluoreszenzintensität für beide Gruppen zu berechnen. Die Ergebnisse der quantitativen Analyse zeigten eine signifikant erhöhte Rho-Fluoreszenzintensität in der 5EL-Gruppe als in der 5E-Gruppe (1 h:59,61 ± 6,39 vs.6,39 ± 1,64, p < 0,0001; 6 h:163,32 ± 13,23 vs. 49,89 ± 4,01, p < 0,0001; 24 h:270,36 ± 8,73vs. 148,25 ± 16,89, p < 0,0001) (Abb. 3b). Zusammengefasst:CO₂ fraktionierte Laserbestrahlung fördert in vitro signifikant die 5E-Durchdringung in das humane hypertrophe Narbengewebe.

CO₂ fraktionierter Laser fördert in vitro die Permeabilität durch hypertrophe Narben a Die rote Fluoreszenz ist als Ethosomen markiert, die hypertrophes Narbengewebe nach 1, 6 und 24 h in vitro durchdrungen haben. b Die Fluoreszenzintensität von mit Rhodamin 6GO markierten Ethosomen auf hypertrophem Narbengewebe in vitro nach 1, 6 und 24 h. ****p Wert < 0,0001 wurde als statistisch hochgradig signifikant angesehen

Dauer von CO₂ Fractional Laser verbessert die 5-FU-Penetration in vivo

Um stichhaltigere Beweise für CO₂ . zu erhalten fraktionierten Lasereffekt führten wir eine 5-FU-Penetration in vivo unter Verwendung eines hypertrophen Narbenmodells von Kaninchen durch. Der Aufbau des hypertrophen Narbenmodells des Kaninchens wurde als Methode beschrieben. Verschiedene Zeitpunkte (3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 3 Tage und 7 Tage) nach der Anwendung von CO₂ Es wurde eine fraktionierte Laser-, 5E- oder 5EL-Behandlung durchgeführt und die Fluoreszenzverteilung wurde sofort durch CLSM bestimmt (Abb. 4). Die Rho-Fluoreszenz war in der Dermisschicht der hypertrophen Narben des Kaninchenohrs, die näher an der ablativen Zone lagen, weithin sichtbar und verteilt (Abb. 4a). Diese Ergebnisse können darauf hindeuten, dass Rho gemischt mit 5E hauptsächlich durch den porösen Kanal nach CO₂ . infiltriert fraktionierte Laserbestrahlung. Fluoreszenz kann in der das Hautgewebe umgebenden ablativen Zone nach 6 h 5EL selbst bei einem kleinen Verteilungsbereich nachgewiesen werden (Abb. 4b). Der Bereich der Fluoreszenzverteilung schrumpft 12 h nach der medikamentösen Behandlung weiter, was darauf hindeutet, dass mikroporöse Kanäle nach der Wundheilung allmählich geschlossen werden (Abb. 4c). Nach 24 Stunden, 3 Tagen und 7 Tagen Behandlung mit CO₂ fraktionierter Laserbestrahlung konnte nur innerhalb der Krustenporen um Öffnungen herum Fluoreszenz gefunden werden und kein Eindringen in die Dermis (Abb. 4d–f), was darauf hindeutet, dass CO₂ Der fraktionierte Laserpenetrationseffekt ist mit vollständiger Reepithelisierung der Epidermis verschwunden. Unsere Daten legten nahe, dass die Mikrokanalöffnung eine entscheidende Rolle bei der Wirkstoffpenetration bei der 5EL-Behandlung spielt. Danach berechneten wir Mikrokanalöffnungsraten von 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 3 Tagen bzw. 7 Tagen nach der Laserbestrahlung. Zu den Zeitpunkten 3 und 6 h waren alle mikroporösen Kanäle offen, was darauf hindeutete, dass die Öffnungsraten der Mikrokanäle 100 % betrugen. Die Öffnungsraten der Mikrokanäle begannen um 12 Stunden auf 90,59 % und um 24 Stunden auf 15,58 % zu sinken. Insbesondere waren alle mikroporösen Kanäle 3 und 7 Tage nach der 5EL-Behandlung geschlossen. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass CO₂ fraktionierter Laser kontrolliert die Wirkstoffpenetration in hypertrophem Narbengewebe von Kaninchen in vivo.

