Quantitative Bewertung der zellulären Internalisierung von polymeren Nanopartikeln in Kehlkopfkrebszellen und Immunzellen für eine verbesserte Wirkstoffabgabe

Einführung

Krebs ist mit rund 10 Millionen neuen Todesfällen im Jahr 2018 eine der führenden Todesursachen weltweit [1]. Das Larynxkarzinom (Krebszellen entstehen aus dem Kehlkopf) ist die zweithäufigste bösartige Erkrankung von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs (HNSCC) und machte im Jahr 2018 etwa 180.000 Neuerkrankungen und 95.000 Todesfälle aus [2]. Derzeit werden zielgerichtete Medikamente als optionale Behandlung für Herausforderungen entwickelt, die durch traditionelle Therapien wie Operation, Strahlentherapie und Chemotherapie entstehen.[3] Die wissenschaftlichen Bemühungen wurden vorangetrieben, um das Targeting und die Wirksamkeit von Arzneimitteln zu verbessern und unerwünschte Nebenwirkungen zu reduzieren, beispielsweise durch die Entwicklung neuartiger Arzneimittel-Nanoträger (d. h. , Mikronadeln), personalisierte Krebsmedikamente und therapeutische Antikörper-gezielte Abgabesysteme [4].

Nanocarrier werden häufig verwendet, um Krebsmedikamente wie Cisplatin, Paclitaxel und Docetaxel zu beladen, um ihre Wasserlöslichkeit, Bioverfügbarkeit und Stabilität für eine verbesserte Wirkstoffabgabe und Wirksamkeit zu verbessern [3, 4]. Im Allgemeinen ermöglicht die Wirkstoffabgabe auf Nanopartikelbasis (NP) die Abgabe einer breiten Palette anderer Substanzen (z. B. , Proteine, Antikörper, Impfstoffe und Nukleinsäuren) auf bestimmte Körperregionen in Tiermodellen und Patienten [4, 5]. Der sogenannte Enhanced Permeability and Retention (EPR)-Effekt hat jedoch dazu geführt, dass die Targeting-Effizienz bei den verschiedenen Krebsarten erheblich variiert [6]. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Ablagerung von Nano-Wirkstoff-Trägern (hier Gold-NPs) an Tumoren bevorzugt vom Prozess der Transzytose abhängt [7], einer Art biologischen transzellulären Transports, bei dem Substanzen/NPs von einer Seite nach ein anderer umfasst die Verläufe der Endozytose, des vesikulären Transfers und der Exozytose. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass die widersprüchlichen Ergebnisse in Bezug auf die Mechanismen der gezielten Wirkstoffabgabe von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Grundlagen der zellulären Interaktion mit Nanowirkstoffen oder NPs sind, wobei mehrere experimentelle Strategien von In-vitro-Zellkulturen bis Ex-vivo-Gewebekulturen verwendet werden und in-vivo-Tierstudien.

Zahlreiche Nanocarrier wie Liposomen, Albumin-NPs (NPs), Silica-NPs und Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA) wurden klinisch zur Behandlung verschiedener Krebsarten einschließlich des Kehlkopfkarzinoms eingesetzt [4]. Polymerbasierte NPs wie Micellen und PLGA besitzen aufgrund ihrer vielseitigen Formulierungen von Nanowirkstoffen durch einfaches Mischen oder kovalenter Konjugation, ausgezeichnete Selbstorganisation, hohe Fähigkeit zur Wirkstoffbeladung und Biokompatibilität ein großes Potenzial in biomedizinischen Anwendungen [8, 9 ]. Beispielsweise ermöglichen Polyethylenglycol (PEG)-beschichtete PLGA-Nanocarrier, die mit Doxorubicin und Indocyaningrün beladen sind, eine synergistische chemo-photothermische Therapie bei Brustkrebs [10]. Sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Studien haben außerdem gezeigt, dass mit Cisplatin beladene Mizellen eine ausgezeichnete Antikrebsaktivität gegen orthotope HNSCC-Tumoren aufweisen (d. h. , SAS-L1 und HSC-2) [11]. Obwohl mehrere polymerbasierte Nanowirkstoffe wie PLGA und Micellen für die klinische Anwendung zugelassen sind oder in klinischen Studien evaluiert werden [4, 6], werden viele weitere polymere Nanowirkstoffe mit verschiedenen Kopf-Hals-Krebszellen präklinisch untersucht Linien und Xenotransplantat-Tumormodelle von Tieren [11,12,13,14].

