Osteoblasten-Reaktion auf kupferdotierte mikroporöse Beschichtungen auf Titan für eine verbesserte Knochenintegration

Einführung

Ein medizinisches Hartgewebeimplantatmaterial muss über entsprechende mechanische Eigenschaften wie Festigkeit, Elastizitätsmodul, Verschleißfestigkeit und Ermüdungsbeständigkeit verfügen, damit das Implantat die physiologische Belastung des implantierten Bereichs lange tragen kann. Gleichzeitig muss das Material eine gute Biokompatibilität und sogar Bioaktivität aufweisen, damit das Implantat eine gute Verbindung mit dem physiologischen Gewebe des Implantationsgebiets eingehen kann, ohne dass es zu unerwünschten Reaktionen im menschlichen Körper kommt. Reintitan und Titanlegierungen haben gute mechanische Eigenschaften und Biokompatibilität und sind derzeit die am häufigsten verwendeten Metallimplantatmaterialien.

Nachdem das Implantat implantiert wurde, finden zunächst eine Reihe biochemischer Reaktionen auf der Oberfläche des Materials statt, und die Oberflächeneigenschaften spielen eine entscheidende Rolle bei der Reaktion des Implantats auf die innere Umgebung. Die Mikrostruktur und chemische Zusammensetzung der Implantatoberfläche kann die Adsorption von Proteinen verändern, Proteine ​​regulieren die Zelladhäsion und bestimmen letztendlich deren Funktion [1]. Obwohl Titan und Titanlegierungen die am häufigsten verwendeten orthopädischen Implantatmaterialien sind, besitzt Titan keine biologische Aktivität. Nach der Implantation in den Körper kann es keine chemische Bindung mit dem Knochengewebe des Implantationsgebiets eingehen. Titan und Titanlegierungen beruhen hauptsächlich auf einer mechanischen Verzahnung, um eine Retention zu erreichen [2] und sind der langfristigen körperlichen Funktion im Körper nicht förderlich.

Die Oberflächenbeschichtung von Titanimplantaten kann die mechanischen Eigenschaften von Titan ergänzen und seine Mängel im Zusammenhang mit geringer biologischer Aktivität überwinden; das heißt, Titan als Substrat kann mechanische Eigenschaften bereitstellen und Elemente mit guter Oberflächenstruktur und biologischer Aktivität werden als Beschichtung verwendet. Diese Schicht bietet biologische Aktivität, und die Forschung in diesem Bereich hat sich zu einem Forschungs-Hotspot entwickelt.

Zur Herstellung bioaktiver Beschichtungen auf Metalloberflächen werden derzeit hauptsächlich Technologien wie Plasmaspritzen, ionenstrahlunterstützte Abscheidung, elektrophoretische Abscheidung, physikalische Gasphasenabscheidung mit gepulstem Laser, Mikroarc-Oxidation, Magnetron-Sputter-Abscheidung, Sol-Gel, Direct Laser Cladding und Laserablation [3,4,5,6,7,8,9,10]. Darunter hat die Plasmaspritztechnologie kommerzielle Anwendungen; jedoch kann die derzeitige Beschichtungstechnologie die klinischen Anforderungen immer noch nicht erfüllen, hauptsächlich aufgrund der folgenden Probleme:die bioaktive Phase der Beschichtung weist eine geringe Kristallinität und eine geringe Bioaktivität auf; die Haftfestigkeit zwischen Beschichtung und Substrat ist nicht gut; das Innenmaterial der Beschichtung löst sich leicht auf, was die Langzeitstabilität der Beschichtung im Körper beeinträchtigt; und der Vorbereitungsprozess für die Beschichtung ist zu kompliziert, die Prozessbedingungen sind streng, die Kosten sind hoch und die Effizienz ist gering [11].

Die Mikrolichtbogenoxidation, eine effektive Oberflächenmodifizierungstechnologie, die derzeit bei der Oberflächenmodifizierung von Metallimplantaten weit verbreitet ist, nutzt den sofortigen Sintereffekt von Plasma hoher Temperatur und hohem Druck; Die Materialoberfläche erzeugt nicht nur eine raue und poröse Oberfläche, sondern es können auch biologisch aktive Elemente in die Beschichtung eingebracht werden. Die durch die Mikrolichtbogen-Oxidationstechnologie modifizierte Oberfläche des Materials kann die Oberflächenmorphologie, Rauheit, Hydrophobie und Oberflächenenergie des Matrixmaterials sowie andere physikalische und chemische Eigenschaften signifikant verbessern, so dass die biologische Aktivität und Biokompatibilität des Materials stark verbessert werden. Die Osseointegration zwischen dem importierten Material und dem Knochengewebe ist von großer Bedeutung [12].