CO₂ Der fraktionierte Laser fördert die Öffnungsraten von Mikrokanälen in vivo. Die rote Fluoreszenz ist gekennzeichnet. Ethosomen durchdringen hypertrophes Narbengewebe des Kaninchenohrs 0 h (a ), 6 h (b ), 12 Stunden (c ), 24 h (d ), 3 Tage (e ) und 7 Tage (f ) nach CO₂ fraktionierte Laserbehandlung in vivo

Die therapeutische Wirkung von 5EL auf hypertrophe Narben in vivo

Um die 5EL-Behandlung gründlich zu verstehen, haben wir die relative Dicke der hypertrophen Narbe des Kaninchenohrs bestimmt. Nach dem Aufbau des hypertrophen Narbenmodells des Kaninchenohrs wurden die relativen Dickenwerte vor und nach der 5EL-Behandlung berechnet. In den Gruppen vor der Behandlung wurde kein signifikanter Unterschied gefunden. Die relative Dicke der 5EL-Gruppe betrug jedoch 1,27 ± 0,15, was signifikant niedriger war als die der 5E-Gruppe (1,52 ±   0,10, p < 0,05) und unbehandelt (1,61 ± 0,15, p < 0,0001) Gruppe (Abb. 5). Interessanterweise gab es keine signifikante Änderung zwischen den CO₂ Nur-Laser-Behandlungsgruppe und die 5EL-Gruppe. Diese Daten deuten darauf hin, dass CO₂ Der fraktionierte Laser spielt eine dominante Rolle bei der Heilung von hypertrophen Narben im Kaninchenohr in vivo.

Vergleich der relativen Dicke hypertropher Narben von Kaninchen vor und nach verschiedenen Behandlungen. 5EL:die mit 5-FU verkapselten enthosomalen Gele in Kombination mit CO₂ fraktionierter Laser, n = 14; CO₂ :CO₂ Nur fraktionierter Laser, n = 12; 5E-Gruppe:die mit 5-FU verkapselten enthosomalen Gele, n = 14; Kontrolle:leer, n = 16. *p Wert < 0,001 wurde als signifikant angesehen, ****p Wert < 0,0001 wurde als statistisch hochgradig signifikant angesehen

Wir haben auch die Morphologie der hypertrophen Narbe des Kaninchenohrs verglichen, um den Unterschied bei der Verwendung von CO₂ . zu bestimmen fraktionierter Laser. In der 5EL-Gruppe wurden hypertrophe Narben abgeflacht und die Farbe wurde signifikant hellrosa (Abb. 6a–b). In CO₂ Gruppe nur mit fraktionierter Laserbehandlung, die Dicke der hypertrophen Narbe nahm bis zu einem gewissen Grad ab und ihre Farbe wurde blassrot (Abb. 6c–d). In der 5E-Gruppe nahm die Dicke der hypertrophen Narbe leicht ab, die Farbe blieb jedoch leuchtend rot (Abb. 6e–f). Schließlich gab es keine signifikante Veränderung in der unbehandelten Gruppe im Vergleich zur Vorbehandlung (Abb. 6g–h). Als nächstes wurde die H&E-Färbung für die pathologische Analyse 7 Tage nach der Behandlung für diese vier Gruppen auf hypertrophem Narbengewebe von Kaninchenohren verwendet (Abb. 7). Die 5EL-Gruppe und CO₂ Nur Gruppen mit fraktionierter Laserbehandlung zeigten eine verringerte dermale Schichtdicke von hypertrophen Narben und punktförmigen Krusten mit seltenen oberflächlichen oberflächlichen Dermis-Kollagenfasern in knoten- oder spiralförmiger Anordnung (Abb. 7a–b). In der 5E-Gruppe und der unbehandelten Gruppe wurde eine große Zahl von dermaler Kollagenfaserpenetration, ungeordneter Anordnung von Kollagenfasern und oberflächlicher knötchenförmiger oder spiralförmiger Anordnung der Dermis gefunden (Abb. 7c–d). Eine weitere wichtige Bewertungsmethode für hypertrophe Narben ist der Scar Elevation Index (SEI). Ähnlich mit dem relativen Dickenmuster, SEI der 5EL-Gruppe (1,16 ± 0,08) und CO₂ Die Gruppe mit nur fraktionierter Laserbehandlung (1,22 ± 0,10) war im Vergleich zur 5E-Gruppe (1,32 ± 0,13) und der unbehandelten Gruppe (1,49 ± 0,08) signifikant verringert (Abb. 8). Zusammengenommen zeigen Morphologieanalyse und SEI-Berechnungsdaten CO₂ fraktionierte Laserfunktionen zur Heilung von hypertrophen Narben in Kaninchenohren in vivo.