Wissenschaftliche Beweise haben die Bedeutung der immunologischen Reaktionen des Wirts auf Nano-Wirkstoff-Träger hervorgehoben, da diese NPs, sobald sie einmal in den Körper gelangen, vom Immunsystem unweigerlich erkannt werden. Makrophagen gelten als die erste Verteidigungslinie des zellulären Wirts und sind auf die Neutralisierung und Beseitigung von Allergenen, Mikroorganismen und Fremdpartikeln (z. B. .) spezialisiert , Nanocarrier) über Phagozytose und die darauffolgende Aktivierung von Immunantworten. Die meisten der neuartigen Nanoträger konnten in vivo aufgrund der effizienten Akkumulation von NPs im mononuklearen Phagozytensystem (MPS), wie Kupffer-Zellen in der Leber und Makrophagen der roten Pulpa in der Milz, nicht gezielt in bestimmte erkrankte Regionen oder Tumoren transportiert werden [fünfzehn]. Daher ist das Verständnis der Mechanismen der zellulären Aufnahme von Nanopartikeln durch Immunzellen wie Monozyten und Makrophagen von entscheidender Bedeutung, da es die Lebensdauer von Nanoträgern in relevanten Geweben und biologischen Flüssigkeiten bestimmt. Das aufkommende In-vitro-Zell-Kokultursystem hat daher aufgrund der steigenden Nachfrage nach aussagekräftigeren Ergebnissen, die den In-vivo-Zustand besser widerspiegeln können, allmählich zunehmende Aufmerksamkeit in den Bereichen Nanomedizin und Toxikologie auf sich gezogen [16]. In der Tat hat sich gezeigt, dass Kokultursysteme eine realistische Situation bei der Nachahmung von gesunden und erkrankten Gewebezuständen aufweisen [17] und wurden zuverlässig in NP-Zellaufnahme- und Arzneimittelabsorptionsstudien verwendet [18, 19, 20, 21]. Die Verwendung von Kokultur-Krebszell- und Immunzellmodellen bietet im Allgemeinen eine geeignete Plattform, um die Aufnahmewege und -mechanismen dieser Nanomaterialien in Zellen zu untersuchen, was das Design von Nanoträgern erleichtern könnte, die besser auf Krebszellen ausgerichtet sind und gleichzeitig die NP-Phagozytose reduzieren. Daher ist es von wesentlicher Bedeutung, die Aufnahmeeffizienz und das Schicksal von NPs in Krebszellen in Gegenwart von Immunzellen zu bestimmen. Die meisten Nanoträger wurden mit Durchmessern von 50–200 nm entwickelt, um den EPR-Effekt zu nutzen und die Blutzirkulation zu verlängern, während größere NPs (> 500 nm) von der MPS effizient entfernt werden sollen [6]. PLGA, ein von der FDA zugelassener Nano-Träger, in verschiedenen Größen (100, 500 und 1000 nm) wurde daher ausgewählt, um die Aufnahmefähigkeit von UM-SCC-17A (einer klassischen Plattenepithelkarzinomzelllinie des Kehlkopfes) [22] und THP- 1 (eine humane akute monozytäre Zelllinie) Zellen. Mehrere In-vitro-Studien haben PLGA-Nanocarrier verwendet, um Medikamente zur Abtötung von HNSCC-Krebszellen in Monokulturen zu liefern [12, 13, 23]. Dies ist die erste Studie, die die Aufnahmeeffizienz und den Mechanismus der NP-Aufnahme durch Immunzellen und Kehlkopfkrebszellen synchron in ein Co-Kultur-Modell durch den Einsatz unterschiedlicher PLGA-Größen, das eine grundlegende Grundlage für die Entwicklung einer neuartigen sicheren Nanomedizin für die HNSCC-Therapie darstellen könnte.

Materialien und Methoden

Materialien

In dieser Studie wurden drei kommerzialisierte PLGA-Partikel (Sigma-Aldrich) mit unterschiedlichen Größen, einschließlich 100 nm, 500 nm und 1000 nm, verwendet. Alle Partikel wurden mit grünen Fluorophoren mit optischen Anregungs- und Emissionswellenlängen (ex/em) von 460 nm und 500 nm beladen. Alle Partikel wurden in Pulverform erhalten und zur weiteren Verwendung in destilliertem Wasser mit einer Endkonzentration von 10 mg/ml suspendiert. Hydrodynamische Durchmesser und Zetapotentiale von drei Partikeln wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) durchgeführt, die mit einem Malvern Zeta Sizer Nano Instrument (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK) durchgeführt wurde. Die Stammsuspensionen jedes Partikels wurden für die DLS-Messung 1:100 in 80 µl destilliertem Wasser verdünnt. Nach Angaben des Herstellers wurden 3 Wiederholungsmessungen für jedes Partikel durchgeführt.

Zellkulturen von UM-SCC-17A und THP-1 und Partikelexposition

Die humane Larynxkarzinom-Zelllinie UM-SCC-17A und die humane Monozyten/Makrophagen-Zelllinie THP-1, bezogen von Sigma-Aldrich, USA bzw. Shanghai Hengya Biotechnology Company (Shanghai, China), wurden verwendet, um das In-vitro-Modell zu bauen diese Studie. UM-SCC-17A-Zellen und THP-1-Zellen wurden entweder in DMEM [22] oder RPMI-1640-Zellkulturmedium, ergänzt mit 10 % FBS (Gibco, Deutschland) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung (Gibco, Deutschland) bei 37 °C kultiviert °C mit 5 % CO2. THP-1-Zellen wurden 72 h lang 100 nM Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) (Sigma, USA)-Lösungen ausgesetzt, bevor die Zellen ausgesät wurden, um sich in Makrophagen zu differenzieren. Beide Zellen wurden alle 3 Tage mit 0,5 % Trypsin-EDTA passagiert und die Zellmorphologie wurde jeden Tag überprüft, um die Gesundheit der Zellen zu gewährleisten.

Die Zellen wurden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 0,1 × 10 ⁶ . ausgesät Zellen/Well für monokultivierte Zellen für den WST-1- und LDH-Assay oder auf sterilem Deckglas in 24-Well-Platten für die Fluoreszenzmikroskopie. Für das co-kultivierte Modell wurden UM-SCC-17A-Zellen zuerst in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 50.000/Well über Nacht ausgesät und dann mit 50.000/Well THP-1-Zellen versetzt. Die Partikel wurden in 500 µl entweder in jeweiligem Zellkulturmedium für monokultivierte UM-SCC-17A- und THP-1-Zellen oder 1:1 gemischtes Zellkulturmedium für cokultivierte Zellen suspendiert und Zellproben für 24 h mit abschließendem ausgesetzt Konzentrationen von 5, 10 und 20 µg/ml für den WST-1- und LDH-Assay oder 10 µg/ml für die Fluoreszenzmikroskopie.

Für die FACS-Messung wurden Zellen in 12-Well-Platten in der gleichen Weise wie zuvor beschrieben mit einer Dichte von 250.000 Zellen/Well oder jeweils 125.000 Zellen/Well für das cokultivierte Modell ausgesät. Die Zellen wurden über Nacht in 1 ml Zellkulturmedium gezüchtet und 24 Stunden lang PLGA-Partikeln in einer Endkonzentration von 10 µg/ml ausgesetzt.

