Wirksames, immunstimulierendes, biokompatibles Antitumor-Nanohydrogel aus DNA

Einführung

Bakterielle DNA, die unmethylierte CpG-Motive enthält, sind äußerst vielversprechende Impfstoff-Adjuvantien, Antiallergene und Immunschutz- und Antikrebsmittel [1]; es könnte von Rezeptoren auf endosomalen inneren Zellen des Immunsystems erkannt werden, wie dendritischen Zellen (DC), Makrophagen, T-Zellen, natürlichen Killerzellen (NK) und NKT-Zellen [2]. Diese angeborenen Immunzellen sind in der Lage, auf unmethylierte CpG-Motive zu reagieren, indem sie pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) auf pathogen-spezifische Moleküle im pathogenen Mikroorganismus erkennen. Es wurde bestätigt, dass CpG-Oligonukleotid (CpG-ODN) vom Toll-like-Rezeptor 9 (TLR9) erkannt werden konnte [3] und eine Immunantwort vom Th1-Typ über den Myd88-abhängigen Signalweg induzierte [4]. Diese Nachteile von CpG-ODN behinderten jedoch seine klinische Anwendung aufgrund seiner vorzeitigen Reifung durch Proteinadsorption, Verdauung durch Endonukleasen im Serum [5] und Instabilität in vivo. Es wird erwartet, dass diese Probleme gelöst werden, indem einzelsträngige (ss) Nukleinsäuren in einen Transportträger eingekapselt werden oder sie sich selbst zu einer Nanostruktur zusammenbauen, die ihre Stabilität in vivo sowie ein effizienteres Internalisierungsverhältnis zu Zellen des angeborenen Immunsystems verbessert. Derzeit werden verschiedene Träger wie kationische Polymerpolyethylenimine (PEI) [6], Liposomen [7, 8] und Mikropartikel [9] zur Abgabe von CpG-ODN verwendet; Es gibt noch einige Nachteile, die noch verbessert werden müssen, z. B. Zytotoxizität, begrenzte Belastungsrate usw.

DNA-Materialien, die aus Nukleinsäuren bestehen, weisen ein großes Potenzial auf, als Träger zur Abgabe von CpG-ODN verwendet zu werden. Im Vergleich zu ssDNA weisen DNA-Materialien mit zweidimensionaler oder dreidimensionaler Struktur andere Eigenschaften auf, wie z. B. leichte Penetration von Zellmembranen und Stimulation von Makrophagen zur Sekretion von Zytokinen [10]. X-förmige DNA wurde verwendet, um CpG-Motive zu liefern und die immunstimulatorische Aktivität von CpG-ODN durch erhöhte zelluläre Aufnahme erfolgreich zu erhöhen, während die erhöhte zelluläre Aufnahme teilweise auf die X-förmige Struktur zurückzuführen ist [11]. In ähnlicher Weise wurde ein dreidimensionales DNA-Tetraeder, das sich selbst zu Nanostrukturen mit einheitlicher Größe anordnen kann, nicht-invasiv und effizient in RAW264.7-Zellen eingebracht, um zu funktionieren. Darüber hinaus erwiesen sich solche Tetraeder gemäß der Forschung als mechanisch stabil und nicht zytotoxisch [12]. Kürzlich wurde gezeigt, dass CpG-RCA-Hydrogel (CpG-RCA-Gel) mit einer durch Rolling-Circle-Amplifikation (RCA) hergestellten Nanoblumenstruktur in der Lage ist, immunstimulierende Signale zu liefern, Nukleaseabbau zu widerstehen, die Sekretion von Immunzytokinen zu erhöhen und hemmen die Proliferation von menschlichen akuten lymphatischen Leukämie-T-Lymphozyten (CCRF-CEM)-Zellen [13]. Diese obigen Ergebnisse legten nahe, dass die Form und Struktur von DNA-Materialien eine wichtige Rolle bei der Verbesserung der zellulären Aufnahme und der Erhöhung der Immunstimulationseffizienz spielten. Da CCRF-CEM-Zellen aus menschlicher T-Lymphoblasten-Leukämie, einer Art hämatologischer Malignität, stammen, unterschied sie sich von einem hämatologischen malignen Tumor; solide Tumoren umgeben oft von einer immunsuppressiven Mikroumgebung, die eine gültige Anti-Tumor-Immunität behindern kann [14]. Dafür konstruierten wir ein DNA-Immunstimulans, das viel mehr Kopien von CpG-ODN durch Multi-Primed-Chain-Amplifikation (MCA) [15] anstelle von RCA [16] enthält. Unter Ausnutzung des Prinzips der komplementären Basenpaarung wurden ein CpG-involvierter Primer und eine speziell entworfene Matrizensequenz mit Ligase vermischt und durch phi29-Polymerase in Gegenwart von freien dNTPs verlängert. RCA (R) oder MCA (M) reagierten x oder y Stunden, die separat als Rx oder My dargestellt werden (Abb. 1); die Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese identifiziert (Abb. 2a). Basierend auf der MCA-Reaktion nannten wir die erhaltenen Produkte CpG-MCA-Hydrogele (CpG-MCA-Gele), die aufgrund der starken Zunahme der CpG-Motivkopien Hunderte oder Tausende von Tandem-CpGs besitzen. CpG-MCA-Gele waren auch ein wirksames Immunstimulans, das die Sekretion von Zytokinen aus RAW264.7-Zellen signifikant erhöhte und die Proliferation von menschlichen Gliom-U251-Zelllinien effektiv hemmte. Wir erwarteten, dass diese Studie zu einem neuartigen Nanohydrogel-Immunstimulans auf der Basis von DNA-Materialien führt und förderten dessen Anwendung für die Tumorimmuntherapie [17].

