Quantitative Untersuchung der PLGA-Nanopartikel-Aufnahme in Larynxkrebs- und Immunzellen zur Verbesserung der Wirkstofffreisetzung

Zusammenfassung

Die klinische Translation von Poly(lactid-co-glycolid)säure (PLGA)-basierter Nanomedizin ist begrenzt, teilweise aufgrund der geringen Lieferwirksamkeit, die durch unspezifische Phagozytose durch Phagozyten resultiert. Das Verständnis des Nanopartikel-Wechselspiels zwischen Krebszellen und Immunzellen bleibt weitgehend unklar. In dieser Studie wurde erstmals eine quantitative Untersuchung der zellulären Internalisierung fluoreszierender PLGA-Partikel (100 nm, 500 nm und 1 µm) an Larynxkarzinomzellen mit oder ohne Monozyten/Makrophagen in Monokultur- oder Co-Kultursystemen durchgeführt.

PLGA-Partikel in Konzentrationen von 5–20 µg/mL zeigten eine hervorragende Biokompatibilität, mit Ausnahme von 500 nm und 1 µm PLGA-Partikeln bei 20 µg/mL, die die Zelllebensfähigkeit leicht verringerten. Mikroskopische Beobachtungen zeigten, dass alle drei Partikelgrößen effektiv von sowohl Krebszellen als auch Makrophagen aufgenommen wurden; quantitative Fluoreszenzuntersuchungen ergaben jedoch, dass der Aufnahmedex der Krebszellen (mittlere intrazelluläre Partikelfluoreszenz pro Krebszelle, normalisiert auf die pro Makrophage) für alle PLGA-Partikel in Co-Kulturen im Vergleich zu Monokulturen erheblich abnahm (1,35–1,05, 1,50–0,59 und 1,4–0,47 für 100 nm, 500 nm und 1 µm Partikel, jeweils). Die quantitative Analyse mittels Durchflusszytometrie bestätigte den reduzierten Aufnahmedex der Krebszellen in Co-Kulturen, aber höhere Partikelzahlen pro Makrophagen. Es wurde auch festgestellt, dass die Bildung multinuclierter Riesenzellen durch Fusion von Makrophagen nach PLGA-Behandlung zunahm, was als potenzieller Ansatz für die Tumor-Wirkstofffreisetzung weiter genutzt werden könnte. Insgesamt liefern diese Ergebnisse neue Einblicke in die Interaktion von Nanopartikel-Immun-Krebszellen, was die Anwendung PLGA-basierter Nanoträger zur Behandlung von Larynxkarzinomen erleichtern könnte.

Einleitung

Krebs ist eine der weltweit häufigsten Todesursachen mit rund 10 Millionen neuen Todesfällen im Jahr 2018 [1]. Larynxkarzinom (Krebszellen, die vom Kehlkopf ausgehen) ist die zweithäufigste Malignität der Plattenepithelkarzinome im Kopf-Hals-Bereich (HNSCC) und verursachte 2018 etwa 180.000 Neuerkrankungen und 95.000 Todesfälle [2]. Derzeit werden zielgerichtete Medikamente als optionale Behandlung für Herausforderungen entwickelt, die durch traditionelle Therapien wie Chirurgie, Radiotherapie und Chemotherapie entstehen [3]. Wissenschaftliche Anstrengungen wurden beschleunigt, um die Wirkstoffzielgenauigkeit und -wirksamkeit zu verbessern und unerwünschte Nebenwirkungen zu reduzieren, indem beispielsweise neuartige Wirkstoff-Nanoträger (z. B. Mikronadeln), personalisierte Antikrebsmedikamente und therapeutische Antikörper-zielgerichtete Freisetzungssysteme entwickelt werden [4].

Nanoträger wurden breit genutzt, um Antikrebsmedikamente wie Cisplatin, Paclitaxel und Docetaxel zu laden, um deren Wasslöslichkeit, Bioverfügbarkeit und Stabilität für eine verbesserte Wirkstofffreisetzung und -wirksamkeit zu erhöhen [3, 4]. Im Allgemeinen ermöglicht die nanopartikelbasierte Wirkstofffreisetzung die Zufuhr einer breiten Palette anderer Substanzen (z. B. Proteine, Antikörper, Impfstoffe und Nukleinsäuren) an spezifische Körperregionen sowohl in Tiermodellen als auch bei Patienten [4, 5]. Allerdings hat der sogenannte Enhanced Permeability and Retention (EPR)-Effekt zu erheblich variierender Zielgenauigkeit bei verschiedenen Krebsarten geführt [6]. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Ablagerung von Nano-Wirkstoffträgern (hier Gold-NPs) in Tumoren bevorzugt vom Prozess der Transzytose abhängt [7], einer Art biologischen transzellulären Transport, bei der Substanzen/NPs über Endozytose, vesikulären Transfer und Exozytose von einer Zellseite zur anderen transportiert werden. Es ist jedoch zu beachten, dass widersprüchliche Ergebnisse zu den Mechanismen der zielgerichteten Wirkstofffreisetzung die kritische Bedeutung des Verständnisses der zellulären Interaktion mit Nano-Wirkstoffen oder NPs unter Nutzung mehrerer experimenteller Strategien von In-vitro-Zellkultur bis Ex-vivo-Gewebekultur und In-vivo-Tierstudien betonen.