Zelllebensfähigkeitstest

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem Zellproliferationsreagenz WST-1-Kit (Roche, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Kurz gesagt, die WST-1-Lösung wurde 1:10 entweder in jeweiligem Zellkulturmedium für Monokultur UM-SCC-17A oder THP-1 oder 1:1 gemischtes Zellkulturmedium für cokultivierte Zellen verdünnt. Der Überstand wurde nach der Exposition abgelassen und die Zellen wurden mit 500 µl Arbeitslösung des WST-1-Assays bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert. Proben wurden gesammelt und bei 14.000 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert, um die Partikel zu entfernen. Die Extinktion (OD-Wert) der Lösungen wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm mit Infinite ^® . gemessen F200 (Tecan, USA). Die Extinktionswerte wurden korrigiert, indem der Wert einer Blindprobe, die nur die WST-1-Arbeitslösung enthielt, abgezogen wurde, und die relativen Lebensfähigkeiten der Zellen wurden mit der unbehandelten Kontrollprobe verglichen.

Zellmembranleckagetest

Die Freisetzung von Lactatdehydrogenase (LDH) wurde unter Verwendung eines kommerziellen Cytotoxizitäts-Detektionskits (LDH) (Roche, Deutschland) gemessen, um die Cytotoxizität durch PLGA-Partikel zu bestimmen. Der Überstand der Zellen wurde 24 h nach der Exposition gesammelt, 10 min bei 14.000 U/min zentrifugiert und 1:10 in 200 µl vollständigem Zellkulturmedium verdünnt. Die Positivkontrolle wurde als die Gesamtfreisetzung von LDH durch Inkubation der Zellen mit 0,2% Triton X-100 bei 37 °C für 15 Minuten und 1:50 verdünnt in 200 µl vollständigem Zellkulturmedium definiert. Die Proben wurden mit 100 Arbeitslösungen des LDH-Assays für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die Reaktion wurde mit 50 µl 1% HCl gestoppt. Die Absorption bei der Wellenlänge von 492 nm wurde mit Infinite®F200 (Tecan, USA) gemessen und die relativen LDH-Konzentrationen wurden gemäß der folgenden Gleichung berechnet

Fluoreszenzmikroskopie

Die Zellen wurden durch Hoechst-Färbung zur Lokalisierung der Partikel unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Die Zellen wurden nach 24 h Exposition der Partikel dreimal mit PBS gewaschen und 10 min bei Raumtemperatur mit 4% Formaldehyd inkubiert. Nach der Fixierung mit Formaldehyd wurden die Zellen dann mit 200 µl Färbelösung inkubiert, die 1:1000 verdünnte Hoechst . enthielt und 1 % BSA in PBS für 30 Minuten. Dann wurden die Deckgläser auf den Kopf gestellt und mit einem Tropfen DAKO-Fluoreszenz-Anti-Fade-Mittel zur Visualisierung gehalten. Vier optische Kanäle wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop eingestellt, darunter ein helles Feld für die Zellmorphologie, DAPI für Zellkerne und GFP für Partikel. Die Expositionszeiten des Partikelkanals für jedes Fluoreszenzbild wurden aufgezeichnet und zur Homogenisierung der Fluoreszenzintensität über verschiedene Partikel hinweg verwendet, und intrazelluläre Partikel wurden anhand der Fluoreszenzintensität unter Verwendung zufällig ausgewählter Bereiche von ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij .) berechnet /). Der Aufnahmeindex über verschiedene Partikel wurde zwischen monokultivierten oder cokultivierten UM-SCC-17A-Zellen verglichen. Kurz gesagt wurde die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) internalisierter Partikel in z. B. 50 Zellen für jeden Zelltyp berechnet, die als Subtraktionswert zwischen der Gesamtfluoreszenzintensität (I _Gesamt ) eines bestimmten Bereichs und die Autofluoreszenz (I _automatisch ) der gleich großen Fläche in der partikelfreien Regionsgleichung [24, 25]. Der Aufnahmeindex von Krebszellen wurde durch den MFI von UM-SCC-17A, normalisiert auf den von THP-1-Zellen, entweder in einem monokultivierten oder kokultivierten Modell bestimmt. Die Berechnung wurde nach der folgenden Gleichung durchgeführt:

Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)

Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) wurde durchgeführt, um die Aufnahmefähigkeit von drei Partikeln zu messen. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen, um das Zellmedium und dissoziative Partikel 24 h nach der Exposition zu entfernen, und mit 200 µl 0,5% Trypsin-EDTA (Gibco, Deutschland) bei 37 °C für 4 Minuten inkubiert, um die Zellen von der Platte zu entfernen . Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 ml vollständigem Zellkulturmedium gestoppt und die Zellsuspension wurde zur FACS-Messung in ein Glasröhrchen überführt und 5 min bei 300 × G, 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgelassen und die Zellen wurden in 200 µl PBS suspendiert und auf Eis konserviert. Lebende Zellen wurden zuerst von Trümmern und toten Zellen unter Verwendung von Vorwärtsstreuung (FSC-A) (SSC-A) abgegrenzt. Dann wurden die cokultivierten Zellen unter Verwendung von APC-Kanal versus FSC-A analysiert, um UM-SCC-17A-Zellen von Makrophagen basierend auf der Zellgröße zu trennen. Für jede Probe wurden insgesamt 30.000 Zellen analysiert und die mittlere Fluoreszenzintensität für jede Zelle wurde berechnet und über verschiedene Partikel normalisiert. In der Zwischenzeit wurden nach 24-stündiger Inkubation der Partikel mit Zellen der Zellkulturüberstand, der Waschpuffer (dreimal gewaschen, um die an der Zelloberfläche haftenden Restpartikel zu entfernen) und die Zellen (trypsinisierter Verdau) gesammelt, um die Fluoreszenzintensität mit einer Mikroplatte zu messen Lesegerät (Infinite®F200, Tecan). Durch diesen Ansatz kann der Prozentsatz der von Zellen aufgenommenen Partikel für jede Gruppe bestimmt werden, zum Beispiel etwa 30.000 Partikel, die einer einzelnen Zelle in einer 12-Wells/Platte (insgesamt 250.000 Zellen) bei einer Dosierung von 5 µg von 100 nm . ausgesetzt wurden PLGA-Partikel, was zu durchschnittlich 13.000 Partikeln führt, die von einzelnen Zellen internalisiert werden, was etwa 43% der applizierten Dosis entspricht, die an die Zellen abgegeben wird. Dieser gelieferte Prozentsatz kann weiter verwendet werden, um die Partikelanzahl im co-kultivierten System für jeden Zelltyp in FACS zu berechnen.