Fotografische Darstellung von hypertrophen Narben von Kaninchen vor und nach Anwendung verschiedener Behandlungen für 7 Tage. Die 5EL-Gruppe:die mit 5-FU verkapselten enthosomalen Gele in Kombination mit CO₂ fraktionierter Laser, vorher (a ) und nach (b ) Behandlung für 7 Tage; CO₂ Gruppe:CO₂ fraktionierter Laser, vorher (c ) und nach (d )Behandlung für 7 Tage; 5E Gruppe B:die mit 5-FU verkapselten enthosomalen Gele vor (e ) und nach (f ) Behandlung für 7 Tage; und leere Gruppe:leer, vorher (g ) und nach (h ) Behandlung für 7 Tage

Histologische H&E-Analyse hypertropher Narben von Kaninchen nach Anwendung verschiedener Behandlungen über 7 Tage. Die 5EL-Gruppe:die mit 5-FU verkapselten enthosomalen Gele in Kombination mit CO₂ fraktionierter Laser (a ); CO₂ Gruppe:CO₂ fraktionierte Laserbehandlung (b ); 5E-Gruppe:die mit 5-FU verkapselten enthosomalen Gele (c ); und leere Gruppe:leer (d ). Originalvergrößerungen:× 40

Vergleich des SEI von hypertrophen Narben von Kaninchen nach Anwendung verschiedener Behandlungen für 7 Tage. 5EL:die mit 5-FU verkapselten enthosomalen Gele in Kombination mit CO₂ fraktionierter Laser, n = 14; CO₂ :CO₂ fraktionierter Laser, n = 12; 5E:die mit 5-FU verkapselten enthosomalen Gele, n = 14; Kontrolle:leer, n = 16.***p Wert < 0,001 wurde als statistisch äußerst signifikant angesehen und ****p Wert < 0,0001 wurde als statistisch hochgradig signifikant angesehen

Diskussion

Die medikamentöse Behandlung ist der wichtigste Behandlungsansatz, hauptsächlich topisch oder als lokale Injektion, zur nicht-chirurgischen Behandlung von hypertrophen Narben. Aufgrund der Nebenwirkungen verschiedener Medikamente ist die lokale Injektion oft auf kleine Dosierungen beschränkt und erlaubt somit nur einen kleinen Behandlungsumfang. Aufgrund der kurzen Halbwertszeit von Arzneimitteln erfordern anhaltend hohe Konzentrationen in der Narbe außerdem wiederholte Injektionen [6, 30, 31]. Da das Narbengewebe außerdem sehr konzentriert ist und bei Injektionen oft starke Schmerzen auftreten, akzeptieren Patienten die Behandlung oft nicht. Although external drug usage having advantage of being convenient, painless, with long-term stability, low side effects, avoiding to affection of the gastrointestinal environment [7, 8], there are several limitations. First of all, topical and injected drugs availability is limited by special pathological scar tissue structure, which presents with a thickening of the stratum corneum and hyperplasia of the dermis, which hinders the penetration of the drug and achieving an effective therapeutic concentration. Recent reports have proven this and described how external use of drugs inefficiently penetrates the scar tissue [4, 9]. Ethosomes, proposed by Touitou et al. [10] in 2000 as a transdermal drug carrier, have been widely reported [11, 12, 32]. In this study, we improved the ethosomes preparation process to nano-level (particle size 70~90 nm). This change of a new nanoscale dimensions and the spatial conformation of the ethosomes allow them to penetrate into the scar tissue through a narrowly tightly connected cell gap not only due to the small size, but also by the similarity to the cell membrane of scar tissue cells. Based on such penetration mechanisms, ethosomes become a convenient transdermal drug carrier [14, 33, 34]. However, the anti-scar drug 5-FU encapsulated with ethosomes is mainly concentrated in the epidermis and dermis, which is not conducive to fibroblasts in deeper layers of the dermis. Therefore, our purpose is to explore a method that would allow to increase the penetration of drugs and would promote the uniform dispersion of drugs in scar tissue.

