Untersuchung der Rolle der Emulsionströpfchengröße und des Tensids im auf Grenzflächeninstabilität basierenden Herstellungsprozess von mizellaren Nanokristallen

Hintergrund

Das Potenzial der Anwendung von Nanomaterialien, wie fluoreszierende Halbleiter-Nanokristalle (Quantum Dots, QDs) [1,2,3], superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPIONs) [4,5,6] und Gold-Nanopartikel [7,8,9] , zum biomedizinischen Nachweis, Bildgebung und Therapie hat sich nach fast zwei Jahrzehnten Forschung gut etabliert [10, 11]. Daher hat sich der Fokus der Nanobiomaterialforschung in den letzten Jahren von Proof-of-Concept-Experimenten hin zu mechanistischen Studien verlagert, die darauf abzielen, Einblicke und ein systematisches Verständnis von Nanomaterial-Herstellungsprozessen, Nanomaterial-Struktur-Eigenschafts-Beziehungen sowie Nanomaterial-Biosystem-Interaktionen zu gewinnen , und translationale Forschung, die darauf abzielt, die Schlüsselprobleme bei der Übertragung von Nanomaterialien in die Industrie und die Klinik zu identifizieren und zu lösen. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Gewinnung neuer Erkenntnisse über einen neuen Herstellungsprozess, der als Grenzflächeninstabilitätsmethode bekannt ist, von mizellaren Nanokristallen, die zu einer wichtigen Klasse von Nanobiomaterialien geworden sind.

Eine Hauptstrategie zur Solubilisierung hydrophober Nanomaterialien (z. B. QDs, SPIONs und Goldnanopartikel, synthetisiert durch die häufig verwendete organische Lösungsmittel-basierte Hochtemperatursynthese [12,13,14]) in Wasser besteht darin, eine Mizelle zu verwenden, um die hydrophoben Nanomaterialien einzukapseln [ 15,16,17]. Eine Mizelle ist ein klassisches Selbstorganisationssystem, bei dem amphiphile Moleküle in einer wässrigen Umgebung spontan eine Kern-Schale-Struktur (eine sogenannte Mizelle) bilden, wobei das hydrophile Segment der amphiphilen Moleküle als Micellenhülle nach außen und das hydrophobe Segment nach außen gerichtet nach innen wie der Mizellenkern, um die Gesamtenergie des Systems zu minimieren. Mizellen haben eine lange Anwendungsgeschichte als Reinigungsmittel und Wirkstoffabgabesysteme [18,19,20,21,22], hauptsächlich aufgrund der Tatsache, dass hydrophobe Moleküle (z. B. Öle, viele Krebsmedikamente) in die hydrophoben Kerne eingekapselt werden können der Micellen hauptsächlich durch hydrophobe Wechselwirkung angetrieben [23]. In jüngerer Zeit wurden Micellen verwendet, um einzelne Nanokristalle (wobei jede Mizelle einen einzelnen Nanokristall einkapselt) für die biomedizinische Bildgebung und Detektion zu verkapseln [24]. In jüngster Zeit haben einige Forschungsgruppen über die Verwendung einer Mizelle zur Einkapselung mehrerer Nanokristalle für Multifunktionalität oder synergistische Effekte zwischen den verschiedenen Nanokristallen in einer Mizelle berichtet [25,26,27,28,29,30,31,32].

Eine neue Methode zur Herstellung mizellarer Nanokristalle (Nanokristall-verkapselte Micellen) ist die Grenzflächeninstabilitätsmethode [33,34,35]. Der Prozess der Grenzflächeninstabilität wurde erstmals 2008 von Zhu und Hayward zur Herstellung von mit Eisenoxid-Nanopartikeln verkapselten Micellen beschrieben [33] und später von Ruan und Winter et al. im Jahr 2010 Micellen herzustellen, die sowohl QDs als auch SPIONs einkapseln, und 2011 Micellen, die QDs mit verschiedenen Fluoreszenzemissionsfarben einkapseln [25, 26]. Der Grenzflächeninstabilitätsprozess zur Herstellung von QD-eingekapselten Poly(styrol-b-ethylenglykol) (PS-PEG)-Mizellen umfasst zwei Hauptschritte:(1) Bildung von Öl-in-Wasser-Emulsionströpfchen. In dieser Emulsion enthält die Ölphase hydrophobe QDs und das amphiphile Blockcopolymer PS-PEG gelöst in einem unpolaren organischen Lösungsmittel (Chloroform in der vorliegenden Arbeit); die wässrige Phase enthält ein in Wasser gelöstes Tensid Poly(vinylalkohol) (PVA); (2) Bildung von Nanokristall-verkapselten Micellen. Beim Verdampfen des organischen Lösungsmittels wird die Öl/Wasser-Grenzfläche der Emulsion instabil, und die hydrophobe Wechselwirkung treibt das System zur spontanen Bildung von PS-PEG-Mizellen, die hydrophobe QDs einkapseln. Ein einfacher Indikator für die erfolgreiche Bildung von Micellen, die typischerweise in den Experimenten verwendet werden, ist die dramatische visuelle Umwandlung des Systems von einer milchigen Dispersion (Emulsion) in eine transparente (mizellare Nanokristalldispersion) dank der Nanometergröße (typischer Durchmesser 30–40 nm .). ) der Mizellen. In früheren Experimenten von Ruan und Winter zur Einkapselung von QDs in PS-PEG-Micellen unter Verwendung des Grenzflächeninstabilitätsprozesses wurde festgestellt, dass dieser Prozess zwar viele positive Eigenschaften aufwies, ein Hauptproblem jedoch der häufig beobachtete starke Verlust der QD-Fluoreszenz des Systems während der Herstellungs-/Lagerungsprozess und die Ursache für den Fluoreszenzverlust war unbekannt. Die Ziele der vorliegenden Arbeit sind zweierlei:Einerseits wollen wir den Fluoreszenzverlust von QD-verkapselten PS-PEG-Mizellen, die durch den Grenzflächeninstabilitätsprozess hergestellt werden, minimieren; Andererseits wollen wir durch den Technologieoptimierungsprozess und die Nutzung der Fluoreszenz von QDs als Reporter zur Verfolgung des Herstellungsprozesses von QD-haltigen Nanokompositmaterialien neue Erkenntnisse über den aufkommenden allgemeinen Prozess zur Herstellung von Nanokristall-verkapselten Micellen gewinnen , dh der Grenzflächeninstabilitätsprozess. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Emulsionströpfchengröße und das Tensid PVA eine Schlüsselrolle im Herstellungsprozess spielen:Jedes Emulsionströpfchen fungiert im Wesentlichen als „Mikroreaktor“, in dem Grenzflächeninstabilität und Selbstorganisations-„Reaktionen“ auftreten, wobei das Tensid PVA erforderlich für die Bildung der „Mikroreaktoren“; Die Verwendung einer großen „Mikroreaktor“-Größe (~25 μm) führt zu einem großen Anteil kolloidal instabiler Nanokristall-verkapselter PVA-Mizellen zusätzlich zu kolloidal stabilen Nanokristall-eingekapselten PS-PEG-Mizellen, während eine kleine „Mikroreaktor“-Größe (~ 3 μm oder kleiner, erzeugt durch Beschallung oder Elektrospray) führt nur zu kolloidal stabilen Nanokristall-eingekapselten PS-PEG-Mizellen.