Zahlreiche Nanoträger wie Liposomen, Albumin-NPs, Silica-NPs und Poly(lactid-co-glycolid)säure (PLGA) wurden klinisch zur Behandlung verschiedener Krebsarten einschließlich Larynxkarzinom eingesetzt [4]. Polymerbasierte NPs wie Mizellen und PLGA haben großes Potenzial in biomedizinischen Anwendungen aufgrund ihrer vielseitigen Formulierungen von Nano-Wirkstoffen durch einfaches Mischen oder kovalente Konjugation, hervorragende Selbstassemblierungsfähigkeit, hohe Wirkstoffbeladungskapazität und Biokompatibilität [8, 9]. Beispielsweise ermöglichen PEG-beschichtete PLGA-Nanoträger, beladen mit Doxorubicin und Indocyaningrün, eine synergistische Chemo-Photothermische Therapie bei Brustkrebs [10]. Auch zeigten sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Studien, dass Cisplatin-beladene Mizellen eine hervorragende Antikrebsaktivität gegen orthotope HNSCC-Tumoren (z. B. SAS-L1 und HSC-2) aufweisen [11]. Obwohl mehrere polymerbasierte Nano-Wirkstoffträger wie PLGA und Mizellen für den klinischen Einsatz zugelassen sind oder in klinischen Studien evaluiert werden [4, 6], befinden sich viele weitere polymere Nano-Wirkstoffe in präklinischer Untersuchung mit verschiedenen Kopf-Hals-Krebszelllinien und Xenograft-Tumormodellen von Tieren [11,12,13,14].

Wissenschaftliche Erkenntnisse haben die Bedeutung der Wirtsimmunantwort auf Nano-Wirkstoffträger hervorgehoben, da diese NPs, sobald sie in den Körper gelangen, unvermeidlich vom Immunsystem erkannt werden. Makrophagen gelten als erste Linie der zellulären Wirtsabwehr und spezialisieren sich auf die Neutralisierung und Beseitigung von Allergenen, Mikroorganismen und Fremdpartikeln (z. B. Nanoträgern) durch Phagozytose und nachfolgende Priming von Immunantworten. Die meisten neuartig entwickelten Nanoträger scheiterten an der zielgerichteten Freisetzung an spezifische kranke Regionen oder Tumoren in vivo, wegen der effizienten Anreicherung von NPs im mononukleären Phagozyten-System (MPS), wie Kupffer-Zellen in der Leber und rote-Pulpa-Makrophagen in der Milz [15]. Daher ist das Verständnis der Mechanismen der zellulären Aufnahme von NPs durch Immunzellen wie Monozyten und Makrophagen entscheidend, da es die Lebensdauer von Nanoträgern in relevanten Geweben und biologischen Flüssigkeiten bestimmt. Etablierte In-vitro-Co-Kultursysteme haben daher zunehmend Aufmerksamkeit in den Bereichen Nanomedizin und Toxikologie auf sich gezogen, aufgrund der steigenden Nachfrage nach aussagekräftigeren Ergebnissen, die die In-vivo-Bedingungen besser widerspiegeln [16]. Tatsächlich haben sich Co-Kultursysteme als realistische Situationen erwiesen, die gesunde und kranke Gewebezustände nachahmen [17] und zuverlässig in NP-zellulären Aufnahmestudien und Wirkstoffabsorptionsstudien eingesetzt wurden [18,19,20,21]. Die Nutzung von Co-Kultur-Modellen aus Krebs- und Immunzellen bietet generell eine geeignete Plattform, um Aufnahmerouten und -mechanismen dieser Nanomaterialien in Zellen zu untersuchen, was das Design von Nanoträgern erleichtern könnte, die besser auf Krebszellen abzielen, während gleichzeitig die NP-Phagozytose reduziert wird. Daher ist es von essenzieller Bedeutung, die Aufnahmeeffizienz und das Schicksal von NPs in Krebszellen in Gegenwart von Immunzellen zu bestimmen. Die meisten Nanoträger wurden mit Durchmessern von 50–200 nm entworfen, um den EPR-Effekt zu nutzen und die Blutzirkulation zu verlängern, während größere NPs (> 500 nm) effizient durch das MPS beseitigt werden [6]. PLGA, ein FDA-zugelassener Nanoträger, in verschiedenen Größen (100, 500 und 1000 nm) wurde daher ausgewählt, um die Aufnahmeraten von UM-SCC-17A (einer klassischen Larynx-Plattenepithelkarzinom-Zelllinie) [22] und THP-1 (einer humanen akuten monozytären Zelllinie) zu untersuchen. Mehrere In-vitro-Studien haben PLGA-Nanoträger zur Wirkstofffreisetzung an HNSCC-Krebszellen in Monokulturen angewendet [12, 13, 23]; dies ist die erste Studie, die die Aufnahmeeffizienz und den Mechanismus der NP-Aufnahme durch Immunzellen und Larynxkrebszellen synchron in einem Co-Kultur-Modell unter Verwendung verschiedener PLGA-Größen untersucht, was eine grundlegende Basis für die Entwicklung neuartiger sicherer Nanomedizin für die HNSCC-Therapie liefern könnte.

Materialien und Methoden

Materialien

Drei kommerzialisierte PLGA-Partikel (Sigma-Aldrich) mit unterschiedlichen Größen (100 nm, 500 nm und 1000 nm) wurden in dieser Studie verwendet. Alle Partikel waren mit grünen Fluorophoren beladen, mit optischen Anregungs- und Emissionswellenlängen (ex/em) von 460 nm und 500 nm. Alle Partikel wurden als Pulver erhalten und in destilliertem Wasser mit einer Endkonzentration von 10 mg/mL suspendiert. Hydrodynamische Durchmesser und Zeta-Potenziale der drei Partikel wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) mit einem Malvern Zeta Sizer Nano Instrument (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK) durchgeführt. Die Stammsuspensionen jedes Partikels wurden 1:100 in 80 µl destilliertem Wasser für die DLS-Messung verdünnt. Gemäß Herstellerangaben wurden 3 Wiederholungsmessungen für jedes Partikel erhalten.

