Erhöhte Biokompatibilität in anodischen TaO x Nanotube-Arrays

Hintergrund

Tantal (Ta) ist ein seltenes, hartes, hochkorrosionsbeständiges und bioinertes Metall [1,2,3]. Die Oxidation des Tantalmaterials durch Bildung eines sehr dünnen, undurchdringlichen Oxidfilms auf seiner Oberfläche trägt zu seiner Biokompatibilität bei. Die hohe Flexibilität und Biokompatibilität von Tantal macht seine klinischen Anwendungen wie Zahnimplantate, orthopädische Implantate und Knochenrekonstruktion möglich [4,5,6]. Kürzlich wurde festgestellt, dass Tantal eine bessere Biokompatibilität als Titan aufweist, wie beispielsweise eine stärkere extrazelluläre Matrixbildung, ausgezeichnete Zelladhäsion und -wachstum und eine viel höhere Dichte lebender Zellen auf der Oberfläche [7,8,9]. Andererseits haben mehrere Studien bewiesen, dass die charakteristische physikalisch-chemische Eigenschaft der nanostrukturierten Oberflächengeometrie der Hauptfaktor ist, der das Zellverhalten beeinflusst [10,11,12]. Die ideale Biomaterialoberfläche sollte in der Lage sein, die optimale Umgebung für das Einwachsen von Zellen bereitzustellen. Rucket al. zeigten, dass eloxierte Ta-Nanoröhren ein Substrat für eine verbesserte Osseointegration im Vergleich zu einer flachen Oberfläche bieten [13]. Ein kürzlich entwickeltes poröses Tantalmaterial, das die Eigenschaften von Knochen nachahmt, ermöglicht das Einwachsen von Weichgewebe und Knochen, was eine gute biologische Fixierung bietet [14,15,16,17]. Die hohe Stabilität und das Heilungspotential von porösem Tantal helfen, die Lücken zwischen den Knochenstrukturen während der rekonstruktiven Chirurgie zu verschmelzen. Das poröse Tantal hat daher aufgrund seiner zahlreichen Vorteile im Vergleich zu anderen Transplantaten, wie z ,21]. Eine kürzlich durchgeführte klinische Überprüfung zeigte, dass Patienten, die poröse Tantal-Hüftpfannen erhielten, einen höheren Grad an Implantatfixierung aufwiesen als Patienten mit Hydroxyapatit-beschichteten Titan(Ti)-Pfannen [22,23,24,25].

Vor kurzem haben wir selbstorganisiertes TiO₂ . entwickelt Nanoröhren mit unterschiedlichen Durchmessern unter Verwendung einer elektrochemischen Anodisierungsmethode [26, 27]. Wir fanden heraus, dass menschliche Fibroblastenzellen ein deutlicheres durchmesserspezifisches Verhalten auf dem überkritischen CO₂ . zeigen (ScCO₂ )-behandelten Nanoröhrchen als die auf den eloxierten [27]. Wir stellten außerdem mit Ag dekoriertes TiO₂ . her Nanoröhren durch die Elektronenstrahlverdampfungsmethode und fanden den kleinsten Durchmesser (25 nm Durchmesser) Ag-dekorierte Nanoröhren zeigten die offensichtlichste biologische Aktivität bei der Förderung der Adhäsion und Proliferation von menschlichen Fibroblasten und auch menschlichen Nasenepithelzellen [26]. In dieser Studie haben wir TaO _{x . hergestellt} Nanoröhren mit unterschiedlichen Durchmessern durch das ähnliche elektrochemische Anodisierungsverfahren. Das Zellverhalten, einschließlich Zelladhäsion und -proliferation, als Reaktion auf den Durchmesser von TaO _x Nanoröhren untersucht. Das Ziel dieser Forschung ist es, die Biokompatibilität von selbstorganisiertem TaO _{x . zu untersuchen} Nanoröhren-Arrays mit unterschiedlichen Nanoröhren-Durchmessern, hergestellt durch elektrochemische Anodisierung.