Methoden

Materialien

Kern-Schale-CdSe/ZnS-Quantenpunkte (QDs, Emissionswellenlänge 600 nm, bedeckt mit Octadecylamin) wurden von Ocean Nanotech bezogen. Poly(styrol-b-ethylenglycol) (PS-PEG) und Poly(styrol-b-ethylenglycol) mit Carbonsäure-Endgruppen (PS-PEG-COOH) (PS 9,5 k Dalton, PEG 18,0 k Dalton) wurden von Polymer Source bezogen . Poly(vinylalkohol) (PVA) (Molekulargewicht 13–23 kg/mol, 87–89 % hydrolysiert) wurde von Sigma-Aldrich bezogen. Tat-Peptid (Sequenz YGRKKRRQRRR) und RGD-Peptid (Arg-Gly-Asp) wurden von ChinaPeptides bezogen. 1-Ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC) und Sulfo-NHS wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Alle anderen Chemikalien waren von Reagenzqualität. Das für alle Experimente verwendete Wasser wurde doppelt destilliert und durch ein Millipore Milli-Q-Reinigungssystem gereinigt.

Herstellung mizellarer Nanokristalle über den Grenzflächeninstabilitätsprozess

In einem typischen Verfahren wurde zuerst eine Ölphase durch Mischen von QDs (0,1 μM, 0,1 ml) und PS-PEG (10 mg/ml, 20 μl) in dem organischen Lösungsmittel Chloroform gebildet. Darauf folgte die Zugabe einer wässrigen Phase (0,6 ml Wasser mit 5 mg/ml PVA). Eine Öl-in-Wasser-Emulsion wurde entweder durch manuelles Schütteln (starkes Schütteln der Mischung mit der Hand für 1 Minute) oder Beschallen (Beschallen der Mischung in einem ShuMei KQ218-Bad-Sonicator für 30 s) gebildet. In einigen Experimenten wurde Elektrospray verwendet, um ultrafeine Emulsionströpfchen für den Grenzflächeninstabilitätsprozess zu erzeugen [35]. Die verschiedenen Behandlungen wurden verwendet, um Emulsionströpfchen mit unterschiedlichen Größen zu erzeugen, um die Auswirkungen der Tröpfchengröße zu untersuchen:Tröpfchen von ~25 μm (Durchmesser) wurden durch manuelles Schütteln gebildet, Tröpfchen von ~3 μm (Durchmesser) wurden durch Beschallung gebildet und einige Hundert Nanometer bis einige Mikrometer (im Durchmesser) Tröpfchen wurden durch Elektrospray gebildet. Die Emulsion wurde mit Reinstwasser (2,4 ml) um einen weiteren Faktor von vier verdünnt. Die Emulsion wurde in einem chemischen Abzug mit magnetischem Rühren bei 100 U/min belassen, um die Verdampfung des Chloroforms zu ermöglichen, was zur Bildung mizellarer QDs führte. Ein sichtbarer Übergang im Aussehen von einer milchigen Dispersion zu einer transparenten war ein Hinweis auf eine erfolgreiche Micellenbildung.

Bei Verwendung von Tetrahydrofuran (THF) als organisches Lösungsmittel wurde zunächst eine Ölphase durch Mischen von QDs (0,1 μM, 1 ml) und PS-PEG (10 mg/ml, 0,2 ml) in THF gebildet. Entionisiertes Wasser wurde tropfenweise zu der Lösung gegeben (1 Tropfen/20 s), bis der Wassergehalt 50 % erreichte v /v . Die Lösung wurde dann durch Votexing für 10–15 Minuten gemischt und dann 2 Tage lang gegen entionisiertes Wasser dialysiert, um THF zu entfernen (Molekulargewichtsgrenzwert 100.000 Dalton).

Wenn Elektrospray verwendet wurde, um Tröpfchen für den Grenzflächeninstabilitätsprozess zu erzeugen, wurde wie folgt vorgegangen [35]. Es wurde eine koaxiale Elektrospray-Konfiguration verwendet. Die innere Kapillarnadel war eine 27-Gauge-Kapillare (Außendurchmesser 500 μm; Innendurchmesser 300 μm) Edelstahlkapillare, und die Außennadel war ein 20-Gauge (Außendurchmesser 1000 μm; Innendurchmesser 500 μm) Edelstahl-Dreiwegeverbinder. Die Düsenspitze wurde 0,8 cm über einem geerdeten Stahlring und 10 cm über einer Glasauffangschale positioniert. Durch Mischen von QDs und PS-PEG wurde eine Ölphase gebildet und dann mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,6 ml/h unter Verwendung einer Spritzenpumpe (SPLab01, Shenzhen, China) in die innere Edelstahlkapillare gefördert. Die Konzentrationen von PS-PEG und QDs in der Ölphase betrugen 5 mg/ml bzw. 0,2 μM. Eine wässrige Phase wurde durch Auflösen von PVA in entionisiertem H₂ . hergestellt O bei 40 mg/ml. Die wässrige Lösung wurde unter Verwendung einer zweiten Spritzenpumpe (SPLab01, Shenzhen, China) mit einer Flussrate von 1,5 ml/h in den äußeren Ring der koaxialen Nadel abgegeben. Typischerweise wurde bei einer Spannung im Bereich von 6–7 kV ein konkaver Kegelstrahl (Taylor-Kegel) an der Spitze der Koaxialdüse beobachtet. Eine Glassammelschale mit 10 ml entionisiertem Wasser wurde unter die Düsenspitze gestellt, um Tröpfchen aufzufangen. Die Elektrospray-Zeit (nach der Bildung eines stabilen Taylor-Kegels) betrug in der Regel 30–90 Minuten. Anschließend erfolgte über Nacht eine weitere Verdampfung im Chemieabzug. Schließlich wurde die Dispersion in der Auffangschale aus Glas zur Charakterisierung in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen überführt.