Kupfer (Cu) ist ein essentielles Spurenelement im menschlichen Körper, das eine Vielzahl von Funktionen hat, einschließlich der Förderung des Wachstums von Osteoblasten und der Förderung der Expression des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors im Intimagewebe, was für die Adhäsion und Proliferation von vaskulärem Endothel von Vorteil ist Zellen. Cu verstärkt auch die Lipidperoxidationsreaktion, hemmt die Synthese von bakterieller aktiver DNA und verwandter Enzyme, die in den bakteriellen Energiestoffwechsel eingreifen und führt nicht so leicht zu Arzneimittelresistenz [13]; noch wichtiger ist, dass Kupferionen in einem bestimmten Konzentrationsbereich sowohl eine hohe biologische Aktivität als auch ausgezeichnete antibakterielle Eigenschaften aufweisen. Daher haben Kupferionen nachweislich eine gute Biokompatibilität, wenn sie beim Design von Biomaterialien verwendet werden [14].

Die Interaktion zwischen den Zellen und dem Implantat ist ein wichtiger Faktor, um die Bildung einer Osseointegrationsschnittstelle zu induzieren. Diese Wechselwirkung hängt hauptsächlich von den Materialeigenschaften der Implantatoberfläche ab, wie der chemischen Zusammensetzung der Oberfläche, Oberflächenenergie, Oberflächenladung und Oberflächenmorphologie. Diese Wechselwirkung zwischen Zellen und Implantaten kann die Zelladhäsion, -proliferation und -differenzierung beeinflussen. Eine poröse Oberfläche fördert nachweislich die Zelladhäsion, -proliferation und -differenzierung, und mit anorganischen Ionen (Zink, Strontium, Magnesium usw.) dotierte Implantate fördern nachweislich die Osseointegration [15, 16].

Der Prozess der Mikrolichtbogen-Oxidationsanlage ist einfach und die Eigenschaften der vorbereiteten Beschichtung können angepasst werden. Mit unterschiedlichen Ionen dotierte Beschichtungen können durch Veränderung der Zusammensetzung des Elektrolyten hergestellt werden. Kupfer spielt eine wichtige Rolle im Organismus. Die geeignete Menge an Kupferionen in der Beschichtung kann die Vermehrung von Osteoblasten fördern und die Adhäsion von Oberflächenbakterien hemmen. Daher haben wir in dieser Studie ein mikroporöses Cu-TiO₂ . hergestellt Beschichtung auf der Titanoberfläche und in-vitro-Zellexperimenten und Tierversuchen verwendet, um die Wirkung des mikroporösen Cu-TiO₂ . zu beobachten und zu analysieren Beschichtung auf die Oberflächenaktivität und Biokompatibilität von Titan. Wir versuchten auch, die Machbarkeit von mikroporösem Cu-TiO₂ . zu untersuchen Beschichtung als neuartiges Beschichtungsmaterial für Implantate zur Verbesserung der Adhäsion, Proliferation und osteogenen Differenzierung von MC3T3-E1-Zellen und zur Förderung der Bildung und Osseointegration von neuem Knochen an der Implantat-Knochen-Grenzfläche als theoretische und experimentelle Grundlage für die klinische Anwendung von mikroporöses Cu-TiO₂ Beschichtung auf der Oberfläche von Titanimplantaten.

Materialien und Methoden

Probenvorbereitung und Charakterisierung

Durch Drahtschneiden wurde das Titan zu einer Probe mit einem Durchmesser von 12 mm und einer Dicke von 1 mm verarbeitet. Die Implantate wurden zu Titanstäben mit einem Durchmesser von 3 mm und einer Länge von 8 mm verarbeitet. Sandpapier wurde geglättet und mit Aceton und entionisiertem Wasser gewaschen, um die Beschichtung herzustellen. In dieser Studie wurde ein selbstgebautes stromsparendes Mikrolichtbogen-Oxidationsnetzteil verwendet; die Mikrolichtbogen-Oxidationsspannung betrug 450 V, der Modus war Konstantstrom, die Mikrolichtbogen-Oxidationszeit betrug 5 Minuten und die Frequenz betrug 1000 Hz.

Die Blindkontrollgruppe wurde mit Ti markiert und Calciumacetat und Calciumglycerophosphat wurden als basische Elektrolytlösungen verwendet. Die Ti-Proben nach der Microarc-Oxidation in der basischen Elektrolytlösung wurden mit TCP markiert und die Proben nach der Microarc-Oxidation mit unterschiedlichen Kupferoxidgehalten in der basischen Elektrolytlösung wurden mit TCP Cu I und TCP Cu II markiert (Tabelle 1).

Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FE-SEM) wurde verwendet, um die Oberflächenmorphologie der Proben zu beobachten, energiedispersive Spektroskopie (EDS) wurde verwendet, um die Elementverteilung auf der Beschichtungsoberfläche zu beobachten, und ein Oberflächenrauheits-Profiler wurde verwendet, um die Rauheit von verschiedene Proben. Röntgenbeugung (XRD) und Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS) wurden verwendet, um die elementare Zusammensetzung und Mikrostruktur der Beschichtungsphase und den chemischen Zustand zu beobachten.