Quantifizierung der Zellfusion

Die Fusion von Makrophagen zu mehrkernigen Riesenzellen (MGC) wurde als Riesenzelle definiert, die morphologisch zwei oder mehr Kerne in einem normalen Zytoplasma enthält, die in Hellfeldbildern und Fluoreszenzbildern nach Färbung klar und synchron identifiziert werden können, wie in der Literatur beschrieben [26] . Der Prozentsatz der Zellfusion wurde durch die Anzahl der MGC-Kerne (manuelles Zählen) berechnet, die auf die Gesamtzellzahl normalisiert wurden, die mit einem automatisierten Ansatz in ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) bestimmt wurde.

Statistische Analyse

Zur statistischen Analyse und Ergebnisvisualisierung wurde die Software GraphPad V8.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) verwendet. Nach Einweg-ANONA wurde entweder die Holm-Sidak-Methode oder der t-Test zum Vergleich von Mehrgruppenergebnissen bzw. Zweigruppenergebnissen durchgeführt. Alle Experimente wurden mit unabhängigen Verdreifachungen durchgeführt und die Daten wurden als mittlere ± ± Standardabweichung (STD) dargestellt. Ergebnisse mit p Wert < 0.05 (*) und p < 0,01 (**) wurden als signifikant angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung von Poly(milchsäure-co-glycolsäure)-Partikeln

Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von PLGA-Partikeln (Abb. 1a,b,c) zeigten eine robuste Fluoreszenzintensität und keine signifikante Abnahme der Fluoreszenzsignale im Verlauf von 14 d nach Präparation (Zusatzdatei 1:S1), was auf eine relativ homogene Größenverteilung und hohe Fluoreszenz hindeutet. Stabilität. Wie vom Lieferanten angegeben, zeigten 100-, 500- und 1000-nm-PLGA-Partikel die Größen von etwa 80,6 ±   19,3 nm, 542,6 ± 128,3 nm bzw. 951,9 ± 237,5 nm (Abb. 1d, e, f). Laut Zetapotentialmessungen wurden die durchschnittlichen Oberflächenladungen auf den Partikeln zu − 20,6 ± 5,3, − 17 ± 4,6 und − 16,5 ± 3,5 mit einem Polydispersitätsindex von 0,057, 0,056 und 0,062 für 100, 500 und 1000 . gefunden nm-Partikel, wobei letztere ihre stark monodispersen Standards anzeigten. Alle Partikel wurden verwirbelt und dann 5 Minuten lang in einem Wasserbad beschallt, um die Partikelaggregation weitgehend zu beseitigen. Aufgrund der unvermeidlichen Partikelaggregation in sehr kleinen Mengen (ca. 3–4 %) wurden jedoch kleine Peaks, die 100- und 1000-nm-Partikeln entsprachen, mit Durchmessern von etwa 4–6 µm beobachtet.

Charakterisierung von PLGA-Partikeln. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zeigen die unterschiedlichen Größen (a 100 nm, b 500 nm und c 1 µm) von PLGA-Partikeln. Diese Partikel können unter der optischen Mikroskopie von Olympus nachgewiesen werden und zeigen eine relativ gleichmäßige Partikelgrößenverteilung in Wassersuspension. Messungen der dynamischen Lichtstreuung (DLS) zeigen die volumengewichtete Größenverteilung für 100 nm (d ), 500 (e ), 1 µm (f ) PLGA-Partikel. Trotz eines kleinen Teils der Partikelaggregation (kleinere Peaks:3–4%) in 100 nm- und 1 µm-PLGA-Suspensionen ist die Gesamtpartikelgrößenverteilung aufgrund des schmalen Hauptpeaks recht homogen

Bewertung der Zelllebensfähigkeit und Zytotoxizität

Aufgrund ihrer hervorragenden Biokompatibilität und biologischen Abbaubarkeit wurden PLGA-Partikel von der FDA und der European Medicine Agency für biomedizinische Anwendungen zugelassen [27, 28]. PLGA-Partikel werden daher derzeit in der Klinik eingesetzt und finden in präklinischen Studien breite Anwendung als Nanocarrier, die Medikamente zu bestimmten erkrankten Regionen oder Tumoren transportieren. Die Targeting-Effizienz und therapeutische Wirksamkeit von PLGA-Partikeln werden jedoch zumindest teilweise durch das Immunsystem behindert. Beispielsweise schränkte die Phagozytose mit hohen Partikeln durch Kupffer-Zellen in der Leber die Nano-Wirkstoff-Träger stark daran ein, in die Tumorstelle einzudringen [15]. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, fortschrittliche In-vitro-Modelle zu etablieren, um die Interaktion zwischen Krebszellen, Immunzellen und Partikeln zu untersuchen, um die In-vivo-Situation der Wirkstoffabgabe besser nachzuahmen. UM-SCC-17A ist eine einzigartige Larynx-Plattenepithelkarzinom-Zelllinie, die aus der primären Larynxkrebs-Probe isoliert wurde [29]. Informationen zu seiner zellulären In-vitro-Aufnahmeeffizienz in Kokultursystemen (z. B. , Co-Inkubation von Makrophagen und Krebszellen) ist immer noch unzureichend, ein Problem, das angegangen werden muss, um die Vorhersagefähigkeit von In-vivo-Reaktionen zu verbessern. Darüber hinaus wurde in Tiermodellen und Zellkulturen nachgewiesen, dass Partikelgröße und Oberflächenbeschichtung eine wichtige Rolle bei der Abgabefähigkeit an solide Tumore, erkrankte Stellen und Krebszellen spielen [30,31,32,33]. Hier haben wir daher drei PLGA-Größen auf UM-SCC-17A-Karzinomzellen angewendet, um die Auswirkungen der Partikelgröße auf die zelluläre Aufnahme und die intrazelluläre Verteilung in Monokultur- und Co-Kultursystemen zu untersuchen.