Charakterisierungen der physikalischen Eigenschaften mizellarer QDs

Die Morphologie mizellarer QDs wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, JEOL JEM-2100 (HR)) charakterisiert, und alle mit TEM in der vorliegenden Arbeit untersuchten Proben wurden mit 1% Phosphorwolframsäure (PTA) negativ gefärbt. Die Partikelgröße wurde durch TEM oder dynamische Lichtstreuung (DLS) charakterisiert. Fluoreszenzspektren wurden mit einem Hitachi F-4600 Fluoreszenz-Spektrophotometer erhalten.

Zytotoxizität von Nanomaterialien

Die Zytotoxizitätsstudie wurde an drei gut charakterisierten menschlichen Krebszelllinien durchgeführt, nämlich A549 (alveoläres Basalepithel), MCF-7 (Brust) und HeLa (Zervix) Zellen (erworben von KeyGen Biotech, China). Die Zellen wurden mit kultiviertem DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum und Antibiotika (Penicillin/Streptomycin) in einem feuchten Inkubator (37 °C und 5 % CO₂ .) gehalten ). Für die Zytotoxizitätsbewertung wurden Zellen 24 h lang in 200 μl Medium auf 96-Well-Platten ausgesät. Anschließend wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an mizellaren QDs in frischem Kulturmedium bei 37 °C in 5 % CO₂ . inkubiert Atmosphäre. Nach 24 h Inkubation wurden die Kulturmedien mit dispergierten mizellaren QDs entfernt und der MTT-Assay wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers angewendet. Schließlich wurde die optische Extinktion in jeder Vertiefung bei 570 nm in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät gemessen.

Konjugation von QD-verkapselten PS-PEG-COOH-Mizellen mit Peptiden

PS-PEG-COOH-Mizellen wurden mit dem oben beschriebenen Grenzflächeninstabilitätsverfahren hergestellt, wobei PS-PEG-COOH-Moleküle anstelle von PS-PEG-Molekülen verwendet wurden. Die Konjugation mit Tat-Peptid oder RGD-Peptid wurde dann über das EDC/Sulfo-NHS-Verfahren durchgeführt. Zur Aktivierung der Carboxylgruppen der Micellen wurden 0,3 ml einer 0,1 M MES-Pufferlösung mit 2 mg/ml EDC und 5 mg/ml Sulfo-NHS zur Micellendispersion (3 ml) gegeben und ohne Rühren 30 min bei Raumtemperatur umgesetzt . Das zusätzliche EDC und Sulfo-NHS wurden dann unter Verwendung eines 30-kD-Ultrafiltrationsröhrchens entfernt (Zentrifugation bei 10 krpm für 5 Minuten) und die erhaltene Dispersion wurde in PBS (1 ml) resuspendiert. Anschließend wurden 50 μl Tat-Peptid (2 mg/ml in PBS) bzw. 50 μl RGD-Peptid (0,5 mg/ml in PBS) zugegeben und 12 h bei 4 °C umgesetzt. Die erhaltene peptidkonjugierte mizellare QD-Dispersion von PS-PEG wurde unter Verwendung eines 50-kD-Ultrafiltrationsröhrchens (Zentrifugation bei 10 krpm für 5 min) dreimal gereinigt, um die zusätzlichen Peptidmoleküle zu entfernen, und in PBS (1 ml) resuspendiert.

Live Cell Imaging

Die Bildgebung von lebenden Zellen wurde verwendet, um die zelluläre Internalisierung und den intrazellulären Transport von Tat-Peptid-konjugierten mizellaren PS-PEG-QDs zu untersuchen. HeLa-Zellen (erworben von KeyGen Biotech, China) wurden auf Gewebekulturplatten mit Glasboden bei einer anfänglichen Konfluenz von 20 % ausgesät (Aussaatdichte 1 × 10 ⁵ Zellen/ml) in 600 μl Medium (DMEM + 10 % fetales Rinderserum) und wurden 40 h in 5 % CO₂ . kultiviert bei 37 °C. Tat-Peptid-konjugierte mizellare PS-PEG-QDs (10 nM QDs in Zellkulturmedium) wurden dann zugegeben. Nach einer Inkubation mit den mizellaren QDs für 1 h wurden die Zellen zweimal mit frischem Kulturmedium gewaschen, um freie mizellare QDs zu entfernen (der Waschschritt wurde durchgeführt, damit der Startzeitpunkt des intrazellulären Transports der internalisierten mizellaren QDs ungefähr der gleich für alle hinzugefügten Nanopartikel). Nach 6 h wurde jede Zellplatte mit einem Live-Cell-Imaging-System abgebildet, das aus einer Zellinkubationskammer (IX3W, Tokai Hit), einem Epi-Fluoreszenzmikroskop (IX-83, Olympus, mit Halogenlampe als Lichtquelle) besteht ), ein konfokales System mit rotierender Scheibe (Andor) und eine ladungsgekoppelte Elektronenvervielfacher(EMCCD)-Kamera (Evolve 512, Photometrics). Das hier verwendete konfokale Bildgebungssystem für lebende Zellen ermöglicht eine konfokale Bildgebung von lebenden Zellen, die auf dem Mikroskoptisch kultiviert wurden, mit einer rotierenden Scheibe, was besonders nützlich ist, um den zellulären Transportprozess zu untersuchen. Indem die lebenden Zellen auf dem Mikroskoptisch kultiviert werden, könnte sichergestellt werden, dass der natürliche biologische Prozess mit minimalen Störungen überwacht wird. Um den Zellkern gegenzufärben, wurde direkt vor der Bildgebung (zu einem bestimmten Zeitpunkt des Zelltransports) der Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342 (5 μM in Zellkulturmedium) mit lebenden Zellen für 20 Minuten inkubiert.