Die Bilder von CpG-MCA-Gelen und CpG-RCA-Gel. a Agarosegelelektrophoresebild von CpG-RCA-Gel (R12) und CpG-MCA-Gelen (R4M4 und R4M8). Spur 1, DNA-MW-Standardmarker -Hind III-Verdau; Spur 2, R12; Spur 3, R4M4; Spur 4, R4M8, Spur 5, DL5000-DNA-Marker. REM-Aufnahmen von R12 (b ), R4M4 (c ) und R4M8 (d ). TEM-Bilder von R12 (e ), R4M4 (f ) und R4M8 (g ). Der schwarze Skalenbalken ist 3 μm; roter Maßstabsbalken ist 1 μm; weißer Skalenbalken ist 500 nm

Die Bilder des konfokalen Mikroskops und der mittleren Fluoreszenzintensität in RAW 264.7-Zellen, die mit CpG-ODN, CpG-RCA-Gel (R12) und CpG-MCA-Gelen (R4M4 und R4M8) (100 nM CpG-Äquivalente) behandelt wurden. CpG-MCA-Gele und CpG-RCA-Gel wurden mit Cy5 (rot) durch Zugabe von Cy5-dCTP für ihre zelluläre Aufnahme markiert. Als Kontrollgruppe wurde Cy5-markiertes CpG-ODN verwendet. a Konfokalmikroskopische Aufnahmen von CpG-RCA-Gel und CpG-MCA-Gelen von RAW 264.7-Zellen nach 2 Stunden Inkubation. b Die mittlere Fluoreszenzintensität von Cy5 in RAW264.7-Zellen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert  ± SD von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. ****P < 0,0001

Methoden/Experimental

Materialien

Alle Oligonukleotide wurden von Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. gekauft und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt. dNTP-Sets (jeweils 100 µM), phi29 DNA Polymerase (10 µU/μL) und 10× phi29 DNA Polymerase Reaktionspuffer (330 µM Tris-Acetat (pH  7,9 bei 37 °C), 100 µM µMg Acetat, 660 µM µK Acetat , 1% (v /v ) Tween 20, 10 mM DTT) wurden von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) bezogen. T4-DNA-Ligase (400 U/μl), 5′-Triphosadenin (ATP) und 10× T4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂ , 1 mM ATP, 10 mM DTT, pH 7,5 bei 25 °C) wurden von New England Biolabs, Inc. (Ipswich, MA) bezogen. Cyanin-5-dCTP wurde von PerkinElmer, Inc. (Waltham, MA, USA) bezogen. Amicon Ultra-0.5 Zentrifugalfiltervorrichtungen wurden von Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Das in diesem Papier verwendete Wasser wurde durch das Millipore Synergy UV Ultrapure Wasserreinigungssystem gereinigt. Gibco fötales Rinderserum (FBS), Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM, mit hohem Glukosegehalt, L-Glutamin, Phenolrot, Natriumpyruvat, ohne HEPES), Trypsin-EDTA (0,25 %) und Penicillin (10000 µE/ml)- Streptomycin (10000 &mgr;g/ml) wurden von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) bezogen. ELISA-Kits wurden von R&D Systems, Inc. gekauft. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) wurde von Dojindo (Kumamoto, Japan) gekauft. Die Mausmakrophagen-ähnliche Zelllinie (RAW264.7-Zellen) wurde von der Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erhalten. Die menschlichen Gliomzelllinien (U251-Zellen) wurden von der Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) bezogen.

Vorbereitung zirkulärer DNA-Vorlagen

Lange einzelsträngige DNA mit einer phosphorylierten Gruppe am 5′-Ende mit gleichem Verhältnis von CpG-ODN-Primern (Primer 1) wurden in 1× phi29-Reaktionspuffer gemischt und bei 95 °C für 5 min angelagert und langsam auf 4°C bei a . abgekühlt - 1 °C/s mit einem Thermocycler (Bio-Rad T100, Deutschland). Nach dem Annealing wurden 20 µU/µL T4-DNA-Ligase mit ATP und T4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer zugegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Enzyme waren bei 75°C für 10 min inaktiv.

Vorbereitung von CpG-MCA-Gelen und CpG-RCA-Gel

Eine zirkuläre DNA-Matrize (10 µl) wurde mit 1 × phi29 DNA-Polymerase-Reaktionspuffer, jeweils 4 µM dNTP, gemischt, und 5 µU phi29 DNA-Polymerase und steriles DDW wurden zugegeben, insgesamt 50 µl. Die Mischung wurde bei 30 °C unter Schütteln 12 h lang inkubiert (R12). Für die MCA-Gelbildung wurden nach 4 h RCA-Reaktion 500 pM Primer 2 und Primer 3 in das resultierende Gemisch gegeben, um für die restlichen Stunden bei 30 °C ohne Zugabe zusätzlicher Reagenzien (R4M4 und R4M8) inkubiert zu werden. Die phi29-Polymerase wurde 10 min bei 65 °C inaktiviert. Das CpG-RCA-Gel und die CpG-MCA-Gele wurden durch Ultrafiltration gereinigt.