In dieser Studie wurde die Lebensfähigkeit der Zellen mit der WST-1-Methode (4-[3-(4-Iodphenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzoldisulfonat) für die Monokultur THP-1 . bestimmt und UM-SCC-17A-Zellen, sowie eine Co-Kultur beider Zelltypen. Obwohl in Gruppen, die mit 100 und 500 nm PLGA bei allen getesteten Konzentrationen behandelt wurden, kein offensichtlicher Zelltod auftrat, reduzierten 500 nm und 1 µm PLGA-Partikel bei der höchsten Konzentration (20 µg/ml) die Zelllebensfähigkeit in Monokultur UM-SCC-17A . signifikant Zellen (Abb. 2a). Erwartungsgemäß war die Lebensfähigkeit der THP-1-Zellen nach 24 Stunden Inkubation mit allen drei PLGA-Typen in Konzentrationen von 5–20 µg/ml nicht signifikant beeinträchtigt (≥ 95 % Lebensfähigkeit im Vergleich zu unbehandelten Zellen, deren Lebensfähigkeit als 100 % angesehen wird). , Abb. 2b). Identisch mit den Ergebnissen von Monokultur-UM-SCC-17A-Zellen wurde die Zelllebensfähigkeit im Kokultursystem durch die Anwesenheit von 100 und 500 nm PLGA-Partikeln in drei hier verwendeten Dosierungen nicht verändert, während sie in der mit 20 . behandelten Gruppe signifikant abnahm µg/ml 1 µm PLGA (Abb. 2c).

Bestimmung der Zellviabilität in Monokultur- und Co-Kulturzellen unter Verwendung des WST-Assays. UM-SCC-17A (a ) und THP-1-Zellen (b ) und co-kultivierte UM-SCC-17A- und THP-1-Zellen (c ) wurden mit verschiedenen Konzentrationen (5–20 µg/ml) von PLGA-Partikeln in drei Größen behandelt

Die Bewertung der Partikelzytotoxizität unter Verwendung des LDH-Assays besteht darin, die Leckage der Zellmembran durch Messung der Menge an extrazellulärem LDH zu bestimmen [9]. Die Freisetzung dieses zytoplasmatischen Enzyms in den Zellkulturüberstand ist charakteristisch für eine Zellmembranschädigung, die zum irreversiblen Zelltod führt. Trotz der leichten Erhöhung der LDH-Spiegel mit höheren Dosierungen in Monokultur-UM-SCC-17A-Zellen, die mit verschiedenen Dosen von 1 µm PLGA behandelt wurden, wurde selbst bei der höchsten Konzentration von 20 µg/ml keine ausgeprägte Zytotoxizität für die Zellen beobachtet (Abb. 3a). . Es überrascht nicht, dass alle drei hier verwendeten PLGA-Größen in verschiedenen Dosierungen nicht in der Lage waren, eine wesentliche LDH-Freisetzung in den Überstand zu induzieren, was auf die unbedeutenden toxischen Wirkungen auf Monokultur-THP-1-Zellen hinweist, was auch sehr gut mit den oben beschriebenen Zelllebensfähigkeitsergebnissen übereinstimmt (Abb . 3b). In den Kokulturexperimenten zeigten alle Partikel mit unterschiedlichen Konzentrationen eine ausgezeichnete Biokompatibilität gegenüber beiden Zellen in Bezug auf die freigesetzten LDH-Spiegel (Abb. 3c). Im Allgemeinen deckt der hier verwendete breite Partikelgrößenbereich von 100 nm bis 1 µm die typischen Größen von Nanocarriern (50–200 nm) wie Liposomen, Mizellen, Dendrimere, Polymere und Minizellen ab. Dieser Bereich umfasst auch Partikel im Submikrometerbereich (500 nm-Partikel können immer noch als NPs betrachtet werden, z. B. Partikel mit einer Größe von etwa 500 nm haben die gleichen Clearance-Pfade in der Lunge wie die von NPs in 10–100 nm [34] und mikrometergroßen 1 µm. Keines dieser PLGA-Partikel zeigte eine offensichtliche Zytotoxizität gegenüber den THP-1- und/oder UM-SCC-17A-Zellen in Monokultur- und Kokultursystemen, mit Ausnahme der 500-nm- und 1-µm-PLGA-Partikel in der höchsten Konzentration gegen UM-SCC- 17A- und Co-Kulturzellen (aber mehr als 85% der Zellen überleben), was darauf hindeutet, dass sie für Anwendungen in Medikamentenabgabesystemen günstig sind.