Methoden

Vorbereitung von TaO _x Nanoröhren

Ta-Blätter wurden von ECHO Chemical gekauft (Dicke 0,127 mm, 99,7% Reinheit, CAS-Nr. 7440-25-7). Vor dem Anodisierungsprozess wurden Ta-Blätter in Aceton, Isopropanol, Ethanol und Wasser mit Ultraschall gereinigt. Alle Anodisierungsexperimente wurden bei 20 °C in Schwefelsäurelösung mit 4,9 Gew.-% HF durchgeführt, die aus Chemikalien in Reagensqualität und entionisiertem Wasser hergestellt wurde. Es wurde eine elektrochemische Zweielektrodenzelle mit Ta als Anode und Pt als Gegenelektrode verwendet. Die Spannungen wurden von 10 bis 40 V angepasst, um TaO _{x . zu ergeben} Nanoröhrendurchmesser von 20 bis 90 nm. Bestrahlung mit UV-Licht geringer Intensität (ca. 2 mW/cm ² .) ) mit fluoreszierenden Schwarzlichtbirnen auf TaO _x Nanotube-Proben für 8 Stunden wurden vor den biokompatiblen Tests durchgeführt.

Materialcharakterisierung

Oberflächenmorphologie, Innen- und Außendurchmesser, Wandstärke und Länge von TaO _x Nanoröhren wurden durch Rasterelektronenmikroskopie (REM) charakterisiert. Röntgenbeugung (XRD) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), ausgestattet mit einem Energiedispersionsspektrometer (EDS), wurden verwendet, um die kristalline Struktur des TaO _{x . zu untersuchen} Nanoröhren-Arrays. Kontaktwinkelmessungen wurden durchgeführt, um die Oberflächenbenetzbarkeit des TaO _{x . zu bewerten} Nanoröhrenproben durch die Extensionsmethode unter Verwendung eines Horizontalmikroskops mit Winkelmesserokular. Als Testflüssigkeiten für die Messungen wurden Wasser und Kulturmedium verwendet.

Kultur von menschlichen Fibroblasten

Humane MRC-5-Fibroblasten (BRCC, Bioresource Collection and Research Center, Hsinchu, Taiwan, BCRC Nr. 60023) wurden auf einer 10-cm-Gewebekulturplatte ausplattiert und mit Eagle's Minimum Essential Medium (Gibco) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS .) kultiviert ), 2 mM L-Glutamin, 1,5 g/l Natriumbicarbonat, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren und 1,0 mM Natriumpyruvat und in 5 % CO₂ bei 37 °C. Die Zellen wurden dann auf das autoklavierte TaO _{x . ausgesät} Blätter auf den Boden einer 12-Well-Kulturplatte (Falcon) für weitere Untersuchungen gelegt.

Zelladhäsionsassay

Zellen wurden auf jedem TaO _{x . ausgesät} Blatt mit einer Dichte von 2.5 × 10 ³ Zellen/cm ² und in 5 % CO₂ . inkubiert bei 37 °C für 3 Tage und zweimal mit PBS gespült. Die adhärenten Zellen auf dem Substrat wurden 1 h in 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixiert, gefolgt von zwei Waschungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Permeabilisierung mit 0,1 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich) in PBS für 15 min bei 4 °C. Nach dem Waschen mit PBS wurde das Aktinfilament durch Inkubation mit Rhodamin-Phalloidin (Life Technologies) bei Raumtemperatur für 15 Minuten markiert. Dann wurden die Zellkerne durch Inkubation mit Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Thermo FisherScientific) für 5 Minuten gefärbt. Die Zellen wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop (AX80, Olympus) analysiert, um die Zelladhäsionsmorphologie und die Anordnung des Zytoskeletts zu untersuchen. Für die SEM-Beobachtung wurden die Zellen mit 2,5% Glutaraldehydlösung (Merck) 1 h bei Raumtemperatur fixiert, dann zweimal in PBS-Lösung gespült, in einer Reihe von Ethanol (40, 50, 60, 70, 80, 90 und 100 .) dehydratisiert %) und kritischer Punkt getrocknet mit einem kritischen Punkttrockner (CPD 030, Leica). Vor der REM-Beobachtung wurde ein dünner Platinfilm auf die Proben aufgetragen.

Zellproliferationsassay

Auf jedem TO _{x . wurden Zellen ausgesät} Substrate mit einer Dichte von 1 × 10 ⁴ Zellen/cm ² und 1 Woche kultiviert. Nach 1 Woche wurden die Proben zweimal mit PBS gespült und die Zellproliferation wurde unter Verwendung des WST-1-Reagenskits (Roche, Penzberg, Deutschland) geschätzt. Das Medium mit 10 % WST-1-Zellproliferationsreagenz wurde zu jeder Probe gegeben und in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5 % CO₂ . inkubiert bei 37 °C für 2 h. Die Lösung jedes Wells wurde auf eine 96-Well-Platte überführt. Die Absorption der Lösung wurde bei 450 nm mit dem Spektrophotometer (Spectral Max250) gemessen.