Konzentration von CpG-MCA-Gelen und CpG-RCA-Gel

Die Konzentration von CpG-MCA-Gelen und CpG-RCA-Gel wurde basierend auf der Anzahl der CpG-Kopien gemessen, die an allen Hydrogelen in der Behandlungsgruppe beteiligt waren. Da das in das Reaktionssystem zugegebene dNTP jeweils 4 µmM betrug, enthielt eine zirkuläre Matrize 81 Nukleotide und 1 Kopie von CpG. Wenn Abs die Absorption von dNTP bei 260 nm und ε . ist der Extinktionskoeffizient von dNTP bei 260 nm ist, dann könnte das verbrauchte dNTP in der Reaktion gemessen und die Gesamtkopien von CpG nach folgender Gleichung berechnet werden:CpG-Kopien = (4 mM × 4 − Abs/ε ×  1.000.000)/81 [13]. Bauchmuskeln und ε von dNTP wurden mit NanoDrop 2000c gemessen.

Agarose-Gelelektrophorese

Agarosegelelektrophorese wurde verwendet, um die Bildung und den Abbau von CpG-MCA-Gelen und die Bildung einer kreisförmigen Matrize zu bewerten. Hydrogele wurden auf 1% Agarosegel bei 100 V für 60 min laufen gelassen, und die zirkuläre Vorlage wurde auf 3% Agarosegel bei 100 V für 60 min laufen gelassen

Charakterisierung von CpG-MCA-Gelen und CpG-RCA-Gel

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, Hitachi HT7700, Japan) wurde verwendet, um die innere Struktur und ungefähre Größe der CpG-MCA-Gele zu charakterisieren. CpG-MCA-Gele wurden 30 min mit Ultraschall untersucht, bevor sie auf Kupfer abgeschieden und getrocknet wurden. Die Tests wurden im Zentrumslabor des Renji-Krankenhauses durchgeführt. Rasterelektronenmikroskopie (SEM, Hitachi SU8020, Japan) wurde verwendet, um die Morphologie der CpG-MCA-Gele zu erhalten. CpG-MCA-Gele wurden 30 Minuten lang mit Ultraschall untersucht, bevor sie auf einem sauberen Siliziumwafer abgeschieden wurden, und die Probe wurde mit Au metallbeschichtet.

Konfokale mikroskopische Bildgebung

Die Zellaufnahme wurde mit einem konfokalen Mikroskop von Leica abgebildet. RAW264.7-Zellen wurden auf einer konfokalen Petrischale mit einer Dichte von 2 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen/ml. Nach zweimaligem Waschen mit Phosphatpuffer (PBS) wurden die Zellen mit 100 nM Cy5-markiertem CpG-ODN, CpG-RCA-Gel und CpG-MCA-Gelen in frischem DMEM-Medium 2 h bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und 30 min mit 4% Paraformaldehyd fixiert, dann wurden die Zellen mit FITC-Phalloidin und Hoechst 33342 gefärbt. Alle Bilder wurden unter Verwendung eines Leica Laser-Konfokalmikroskops aufgenommen. Die semiquantitative mittlere Fluoreszenzintensität wurde von Image J berechnet, einer Java-basierten Anwendung zur Analyse von Bildern.

ELISA-Assay

RAW264.7-Zellen wurden mit einer Dichte von 7 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen/ml in einer 24-Well-Platte, die vor der Verwendung 24 Stunden lang kultiviert wurde. Die Zellen wurden in Gegenwart von CpG-MCA-Gelen und anderen Gruppen bei 37 °C für 8 Stunden für TNF-α und 24 Stunden für IL-6 inkubiert; die Überstände wurden gesammelt. Die Zytokinspiegel in den Überständen wurden durch Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) nach den vom Hersteller empfohlenen Protokollen nachgewiesen.

Gene-Expressions-Assay

Die Genexpressionsniveaus wurden durch quantitative Echtzeit-PCR (Q-PCR) bestimmt. RAW264.7-Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 10 ⁶ . ausgesät Zellen/ml in einer 6-Well-Platte, die vor der Verwendung 24 Stunden lang kultiviert wurde. Die Zellen wurden in Gegenwart von CpG-MCA-Gelen und anderen Gruppen bei 37 °C für 2 Stunden für TNF-α und TLR9 und 8 Stunden für IL-6 und andere inkubiert. Isolierung und Reinigung von mRNA wurden unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Extrahierte mRNA wurde mit NanoDrop 2000c quantifiziert. Ein Mikrogramm Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des PrimeScript RT Reagenz Kits mit gDNA Eraser (Takara Bio Inc.) revers transkribiert; Die Amplifikation wurde in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 µl unter Verwendung von TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio Inc) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Primer für Gene sind wie folgt:GAPDH:F:AGGTCGGTGTGAACGGATTTG; R:TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA; TLR9:F:ATGGTTCTCCGTCGAAGGACT; R:GAGGCTTCAGCTCACAGGG; TNF-α:F:GACGTGGAACTGGCAGAAGAG; R:TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG; IL-6:F:CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC; R:CTGTTGTTCAGACTCTCTCCCT; CD86:F:GAGCTGGTAGTATTTTGGCAGG; R:GGCCCAGGTACTTGGCATT; CD206(MRC1):F:CTCTGTTCAGCTATTGGACGC; R:CGGAATTTCTGGGATTCAGCTTC.