Zellkulturen von UM-SCC-17A und THP-1 und Partikelexposition

Die humane Larynxkarzinom-Zelllinie UM-SCC-17A und die humane Monozyten/Makrophagen-Zelllinie THP-1, erworben von Sigma-Aldrich, USA und Shanghai Hengya Biotechnology Company (Shanghai, China), wurden verwendet, um das In-vitro-Modell in dieser Studie aufzubauen. UM-SCC-17A-Zellen und THP-1-Zellen wurden entweder in DMEM [22] oder RPMI-1640 Zellkulturmedium kultiviert, ergänzt mit 10% FBS (Gibco, Deutschland) und 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung (Gibco, Deutschland) bei 37 °C mit 5% CO2. THP-1-Zellen wurden 72 h vor der Aussaat 100 nM Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) (Sigma, USA) Lösungen ausgesetzt, um in Makrophagen zu differenzieren. Beide Zelltypen wurden alle 3 Tage mit 0,5% Trypsin-EDTA passagiert, und die Zellmorphologie wurde täglich überprüft, um die Zellgesundheit sicherzustellen.

Zellen wurden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 0,1 × 10⁶ Zellen/Well für monokultivierte Zellen für WST-1- und LDH-Assays oder auf sterile Deckgläser in 24-Well-Platten für Fluoreszenzmikroskopie ausgesät. Für das Co-Kultur-Modell wurden UM-SCC-17A-Zellen zuerst in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 50.000/Well über Nacht ausgesät und dann mit 50.000/Well THP-1-Zellen ergänzt. Partikel wurden in 500 µl jeweils jeweiligem Zellkulturmedium für monokultivierte UM-SCC-17A und THP-1 Zellen oder 1:1 gemischtem Zellkulturmedium für co-kultivierte Zellen suspendiert und den Zellproben für 24 h mit Endkonzentrationen von 5, 10 und 20 µg/mL für WST-1- und LDH-Assay oder 10 µg/mL für Fluoreszenzmikroskopie ausgesetzt.

Für FACS-Messungen wurden Zellen in 12-Well-Platten in gleicher Weise wie zuvor beschrieben mit einer Dichte von 250.000 Zellen/Well ausgesät, oder 125.000 Zellen/Well jeweils für das Co-Kultur-Modell. Zellen wuchsen in 1 ml Zellkulturmedium über Nacht und wurden PLGA-Partikeln mit einer Endkonzentration von 10 µg/mL für 24 h ausgesetzt.

Zelllebensfähigkeitsassay

Die Zelllebensfähigkeit wurde mittels Zellproliferationsreagenz WST-1 Kit (Roche, Deutschland) gemäß Herstelleranweisungen bestimmt. Kurz gesagt, die WST-1-Lösung wurde 1:10 in jeweils jeweiligem Zellkulturmedium für Monokultur UM-SCC-17A oder THP-1, oder 1:1 gemischtem Zellkulturmedium für Co-Kultur-Zellen verdünnt. Der Überstand wurde nach der Exposition abgegossen, und Zellen wurden mit 500 µl Arbeitslösung des WST-1-Assays bei 37 °C für 30 min inkubiert. Proben wurden gesammelt und bei 14.000 rpm für 10 min zentrifugiert, um die Partikel zu entfernen. Die Absorption (OD-Wert) der Lösungen wurde bei 450 nm Wellenlänge mit einem Infinite®F200 (Tecan, USA) gemessen. Die Absorptionswerte wurden durch Subtraktion des Wertes einer Blindprobe, die nur die WST-1-Arbeitslösung enthielt, korrigiert, und die relativen Zelllebensfähigkeiten wurden mit der unbehandelten Kontrollprobe verglichen.

Zellmembran-Leckage-Assay

Lactatdehydrogenase (LDH)-Freisetzung wurde mit einem kommerziellen Zytotoxizitätsnachweis-Kit (LDH) (Roche, Deutschland) gemessen, um die Zytotoxizität durch PLGA-Partikel zu bestimmen. Die Freisetzung dieses zytoplasmatischen Enzyms in den Zellkulturüberstand ist charakteristisch für zelluläre Membranschädigung, die zu irreversiblen Zelltod führt. Trotz leichter Erhöhung der LDH-Werte mit höheren Dosierungen in monokultivierten UM-SCC-17A-Zellen, die mit verschiedenen Dosen von 1 µm PLGA behandelt wurden, wurde keine signifikante Zytotoxizität für die Zellen beobachtet, selbst bei der höchsten Konzentration von 20 µg/mL. Unerwartet konnten alle drei PLGA-Größen in verschiedenen Dosierungen keine substanzielle LDH-Freisetzung in den Überstand induzieren, was die unbedeutenden toxischen Effekte auf monokultivierte THP-1-Zellen anzeigt, was auch hochkonsistent mit den oben beschriebenen Zelllebensfähigkeitsergebnissen ist. In den Co-Kultur-Experimenten zeigten alle Partikel mit verschiedenen Konzentrationen eine hervorragende Biokompatibilität gegenüber beiden Zelltypen in Bezug auf freigesetzte LDH-Werte. Im Allgemeinen deckt der hier verwendete breite Partikelgrößenbereich von 100 nm bis 1 µm die typischen Größen von Nanoträgern (50–200 nm) ab, wie Liposomen, Mizellen, Dendrimere, Polymere und Minizellen. Dieser Bereich umfasst auch sub-mikrongroße Partikel (500 nm Partikel können noch als NPs betrachtet werden, z. B. Partikel mit Größen um 500 nm haben dieselben Clearance-Pfade in der Lunge wie NPs von 10–100 nm [34] und mikrongroße 1 µm. Keines dieser PLGA-Partikel zeigte offensichtliche Zytotoxizität gegenüber THP-1 und/oder UM-SCC-17A-Zellen in Monokultur- und Co-Kultursystemen, außer den 500 nm und 1 µm PLGA-Partikeln bei der höchsten Konzentration gegen UM-SCC-17A und Co-Kultur-Zellen (aber mehr als 85% der Zellen überlebten), was darauf hindeutet, dass sie für Anwendungen in Wirkstofffreisetzungssystemen günstig sind.