Statistische Analyse

Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt, und es wurden mindestens drei unabhängige Experimente durchgeführt. Die Daten wurden als Mittelwert ± ± Standardabweichung (SD) dargestellt und durch Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung der Software SPSS 12.0 (SPSS Inc.) analysiert. Ein p Wert von < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 1a–e zeigt die REM-Bilder der flachen Ta-Folie und des eloxierten TaO _x Nanoröhren-Arrays mit einem durchschnittlichen Nanoröhren-Durchmesser von 20, 35, 65 bzw. 90 nm. Alle eloxierten TaO _x Nanoröhren weisen eine wohldefinierte Nanoröhrenstruktur auf, und ihre Nanoröhrendurchmesser waren nahezu proportional zu den angelegten Spannungen. Unter diesen Proben weisen die Nanoröhren mit einem Durchmesser von 20 nm eine relativ unklare Nanoröhrenoberfläche auf, wie in dem vergrößerten Bereich aus Fig. 1b gezeigt. Diese Beobachtung ist auf die schwächere Feldstärke im Niederspannungsbetrieb im Anodisierungsprozess zurückzuführen. Abbildung 2 zeigt außerdem die sitzungsübergreifende Darstellung aller TaO _{x .} Nanoröhren und ihre entsprechenden Nanoröhrenlängen. XRD- und TEM-Analysen wurden verwendet, um das TaO _{x . weiter zu identifizieren} Kristallinität von Nanoröhren. Wie in den XRD-Spektren von Abb. 3a gezeigt, werden nur Peaks im Zusammenhang mit der Ta-Folie beobachtet (JCPDS-Karte Nr. 04–0788), was darauf hindeutet, dass TaO im anodisierten Zustand _x Nanoröhren sind möglicherweise amorphe Phase. Abbildung 3b zeigt ein repräsentatives TEM-Bild, das von einem TaO _{x . mit einem Durchmesser von 90 nm aufgenommen wurde} Nanoröhre, die sich von der Probe im anodisierten Zustand abgelöst hat, zeigt eine gut definierte Nanoröhrenstruktur. Das fleckenlose Beugungsmuster im Einschub bestätigt, dass der TaO _x Nanoröhren sind nicht kristallin.

REM-Bilder, die das a zeigen Ta-Folienoberfläche und selbstorganisiertes TaO _x Nanoröhren mit Durchmessern von b 20, c 35, d 65 und e 90 nm bzw.

REM-Bilder, die die Querschnitte von TaO _{x . zeigen} Nanoröhren mit Durchmessern von a 20, b 35, c 65 und d 90 nm bzw.

a XRD-Spektren von TaO im anodisierten Zustand _x Nanoröhren mit unterschiedlichen Durchmessern und b TEM-Bild von einem eloxierten TaO _x Nanoröhre mit einem Durchmesser von 90 nm. Der Einschub zeigt auch das entsprechende Beugungsmuster

Die vorherige Studie hat berichtet, dass die Zellanheftung, -ausbreitung und die Zytoskelett-Organisation auf hydrophilen Oberflächen im Vergleich zu hydrophoben Oberflächen signifikant besser sind [28]. Daset al. zeigten ferner, dass ein niedriger Kontaktwinkel eine hohe Oberflächenenergie impliziert, die ebenfalls ein entscheidender Faktor ist, der zu einer besseren Zellanhaftung beiträgt [29]. Daher ist es wichtig, den Einfluss von TaO _{x . zu verstehen} Nanoröhrentopographie auf die Oberflächenbenetzbarkeit. Wie in Abb. 4 gezeigt, sind alle TaO _{x . im eloxierten Zustand} Nanoröhren sind stark hydrophil, da ihre Kontaktwinkel viel kleiner als 90° sind. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass ihre Kontaktwinkel mit abnehmendem Nanoröhrendurchmesser auf 35 nm monoton abnehmen und dann umgekehrt zunehmen, wenn der Durchmesser auf 20 nm abnimmt. Wir finden auch, dass der TaO _x Nanoröhrchenproben zeigen einen ähnlichen Trend, wenn entweder Wasser oder Kulturmedium als Testflüssigkeiten verwendet werden. Wir versuchen, das beobachtete Benetzungsverhalten mit dem Wenzelschen Gesetz zu erklären, das den kleinen Kontaktwinkel auf hydrophilen Materialien beschreibt [30]. In Wenzels Modell führt eine Zunahme der Oberflächenrauheit in hydrophilem Material zu einem kleineren Kontaktwinkel und Wasser füllt die Rillen unter dem Tröpfchen. Hier verwenden wir den Rauheitsfaktor, d. h. die physikalische Oberfläche der Nanoröhren pro Einheit der projizierten Fläche, um die geometrische Rauheit von TaO _{x . zu bewerten} Nanoröhrenproben [31]. Wie in Abb. 5 gezeigt, mit Innendurchmesser D , Wandstärke W , und Nanoröhrenlänge L , der rein geometrische Rauheitsfaktor G kann berechnet werden als [4πL {D + W }/ {√3(D + 2 W) ² }] + 1. Diese Berechnung geht davon aus, dass alle Oberflächen der Nanoröhren vollkommen glatt sind. Die berechneten Rauheitsfaktoren für alle Nanoröhrenproben sind in der Tabelle von Abb. 5 zusammengefasst. Mit Ausnahme der Probe mit 20 nm Durchmesser haben die Nanoröhren mit kleinerem Durchmesser die größere geometrische Rauheit und sollen daher gemäß dem Modell von Wenzel eine bessere Hydrophilie aufweisen. Diese Schlussfolgerung stimmt mit unserem Ergebnis überein, dass der Kontaktwinkel mit abnehmendem Nanoröhrendurchmesser auf 35 nm abnimmt. Es erklärt auch gut, dass die Nanoröhren mit 20 nm Durchmesser, die eine relativ unklare Nanoröhrenoberfläche aufweisen, eine geringere geometrische Rauheit und eine schlechtere Hydrophilie aufweisen als andere.