Kratzer Wundmigrations-Assay

RAW264.7-Zellen wurden mit 70 μL bei einer Dichte von 5 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen/ml in Kultureinsätzen für 24 h vor der Verwendung. Dann wurden die Einsätze vorsichtig entfernt und die Zellen wurden zweimal gewaschen, bevor sie mit jeder Gruppe in einem frischen Medium behandelt wurden. Fotos wurden in 0 h, 6 h und 24 h gesammelt; die Wundfläche wurde von ImageJ gemessen. Jede Gruppe hatte drei Wiederholungen und das Experiment wurde dreimal wiederholt.

Zytotoxizitäts-Assay

Die Zytotoxizität wurde unter Verwendung von CCK8 getestet. RAW264.7-Zellen wurden in 96-Well-Platten ausgesät und mit jeder Gruppe 24 Stunden lang behandelt. Dann wurden 10 µl CCK8-Lösung in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von 1–2 Stunden Inkubation bei 37 °C. Die Absorption wurde bei 450 nm gemessen, jede Gruppe hatte drei Wiederholungen und das Experiment wurde dreimal wiederholt.

U251-Zellen, die mit RAW264.7-Zellen cokultiviert wurden

RAW264.7-Zellen wurden in den oberen Kammern ausgesät und U251-Zellen wurden separat in den unteren Kammern ausgesät und vor der Behandlung 24 h inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden 1 &mgr;M GpC-ODN, CpG-ODN, CpG-RCA-Gel und CpG-MCA-Gel im frischen Medium für die angegebene Zeit sowohl in die obere als auch in die untere Kammer gegeben. Die U251-Zellen in den unteren Kammern wurden gesammelt und das Plattenklonierungsexperiment durchgeführt.

Plattenklonbildungsassay

Die Wirkung auf die Proliferation von U251-Zellen von mit RAW264.7 cokultivierten Zellen wurde mit Plattenklonierungsexperimenten analysiert. U251-Zellen in den unteren Kammern wurden gesammelt und mit mehreren Anteilen in DMEM, das 15% FBS enthielt, auf eine endgültige Anzahl von 200 Zellen/Well auf einer 6-Well-Kulturplatte verdünnt und 2 Wochen lang weiter kultiviert, bis die Kloncluster durch . beobachtet werden konnten bloßes Auge (mehr als 50 Zellen/Klon). Nach vorsichtigem Waschen mit PBS wurden die Zellen 30 min mit 4% Paraformaldehyd fixiert und dann 1 h mit Kristallviolett gefärbt. Cluster mit mehr als 50 Zellen würden als erfolgreiche Klonbildung in die Zählung einbezogen. Die Experimente wurden dreimal wiederholt und jedes Experiment hatte drei Wiederholungsvertiefungen:Klonbildungsrate = (Klonbildungszahl/Anzahl der beimpften Zellen) × 100%.

Stabilität von CpG-MCA-Gelen und CpG-RCA-Gel

Gefriergetrocknete CpG-MCA-Gele oder CpG-RCA-Gel wurden in 400 µl DMEM, das jeweils 10 % fötales Rinderserum (10 % FBS-DMEM) enthielt, gegeben und bei 37 °C für 24 h inkubiert; die DNA-Konzentrationen im Überstand wurden mit NanoDrop 2000c nach 10 s Zentrifugation bei 1000 U/min gemessen. Die verbleibenden Hydrogele wurden nach den DNA-Konzentrationen im Überstand berechnet. Das verbleibende Gel = (m − c × V )/m × 100 %, wobei m ist die Gelmasse, die wir hinzugefügt haben, c die DNA-Konzentration im Überstand ist und V ist das Überstandsvolumen. CpG-MCA-Gele oder CpG-RCA-Gel wurden in 10 % FBS-DMEM bzw. PBS gegeben und bei 37 °C für 12 h oder 24 h inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Gele auf 1% Agarosegel bei 100 V für 60 min laufen gelassen.

CpG-ODN

Einzelstrang-CpG-ODN wurde von Sangon Company (Beijing, China) synthetisiert und mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt. Das in dieser Studie verwendete CpG-ODN war CpG-ODN 1668 [18]:5'-TCCATGACGTTCCTGATGCT, und die Nicht-CpG-Oligonukleotide wurden als GpC-ODN bezeichnet [18]:5'-TCCATGAGCTTCCTGATGCT.

Statistische Analyse

Alle Daten in dieser Studie werden als Mittelwerte ± Standardabweichung (Mittelwert ± ± SD) aus zwei oder drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Die statistische Analyse zwischen verschiedenen Gruppen wurde durch das t . eines Schülers durchgeführt Prüfung. Die statistische Signifikanz wurde auf P . festgelegt < 0,05 (95% Konfidenzniveau).