Fluoreszenzmikroskopie

Zellen wurden durch Hoechst-Färbung zur Lokalisierung der Partikel unter dem Fluoreszenzmikroskop visualisiert. Zellen wurden nach 24 h Exposition der Partikel 3-mal mit PBS gewaschen und 10 min bei Raumtemperatur mit 4% Formaldehyd inkubiert. Nach Fixierung mit Formaldehyd wurden Zellen dann 30 min mit 200 µl Färbelösung, enthaltend 1:1000 verdünntes Hoechst und 1% BSA in PBS, inkubiert. Dann wurden die Deckgläser umgekehrt auf einen Objektträger gelegt und mit einem Tropfen DAKO Fluoreszenz-Anti-Fading-Mittel für die Visualisierung befestigt. Vier optische Kanäle wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop eingestellt, einschließlich Hellfeld für Zellmorphologie, DAPI für Zellkerne und GFP für Partikel. Belichtungszeiten des Partikelkanals für jedes Fluoreszenzbild wurden aufgezeichnet und zur Homogenisierung der Fluoreszenzintensität über verschiedene Partikel verwendet, und intrazelluläre Partikel wurden durch Fluoreszenzintensität mittels zufällig ausgewählter Bereiche mit ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) berechnet. Der Aufnahmedex über verschiedene Partikel wurde zwischen monokultivierten oder ko-kultivierten UM-SCC-17A-Zellen verglichen. Kurz gesagt, die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) internalisierter Partikel wurde in z. B. 50 Zellen für jeden Zelltyp berechnet, was als Subtraktionswert zwischen der Gesamtfluoreszenzintensität (I_total) eines spezifischen Bereichs und der Autofluoreszenz (I_auto) des gleich großen Bereichs in der partikelfreien Region bestimmt wurde [24, 25]. Der Aufnahmedex der Krebszellen wurde durch die MFI von UM-SCC-17A normalisiert auf die von THP-1-Zellen in entweder monokultiviertem oder ko-kultiviertem Modell bestimmt. Die Berechnung erfolgte gemäß der folgenden Gleichung:

Aufnahmedex = (I_total1 - I_auto1) (MFI_UM-SCC-17A) / (I_total2 - I_auto2) (MFI_THP-1)

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)

Die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) wurde durchgeführt, um die Aufnahmeraten der drei Partikel zu messen. Zellen wurden 3-mal mit PBS gewaschen, um das Zellmedium und dissoziierte Partikel 24 h nach der Exposition zu entfernen, und 4 min bei 37 °C mit 200 µl 0,5% Trypsin-EDTA (Gibco, Deutschland) inkubiert, um die Zellen von der Platte zu lösen. Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 ml vollständigem Zellkulturmedium gestoppt, und die Zellsuspension wurde in ein Glasröhrchen für die FACS-Messung überführt und 5 min bei 300 × G, 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgeseiht, und Zellen wurden in 200 µl PBS resuspendiert und auf Eis aufbewahrt. Lebende Zellen wurden zunächst mittels Vorwärts- (FSC-A) und Seitenstreuung (SSC-A) von Trümmer und toten Zellen separiert. Dann wurden die co-kultivierten Zellen mittels APC-Kanal versus FSC-A analysiert, um UM-SCC-17A-Zellen von Makrophagen basierend auf der Zellgröße zu trennen. Insgesamt wurden 30.000 Zellen für jede Probe analysiert, und die mittlere Fluoreszenzintensität für jede Zelle wurde berechnet und über verschiedene Partikel normalisiert. Mittlerweile wurden nach 24 h Inkubation von Partikeln mit Zellen der Zellkulturüberstand, Waschpuffer (dreimaliges Waschen zur Entfernung der an der Zelloberfläche anhaftenden Restpartikel) und Zellen (trypsinisierte Verdauung) gesammelt, um die Fluoreszenzintensität mit einem Mikroplattenleser (Infinite®F200, Tecan) zu messen. Mit diesem Ansatz kann der Prozentsatz der von Zellen aufgenommenen Partikel für jede Gruppe bestimmt werden, z. B. etwa 30.000 Partikel, die einer einzelnen Zelle in einer 12-Well-Platte (250.000 Zellen gesamt) bei einer Dosierung von 5 µg 100 nm PLGA-Partikeln ausgesetzt waren, was zu durchschnittlich 13.000 von einzelnen Zellen internalisierten Partikeln führte, was etwa 43% der applizierten Dosis entspricht, die an die Zellen gelangte. Dieser gelieferte Prozentsatz kann weiter verwendet werden, um die Partikelzahlen im Co-Kultur-System für jeden Zelltyp in FACS zu berechnen.

Quantifizierung der Zellfusion

Makrophagen-Fusion zu multinuclierten Riesenzellen (MGC) wurde definiert als eine Riesen-Zelle, morphologisch zwei oder mehr Kerne innerhalb eines normalen Zytoplasmas enthaltend, was klar und synchron in Hellfeldbildern und Fluoreszenzbildern nach Färbung identifiziert werden kann, wie in der Literatur beschrieben [26]. Der Prozentsatz der Zellfusion wurde berechnet durch die Anzahl der MGC-Kerne (manuelles Zählen) normalisiert auf die Gesamtzellzahl, die mit einem automatisierten Ansatz in ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) bestimmt wurde.