Die Bildgebung von lebenden Zellen wurde auch angewendet, um die spezifische Bindung von RGD-Peptid-konjugierten mizellaren PS-PEG-QDs mit α _{v . zu untersuchen} β₃ -Integrinmoleküle mit einem α _v β₃ -integrin überexprimierte Zelllinie (U87 MG-Zellen, bezogen von KeyGen Biotech, China) im Vergleich zu einer Zelllinie ohne α _v β₃ -Integrin-Überexpression (MCF-7-Zellen, bezogen von KeyGen Biotech, China). Das obige zelluläre Bildgebungsprotokoll, das für Tat-Peptid-konjugierte mizellare PS-PEG-QDs verwendet wurde, wurde übernommen, wobei die Hauptänderung darin bestand, dass die für RGD-Peptid-konjugierte mizellare QDs verwendete Konzentration 100 nM (QDs in Zellkulturmedium) betrug.

Ergebnisse und Diskussion

Wir und andere haben kürzlich die Grenzflächeninstabilitätsmethode eingeführt, um Nanokristalle zu verkapseln, um zusammengesetzte Nanopartikel für biologische Anwendungen zu bilden. Wir stießen jedoch häufig auf nicht reproduzierbare und manchmal widersprüchliche Ergebnisse zur Fluoreszenzintensität von QDs (QDs wurden hier als Modell für Nanokristalle verwendet). Dieses Problem muss für die Übersetzung in die Industrie und die Klinik angegangen werden. Viele Faktoren (z. B. Lösungsmittel, Polymer, Temperatur, Größe des „Mikroreaktors“), die während des gesamten Herstellungsprozesses involviert sind, können zu Fluoreszenzverlust und nicht reproduzierbaren Ergebnissen führen. Wir haben die verschiedenen beteiligten Faktoren untersucht und festgestellt, dass die Größe des „Mikroreaktors“ (Emulsionströpfchen) in dieser Hinsicht ein Schlüsselfaktor ist, wobei der Einsatz von Tensid PVA ein eng verwandter Faktor ist. Im Folgenden beschreiben wir hauptsächlich die Ergebnisse zu den Auswirkungen der Emulsionströpfchengröße sowie des Tensids PVA.

Wir verglichen die Auswirkungen von zwei verschiedenen Emulgierungsmethoden mit stark unterschiedlichen mechanischen Stärken, nämlich manuelles Schütteln (starkes manuelles Schütteln der Mischung) und Badbeschallung (Beschallen der Mischung in einem Badbeschallungsgerät). Wir fanden heraus, dass beide Methoden nach dem Verdampfen des organischen Lösungsmittels schließlich zu transparenten und homogenen Dispersionen führen könnten, was auf eine erfolgreiche Nanokristall-verkapselte Micellenbildung hinweist (Abb. 1b, c, unten). Da ein transparentes und homogenes visuelles Erscheinungsbild häufig als einfacher und praktischer Indikator für eine erfolgreiche Micellenbildung im auf Grenzflächeninstabilität basierenden Herstellungsprozess verwendet wird, wurde der potenzielle Einfluss verschiedener Emulgierungsmethoden auf das Micellenprodukt bisher übersehen. Wir verwendeten Lichtmikroskopie, um die Größe der Emulsionströpfchen zu untersuchen, die durch diese beiden verschiedenen Emulgierungsmethoden erzeugt wurden, und stellten fest, dass die manuelle Schüttelmethode zu Tröpfchen von ~25 μm (im Durchmesser) führte, während die Beschallungsmethode zu ~3 μm führte ( im Durchmesser) (Abb. 1b, c, oben). Ungefähr die Größen von 500 Tröpfchen wurden für jede Probe unter Verwendung von Lichtmikroskopiebildern gemessen, um die durchschnittliche Größe und Größenverteilung zu erhalten. Statistische Analyse (Schüler t Test) zeigt, dass der Unterschied zwischen der durchschnittlichen Tröpfchengröße durch manuelles Schütteln (~25 μm) und der durch Beschallung (~3 μm) statistisch signifikant war (P < 0,001). Wichtig ist, dass wir auch Kontrollexperimente durchgeführt haben, um zu bestätigen, dass diese beiden unterschiedlichen Emulgierungsmethoden konsistent Emulsionströpfchengrößen in den oben genannten zwei unterschiedlichen Größenbereichen erzeugen:manuelles Schütteln mit mehreren unterschiedlichen Zeitdauern (0,5, 1, 2 und 3 Minuten) führte alle dazu. in ~25 μm Emulsionströpfchen (mit ähnlicher Größenverteilung) und Badbeschallung mit mehreren unterschiedlichen Zeitdauern (0,5, 1 und 2 min) ergaben alle ~3 μm Emulsionströpfchen (mit ähnlicher Größenverteilung, zusätzliche Datei 1:Abbildung S1) .