Ergebnisse und Diskussion

Das DNA-Immunstimulans wurde erfolgreich durch MCA-Reaktion konstruiert [16]. Bei dieser Reaktion ist der erste und wichtige Schritt vor der isothermen Amplifikation die Cyclisierungsreaktion eines langen einzelsträngigen (ss) Templats (Schema 1). Wir verwendeten Agarosegelelektrophorese, um die Bildung von zirkulärer DNA nach dem Annealing und der Ligation mit einem Primer zu bestätigen (zusätzliche Datei 1:Abbildung S1). Die Migrationsstrecke zwischen Primer und langer ssDNA-Matrize wurde kürzer, da sich die Struktur änderte, nachdem die Matrize zu einem Zyklus wurde und mit Primer ligiert wurde. Die MCA-Reaktion enthält eine Reihe sich wiederholender Einheiten in Reihe und führte aufgrund der kontinuierlichen Windung leicht zum Erscheinen von Nanoblumen (Schema 1). Die Ergebnisse der Agarosegel-Elektrophorese zeigten, dass die Produkte der RCA-Reaktion (CpG-RCA-Gel oder R12) und MCA-Reaktion (CpG-MCA-Gel oder R4M4/R4M8) erfolgreich erhalten wurden (Abb. 1a). CpG-RCA-Gel und CpG-MCA-Gele waren schwierig durch das Agarosegel zu wandern und behielten die Retention in der Ausgangsposition. Beide Gele waren zu klebrig, sodass sie beim Pipettieren wie Seide herausgezogen wurden (zusätzliche Datei 1:Abbildung S2A–C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die DNA-Matrize mit freien dNTPs exponentiell amplifiziert wird, um ein Hydrogel zu bilden [15]. Es ist erwähnenswert, dass die Migrationsstrecke zwischen dem CpG-RCA-Gel und den CpG-MCA-Gelen keinen signifikanten Unterschied aufwies. Darüber hinaus zeigten SEM- und TEM-Ergebnisse weiterhin, dass der Durchmesser von CpG-RCA-Gel (Abb. 1b, e) und CpG-MCA-Gelen (Abb. 1c, d, f und g) von der Nanoskala bis zur Mikrometerskala reichte und zeigte eine Morphologie von Nanoblumen. Das CpG-ODN muss in TLR9-positive Immunzellen internalisiert werden und mit TLR9 interagieren, das in den Endosomen innerhalb der Immunzellen lokalisiert ist, um seine immunstimulatorische Aktivität auszuführen. Dazu haben wir Cy5-markierte CpG-ODN-, CpG-RCA-Gele und CpG-MCA-Gele verwendet, um ihre Aufnahme in die RAW264.7-Zellen mittels konfokaler Mikroskopie zu untersuchen. Wie in Fig. 2a zu sehen ist, wurden Cy5-markierte CpG-MCA-Gele effektiv internalisiert und im Zytoplasma von RAW264.7-Zellen verteilt. Basierend auf der gemessenen mittleren Fluoreszenzintensität war die Aufnahmeeffizienz von CpG-MCA-Gelen signifikant erhöht (P < 0,0001) im Vergleich zu CpG-ODN (Abb. 2b), was die effektive Aufnahme von CpG-MCA-Gelen demonstriert, die für eine stärkere Immunstimulation günstig ist. Es wird berichtet, dass die Aufnahme von DNA durch Maus-Makrophagen-RAW264.7-Zellen durch das Design verschiedener DNA-Nanostrukturen erhöht wurde. Wie Tetrapod-artig strukturierte DNA (Tetrapodna), tetraedrische DNA (Tetraeder) und tetragonale DNA (Tetragon) [19]. In ähnlicher Weise wurde auch nachgewiesen, dass X-förmige DNA, Y-förmige DNA und X-DNA-Hydrogel die Aufnahme von DNA durch Zellen erhöhen [20, 21]. Diese Ergebnisse legten nahe, dass DNA-Strukturen höherer Ordnung effizientere Formen sind, um funktionalisierte DNA-Fragmente zu liefern. Wir spekulierten daher, dass die hohe zelluläre Aufnahme von CpG-MCA-Gelen von der Veränderung der CpG-MCA-Gelform durch Gelbildung herrührt. Anschließend testeten wir die Stabilität von CpG-MCA-Gelen. CpG-MCA-Gele wurden bei 37 °C für unterschiedliche Zeit in verschiedenen Lösungen inkubiert. Die Ergebnisse der Agarose-Gelelektrophorese zeigten, dass CpG-MCA-Gele in PBS-Lösung relativ stabil waren und in Serum mit Mediumbeteiligung teilweise abgebaut wurden (zusätzliche Datei 1:Abbildung S3A). CpG-MCA-Gele zeigten immer noch eher eine Leiter als eine einzelne Bande, was auf einen unvollständigen Abbau hindeutete. Anschließend untersuchten wir die Stabilität von Gelen in 10 % FBS-DMEM. TEM-Ergebnisse bestätigten, dass CpG-MCA-Gele teilweise verdaut wurden und nicht mehr wie Blumen aussehen, aber immer noch die Form behalten (zusätzliche Datei 1:Abbildung S2D–F). Die Abbaukurve von CpG-MCA-Gelen wurde aufgezeichnet, indem die DNA-Konzentration im Überstand innerhalb von 24 Stunden nachgewiesen wurde (zusätzliche Datei 1:Abbildung S3B). Es wurde gezeigt, dass R12 nach einer Inkubation für 24 Stunden in 10 % FBS-DMEM fast 80 % beibehielt, während R4M4 und R4M8 fast 85 % verblieben, was den Ergebnissen der Agarosegelelektrophorese entsprach. Um den Abbau von Gelen zu bestätigen, wurden CpG-MCA-Gele bei 37 °C bis zu 48 h im Serum inkubiert und die Abbauproduktion wurde in Agarosegelelektrophorese durchgeführt (zusätzliche Datei 1:Abbildung S4). Gele sehen nicht mehr wie Leitern aus, da sie durch das Enzym im Serum in Stücke zerlegt wurden und ihre Viskosität verloren und sogar einzelne Nukleotidstücke wurden, was darauf hindeutet, dass CpG-MCA-Gele biologisch abbaubar sind, da sie in Gegenwart von fötalem Rinderserum verdaut werden könnten ( FBS). Dementsprechend widerstehen CpG-MCA-Gele effektiv der Serumverdauung innerhalb von 24 h und werden schließlich vollständig abgebaut. Die hohe Fähigkeit, dem Abbau zu widerstehen, wird dazu beitragen, die immunstimulierende Wirksamkeit zu verbessern; die Expressionsspiegel von TNF-α und IL-6 im Überstand von RAW264.7-Zellen zeigten auch klar, dass CpG-MCA-Gele Zellen effektiv zur Produktion von Immunzytokinen stimulieren können.