Statistische Analyse

GraphPad V8.0 Software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) wurde für statistische Analyse und Ergebnisvisualisierung verwendet. Nach einseitiger ANOVA wurde entweder die Holm-Sidak-Methode oder t-Test für den Vergleich von Mehrgruppen- bzw. Zwei-Gruppen-Ergebnissen durchgeführt. Alle Experimente wurden in unabhängigen Triplikaten durchgeführt, und Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (STD) dargestellt. Ergebnisse mit p-Wert < 0,05 (*) und p < 0,01 (**) wurden als signifikant betrachtet.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung von Poly(lactid-co-glycolid)säure Partikeln

Fluoreszenzmikrographien der PLGA-Partikel (Abb. 1a,b,c) zeigten robuste Fluoreszenzintensität und keine signifikanten Abnahmen der Fluoreszenzsignale über 14 Tage nach der Herstellung (Zusatzdatei 1: S1), was auf eine relativ homogene Größenverteilung und hohe Fluoreszenzstabilität hindeutet. Wie vom Lieferanten angegeben, zeigten 100, 500 und 1000 nm PLGA-Partikel Größen von etwa 80,6 ± 19,3 nm, 542,6 ± 128,3 nm und 951,9 ± 237,5 nm (Abb. 1d,e,f). Gemäß Zeta-Potenzial-Messungen betrugen die durchschnittlichen Oberflächenladungen der Partikel −20,6 ± 5,3, −17 ± 4,6 und −16,5 ± 3,5 mit Polydispersitätsindex von 0,057, 0,056 und 0,062 für 100, 500 und 1000 nm Partikel, jeweils, was letztere ihre hochmonodispersen Standards anzeigten. Alle Partikel wurden vortext und dann 5 min in einem Wasserbad soniziert, um die Partikelaggregation weitgehend zu eliminieren. Allerdings wurden kleine Peaks entsprechend 100 und 1000 nm Partikeln mit Durchmessern von etwa 4–6 µm beobachtet, aufgrund der unvermeidbaren Partikelaggregation in sehr geringen Mengen (etwa 3–4%).

Bewertung der Zelllebensfähigkeit und Zytotoxizität

Aufgrund ihrer hervorragenden Biokompatibilität und Biologischen Abbaubarkeit wurden PLGA-Partikel von der FDA und der Europäischen Arzneimittelagentur für biomedizinische Anwendungen zugelassen [27, 28]. PLGA-Partikel werden daher derzeit in der Klinik eingesetzt und breit in präklinischen Studien als Nanoträger angewendet, die Wirkstoffe an spezifische kranke Regionen oder Tumoren liefern. Allerdings werden die Zielgenauigkeit und therapeutische Wirksamkeit von PLGA-Partikeln zumindest teilweise durch das Immunsystem behindert. Zum Beispiel schränkte die hohe Partikel-Phagozytose durch Kupffer-Zellen in der Leber die Nano-Wirkstoffträger stark ein, den Tumorort zu erreichen [15]. Daher ist es von vitaler Bedeutung, fortgeschrittene In-vitro-Modelle zu etablieren, um die Interaktion zwischen Krebszellen, Immunzellen und Partikeln zu untersuchen, um die In-vivo-Situation der Wirkstofffreisetzung besser nachzuahmen. UM-SCC-17A ist eine einzigartige Larynx-Plattenepithelkarzinom-Zelllinie, isoliert aus einem primären Larynxkrebs-Specimen [29]. Allerdings sind Informationen bezüglich ihrer In-vitro-zellulären Aufnahmeeffizienz in Co-Kultursystemen (z. B. Ko-Inkubation von Makrophagen und Krebszellen) noch unzureichend, ein Problem, das angegangen werden muss, um die Vorhersagefähigkeit von In-vivo-Antworten zu verbessern. Zudem wurde bewiesen, dass Partikelgröße und Oberflächenbeschichtung eine wichtige Rolle in der Lieferfähigkeit an solide Tumoren, kranke Stellen und Krebszellen in Tiermodellen und Zellkulturen spielen [30,31,32,33]. Hier wendeten wir daher drei Größen von PLGA an UM-SCC-17A-Karzinomzellen an, um die Auswirkungen der Partikelgröße auf zelluläre Aufnahme und intrazelluläre Verteilung in Monokultur- und Co-Kultursystemen zu untersuchen.

Diese Studie bestimmte die Zelllebensfähigkeit mittels WST-1-Methode für Monokultur THP-1 und UM-SCC-17A Zellen sowie eine Co-Kultur beider Zelltypen. Trotz keiner offensichtlichen Zelltod in Gruppen, die mit 100 und 500 nm PLGA bei allen getesteten Konzentrationen behandelt wurden, reduzierten 500 nm und 1 µm PLGA-Partikel bei der höchsten Konzentration (20 µg/mL) die Zelllebensfähigkeit in Monokultur UM-SCC-17A-Zellen signifikant (Abb. 2a). Wie erwartet, wurde die THP-1-Zelllebensfähigkeit nach 24 h Inkubation mit allen drei PLGA-Typen bei Konzentrationen von 5–20 µg/mL nicht signifikant beeinflusst (≥ 95% Lebensfähigkeit im Vergleich zu unbehandelten Zellen, deren Lebensfähigkeit als 100% betrachtet wird, Abb. 2b). Identisch mit den Ergebnissen der Monokultur UM-SCC-17A-Zellen wurde die Zelllebensfähigkeit im Co-Kultur-System durch die Anwesenheit von 100 und 500 nm PLGA-Partikeln in den drei hier verwendeten Dosierungen nicht verändert, während sie in der mit 20 µg/mL 1 µm PLGA behandelten Gruppe signifikant abnahm (Abb. 2c).