Bestimmung der Zytotoxizität gegenüber Monokultur- und Co-Kulturzellen mit dem LDH-Assay. UM-SCC-17A (a ) und THP-1-Zellen (b ) und cokultivierte Zellen (c ) wurden mit PLGA-Partikeln behandelt. Nach 24 Stunden Inkubation von Partikeln (hier mit unterschiedlichen Größen und Konzentrationen) und Zellen wurde kein signifikanter Zelltod beobachtet, sowohl in Monokultur- als auch in Kokultursystemen

Fähigkeiten der zellulären Aufnahme von PLGA in Monokultur- und Kokultursystemen

Abbildung 4 zeigt die Zellmorphologie (Fig. 4a,d,g), Zellkerne und 100 nm-NPs (Fig. 4b,e,h) und zusammengeführte vergrößerte Bilder (Fig. 4c,f,i) in Monokultur und Co- Kultursysteme bzw. In den unbehandelten Zellen der Kontrollgruppe wurden keine Partikel beobachtet (Zusatzdatei 1:S2). Im Zellzytoplasma der Makrophagen-Monokulturzellen wurden massive, großformatige 100 nm-PLGA-NP-Agglomerate beobachtet (Abb. 4c). In der Zwischenzeit zeigte die Monokultur UM-SCC-17A eine ausgezeichnete Aufnahmefähigkeit von 100 nm PLGA, was durch die hellgrünen Fluoreszenzsignale belegt wurde, die innerhalb der Zellmembran beobachtet wurden (Abb. 4f). Um die intrazelluläre Akkumulation von PLGA-Partikeln in THP-1- oder UM-SCC-17A-Zellen und extrazellulären Partikeln in den Kokulturen besser zu veranschaulichen, wurden Überlagerungen von Hellfeldbildern mit Fluoreszenzbildern wie in Zusatzdatei 1:S3) aufgebracht. Im Kokultursystem sind beide Zelltypen hinsichtlich Morphologie und Zellgröße in den Hellfeldbildern unterscheidbar, in denen Makrophagen eine runde Form und eine geringe Größe aufwiesen, während die Krebszellen eine große und längliche Form aufwiesen. Die Krebszellen zeigten jedoch aufgrund der hohen Aufnahme von 100 nm PLGA durch Makrophagen im kokultivierten System eine unzureichende zelluläre Aufnahme. Dies wird erwartet, da Makrophagen als effizienter und spezifischer Typ von Immunzellen angesehen werden, die die Phagozytosefunktion zur Beseitigung von fremden Mikroorganismen, Allergenen und Partikeln erfüllen. In ähnlicher Weise zeigen Abb. 5 und Abb. 6 eine qualitative Analyse der zellulären Aufnahmefähigkeit von 500 nm- und 1 µm-PLGA-Partikeln in Einzelzell- bzw. Mischzellkulturen. Es ist bemerkenswert, dass beide Zellmorphologien nach der Behandlung mit PLGA-Partikeln unterschiedlicher Größe bei der hier verwendeten Konzentration von 10 mg/ml nicht verändert wurden (Abb. 4a, d, g, Abb. 5a, d, g und Abb. 6a, d, g). 500-nm- und 1-µm-PLGA-Partikel zeigten eine stärkere Fluoreszenzintensität in alleinigen UM-SCC-17A-Zellen (Abb. 5e, f und Abb. 6e, f) als in alleinigen THP-1-Zellen (Abb. 5b, c und Abb.). . 6b,c). In Co-Kultur-Inkubationen (Abb. 5h,i und Abb. 6h,i) gibt es offensichtliche Signalabnahmen in Krebszellen, bei denen die Partikelfluoreszenzintensität geringer war als die der Makrophagen. Makrophagen phagozytieren alle Arten von Partikeln schnell und effektiv, sodass Krebszellen nicht genügend Partikel im Kokultursystem aufnehmen können. Um den Effekt der Phagozytose auf die Aufnahmekapazität von Krebszellen für verschiedene Größen von PLGA-Partikeln zu quantifizieren, wurde eine semiquantitative optische Analyse durchgeführt. Kurz gesagt wurden die Partikelfluoreszenzintensitäten auf der Grundlage von beispielsweise 50 einzelnen partikelbeladenen Zellen berechnet, um einen Mittelwert für beide Zelltypen zu erhalten, und der Aufnahmeindex von Krebszellen wurde durch Mittelung der intrazellulären Partikelfluoreszenzintensität pro Krebs bestimmt Zelle normalisiert auf die von Makrophagen (Abb. 7). In Monokultur wurde festgestellt, dass der Krebszellen-Aufnahmeindex für 100 nm PLGA etwa 1,34 ± 0,19 beträgt, was darauf hindeutet, dass die Krebszellen in der Einzelzellkultur mehr Partikel aufgenommen haben als die von Makrophagen aufgenommenen (Abb. 7). Dies ist aufgrund der hohen Viskosität der PLGA-Partikel und der größeren Größe der Kehlkopfkrebszellen nicht überraschend. In ähnlicher Weise wurden 500 nm und 1 µm PLGA auch von Krebszellen mit Aufnahmeindizes von ungefähr 1,5 ± 0,25 bzw. 1,4 ± 0,31 in Monokultur stark internalisiert. Die Aufnahmeindizes für große Partikel waren in Gegenwart von Makrophagen in Kokultursystemen erheblich verringert (0,59 ± ± 0,12 und 0,47 ± ± 0,1). Inzwischen identische zelluläre Internalisierungsfähigkeiten für beide Zelltypen nach 24 Stunden Inkubation von 100 nm-PLGA-Partikeln in der gemischten Zellkultur. Overall, the results accumulated here suggested that the ingestion of particles by cancer cells and macrophages might depend on different routes of uptake pathway in single-cell culture and co-culture environment. Moreover, the presence of macrophages reduced the cellular internalization of PLGA particles by cancer cells particularly for large ones, a biological event that has been observed in in vivo nanomedicine drug delivery studies [3, 15].