Visuelle Beobachtung der Emulsionströpfchen und der resultierenden QD-eingekapselten Micellen nach Verdampfung des organischen Lösungsmittels. a Es wurde kein PVA verwendet. Es wurden wenige bis keine Emulsionströpfchen gebildet (oberes Bild ); Beim Entfernen des organischen Lösungsmittels wurden wenige bis keine QD-verkapselten Micellen gebildet (unteres Bild , der Einschub zeigt ein entsprechendes Fluoreszenzbild mit einer tragbaren UV-Lampe zur Anregung des roten QD-Fluoreszenz). b Zur Bildung von Emulsionströpfchen wurde manuelles Schütteln verwendet. ~25 μm große Emulsionströpfchen wurden gebildet (oberes Bild , der Einschub zeigt das Ergebnis der Tröpfchengrößenmessung aus der Bildanalyse von 500 Tröpfchen). Außerdem wurde festgestellt, dass die Größenvariation aufgrund unterschiedlicher Schüttelzeiten minimal ist (Abb. S1). Beim Entfernen des organischen Lösungsmittels wurde eine transparente und homogene Dispersion gebildet, was auf die erfolgreiche Bildung von Nanokristall-verkapselten Micellen hinweist (unteres Bild , der Einschub zeigt ein entsprechendes Fluoreszenzbild mit einer tragbaren UV-Lampe zur Anregung des roten QD-Fluoreszenz). c Zur Bildung von Emulsionströpfchen wurde eine Badbeschallung verwendet. ~3 μm große Emulsionströpfchen wurden gebildet (oberes Bild , der Einschub zeigt das Ergebnis der Tröpfchengrößenmessung aus der Bildanalyse von 500 Tröpfchen). Auch die Größenvariation aufgrund unterschiedlicher Schüttelzeiten erwies sich als minimal (Abb. S1). Nach Entfernung des organischen Lösungsmittels bildete sich eine transparente und homogene Dispersion, was auf die erfolgreiche Bildung von Nanokristall-verkapselten Micellen hinweist (unteres Bild , der Einschub zeigt ein entsprechendes Fluoreszenzbild mit einer tragbaren UV-Lampe zur Anregung des roten QD-Fluoreszenz). Um die Größe der Emulsionströpfchen einer bestimmten Probe zu analysieren, wurde zunächst eine lichtmikroskopische Aufnahme der Emulsionströpfchen gemacht und anschließend die Durchmesser von ~500 Tröpfchen mit der kostenlosen Software ImageJ gemessen, um die durchschnittliche Größe und Größenverteilung von . zu erhalten die Emulsionströpfchen der Probe

Darüber hinaus führten wir auch eine Emulgierungsbehandlung in Abwesenheit des Tensids PVA durch und stellten fest, dass praktisch keine Emulsionströpfchen erfolgreich gebildet wurden, gemessen am Lichtmikroskopie-Ergebnis (Abb. 1a, oben) und praktisch keine Micellen erfolgreich gebildet wurden, beurteilt nach die Beobachtung einer nahezu vollständigen Phasentrennung (QD-Fällung) im Endprodukt, dh keine Bildung von Micellenprodukt (Abb. 1a, unten). Die Ergebnisse von Abb. 1a legen nahe, dass das Tensid PVA im Grenzflächeninstabilitätsprozess für die erfolgreiche Bildung von Emulsionströpfchen (als „Mikroreaktoren“) und von Mizellen (als Endprodukte) erforderlich ist. Dies ist nicht trivial, da es nahelegt, dass PS-PEG zwar ebenfalls amphiphiler Natur ist, die Anwesenheit von PS-PEG allein (ohne die Anwesenheit von PVA) im System jedoch nicht die für den Grenzflächeninstabilitätsprozess benötigten Emulsionströpfchen liefern kann.

Obwohl die Produktdispersionen gleich nach ihrer Bildung transparent und homogen erschienen (TEM- und DLS-Charakterisierungsergebnisse zeigten sphärische und monodisperse QD-verkapselte Micellen, zusätzliche Datei 2:Abbildung S2), ist der Unterschied in den Emulsionströpfchengrößen durch die beiden oben genannten unterschiedlichen Emulgierungsmethoden, nämlich manuelles Schütteln und Beschallen, führten zu großen Unterschieden bei den mizellaren Nanokristallprodukten. Wir haben die Änderung der Fluoreszenzintensität der mizellaren QDs (QD-verkapselte Mizellen), die durch manuelles Schütteln bzw. Beschallen gebildet wurden, über einen Zeitraum von 40 Tagen bei 4 °C gemessen und verfolgt. Wir fanden heraus, dass für die Mizellen QDs durch manuelles Schütteln gebildet wurden (für 1 min, gebildet aus ~25 μm Emulsionströpfchen), obwohl die Fluoreszenzintensität (gemessen durch Fluoreszenzspektroskopie) während des Mizellenbildungsprozesses im Laufe der Zeit (~10 Tage) nahm die Fluoreszenzintensität der mizellaren QDs allmählich auf nur noch etwa 50 % der ursprünglichen Fluoreszenzintensität ab und blieb danach konstant (Abb. 2a). Im Gegensatz dazu behielten die mizellaren QDs, die durch Beschallung (für 30 s, gebildet aus ~3 μm Emulsionströpfchen) gebildet wurden, die Fluoreszenzintensität (gemessen durch Fluoreszenzspektroskopie) über den gesamten Zeitraum weitgehend bei (Abb. 2a). Darüber hinaus beobachteten wir mit bloßem Auge den unteren Teil der mizellaren QD-Dispersionen, die durch manuelles Schütteln bzw. Beschallen gebildet wurden, nachdem die Proben 10 Tage bei 4 °C stehen gelassen wurden. Im unteren Teil der mizellaren QD-Dispersionen, die durch manuelles Schütteln (für 1 min) nach 10 Tagen Lagerung gebildet wurden, wurde mit bloßem Auge ein sichtbarer Niederschlag beobachtet (Abb. 2a, Einschub). Im Gegensatz dazu wurde im unteren Teil der mizellaren QD-Dispersionen, die durch Beschallung (für 30 s) nach 10 Tagen Lagerung gebildet wurden, mit bloßem Auge kein sichtbarer Niederschlag beobachtet (Abb. 2a, Einschub). Diese Ergebnisse legen nahe, dass, obwohl beide Emulgierungsmethoden zu einer erfolgreichen Bildung von QD-eingekapselten Micellen mit ähnlicher Verkapselungseffizienz führen könnten, ein großer Teil der QD-eingekapselten Micellen durch größere Emulsionströpfchen gebildet wird (~25 μm, hergestellt durch manuelles Schütteln für 1 min ) war kolloidal instabil und führte im Laufe der Zeit zu Ausfällungen und damit zu einem Fluoreszenzverlust aus der Dispersion, während alle QD-verkapselten Micellen, die durch kleinere Emulsionströpfchen (~3 μm, durch Beschallung für 30 s im Bad erzeugt) gebildet wurden, kolloidal stabil waren und somit erhalten blieben Fluoreszenz über einen langen Zeitraum (TEM-Untersuchung der Dispersion nach 10-tägiger Lagerung zeigte auch eine gut erhaltene Morphologie der mizellaren Nanokristalle, wie in Zusatzdatei 3 gezeigt:Abbildung S3). Darüber hinaus fanden wir, dass die Fluoreszenzintensität drastisch reduziert wurde, wenn die Beschallungszeit von 30 s auf 1 und 2 min erhöht wurde, um Emulsionströpfchen zu bilden, obwohl die QD-verkapselten Micellen für die verschiedenen Zeiträume kolloidal stabil waren Dauer der Beschallungsbehandlung, beurteilt nach der stabilen Fluoreszenzintensität während der gesamten Lagerzeit (Abb. 2b). Der in Abb. 2b gezeigte Fluoreszenzverlust wurde wahrscheinlich durch die Erzeugung von Oberflächendefekten auf QDs durch die starke und längere mechanische Behandlung verursacht. In einem Kontrollexperiment wurde auch festgestellt, dass die Fluoreszenzintensität von hydrophoben QDs, die in Chloroform gelöst sind, unter Ultraschallbehandlung mit längerer Beschallungszeit allmählich abnimmt (Zusatzdatei 4:Abbildung S4), was diese vermutete Ursache des Fluoreszenzverlusts unterstützt. Abb. 2a, b zeigen zusammen die beiden Hauptmechanismen des Fluoreszenzverlusts im QD-verkapselten Micellensystem, das durch den Grenzflächeninstabilitätsprozess hergestellt wird, nämlich kolloidal instabile QD-verkapselte Micellen und durch mechanische Behandlung erzeugte QD-Oberflächendefekte.