Die Bewertung der Partikelzytotoxizität mittels LDH-Assay dient der Bestimmung der Zellmembranleckage durch Messung der Menge an extrazellulärem LDH [9]. Trotz der leichten Erhöhung der LDH-Werte mit höheren Dosierungen in monokultivierten UM-SCC-17A-Zellen, die mit verschiedenen Dosen von 1 µm PLGA behandelt wurden, wurde keine signifikante Zytotoxizität für die Zellen beobachtet, selbst bei der höchsten Konzentration von 20 µg/mL (Abb. 3a). Unerwartet konnten alle drei PLGA-Größen in verschiedenen Dosierungen keine substanzielle LDH-Freisetzung in den Überstand induzieren, was die unbedeutenden toxischen Effekte auf monokultivierte THP-1-Zellen anzeigt, was auch hochkonsistent mit den oben beschriebenen Zelllebensfähigkeitsergebnissen ist (Abb. 3b). In den Co-Kultur-Experimenten zeigten alle Partikel mit verschiedenen Konzentrationen eine hervorragende Biokompatibilität gegenüber beiden Zelltypen in Bezug auf freigesetzte LDH-Werte (Abb. 3c). Im Allgemeinen deckt der hier verwendete breite Partikelgrößenbereich von 100 nm bis 1 µm die typischen Größen von Nanoträgern (50–200 nm) ab, wie Liposomen, Mizellen, Dendrimere, Polymere und Minizellen. Dieser Bereich umfasst auch sub-mikrongroße Partikel (500 nm Partikel können noch als NPs betrachtet werden, z. B. Partikel mit Größen um 500 nm haben dieselben Clearance-Pfade in der Lunge wie NPs von 10–100 nm [34] und mikrongroße 1 µm. Keines dieser PLGA-Partikel zeigte offensichtliche Zytotoxizität gegenüber THP-1 und/oder UM-SCC-17A-Zellen in Monokultur- und Co-Kultursystemen, außer den 500 nm und 1 µm PLGA-Partikeln bei der höchsten Konzentration gegen UM-SCC-17A und Co-Kultur-Zellen (aber mehr als 85% der Zellen überlebten), was darauf hindeutet, dass sie für Anwendungen in Wirkstofffreisetzungssystemen günstig sind.

Fähigkeiten der zellulären Aufnahme von PLGA in Monokultur- und Co-Kultursystemen

Abbildung 4 zeigt die Zellmorphologie (Abb. 4a,d,g), Zellkerne und 100 nm NPs (Abb. 4b,e,h) und überlagerte vergrößerte Bilder (Abb. 4c,f,i) in Monokultur- und Co-Kultursystemen. Keine Partikel wurden in den unbehandelten Zellen der Kontrollgruppe beobachtet (Zusatzdatei 1: S2). Massive große 100 nm PLGA NP-Agglomerate wurden im Zytoplasma der Makrophagen-Monokultur-Zellen beobachtet (Abb. 4c). Gleichzeitig wies Monokultur UM-SCC-17A eine hervorragende Aufnahmefähigkeit von 100 nm PLGA auf, bewiesen durch die hellgrünen Fluoreszenzsignale, die innerhalb der Zellmembran beobachtet wurden (Abb. 4f). Um die intrazelluläre Anreicherung von PLGA-Partikeln in THP-1 oder UM-SCC-17A Zellen und extrazelluläre Partikel in den Co-Kulturen besser zu veranschaulichen, wurden Überlagerungen von Hellfeldbildern mit Fluoreszenzbildern angewendet, wie in Zusatzdatei 1: S3. Im Co-Kultur-System sind beide Zelltypen in Bezug auf Morphologie und Zellgröße in den Hellfeldbildern unterscheidbar, in denen Makrophagen eine runde Form und kleine Größe aufwiesen, während die Krebszellen eine große Größe und verlängerte Form zeigten. Allerdings zeigten die Krebszellen eine unzureichende zelluläre Aufnahme aufgrund der hohen Aufnahme von 100 nm PLGA durch Makrophagen im Co-kultivierten System. Dies ist zu erwarten, da Makrophagen als effizienter und spezifischer Typ von Immunzellen gelten, die die Phagozytose-Funktion zur Beseitigung fremder Mikroorganismen, Allergene und Partikel ausführen. Ähnlich zeigen Abb. 5 und Abb. 6 qualitative Analysen der zellulären Aufnahmefähigkeit von 500 nm und 1 µm PLGA-Partikeln in Einzelzell- oder gemischten Zellkulturen. Es ist bemerkenswert, dass beide Zellmorphologien nach Behandlung mit verschiedenen PLGA-Größen bei der hier verwendeten Konzentration von 10 mg/mL nicht verändert wurden (Abb. 4a,d,g, Abb. 5a,d,g und Abb. 6a,d,g). 500 nm und 1 µm PLGA-Partikel zeigten stärkere Fluoreszenzintensität in einzelnen UM-SCC-17A-Zellen (Abb. 5e,f und Abb. 6e,f) als in einzelnen THP-1-Zellen (Abb. 5b,c und Abb. 6b,c). In Co-Kultur-Inkubationen (Abb. 5h,i und Abb. 6h,i) sind offensichtliche Signalabnahmen in Krebszellen zu sehen, in denen die Partikel-Fluoreszenzintensität niedriger war als die der Makrophagen. Makrophagen phagozytierten alle Partikeltypen schnell und effektiv, sodass Krebszellen im Co-Kultur-System nicht genug Partikel aufnehmen konnten. Um den Effekt der Phagozytose auf die Aufnahmekapazität der Krebszellen für verschiedene PLGA-Größen zu quantifizieren, wurde eine semi-quantitative optische Analyse durchgeführt. Kurz gesagt, die Partikel-Fluoreszenzintensitäten wurden auf Basis von z. B. 50 einzelnen partikelbeladenen Zellen berechnet, um einen Mittelwert für beide Zelltypen zu erreichen, und der Aufnahmedex der Krebszellen wurde durch Mittelung der intrazellulären Partikel-Fluoreszenzintensität pro Krebszelle, normalisiert auf die der Makrophagen, bestimmt (Abb. 7). In Monokultur betrug der Aufnahmedex der Krebszellen für 100 nm PLGA etwa 1,34 ± 0,19, was darauf hindeutet, dass die Krebszellen mehr Partikel aufgenommen hatten als die von Makrophagen in der Einzelzellkultur (Abb. 7). Dies ist nicht überraschend wegen der hohen Viskosität von PLGA-Partikeln und der größeren Größe von Larynxkrebszellen. Ähnlich wurden 500 nm und 1 µm PLGA auch stark von Krebszellen internalisiert mit Aufnahmedex von etwa 1,5 ± 0,25 und 1,4 ± 0,31 in Monokultur. Die Aufnahmedex für große Partikel fielen in Gegenwart von Makrophagen in Co-Kultursystemen erheblich ab (0,59 ± 0,12 und 0,47 ± 0,1). Gleichzeitig identische zelluläre Internalisierungsfähigkeiten für beide Zelltypen nach 24 h Inkubation von 100 nm PLGA-Partikeln in der gemischten Zellkultur. Insgesamt deuten die hier gesammelten Ergebnisse darauf hin, dass die Aufnahme von Partikeln durch Krebszellen und Makrophagen von unterschiedlichen Aufnahmerouten in Einzelzellkultur und Co-Kultur-Umgebung abhängen könnte. Zudem verringerte die Anwesenheit von Makrophagen die zelluläre Internalisierung von PLGA-Partikeln durch Krebszellen insbesondere für große Partikel, ein biologisches Ereignis, das in In-vivo-Nanomedizin-Wirkstofffreisetzungsstudien beobachtet wurde [3, 15].