Microscopic examination of cellular internalization of 100 nm PLGA nanoparticles in monoculture and co-culture cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 100 nm PLGA nanoparticles for 24 h at 37 °C at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , g ) and fluorescent channels (b, e, and h) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. Massive cellular uptake of 100 nm PLGA nanoparticles can be visualized in magnified images (c , f , ich ) for monoculture THP-1 macrophages (yellow arrows) and laryngeal cancer cells UM-SCC-17A (red arrows). In the co-culture system, 100 nm PLGA nanoparticles were still highly ingested by macrophages but less efficient for cancer cells compared to single cultured cells

Microscopic examination of cellular internalization of 500 nm PLGA nanoparticles in monoculture and co-cultured cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 500 nm PLGA nanoparticles for 24 h at 37 °C at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , g ) and fluorescent channels (b , e , h ) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. Massive cellular ingestion of 500 nm PLGA nanoparticles can be visualized in magnified images (c , f , ich ) for monoculture THP-1 macrophages (yellow arrows) and laryngeal cancer cells UM-SCC-17A cells (red arrows). In the co-culture system, 500 nm PLGA nanoparticles were still highly uptake by macrophages, while cancer cells had inadequate particle internalization

Microscopic examination of cellular internalization of 1 µm PLGA particles in monoculture and co-culture cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 1 µm PLGA particles for 24 h at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , g ) and fluorescent channels (b , e , h ) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. A large amount of particle uptake and tremendous accumulation of 1 µm PLGA particles can be visualized in magnified images (c , f , ich ) for monoculture THP-1 (yellow arrows) and UM-SCC-17A laryngeal cancer cells (red arrows). In the co-culture system, 1 µm PLGA particles were still efficiently uptake by macrophages, while cancer cells had insufficient particle ingestion

Quantitative analysis of PLGA particle internalization in UM-SCC-17A cells in monoculture and co-culture systems. The percentage of particle fluorescent intensity in UM-SCC-17A cells normalized to that in THP-1 cells for solely and mixed cultured cells

Quantification of cellular uptake by flow cytometry

Flow cytometry is widely used to determine of particle-cell interplay in a quantitative manner, for example, the size-dependent uptake of polystyrene particles with sizes ranging from 20 to 1000 nm by dendritic cells in vivo [35]. FACS was thus utilized for analysis of the percentage of NP-positive cells and particle number in those NP-positive cells in monoculture and co-culture systems. Then, average NP counts in a single cell were calculated by determining the total fluorescence intensity in particle-laden cells normalized to the fluorescence of total applied dose. For example, about 70% of 500 nm PLGA was deposited in the cancer cells, whereas the residual was kept in the supernatant of cell cultures (Additional file 1:S4). This fluorescence intensity measured by a Tecan reader was then compared to the average/total FACS signals (FITC signal values of P5 and P6 in Fig. 8,) to estimate the particle number in the co-culture system. As seeded in the co-cultured cells, about half of the cells were recognized as macrophages and the rest were considered as cancer cells. It was observed that approximately 13,000 of single 100 nm PLGA particles accumulated in cancer cells and 9700 particles in macrophages (Fig. 8i) in the monoculture, consistent with the above microscopic examinations. A much lower particle number (164 ± 30 and 45 ± 15) was ingested by monocultured cancer cells for 500 nm and 1 µm PLGA, with a slightly lower particle count in the respective macrophages (Fig. 8i). The number of particles ingested by single cells is in great agreement with the literature records [24]; for instance, an average 2500 of gold NPs coated with cetyltrimethylammonium bromide were deposited in epithelial cells, while PEG-modified gold NPs only had a few tens per cell [36]. In co-culture systems, unexpectedly, there is a slight increase of 100 nm particle number in cancer cells, despite a higher enhancement of NP internalization by macrophage. Comparing to the uptake index in the single-cell to mixed cell culture, it also reduces about 25% for 100 nm PLGA particles. The uptake indices were found to significantly decline with around 2.5 and 3 folds reduction in co-cultured system for 500 nm and 1 µm PLGA, respectively (Fig. 8i). Generally, it was found that the existence of macrophages largely affects the uptake ability of cancer cells especially for large particles, which is also in excellent agreement with the above observations.

Particle uptake quantification in monoculture UM-SCC-17A cells and co-culture with THP-1 cells by flow cytometry. Grating strategy to identify respective cell populations in mixed cell culture (a –h ). Gating is showing one representative experiment of cells exposure to 500 nm PLGA particles. With initial live gating in the y-axis with a side scatter (SSC-A) and x-axis with a forward scattering (FSC-A), P2 a were further gated with FSC-A versus APC-A to differentiate the THP-1 cells in P4 c from UM-SCC-17A cell population in P3 (monoculture cells (b ) and mixed cells (c )). The cell population of P3 further displayed as counts versus FITC plots (P5) in non-exposed cells (d ), monoculture cells (e ), and co-cultured cells (h ). Also, P6 is the counts versus FITC-A plot originated from P4 population in non-exposed cells (g ) and co-cultured cells (f ). Both types of cells efficiently ingested the 500 nm PLGA indicated by the solid histogram completed shifted to the right side of the x -axis, indicating particles are taken up by all exposed cells. Quantification of particle-laden numbers (i ) in both types of cells for mono-culture and co-culture systems

Currently, different uptake pathways by cancer cells in ingesting particles with different sizes and surface modifications like clathrin-mediated endocytosis, caveolae-mediated endocytosis, clathrin- and caveolae-independent endocytosis, micropinocytosis, and macropinocytosis have been claimed in the literature [37]. For instance, it has been proved that iron oxide aggregates with a size of < 200 nm are taken up by MCF-7 cells through the clathrin-mediated endocytosis, whereas larger aggregates tend to be ingested via macropinocytosis [38]. Another study has demonstrated that 100 nm plain polystyrene particles tended to be taken up mainly through macropinocytosis, whereas the internalization of carboxylated polystyrene particles prefer to occur via the clathrin-mediated endocytic route [25]. Phagocytosis is a classical uptake pathway for immune cells such as neutrophils, dendritic cells, and most importantly monocytes/macrophages. The uptake pathways tightly depend on various parameters of drug delivery vesicles, e.g. , the particle size, chemical composition, surface modification, proteins in the culture environment, as well as cell type. Usually, multiple uptake pathways can be involved in particle ingestion such as the caveolae-mediated endocytosis, clathrin-mediated endocytosis, and macropinocytosis, which has been found to participate in cellular internalization of 300–400 nm chitosan NPs in human HeLa cells [39]. It has also been observed that 63 nm cholesterol-modified pullulan NPs enter into the human hepatocellular carcinoma (HepG2) cells via macropinocytosis and clathrin-mediated endocytosis [40]. Several previous studies showed that PLGA particle cell uptake involves different endocytic pathways, in which clathrin-independent endocytosis is the main route responsible for the internalization of PLGA in in vitro models [23, 24, 37]. Nevertheless, once they entered into the cells, PLGA particles applied here were highly potentially entrapped by the endo-lysosomal system consisting of early endosomes, recycling endosomes, late endosomes, and lysosomes [41]. It should be noted, however, that there is a lack of studies showing the cellular uptake mechanisms in co- or tri-cultured systems in vitro, a notion that has to be probe in the future.

