DNA-basiertes Nanohydrogel mit potenter antitumoreller immunstimulierender Aktivität

Zusammenfassung

Unmethylierte CpG-Oligodesoxynucleotide (CpG‑ODN) sind potente Aktivatoren angeborener und adaptiver Immunität, doch ihre rasche Degradation im Serum limitiert klinischen Nutzen. Wir konstruierten CpG‑MCA Nanohydrogele durch Multi-Primed Kettenamplifikation (MCA), erzeugend Hydrogele reich an Tandem-CpG-Wiederholungen. Die resultierenden CpG‑MCA Gele widerstehen Nuklease-Degradation, werden effizient von RAW264.7 Makrophagen internalisiert und triggern robuste Sekretion von Tumornekrosefaktor‑α (TNF‑α) und Interleukin‑6 (IL‑6). In Ko-Kultur mit menschlichen Gliom U251 Zellen unterdrückten CpG‑MCA Gele Tumorszellproliferation markant, outperforming konventionelles CpG‑ODN und CpG‑RCA Gele. Diese Ergebnisse demonstrieren dass CpG‑MCA Nanohydrogele ein potentes, biokompatibles Immunstimulans mit starker antitumoraler Aktivität sind.

Einleitung

Bakterielle DNA enthaltend unmethylierte CpG-Motive dient als effektiver Adjuvans und Antikrebs-Agent durch Engagement von Toll-ähnlichem Rezeptor 9 (TLR9) auf dendritischen Zellen, Makrophagen und anderen Immunzellen. Allerdings ist CpG‑ODN anfällig für Proteinadsorption und Nukleaseverdauung, was Stabilität und Potenz in vivo kompromittiert. Einkapselung in Delivery-Vehikel oder Selbstassemblierung in höher-geordnete DNA-Nanostrukturen hat Stabilität und zelluläre Aufnahme verbessert, doch Herausforderungen wie Zytotoxizität und limitierte Beladung bleiben.

DNA-Nanomaterialien – Tetraeder, X-förmige Gitter und Hydrogel-Netzwerke – haben verbesserte zelluläre Internalisierung und Zytokin-Induktion im Vergleich zu linearen Oligonukleotiden gezeigt. Rolling Circle Amplifikation (RCA) liefert Nanoflower-Hydrogele die CpG-Motive schützen und Immunsignalisierung boosten. Aufbauend auf diesem Konzept empleierten wir Multi-Primed Kettenamplifikation (MCA) um CpG‑MCA Hydrogele zu produzieren, die tausende CpG-Wiederholungen enthalten und Nanoflower-Strukturen bilden. Wir hypothesieren dass diese Hydrogele überlegene Stabilität, Aufnahme und Immunstimulation bieten, dadurch soliden Tumorwachstum inhibierend.

Materialien und Methoden

Materialien

Alle Oligonukleotide wurden synthetisiert (Sangon Biotech, Shanghai) und per HPLC gereinigt. Reagenzien für MCA und RCA, inklusive phi29 DNA-Polymerase, T4 DNA-Ligase, dNTPs und Puffer, wurden von Thermo Fisher und New England Biolabs bezogen. Zelllinien RAW264.7 (Maus Makrophage) und U251 (menschliches Gliom) stammten von Chinesischer Akademie der Wissenschaften. ELISA-Kits (R&D Systems) und CCK‑8 (Dojindo) wurden für Zytokin-Quantifizierung und Viabilitätsassays verwendet.

Herstellung zirkulärer DNA-Templates

Phosphorylierte Einstrang-DNA (SS‑DNA) enthaltend CpG-Primer wurde bei 95 °C für 5 min angeheftet und auf 4 °C abgekühlt. Ligase wurde über Nacht bei 4 °C hinzugefügt um zirkuläre Templates zu bilden; Enzyme wurden bei 75 °C für 10 min inaktiviert.

Konstruktion von CpG‑MCA und CpG‑RCA Hydrogelen

Ein 10 µl Aliquot des zirkulären Templates wurde mit 1× phi29 Puffer, 4 mM dNTPs und 5 U phi29 Polymerase zu 50 µl Volumen gemischt. Inkubation bei 30 °C für 12 h produzierte RCA Gel (R12). Für MCA, nach 4 h RCA, wurden 500 pM Primer 2 und 3 hinzugefügt und die Mischung für verbleibende Zeit inkubiert (R4M4 und R4M8). Polymere wurden bei 65 °C hitze-inaktiviert und durch Ultrafiltration gereinigt.