Quantifizierung der zellulären Aufnahme durch Durchflusszytometrie

Durchflusszytometrie wird breit genutzt, um Partikel-Zell-Wechselwirkungen quantitativ zu bestimmen, z. B. die größenabhängige Aufnahme von Polystyrol-Partikeln mit Größen von 20 bis 1000 nm durch dendritische Zellen in vivo [35]. FACS wurde daher zur Analyse des Prozentsatzes NP-positiver Zellen und Partikelanzahl in diesen NP-positiven Zellen in Monokultur- und Co-Kultursystemen verwendet. Dann wurden durchschnittliche NP-Anzahlen in einer einzelnen Zelle berechnet, indem die Gesamtfluoreszenzintensität in partikelbeladenen Zellen normalisiert auf die Fluoreszenz der gesamten applizierten Dosis bestimmt wurde. Zum Beispiel wurde etwa 70% von 500 nm PLGA in den Krebszellen abgelagert, während der Rest im Überstand der Zellkulturen verblieb (Zusatzdatei 1: S4). Diese Fluoreszenzintensität, gemessen mit einem Tecan-Reader, wurde dann mit den durchschnittlichen/gesamten FACS-Signalen (FITC-Signalwerte von P5 und P6 in Abb. 8) verglichen, um die Partikelzahl im Co-Kultur-System zu schätzen. Wie in den Co-kultivierten Zellen ausgesät, wurden etwa die Hälfte der Zellen als Makrophagen erkannt und der Rest als Krebszellen betrachtet. Es wurde beobachtet, dass ungefähr 13.000 einzelne 100 nm PLGA-Partikel in Krebszellen und 9700 Partikel in Makrophagen akkumulierten (Abb. 8i) in der Monokultur, konsistent mit den oben genannten mikroskopischen Untersuchungen. Eine viel geringere Partikelanzahl (164 ± 30 und 45 ± 15) wurde von monokultivierten Krebszellen für 500 nm und 1 µm PLGA aufgenommen, mit leicht geringerer Partikelzahl in den jeweiligen Makrophagen (Abb. 8i). Die Anzahl der von einzelnen Zellen aufgenommenen Partikel stimmt gut mit Literaturangaben überein [24]; beispielsweise wurden durchschnittlich 2500 Gold-NPs, beschichtet mit Cetyltrimethylammoniumbromid, in Epithelzellen abgelagert, während PEG-modifizierte Gold-NPs nur wenige Dutzend pro Zelle aufwiesen [36]. In Co-Kultursystemen gab es unerwartet einen leichten Anstieg der 100 nm Partikelzahl in Krebszellen, trotz einer höheren Steigerung der NP-Internalisierung durch Makrophagen. Im Vergleich zum Aufnahmedex in Einzelzell- zu Mischzellkultur verringert er sich auch um etwa 25% für 100 nm PLGA-Partikel. Die Aufnahmedex fielen signifikant mit etwa 2,5- und 3-facher Reduktion im Co-kultivierten System für 500 nm und 1 µm PLGA, jeweils (Abb. 8i). Generell wurde festgestellt, dass die Existenz von Makrophagen die Aufnahmefähigkeit von Krebszellen stark beeinflusst, insbesondere für große Partikel, was auch in hervorragender Übereinstimmung mit den oben genannten Beobachtungen steht.