Fluoreszenzstabilität von QD-verkapselten Micellen, die durch den Grenzflächeninstabilitätsprozess hergestellt wurden. a Änderung der Fluoreszenzintensität (gemessen durch Fluoreszenzspektroskopie) im Zeitverlauf für QD-verkapselte Micellen, wobei die Emulsionströpfchen entweder durch manuelles Schütteln (für 1 min, dh ~25 μm-Tröpfchen) oder Beschallung (für 30 s, dh ~3 .) gebildet werden μm Tröpfchen). Die Einsätze sind Bilder der QD-verkapselten Micellendispersionen nach 10 Tagen Lagerung bei 4 °C, wobei die Emulsionströpfchen entweder durch manuelles Schütteln (für 1 min, dh ~25 μm-Tröpfchen) oder Beschallung (für 30 s, dh ~3 .) gebildet wurden μm Tröpfchen). Panel a weist darauf hin, dass eine Ursache für den Verlust der Fluoreszenz von QD-eingekapselten Micellen die Anwesenheit von kolloidal instabilen QD-eingekapselten Micellen ist. b Änderung der Fluoreszenzintensität (gemessen durch Fluoreszenzspektroskopie) im Zeitverlauf für QD-verkapselte Micellen mit den durch Beschallung gebildeten Emulsionströpfchen (d. h. Tröpfchen von ~3 μm) für drei verschiedene Dauer der Beschallungsbehandlung. Panel b weist darauf hin, dass eine Ursache für den Verlust der Fluoreszenz von QD-eingekapselten Micellen QD-Oberflächendefekte sind, die durch starke und längere mechanische Behandlung erzeugt werden

Von diesen beiden Mechanismen des Fluoreszenzverlusts war zwar bekannt, dass der QD-Fluoreszenzverlust durch eine Beschädigung der QD-Oberfläche verursacht werden kann, das Ergebnis, dass ein Teil der Micellen kolloidal instabil ist, überraschte uns jedoch. Daher führten wir weitere Studien zu diesem speziellen Mechanismus durch. Wir stellten zunächst die Frage, ob die oben erwähnten präzipitierten QDs tatsächlich in Micellen (oder micellenähnlichen Anordnungsstrukturen) eingekapselt sind oder nicht. Wir fanden heraus, dass ein einfaches Schütteln der Dispersion mit diesen Niederschlägen dazu führen kann, dass die Fluoreszenzintensität der Dispersion auf das ursprüngliche Niveau zurückkehrt (Abb. 3a, links); Im Gegensatz dazu zeigte eine Kontrollstudie mit derselben Behandlung für hydrophobe QDs, die in Wasser ausgefällt wurden, keinen solchen Anstieg der Fluoreszenzintensität (Abb. 3a, rechts). Darüber hinaus zeigten Transmissionselektronenmikroskopie-(TEM-)Bilder des unteren Teils der Produktproben, die durch manuelles Schütteln nach 10 Tagen Lagerung gebildet wurden, eine große Anzahl von QDs, die in großen sphärischen und nicht-sphärischen Strukturen gruppiert waren (Abb. 3b, links); Im Gegensatz dazu zeigten die entsprechenden TEM-Bilder im unteren Teil der Produktproben, die durch Beschallung nach 10 Tagen Lagerung gebildet wurden, nur eine kleine Anzahl von QDs, die in einer kugelförmigen Struktur gruppiert waren (Abb. 3b, Mitte). Diese Ergebnisse zeigen somit, dass die präzipitierten QDs tatsächlich in Micellen oder mizellähnlichen Anordnungsstrukturen eingekapselt waren, d. h. diese QDs waren keine nackten hydrophoben QDs. Wir stellten dann die Frage, was die chemische Natur dieser kolloidal instabilen Micellen (oder micellenähnlichen Anordnungsstrukturen) ist. Da eine PS-PEG-Mizelle kolloidal stabil sein sollte, stellten wir die Hypothese auf, dass die instabilen Micellen (oder mizellenähnlichen Anordnungsstrukturen) durch das Tensid PVA gebildet wurden. Diese Hypothese wird durch die folgenden zwei experimentellen Beweise gestützt. Zunächst fanden wir heraus, dass die Verwendung von PVA ohne PS-PEG im Grenzflächeninstabilitätsprozess tatsächlich zu Micellen führen könnte, die QDs einkapseln (Abb. 3b, rechts). Zweitens führten wir zum Vergleich Dialyseexperimente mit mizellaren PS-PEG-QDs bzw. mizellaren PVA-QDs durch. Nach der Dialysebehandlung (wobei der Molekulargewichtsgrenzwert des Dialysebeutels 200 kD beträgt, was größer ist als die Molekulargewichte von PVA und PS-PEG) gegen reines Wasser blieben die mizellaren QDs von PS-PEG kolloidal stabil, wenn man davon ausgeht, dass die QD-Fluoreszenz blieb in der Dispersion homogen (Abb. 3c, links). Im krassen Gegensatz dazu führte die mizellare QD-Dispersion von PVA nach nahezu identischer Dialysebehandlung wie oben zu deutlich sichtbaren fluoreszierenden Aggregaten (Abb. 3c, rechts). As the dialysis experiment could be considered as mimicking the dilution treatment that micelle-based nanomaterials would encounter once introduced to an in vivo environment, our dialysis experimental results indicate that the QD-encapsulated PVA micelles would become colloidally unstable in vivo. Therefore, the results shown in Fig. 3c suggest that the fluorescence loss from using large emulsion droplets (~25 μm, produced by manual shaking) is caused by colloidally unstable PVA micelles (or other micelle-like assembly structures) encapsulating QDs.