a –j Optische Bilder, die Wasser- und Kulturmediumtröpfchen auf dem a zeigen ,f Ta-Folienoberfläche und selbstorganisiertes TaO_x Nanoröhren mit Durchmessern von b ,g 20, c ,h 35, d,i 65 und e ,j 90 nm bzw. Kontaktwinkel sind in den Bildern angegeben

Schematische Darstellung einer idealisierten Nanoröhrenstruktur mit Innendurchmesser D , Wandstärke W , und Nanoröhrenlänge L . Die berechneten Rauheitsfaktoren für alle Nanoröhrenproben in dieser Studie sind in der Tabelle zusammengefasst

Das Verhalten menschlicher Fibroblastenzellen als Reaktion auf die flache Ta-Folie und TaO _x Nanoröhren-Arrays wurde weiter untersucht. Um die Anheftung von Fibroblastenzellen auf dem TaO _{x . zu bewerten} Nanoröhrchen wurde Cytoskelett-Aktin mit Rhodamin-Phalloidin gefärbt, um rote Fluoreszenz zu exprimieren, und Kerne, die mit DAPI gefärbt wurden, um blaue Fluoreszenz zu exprimieren. Die Aktin-Immunfärbung zeigt eine unterscheidbare Zell-Material-Kontaktmorphologie für die flache Ta-Folie und TaO _x Nanoröhren mit unterschiedlichen Durchmessern (siehe Abb. 6). Es ist allgemein bekannt, dass Zellen zuerst an der Materialoberfläche anhaften und sich dann für die weitere Zellteilung ausbreiten müssen. Eine bessere Zelladhäsion kann eine stärkere Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden durch Integrin bewirken, das an Aktinzytoskelett gekoppelt ist [32,33,34]. Für die detaillierte Beobachtung der Zelladhäsion wurde FE-SEM verwendet (siehe Abb. 7). Die Fibroblasten auf dem 35-nm-Durchmesser zeigen eine ausgezeichnete Zelladhäsion mit einer verlängerten abgeflachten Morphologie. Andererseits sind diese Fibroblasten auf der Ta-Folie und TaO mit einem Durchmesser von 90 nm _x Nanoröhren zeigen weniger angelagerte Zellen und bis zu einem gewissen Grad keine Zellausbreitung. Der Bedeckungsbereich der Zellen auf den Nanoröhrchen wurde unter Verwendung der ImageJ-Software weiter abgeschätzt und in diesen SEM-Bildern notiert. Ähnlich dem Trend der Kontaktwinkel wurde festgestellt, dass die Abdeckungsfläche mit abnehmendem Nanoröhrendurchmesser auf 35 nm monoton abnimmt und dann umgekehrt zunimmt, wenn der Durchmesser auf 20 nm abnimmt. Der 35-nm-Durchmesser TaO _x Nanotube zeigt tatsächlich den größten Zellabdeckungsbereich. Es ist bekannt, dass Zellen Oberflächenmerkmale erkennen, wenn eine geeignete Adhäsionsstelle erkannt wurde. Es wird vermutet, dass Zellen ihre Kontakte auf dem TaO _{x . stabilisieren können} Nanoröhren durch Bildung von fokalen Adhäsionen und reifen Aktinfasern, gefolgt von der Rekrutierung von Tubulin-Mikrotubuli [35]. Das Aktin-Zytoskelett ist mit Integrinen verbunden, die sich innerhalb der Adhäsionen befinden. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass das Zytoskelett auf den Nanoröhren mit 35 nm Durchmesser besser gebildet werden könnte als auf der flachen Ta-Folie oder anderem TaO _x Nanoröhren-Arrays.

Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Fibroblastenzellanheftung auf dem a Ta-Folie und selbstorganisiertes TaO _x Nanoröhren mit Durchmessern von b 20, c 35, d 65 und e 90 nm bzw. Die rote Fluoreszenz weist auf Aktinfilamente des Zytoskelettproteins hin, und die blaue Fluoreszenz weist auf Kerne hin

a –e REM-Bilder, die die Zelladhäsion und -proliferation von menschlichen Fibroblastenzellen auf der a . zeigen Ta-Folienoberfläche und selbstorganisiertes TaO_x Nanoröhren mit Durchmessern von b 20, c 35, d 65 und e 90 nm bzw. Die von der ImageJ-Software geschätzten Abdeckungsbereiche der Zellen auf den Proben sind in den Bildern angegeben

Der WST-1-Assay wurde verwendet, um die Proliferation von Fibroblastenzellen auf dem TaO _{x . weiter zu bewerten} Nanoröhren mit unterschiedlichen Durchmessern. Abbildung 8 zeigt den Vergleich der optischen Dichten, die anhand der WST-1-Testergebnisse gemessen wurden. Wir stellen fest, dass die Zellproliferation für das 35-nm-Durchmesser TaO _{x . am höchsten ist} Nanoröhrchen-Probe. Es gibt jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen der Ta-Gruppe und TaO _x Nanoröhren-Arrays. Darüber hinaus zeigen die Zellproliferation und Oberflächenbenetzbarkeit einen nahezu ähnlichen Trend mit dem TaO _x Nanoröhren-Durchmesser. Diese Beobachtung legt nahe, dass nicht nur der Nanoröhrendurchmesser, sondern auch die Oberflächenbenetzbarkeit die Zelladhäsion und die folgende Ausbreitung stark beeinflusst. Mit anderen Worten, im Vergleich zu den Nanoröhren mit 35 nm Durchmesser können die Nanoröhren mit 20 nm Durchmesser mehr Brennpunkte für Fibroblastenzellen ergeben, aber ihre schlechtere Hydrophilie eliminiert einige effektive Brennpunktkontakte und behindert somit die Zellanhaftung. Schließlich wird der 35-nm-Durchmesser TaO _x Nanotubes zeigen die höchste Biokompatibilität unter allen Proben.

Optische Dichten (QD) gemessen nach der Kultur menschlicher Fibroblastenzellen auf der Ta-Folie und selbstorganisiertem TaO _x Nanoröhren mit unterschiedlichen Durchmessern. Die OD-Werte mit ihren Standardabweichungen sind als angehängte Tabelle aufgelistet

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend untersucht diese Arbeit die Biokompatibilität von eloxiertem TaO _x Nanoröhren mit unterschiedlichen Nanoröhrendurchmessern. Alle eloxierten TaO _x Nanoröhren wurden als hauptsächlich amorphe Phase identifiziert. Wir diskutieren den Übergang der Oberflächenbenetzbarkeit mit TaO _x Nanotube-Durchmesser nach dem Modell von Wenzel. Die In-vitro-Biokompatibilitätsbewertung zeigt außerdem, dass Fibroblastenzellen ein offensichtliches von der Benetzbarkeit abhängiges Verhalten auf dem TaO _{x . aufweisen} Nanoröhren-Arrays. Der 35-nm-Durchmesser TaO _x Nanoröhren-Arrays zeigen die beste Biokompatibilität unter allen Nanoröhren-Proben. Diese Verbesserung könnte auf die sehr dichten Brennpunkte von TaO _{x . zurückgeführt werden} Nanotubes aufgrund der höheren Oberflächenhydrophilie. Diese Studie zeigt, dass die Biokompatibilität von Ta durch Bildung von TaO _{x . verbessert werden kann} Nanoröhren-Arrays mit entsprechendem Nanoröhren-Durchmesser und geometrischer Rauheit.