Die schematische Darstellung zur Herstellung und zellulären Aufnahme von CpG-MCA-Gelen und CpG-RCA-Gelen. Lange einzelsträngige DNA mit einer phosphorylierten Gruppe am 5'-Ende wurde mit Primern gemischt, die aus CpG-Motiven bestanden, wurden zuerst angelagert und durch T4-DNA-Ligase ligiert, um eine kreisförmige Matrize zu bilden. Die RCA- und MCA-Reaktion wurde von der phi29-DNA-Polymerase durchgeführt, um eine große Menge sequenzieller Konkatemer-DNA zu erzeugen und sich wie viele Nanoblumen zu falten. Gele können dann von Makrophagen aufgenommen werden und die Sekretion von Zytokinen stimulieren

Die immunstimulierende Wirksamkeit von CpG-MCA-Gelen wurde weiter untersucht, wir behandelten RAW264.7-Makrophagen mit GpC-ODN (die Sequenz änderte sich von Wirkungs-GACGTT zu GAGCTT) [22], CpG-ODN, CpG-RCA-Gel und CpG- MCA geliert und hat dann die Expression von TNF-α und IL-6 nachgewiesen. Die Konzentration von TNF-α im Überstand von RAW264.7-Zellen, die 8 Stunden lang mit CpG-RCA-Gel (R12) und CpG-MCA-Gelen (R4M4 und R4M8) inkubiert wurden, rief viel höhere TNF-α-Spiegel hervor als CpG-ODN in den gleiche Behandlungskonzentration (Abb. 3a). Bei den CpG-MCA-Gelen induzierte R4M8 anstelle von R4M4 eine höhere TNF-α-Sekretion (P <0,001), was darauf hindeutet, dass die TNF-α-Sekretion mit zunehmender Kopienzahl zunahm. Darüber hinaus induzierte R4M8 eine signifikante (P < 0,001) höhere Konzentration von TNF-α als R12, was darauf hindeutet, dass CpG-MCA-Gele bei gleicher Gesamtreaktionszeit stärkere Stimulatoren sind als CpG-RCA-Gele. Der gleiche Trend wurde auch beim Nachweis von IL-6 gefunden (Abb. 3d). Die durch CpG-MCA-Gele und CpG-RCA-Gel stimulierte IL-6-Sekretion war signifikant erhöht. Die Sekretion von IL-6 in den Gruppen R12, R4M4 und R4M8 betrug das 2,97-fache (P < 0,0001), 4,39-mal (P < 0,0001) und 27,81-mal (P <0,0001) davon jeweils in der CpG-ODN-Gruppe. Die Sekretion von IL-6 in der R4M8-Gruppe betrug das 6,33-fache (P < 0,0001) davon in der R4M4-Gruppe und 9,36-mal (P < 0,001) von dem, was in der R12-Gruppe angegeben ist. Es ist erwähnenswert, dass die Sekretion von IL-6 keinen signifikanten Unterschied zwischen den CpG-ODN-, GpC-ODN- und Kontrollgruppen aufwies. Diese Ergebnisse bestätigten, dass eine höhere Effizienz von freigesetztem TNF-α und IL-6 von RAW264.7-Zellen beobachtet wurde, die mit CpG-MCA-Gelen behandelt wurden, anstatt von CpG-ODN. Darüber hinaus wurde auch die Wirkung von CpG-MCA-Gelen mit einer anderen Konzentration auf die Zytokinsekretion untersucht, und wir fanden, dass die Sekretion von TNF-α und IL-6 mit der Konzentration der Gele zunahm (Abb. 3b, e). Das Ergebnis der immunstimulierenden Fähigkeit der Nicht-CpG-Gele (angezeigt als R12-C, R4M4-C und R4M8-C in Abb. 3c) und GpC-ODN zeigten, dass sie kaum die Sekretion von TNF-α induzierten (Abb. 3c), was darauf hinweist, dass die durch CpG-MCA-Gele induzierten Immunantworten aus den CpG-Motiven resultieren.