Examining the colloidally unstable part of the micellar QDs. a Links , the disappearance of fluorescence of the colloidally unstable part of the micellar QDs from the dispersion after 10-day storage could be resumed after the dispersion was shaken. Richtig , the fluorescence of hydrophobic QDs was not detected in water because they could not be dispersed in water. b Links and middle are the TEM images of the bottom portions of the micellar QD dispersions formed from manual shaking for 1 min (i.e., ~25 μm emulsion droplets) and sonication for 30 s (~3 μm emulsion droplets), respectively, after 10-day storage. Richtig , TEM image of PVA micellar QDs. c Dialysis (against water) treatment on PS-PEG micellar QDs (left ) and PVA micellar QDs (right ), respectively. A hand-held UV lamp was used to excite the red QD fluorescence

Further, we conducted two additional experiments to confirm the roles of emulsion droplet size and the surfactant PVA. In the first experiment, we used a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF) instead of the water immiscible organic solvent chloroform. In this case, the “emulsion droplet” size could be considered as zero, and the surfactant PVA was not used because it was not needed to facilitate the mixing of oil phase with water phase. It was found that the fabrication process produced QD-encapsulated micelles with stable fluorescence (Fig. 4a), which is consistent with the result that small emulsion droplets lead to colloidally stable QD-encapsulated micelles and stable fluorescence. In addition, it was observed that the micelles formed by this process (with THF, without PVA) had large size distribution and some of the formed micelles even had non-spherical shapes (Fig. 4b). This indicates that “zero droplet size” could lead to poorly controlled micelle size and shape (although the formed micelles are colloidally stable). Thus, the results of the “zero emulsion droplet size” experiment (with the water-miscible THF as the organic solvent), on the one hand, are consistent with the finding that smaller emulsion droplets lead to colloidally stable micellar nanocrystals (judging by the stable fluorescence given by “zero-sized emulsion droplets”), and on the other hand, indicate the advantage of having an emulsion droplet (with non-zero droplet size) compared with no emulsion droplet at all (“zero-droplet size”, which gives poor micelle morphology). In the second experiment, we used electrospray, which is known to give ultrafine and uniform droplets with the typical droplet size range being a few hundred nanometers to a few micrometers (smaller than what the sonication treatment generates), as the method to produce emulsion droplets (PVA was used in this case) [35,36,37,38,39]. It was found that this method led to micellar QDs with stable fluorescence and well-controlled micelle size and shape (Fig. 4c, d). It should be mentioned that electrospray typically can only produce droplet sizes smaller than what the sonication treatment gives (i.e., a few hundred nanometers to a few micrometers). Thus, to study the effect of larger emulsion droplet size, in this work, we used another mechanical treatment method, i.e., manual shaking, to give larger droplets (~25 μm). The actual size of electrospray-generated droplets is difficult to be obtained by direct imaging (for example, the size of electrospray-generated oil-in-water emulsion droplets would change greatly upon entering the large volume of water phase in the collection container due to aggregation and fusion, and the typical sub-micrometer size of electrospray-generated droplets is approaching the diffraction limit of optical microscopy), but could be theoretically calculated or experimentally measured by methods that characterize aerodynamic mobility as done previously in the literature.

Using additional methods to form small emulsion droplets to confirm the importance of droplet size. a , b Using water-miscible THF as the oil phase solvent (without using PVA) led to micellar QDs with stable fluorescence (a ) and irregular micelle shapes (b ). c , d Using electrospray (with PVA) to form droplets led to micellar QDs with stable fluorescence (c ) and regular micelle shape (d )

Figure 5 presents a schematic to summarize our results and insights on the roles of emulsion droplets and the surfactant PVA in the interfacial instability-based fabrication process of nanocrystals-encapsulated micelles (with QDs as the model for nanocrystals). Each oil-in-water emulsion droplet serves as a “micro-reactor” for the interfacial instability-mediated self-assembly “reaction.” When no PVA (surfactant) is used, emulsion droplet does not form, and thus, no micelle is formed. When the emulsion droplet is large in size (~25 μm), only a part of the QDs (approximately 50%, based on the remaining fluorescence intensity in the dispersion after 10-day storage, Fig. 2a) in the droplet get encapsulated in PS-PEG (an amphiphilic block copolymer) micelles, which are colloidally stable, while the other part of the QDs get encapsulated in PVA (also an amphiphilic polymer, but not a block copolymer) micelles, which are colloidally unstable. When the emulsion droplet is small in size (~3 μm or smaller), nearly all QDs (based on the remaining fluorescence intensity in the dispersion after 10-day storage, combined with comparison of fluorescent intensity with hydrophobic QDs undergoing similar mechanical treatment, Fig. 2a, Fig. 4a, c, and Additional file 4:Fig. S4) in the droplet get encapsulated in stable PS-PEG micelles. Thus, the roles of emulsion droplets and the surfactant PVA in the interfacial instability-based fabrication process of nanocrystal-encapsulated micelles are intricate and intertwined, particularly in the context of biological applications:the surfactant PVA is required for successful formation of emulsion droplets and micelle products, and yet it is also responsible for formation of the colloidally unstable part of nanocrystal-encapsulated micelles, which would be detrimental in a number of biological applications; and the key to avoid the colloidally unstable nanocrystal-encapsulated PVA micelles is to use emulsion droplets small in size (~3 μm or smaller).