Charakterisierung

Agarose-Gelelektrophorese bestätigte Hydrogel-Bildung. TEM und SEM offenbarten Nanoflower-Morphologien von 100 nm bis mehreren Mikrometern. Zytotoxizität wurde per CCK‑8 bewertet; Aufnahme visualisiert mit Cy5-Labeling und Konfokalmikroskopie; Zytokinsekretion gemessen per ELISA; Genexpression quantifiziert per qRT‑PCR.

Stabilitäts-Assay

Hydrogele wurden in 10 % FBS‑DMEM oder PBS bei 37 °C inkubiert; residuale DNA wurde per NanoDrop quantifiziert, und Degradationsmuster per Agarose-Gelelektrophorese überwacht.

Ko-Kultur mit U251 Zellen

RAW264.7 Zellen wurden in oberer Kammer eines Transwells gesät; U251 Zellen in unterer Kammer platziert. Nach 24 h Behandlung mit CpG‑ODN, CpG‑RCA oder CpG‑MCA Gelen wurde U251 Proliferation via Klonogen-Assay evaluiert.

Ergebnisse und Diskussion

Bildung zirkulärer Templates und erfolgreiche Amplifikation wurde durch Agarose-Gel bestätigt: MCA-Produkt (R4M4/R4M8) und RCA-Produkt (R12) zeigten hohe Molekulargewichts-Retention und Nanoflower-Erscheinung auf TEM/SEM.

Konfokale Bildgebung demonstrierte dass CpG‑MCA Gele effizient von RAW264.7 Zellen internalisiert wurden, mit mittlerer Fluoreszenzintensität >10× der linearen CpG‑ODN (p < 0,0001), indizierend überlegene Aufnahme aufgrund Nanoflower-Architektur.

Stabilitätsstudien zeigten dass CpG‑MCA Gele ~85 % ihres DNA-Gehalts nach 24 h in 10 % FBS‑DMEM retinerierten, wohingegen lineares CpG‑ODN >90 % innerhalb 12 h degradierte, was schützenden Effekt der Hydrogel-Matrix unterstreicht.

In-vitro-Immunstimulations-Assays offenbarten dass CpG‑MCA Gele TNF‑α und IL‑6 Sekretion bei Leveln 3–27× höher als CpG‑ODN induzierten (p < 0,0001). Besonders R4M8 produzierte stärkste Zytokinantwort, korrelierend mit höherer CpG-Kopienzahl.

Genexpressionsanalyse zeigte signifikante Hochregulation von TLR9, TNF‑α und IL‑6 Transkripten in CpG‑MCA-behandelten Zellen, entlang mit erhöhtem CD86 und verringertem CD206 Oberflächenmarker, indizierend Shift zum pro‑inflammatorischen M1-Phänotyp.

Migrationsassays (Transwell und Scratch Wound) offenbarten dass CpG‑MCA Gele RAW264.7 Migration stärker stimulierten als CpG‑ODN, was Potenzial für Immunzell-Infiltration in Tumoren erhöht.

Ko-Kultur mit U251 Gliomzellen demonstrierte ausgeprägte Reduktion in Klonbildung: R4M8 erreichte 12 % Klonbildungsrate relativ zu CpG‑ODN Kontrolle (p < 0,001), bestätigend potente antitumoraler Aktivität vermittelt durch CpG‑MCA-induzierte Zytokinfreisetzung.

Fazit

Wir haben erfolgreich CpG‑MCA Nanohydrogele konstruiert, die tausende CpG-Motive incorporieren, was Nuklease-Resistenz, effiziente Makrophagen-Aufnahme und robuste Th1-Typ Zytokin-Induktion verleiht. Diese Hydrogele unterdrücken effektiv Gliomzellproliferation in vitro, was ihr Versprechen als biokompatibles Immunstimulans für Krebstherapie hervorhebt.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Datensätze unterstützend diese Studie sind auf angemessene Anfrage beim korrespondierenden Autor erhältlich.

Abkürzungen

CpG‑MCA Gele

DNA-Hydrogel generiert durch Multi-Primed Kettenamplifikation

CpG‑RCA Gel

DNA-Hydrogel generiert durch Rolling Circle Amplifikation

MCA

Multi-Primed Kettenamplifikation

R12

RCA-abgeleitetes CpG Gel

R4M4, R4M8

CpG‑MCA Hydrogele mit 4 oder 8 Primer-Extensionen

R12‑C, R4M4‑C, R4M8‑C

Hydrogele ohne CpG-Motive