Nachweis von Zytokinen, die aus RAW264.7-Zellen freigesetzt wurden, die mit CpG-ODN, CpG-RCA-Gel und CpG-MCA-Gel stimuliert wurden, unter Verwendung des ELISA-Kits. a Die Sekretion von TNF-α aus RAW264.7-Zellen. b Die Sekretion von TNF-α aus RAW264.7-Zellen nach Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen von CpG-MCA-Gelen. c Nachweis der immunstimulierenden Fähigkeit von CpG-Gelen und Nicht-CpG-Gelen (R12-C, R4M4-C und R4M8-C). d Die Sekretion von IL-6 aus RAW264.7-Zellen. e Die Sekretion von IL-6 aus RAW264.7-Zellen nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von MCA-Gelen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert  ± SD von zwei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. **P < 0.01, ***P <0,001, ****P < 0,0001

Als nächstes testeten wir die mRNA-Expression von Zytokinen, Zelloberflächenmarkern und TLR-9. Die TNF-α-mRNA in der CpG-ODN-Gruppe war 1,25-mal so hoch wie die in der Kontrollgruppe nachgewiesene Expression, und die Faltungsänderung in den R12-, R4M4- und R4M8-Gruppen betrug das 3,28-Fache (P < 0,01), 2,53 mal (P < 0,05) und 4,57-mal (P < 0,001) davon, das in der CpG-ODN-Gruppe separat getestet wurde (zusätzliche Datei 1:Abbildung S5A). Die mRNA-Expression von IL-6 in der CpG-ODN-Gruppe war 1,01-mal so hoch wie in der Kontrollgruppe. Die IL-6-mRNA-Expression in den Gruppen R12, R4M4 und R4M8 betrug das 3,87-fache (P < 0,01), 4,63 mal (P < 0,05) und 23,04-mal (P < 0,0001) genauso viel wie in der CpG-ODN-Gruppe (zusätzliche Datei 1:Abbildung S5B).

Die mRNA-Expression von TLR-9, dem Rezeptor von CpG in Zellen [4], stieg in allen Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe ebenfalls an, aber die CpG-MCA-Gelgruppen erhöhten die mRNA-Expression von TLR-9 im Vergleich zu CpG . bemerkenswert -ODN-Gruppe (zusätzliche Datei 1:Abbildung S5C). Neben Zytokinen und TLR9 haben wir auch kostimulatorische Moleküle (CD) CD86 und CD206 nachgewiesen, die verwendet wurden, um proinflammatorische (M1) bzw. wachstumsfördernde (M2) Makrophagen zu markieren [23]. Es wurde festgestellt, dass es weder bei CD86 noch bei CD206 einen signifikanten Unterschied zwischen der CpG-ODN-Gruppe und der Kontrollgruppe gab (zusätzliche Datei 1:Abbildung S5D, E). Verglichen mit der CpG-RCA-Gelgruppe stieg CD86 in den CpG-MCA-Gelgruppen unterschiedlich stark an, während CD206 unterschiedlich stark abnahm und die R4M8-Gruppe am stärksten zu- und abnahm, was darauf hindeutet, dass mit CpG-MCA-Gelen behandelte RAW264.7-Zellen neigen dazu, sich mit dem CD86-Oberflächenmarker in M1-Populationen zu differenzieren, was die Immunstimulationsfähigkeit von CpG-MCA-Gelen weiter bestätigt.