Roles of emulsion droplet size and surfactant in the interfacial instability-based fabrication of micellar nanocrystals

In addition, it should be mentioned that, for a well-dispersed oil-in-water emulsion to form, a surfactant is often required to lower the surface tension between the oil phase and water phase, and PVA was selected here as the surfactant because it was applied in nearly all the previous works on using the interfacial instability method to fabricate micelles [25, 26, 33,34,35]. We cannot rule out the possibility that other surfactants could give different results. Examining the effects of different types of surfactant would be part of the future studies.

Finally, we performed proof-of-concept biological experiments using live cells to demonstrate that our micellar nanocrystal products (with the emulsion droplets formed from sonication treatment for 30 s) are (1) fairly biocompatible, (2) can be functionalized with biological molecules, (3) can be introduced into live cells, and (4) if conjugated with biological targeting molecules, can bind with specific biological targets (Fig. 6). Cytotoxicity studies by MTT assay showed that the QD-encapsulated PS-PEG micelles had fairly low cytotoxicity in three different cell lines compared with the negative control (cultured cells in the absence of nanomaterials added, i.e., concentration being zero) (Fig. 6a). To bio-functionalize QD-encapsulated PS-PEG micelles, in the micelle fabrication process the PS-PEG molecules were replaced with PS-PEG-COOH molecules, the latter of which could then be conjugated with a wide spectrum of biomolecules (e.g., peptides, nucleic acids, and antibodies) via well-established bioconjugation methods. To show that QD-encapsulated PS-PEG micelles can be introduced into live cells, the micelles were conjugated with Tat peptide, which is derived from HIV virus and is known to be able to introduce a variety of nanomaterials into live cells with high efficiency and low toxicity [40,41,42]. The thus-formed Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs were then incubated with HeLa cells, and live cell confocal imaging was conducted to study the cellular transport of the fluorescent nanomaterials. The live cell confocal imaging system used here permits spinning-disk confocal imaging of live cells cultured on the microscope stage, ensuring that the natural transport process is followed with minimal disturbance. HeLa cells were selected here because this cell line was used in the first tracking study of the cellular transport of Tat peptide-conjugated QDs by Ruan et al. [42]. It was found that, 6 h after the first contact of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs with the cells, many of the Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs had been internalized by the cells, judging by the composite confocal images to show the positions of QDs, cell nucleus and cell periphery, and the cellular uptake level was much higher than that without the assistance of Tat peptide (Fig. 6b). Imaging of the change of QD distribution at different time points of cellular transport for the Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs indicated that, after entering the cells, they were gradually accumulated at a perinuclear region (Additional file 5:Fig. S5). Additional file 6:video 1 shows a three-dimensional reconstructured image of the distribution of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs in the cell at the time point of 24 h, which further confirms cellular internalization and perinuclear accumulation. The behavior of the cellular transport of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs is consistent with that of Tat peptide-conjugated QDs previously reported in the literature [42]. Further, to show that QD-encapsulated PS-PEG micelles can be modified (bio-functionalized) to bind with specific biological targets via ligand-receptor binding, the micelles were conjugated with RGD peptide, which is known to specifically recognize integrins on cell surface [43]. Fluorescent microscopy imaging results indicated that RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs could bind with α _v β₃ -integrin over-expressed cells (U87MG cell line, a human glioblastoma cell line, Fig. 6c, right), judging by the significant QD fluorescence on or in the cells. In contrast, the two control experiments, one of which used RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs to incubate with MCF cells (without α _v β₃ -integrin over-expression, Fig. 6c, left) and the other of which used PS-PEG-COOH micellar QDs (without RGD peptide conjugation) to incubate with U87MG cells (Fig. 6c, middle), showed little to no QD fluorescence on or in the cells. Thus, these results demonstrated the ability of RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs to specifically bind with α _v β₃ -integrin molecules.

Interactions of PS-PEG micellar QDs (prepared by using sonication 30 s in the interfacial instability method) with biological cells. a PS-PEG micellar QDs were fairly biocompatible judging from the MTT cytotoxicity assay results. The concentrations were based on the amounts of QDs used. b Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs can be internalized by live cells. c RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs can specifically recognize and bind with the α _v β₃ -integrin molecules over-expressed on U87MG cells (right image ). In comparison, in the absence of α _v β₃ -integrin over-expression (MCF-7 cells, left image ) or Tat peptide (PS-PEG-COOH micellar QDs, middle image ), no significant binding (QD fluorescence) was observed. The red fluorescence was from QDs. The cell nucleus was stained by the blue fluorescent dye Hoechst 33342. Cell periphery is shown by white line (from the corresponding bright field microscopy images)

Conclusions

In conclusion, we have used QDs as the model nanocrystals to follow the interfacial instability process, an emerging general method to fabricate nanocrystal-encapsulated micelles. Our results reveal the key roles of emulsion droplet size and the surfactant PVA in the interfacial instability process. These results not only help to optimize the quality of nanocrystal-encapsulated micelles for biological applications such as biological detection, imaging and therapy, but offer helpful new knowledge on the interfacial instability process in particular and self-assembly in general.

Abkürzungen

EDC:

1-Ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride

PS-PEG:

Poly (styrene-b-ethylene glycol)

PS-PEG-COOH:

Carboxylic acid terminated poly (styrene-b-ethylene glycol)

PTA:

Phosphotungstic acid

PVA:

Poly (vinyl alcohol)

QD:

Quantum dot

SPION:

Superparamagnetic iron oxide nanoparticle

TEM:

Transmission electron microscopy

THF:

Tetrahydrofuran