Induktion der Zellfusion durch PLGA-NPs

Umfangreiche wissenschaftliche Erkenntnisse haben gezeigt, dass die Fusion von Monozyten/Makrophagen zu multinuclierten Riesenzellen (MGCs) in einer breiten Palette biologischer Prozesse auftritt [42, 43]. Im Allgemeinen verursacht die Implantation von Biomaterialien in den Körper eine Fremdkörperreaktion, charakterisiert durch die Fusion von Makrophagen zu MGCs und fibrotische Einkapselung [44]. Eine Vielzahl menschlicher und muriner Primärzellen wie alveoläre Makrophagen, splenische Makrophagen, Mikroglia, knochenmarkszelluläre Makrophagen und Blutzellen sowie Zelllinien wie RAW264.7 und UG3 wurden auch häufig zur Bildung von MGCs in vitro beobachtet [26, 45]. Es ist bekannt, dass Makrophagen einen fusogenen Phänotyp bilden, wenn sie nicht in der Lage sind, Fremdmaterialien durch Phagozytose zu internalisieren, aufgrund der großen Partikel- oder Implantatgröße. Bisher ist unklar, ob In-vitro-Makrophagen-Fusion mit der Partikelgröße im Bereich 100–1000 nm zusammenhängt, die leicht phagozytiert werden können. Hier wurden Zellfusionen in allen Gruppen durch mikroskopische Untersuchung beobachtet (Abb. 9). Die zelluläre Fusion wurde nur bestätigt, wenn mehrere Kerne gefunden wurden, die dasselbe Zytoplasma in sowohl Fluoreszenzbildern als auch Hellfeldbildern teilten. Spontane Bildung von Riesen-Zellen durch THP-1-Zellen trat in der Kontrollgruppe ohne Partikelbehandlung auf (Abb. 9a), mit einem Fusionsprozentsatz von etwa 10% der Gesamtzellen (Abb. 9h), wie in der Literatur berichtet [46]. Größenabhängige zelluläre Fusion wurde für 100 und 500 nm PLGA-Partikel gefunden, während 1 µm PLGA eine unbedeutende Steigerung der Fusionen in Monokultur induzierte. Dies könnte auf die geringe Anzahl von 1 µm PLGA-Partikeln zurückzuführen sein, die den Zellen ausgesetzt waren (ungefähr 60 Partikel pro Zelle bei einer Konzentration von 10 µg/mL). Wenn Makrophagen mit Krebszellen co-kultiviert wurden, stiegen die Prozentsätze der MGC-Bildung in allen Gruppen im Vergleich zu den entsprechenden Monokultur-Gruppen. Insbesondere gab es einen signifikanten Anstieg der zellulären Fusion für 1 µm PLGA (19%) in der gemischten Zellkultur. Der stärkste Anstieg der Fusion trat in co-kultivierten 500 nm PLGA-Partikeln auf, was auf die große Partikelgröße und ausreichende pro Zelle aufgenommene Partikelzahlen zurückzuführen sein könnte.

Die molekulare Maschinerie, die an der Makrophagen-Fusion beteiligt ist, wurde breit untersucht und erreichte substantialen Fortschritt [43]. Beispielsweise ermöglichte die Bildung von Makrophagen-Fusionsrezeptoren CD47 und CD44 zusammen die Vermittlung des Prozesses der Makrophagen-Fusion und die nachfolgende Differenzierung von Riesen-Zellen [42], und miR-223-Lieferung durch ein NP-Vesikel erlaubte deren Abschwächung [47]. Daher sollten weitere Studien sich auf die Bestimmung der Schlüsselmoleküle konzentrieren, die partikelinduzierte Makrophagen-Fusion regulieren, und die dominanten Rezeptoren, die in der Riesen-Zellmembran exprimiert werden. Ein weiteres wichtiges Anliegen ist das Schicksal der MGCs. Es wird angenommen, dass MGCs, die mit Partikeln oder Stimuli fusioniert sind, anschließend den Prozess der Apoptose oder Nekrose durchlaufen [48]. Dies könnte zur Freisetzung unverdauter Partikel oder anderer riesiger Materialien an andere Zellen in vitro oder biologische Gewebe in vivo führen, was langfristige Entzündungsreaktionen oder Granulome weiter induzieren könnte. Andererseits könnte die Makrophagen-Fusion selbst für die NP-Wirkstofffreisetzung vorteilhaft sein, beispielsweise in Tumorgeweben könnte die erneute Freisetzung von Wirkstoffen aus Makrophagen an Krebszellen eine verstärkte Tumortötungsfähigkeit darstellen. Noch wichtiger: Zukünftige Nanomedizin-Studien sollten untersuchen, wie die Anwendung der Makrophagen-Fusion für Nanoträger-Wirkstofffreisetzung zur verbesserten Krankheitsdiagnose und -therapie genutzt werden kann. Dies liegt daran, dass Makrophagen nicht nur ein häufiger Typ von Immunzellen im Körper mit hervorragender Aufnahmefähigkeit von Nano-Wirkstoffen sind, sondern auch in zielgerichteter Gentherapie zur Reparatur verletzter Gewebe eingesetzt werden könnten.

Schlussfolgerung

Soweit uns bekannt, berichtete diese Studie erstmals über die kompetitive zelluläre Aufnahme von PLGA-Partikeln mit Größen von 100 nm bis 1 µm in co-kultivierten UM-SCC-17A Larynxkrebszellen und THP-1 Monozyten/Makrophagen. Die hier gesammelten Daten bewiesen, dass Immunzellen die Partikelinternalisierung durch Krebszellen in vitro verändern/verringern können, was ähnlich den vorherigen Ergebnissen in In-vivo-Nanoträger-Wirkstofffreisetzungsstudien ist. Größenabhängige und Zellkultur-bezogene Makrophagen-Zellfusion, verursacht durch PLGA-Partikel, wurde hier ebenfalls demonstriert. Zukünftige Studien sollten den Aufnahmemechanismus in Co-Kultursystemen untersuchen und neuartige Ansätze entwickeln, um einen höheren Aufnahmedex für Larynxkrebszellen in Gegenwart von Phagozyten zu erreichen. Zudem ist eine ausführliche Bewertung des intrazellulären Transports und Schicksals von Nano-Wirkstoffträgern in Co- oder Tri-Kultursystemen in 3D, die die In-vivo-Bedingungen besser nachahmen, erforderlich, bevor Tierstudien in vivo und sogar klinische Studien genutzt werden.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel [und seinen ergänzenden Informationsdateien] enthalten.

Abkürzungen

PLGA:

Poly(lactid-co-glycolid)säure

HNSCC:

Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom

EPR:

Enhanced permeability and retention

NPs:

Nanopartikel

ICG:

Indocyaningrün

MPS:

Mononukleäres Phagozyten-System

LDH:

Lactatdehydrogenase

FACS:

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

MGC:

Multinuclierte Riesenzellen

DLS:

Dynamische Lichtstreuung