Die Sekretion von Zytokinen aus Makrophagen ist äußerst wichtig bei der Reaktion auf die Immunstimulation sowie bei der Proliferation und Migration von Makrophagen. Die Stimulation von Makrophagen mit CpG-ODN würde die Produktion von entzündungshemmenden Zytokinen über den TLR9-abhängigen Weg erhöhen. Die durch CpG-ODN induzierten Zytokine erhöhten die Migration von Makrophagen und förderten die Proliferation von Makrophagen, indem sie die Expression eines Zellzyklus-negativen Regulators herunterregulieren [24]. CpG-ODN induzierte auch die Expression des Plasminogen-Aktivator-Inhibitors Typ-1 (PAI-1) in Makrophagen, was zu einer verstärkten Migration durch Vitronectin führte [25]. Wir haben auch die Fähigkeit von CpG-MCA-Gelen, die Migration von Makrophagen zu fördern, weiter untersucht und ihre Zytotoxizität bewertet. Die Migration von RAW264.7-Zellen wurde durch CpG-MCA-Gele sowohl im Transwell-Migrationssystem (Abb. 4a) als auch im Scratch-Wund-Migrationsassay (Abb. 4b) induziert. RAW264.7-Zellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von CpG-MCA-Gelen kultiviert und 24 Stunden lang wandern gelassen. Die Migrationszahl von Makrophagen in den CpG-MCA-Gelgruppen war weitaus höher als in der CpG-ODN-Gruppe (Abb. 4a). Dann fuhren wir mit dem Scratch-Wund-Migrations-Assay fort; Zellen durften 24 Stunden lang wandern, und Bilder wurden in 0 Stunden, 6 Stunden und 24 Stunden aufgenommen. Die Ergebnisse zeigten, dass der Kratzbereich mit der Wundheilung verkleinert wurde. Die Migration von Makrophagen nach 6 Uhr zeigte, dass die CpG-MCA-Gele wirksamer waren als die CpG-ODN-Gruppe, da das Wundheilungsverhältnis höher war, aber es gibt keine deutliche Signifikanz zwischen den Gruppen R12, R4M4 und R4M8 (Zusatzdatei 1:Abbildung S6A, B). Und der Kratzbereich bei 24 h bestätigte, dass die Heilungsrate des Kratzbereichs in der CpG-ODN-Gruppe das 1,70-fache betrug (P < 0,05) davon in der Kontrollgruppe, und die Heilungsrate in den Gruppen R12, R4M4 und R4M8 betrug das 1,63-fache (P < 0,001), 1,63-mal (P < 0,0001) und 2,23-mal (P  < 0.0001) of that measured in the CpG-ODN group separately. The healing rate in the R4M8 group was 1.36 times (P  < 0.01) of that in the R12 group. CpG-MCA gels strongly promoted the migration of RAW264.7 cells compared to that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 4c). In addition, RAW264.7 cells were cultured with a series concentration of gels for 24 h. We found that the CpG-MCA gels exhibited a negligible cytotoxicity to RAW264.7 cells due to the non-toxicity of DNA itself; on the contrary, CpG-MCA gels could stimulate RAW264.7 cell proliferation with a dose-dependent effect, which was a benefit to enhance the production of immune cytokines (Fig. 4d).

The analysises of migration and cell viability of CpG-ODN, CpG-RCA gel (R12), and CpG-MCA gels (R4M4 and R4M8) in RAW264.7 cells. a The migration assay of RAW264.7 cells induced with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8. b The migration assay of RAW264.7 cells stimulated with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8 for 24 h. c The scratch area analysis in the scratch migration experiment. The percentages are calculated as the ratio of the original area. d The cell viability of RAW264.7 cells treated with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8 for 24 h. Results are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. **P < 0.01, ***P  < 0.001, ****P < 0,0001

For further verifying the inhibited efficiency of CpG-MCA gels for the proliferation of solid tumor cells, we estimated the inhibitory effects of CpG-MCA gels as immune stimulators for the U251 human brain glioma cells. The U251 cells was first co-cultured with RAW264.7 macrophages for 24 h, and the clone formation rate was used to check the proliferate ability of the U251 cells. As shown in Fig. 5a–f, the clone formation rate in the CpG-ODN group was 74.1% of that observed in the control group (P  < 0.05), and the rates in R12, R4M4, and R4M8 groups were 45.4% (P  < 0.01), 15.3% (P  < 0.001), and 12.0% (P  < 0.001) of that in the CpG-ODN group, respectively. The results demonstrated that the U251 cells treated with CpG-MCA gels presented a significantly lower percentage of clone formation rate compared with that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 5g). It is notable that the trend of inhibitory results was in accordance with the secretion of TNF-α among groups, CpG-MCA gels exhibited a stronger effect on stimulating RAW264.7 cells to secrete cytokines to inhibit proliferation of U251 cells than CpG-ODN. Our research provided preliminary evidence to demonstrate the CpG-MCA gels have the potential to be used as an immunostimulant.

The assessment on the therapeutic effect of immunostimulatory CpG-RCA gel (R12) and CpG-MCA gels (R4M4 and R4M8) on cancer cells in vitro by plate clone formation assay. U251 cells treated with a none, b RAW264.7 cells, c RAW264.7 cells treated with CpG-ODN, d RAW264.7 cells treated with R12, e RAW264.7 cells treated with R4M4, and f RAW264.7 cells treated with R4M8. g Results of the proliferation percentage of U251 cells after co-cultured with RAW264.7 cells for 24 h. Results are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. **P < 0.01, ***P <0,001

Conclusions

In summary, we have successfully preparedCpG-MCA nanohydrogels that consist of hundreds of immunostimulatory CpG motifs to effectively deliver immune stimulus signal into cells and significantly induce the expression of immune cytokines. CpG-MCA nanohydrogels exhibited powerful anti-tumor immunity against human glioma cells, demonstrating that CpG-MCA nanohydrogels have the potential to be used as an immunostimulant for the therapy of cancer.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die in der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Abkürzungen

CpG-MCA gels:

CpG-MCA hydrogel

CpG-RCA gel:

CpG-RCA hydrogel

MCA/M:

Multi-primed chain amplification

R12:

CpG-RCA gel

R12-C, R4M4-C, R4M8-C:

Hydrogels not containing CpG motifs

R4M4, R4M8:

CpG-MCA gels

RCA/R:

Rolling circle amplification