So far, commonly used methods to promote the penetration are divided into two categories:the promotion of chemical substances and physical methods to enhance permeability. The physical enhancement techniques include electroporation, iontophoresis, laser, microdermabrasion, microneedle, pressure, radiofrequency induction, and sonography [35]. There are many different types of lasers that have been shown to promote percutaneous administration, and ablative fractional lasers become the most popular laser in recent years for promoting drug penetration into the skin [20]. Ablative fractional laser can not only extremely reduce drug dosage, but also be conducive to drug penetration into deep skin and achieve high local concentrations to obtain a therapeutic effect. CO₂ fractional laser, Erbium-doped Yttrium Aluminum Garnet (Er:YAG) fractional laser, and Erbium-doped Yttrium Scandiu Gallium Garnet (Er:YSGG) fractional laser can produce ablative zone or microporous channels on the surface of the skin. Compared with Er:YAG fractional laser (2940 nm wavelength) and Er:YSGG fractional laser (2790 nm wavelength), CO₂ fractional laser (10,600 nm wavelength) has lower water absorption coefficient, larger thermal damage, and greater destruction effect of stratum corneum of the epidermis, which is more conducive to promote penetration effect [36].

In this study, 5-FU retention in the 5EL group (24.42 ± 4.37 μg / cm ² ) was significantly higher than in the 5E group (12.45 ± 1.64 μg/cm ² ) in scar tissue of 24 h treatment in vitro. Additionally, in Rho-labeled assay, 5EL group has shown higher fluorescence intensity than 5E group at 1-, 6-, and 24-h treatment time points. Image analysis showed that fluorescence can be found distributed in the gasification zone and surrounding dermal tissue matrix after 1-h CO₂ laser treatment in the 5EL group, and the fluorescence in 5E group is only distributed in the epidermis. After 6- and 24-h treatment, diffuse fluorescence range is wider and fluorescence intensity is higher in the 5EL group than in the 5E group. CO₂ fractional laser-induced gasification zone provided an effective way for drug penetration through the skin scar tissue, enlarge range of dermis penetration depth, and retention content in scar tissue. There are three different forms of thermal effect damage by CO₂ fractional laser acting on the skin or scar tissue, from center to outliner, the gasification zone, thermal coagulation necrosis zone, and thermal denaturation zone [37]. Fluorescence data showed that Rho fluorescence was distributed from more concentrated gasification zone to diffused tissue, suggesting that there is no effect for permeation of drugs in thermal coagulation necrosis zone and thermal denaturation zone, which also confirmed the feasibility of CO₂ fractional laser for the promotion of topical anti-scarring drug penetration. Together, CO₂ fractional laser is conducive to more anti-scarring drugs 5-FU retention in scar tissue and achieve high drug concentration required to strengthen the anti-scarring effect.

The duration of CO₂ fractional laser enhancing 5E was evaluated by CLSM on rabbit ear hypertrophic scar in vivo. The opening rates of microporous channels for drug permeation were 100% (0 h), 100% (6 h), 90.59% (12 h), and decreased to 15.58% (24 h) after CO₂ fractional laser treatment of hypertrophic scar. Moreover, microporous channel opening rates dropped to zero on 3 and 7 days, and the drug can no longer penetrate into the skin through these channels. These results were consistent with that of epidermal re-epithelialization after ablative fractional laser irradiation, which is the skin wound around the keratinocytes to the wound defect migration and proliferation, covering the wound to form a complete layer of cells formed by the epidermis. When the dermal layer of skin was wound, the repair process will immediately start and quickly rebuild the skin barrier [38, 39]. The whole skin tissue trauma repair process can be divided into four continuous and overlapping steps:coagulation, inflammation, re-epithelialization, and remodeling [40]. Human skin after ablation of the fractional laser irradiation injury area (including the gasification area and coagulation necrosis area) complete epidermal re-epithelialization in 2 to 3 days and dermal remodeling for at least 4 weeks [41]. Thus, although the lesion in the dermis does not heal within 24 h after the CO₂ laser treatment, the epidermis has completed the complex epithelization, including the formation of the stratum corneum, where the topical drug could not penetrate through channels. Taken together, epidermis, especially the stratum corneum, is still the main barrier for drug penetration through the skin.