Induction of cell fusion by PLGA NPs

Extensive scientific evidence has shown that the fusion of monocytes/macrophages into multinucleated giant cells (MGCs) occurred in a broad range of biological processes [42, 43]. Generally, implantation of biomaterials into the body causes a foreign body response characterized by the fusion of macrophages into MGCs and fibrotic encapsulation [44]. A wide type of human and murine primary cells like alveolar macrophages, splenic macrophages, microglia, bone-marrow-derived macrophages, and blood monocytes, as well as cell lines such as RAW264.7 and UG3 were also frequently observed to form MGCs in vitro [26, 45]. It is well-known that the macrophages form a fusogenic phenotype when they are unable to ingest foreign materials via phagocytosis because of the large size of particles or implants. So far, it is unclear whether in vitro macrophage cell fusion relates to the particle size in the range 100–1000 nm, which can be easily phagocytized. Here, the cell fusions were observed in all groups by microscopic examination (Fig. 9). The cellular fusion was confirmed only when multiple nuclei were found to share the same cytoplasm in both fluorescence images and bright-field images. Spontaneous formation of giant cells by THP-1 cells was occurred in the control group without particle treatment (Fig. 9a), with a fusion percentage of about 10% of the total cells (Fig. 9h), as reported in the literature [46]. Size-dependent cellular fusion was found for 100 and 500 nm PLGA particles, whereas 1 µm PLGA-induced insignificant enhancement of fusions in monoculture. This may be due to the small number of 1 µm PLGA particles exposed to cells (approximately 60 particles exposed to each cell at a concentration of 10 µg/mL). When the macrophages were co-cultured with cancer cells, the percentages of MGC formation were increased in all groups in comparison with the corresponding monoculture groups. In particular, there is a significant increment of cellular fusion for 1 µm PLGA (19%) in the mixed cell culture. The most prominent increase in fusion occurred in co-cultured 500 nm PLGA particles, which might be attributed to the large size of particles and sufficient particle numbers ingested per cell.

Visualization and quantification of THP-1 cell fusion in monoculture and co-culture systems. Cell fusion occurred in all groups including the control group without particle treatment for THP-1 cells (a ). Monocultured (b , c ) 100 nm and 500 nm NP-induced significant cell fusion compared to 1 µm PLGA group (d ), which has a slightly higher level than that of the control group. In co-cultured systems, 100 nm (g ) and 1 µm (e ) PLGA had an identical percentage of cellular fusion, which is apparently smaller than that of 500 nm group (f ). Quantification of cell fusion for all groups after 24 h incubation was displayed in h

The molecular machinery involved in macrophage fusion has been widely probed, achieving substantial progress [43]. For example, the formation of macrophage fusion receptors CD47and CD44 together allowed mediating the process of macrophage fusion, and subsequent the differentiation of giant cells [42] and miR-223 delivery by a NP vesicle permitted attenuating it [47]. Hence, further study should focus on the determination of key molecules in regulating particle-induced macrophage fusion and the dominant receptors expressed in the giant cell membrane. Another important concern is the fate of MGCs. It is believed that MGCs fused with particles or stimuli might subsequently experience the process of apoptosis or necrosis [48]. This may lead to the release of undigested particles or other giant materials to the other cells in vitro or biological tissues in vivo, further inducing the long-term inflammatory response or granulomas. On the other hand, the macrophage fusion itself may be benefit for NP drug delivery, for example, in tumorous tissues, the re-release of drugs from macrophages to the cancer cells might represent an enhanced tumor killing ability. More importantly, future nanomedicine study should address how to exploit the application of macrophage fusion for nanocarrier drug delivery to improved disease diagnosis and therapy. This is because not only macrophages an abundant type of immune cells in the body with the excellent uptake ability of nano-drugs, but also they may be used in targeted gene delivery for repair of injured tissues.

Conclusion

To the best of our knowledge, this study first reported the competitive cellular uptake of PLGA particles with sizes ranging from 100 nm to 1 µm in co-cultured UM-SCC-17A laryngeal cancer cells and THP-1 monocytes/macrophages. The data collected here proved that immune cells may alter/lower the particle internalization by cancer cells in vitro, which is similar to the previous findings in in vivo nanocarrier drug delivery studies. Size-dependent and cell culture-related macrophage cellular fusion caused by PLGA particles has also been demonstrated here. Future studies should probe the uptake mechanism in co-cultured systems and design novel approaches to achieve a higher uptake index for laryngeal cancer cells in the presence of phagocytes. Moreover, elaborate evaluation of intracellular trafficking and fate of nano-drug-carriers in co- or tri-cultured systems in 3D, which better mimic the in vivo conditions, is needed prior to the utilization of animal studies in vivo and even in clinical trials.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel [und seinen ergänzenden Informationsdateien] enthalten.

Abkürzungen

PLGA:

Poly(lactic-co-glycolic acid)

HNSCC:

Head and neck squamous cell carcinoma

EPR:

Enhanced permeability and retention

NPs:

Nanopartikel

ICG:

Indocyanine green

MPS:

Mononuclear phagocyte system

LDH:

Laktatdehydrogenase

FACS:

Fluorescence-activated cell sorting

MGC:

Multinucleated giant cells

DLS:

Dynamic light scattering