In addition, our CLSM data showed both in in vitro human hypertrophic scar skin and in vivo rabbit ear hypertrophic scar skin, Rho-labeled 5E can penetrate the necrotic coagulation layer and the formation of crust on the surface after the CO₂ fractional laser irradiation. It suggested that the skin under the crust but not the coagulation necrotic layer and crust tissue can impede the penetration of drug. Therefore, 24 h is the critical time-point for the effect of CO₂ fractional laser on the penetration effect of hypertrophic scar in rabbits.

It has been reported that the clinical application of exfoliative fractional laser is an effective method to treat various skin diseases (such as solar keratosis, basal cell carcinoma, Bowen’s disease, etc.) [25,26,27,28]. However, the clinical efficacy of CO₂ fractional laser in combination with drugs has not been explored in the treatment of hypertrophic scars [42, 43]; in particular, there are no reports of combined CO₂ fractional laser (physical technique) with anti-scar drug nano-level ethosomes (chemical substances promoting scar penetration) for the treatment of hypertrophic scars. Using in vivo study, we performed a rabbit hypertrophic scar model for validation of CO₂ fractional laser protocol. On the seventh day after intervention, the relative thickness of the four groups of hypertrophic scar was measured:experimental group (CO₂ fractional laser combined with 5-FU EG):1.27 ± 0.15 2 fractional laser irradiation only):1.35 ± 0.09 2 fractional laser had a leading role in the intervention of hypertrophic scars. This finding was mainly manifested in three aspects. First of all, CO₂ fractional laser generated micro-channels for the promotion of scar drugs penetration. Secondly, CO₂ fractional laser itself could help in hypertrophic scar tissue’s collagen remodeling. Thirdly, 5E itself could directly influence hypertrophic scars. From H&E staining data, we found that processes of collagen fiber bundle remodeling, from disordered, different-direction collagen fibers into a consistent, paralleled direction collagen beam take place. In the experimental group of rabbit ear hypertrophic scar, there was a significant reduction in scar thickness, but also color change of hypertrophic scar, from bright red to light red, which may be induced by vascular proliferation of the scar tissue.

The toxicity of the ethosomes should be a big concern in this study. Nevertheless, after reviewing literature, there are no results exhibiting the toxicity of ethosomes in vitro or in vivo study [44,45,46]. The permeability mechanism of ethosomes is mainly as follows:high concentration of ethosomes, the flexibility, and fluidity of ethanol liposome membrane, makes ethosomes deform in the process of transmission, and enhances the permeability in scar tissue [47].

Although the difference between the experiment group and control group A was not statistically significant, the relative thickness and SEI of the experimental group was smaller than that in the control group A. Both groups were treated with CO₂ fractional laser, with or without 5E. This finding suggests that CO₂ fractional laser may have the dominant role, which overtakes the minor effect of 5E drug in the final anti-scar effect.

Conclusion

CO₂ fractional laser can rapidly and significantly promote 5-fluorouracil encapsulated ethosomes’ permeability through hypertrophic scars in vitro. CO₂ fractional laser is a potentially efficient method of promoting drug permeation in hypertrophic scars’ treatment. Our hypertrophic scar model (rabbit) showed that CO₂ fractional laser combined with external-loaded 5-fluorouracil encapsulated ethosomes can effectively cure hypertrophic scars. Also, CO₂ fractional laser itself can facilitate collagen remodeling in hypertrophic scar of rabbit ears. CO₂ fractional laser can significantly promote the permeation of 5-fluorouracil encapsulated ethosomes, but the effect begins to relinquish 24 h after CO₂ fractional laser irradiation, which indicates that 24 h is a critical period.