Zellkultur

MC3T3-E1-Zellen (extrahiert aus Mausschädelzellen) wurden für in vitro-Zelltests verwendet. Die Zellen wurden in MEM mit 10 % fötalem Rinderserum α bei 37 ℃ in 5 % CO₂ . inkubiert . Als die Zellen fusionierten und auf eine Dichte von 80 % wuchsen, wurden sie verdaut und mit 0,25 % Trypsin passagiert. Die dritte Passage wurde für Zellexperimente verwendet.

Lebend-/Totfärbung

Die Zytotoxizität jeder Gruppe wurde durch Lebend/Tot-Fluoreszenzfärbung bewertet. Die Zellaussaatdichte betrug 1,5 × 10 ⁴ . Zellen/cm ² . Nach 3 Tagen Kultur wurden die Proben mit sterilem PBS gespült und gemäß dem Kit für Lebend-/Totlebens-/Zytotoxizitäts-Kit behandelt. Die Zytotoxizität des Materials wurde durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet.

Zelladhäsion und -proliferation

Die Zellen wurden auf der Oberfläche jeder Gruppe mit einer Dichte von 1,5 × 10 ⁴ . geimpft Zellen/cm ² . Nach 1 h, 2 h und 6 h Inkubation wurden die Zellen mit PBS gespült und 30 min mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Nach dem Spülen mit PBS wurden 40 μl DAPI-Färbemittel 10 Minuten lang auf die Oberfläche der Probe getropft, um eine Lichtfärbung zu vermeiden, und die Proben wurden mit einem konfokalen Lasermikroskop betrachtet und abgebildet.

Die Zellaussaatdichte und das Kulturverfahren waren die gleichen wie oben, und die Proliferationsaktivität der Zellen wurde mit dem CCK-8-Kit 1, 3 und 10 Tage nach der Zellkultur gemessen.

Expression von Genen im Zusammenhang mit der osteogenen Differenzierung

Die Zellinokulationsdichte und das Kulturverfahren waren die gleichen wie oben. Die Zellen wurden 1, 3 und 10 Tage nach der Inokulation gesammelt, und eine quantitative Echtzeit-PCR wurde verwendet, um die mRNA-Spiegel von osteogenen Differenzierungs-bezogenen Genen (einschließlich BMP) nachzuweisen , COL-I, ALP und OCN ). Die Expressionsniveaus der Zielgene wurden auf die des Housekeeping-Gens GAPDH normal normalisiert . Die Primer-Sets sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tiere und Chirurgie

Die Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Volkskrankenhauses der Provinz Guizhou genehmigt. Sechzehn erwachsene Kaninchen, sowohl männlich als auch weiblich, mit einem Gewicht von 3,6 kg (3,2–3,9 kg) wurden vom Experimental Animal Center der Soochow University gekauft und in eine Versuchs- und eine Kontrollgruppe (jeweils 8 Kaninchen) aufgeteilt. Die intravenöse Anästhesie wurde mit 3 % Natriumpentobarbital (0,1 ml pro Kilogramm Körpergewicht) durchgeführt. Nach der Hautvorbereitung wurde die Haut fixiert und routinemäßig desinfiziert. Im lateralen Femurkondylus wurde ein Längsschnitt vorgenommen, um den lateralen Kondylus freizulegen. Auf einer ebenen Fläche wurde mit einem chirurgischen Elektrobohrer ein Loch mit einem Durchmesser von 2,7 mm und einer Tiefe von 6 mm gebohrt. Zwei Sätze Titanstäbe wurden in den Knochendefekt implantiert (der linke in der Versuchsgruppe und der rechte in der Kontrollgruppe) und Penicillin wurde an 3 aufeinanderfolgenden Tagen nach der Operation verabreicht, um eine Infektion zu verhindern.

Mikro-CT-Assay

Nach der Operation wurden die Kaninchen in getrennten Käfigen gehalten und konnten Wasser trinken und essen. 4 W und 8 W nach der Operation wurden 8 Kaninchen durch Luftembolisation euthanasiert. Die Femurkondylen der Kaninchen mit Titanstäben in der Experimentalgruppe und der Kontrollgruppe wurden entfernt, die Probengröße wurde beschnitten, die Proben wurden formalinfixiert und Mikro-CT-Scans wurden für die dreidimensionale Rekonstruktion verwendet. Die Region of Interest (ROI) wurde mit der Micro-CT-Software eingestellt und der Knochenvolumenanteil der Region of Interest (Knochenvolumen/Gesamtvolumen, BV/TV %) wurde gemessen.

Histologische Untersuchung durch Toluidinblau- und Fuchsin-Methylenblau-Färbung

Die Proben wurden mit Gradientenalkohol (70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 100 %) entwässert. Die dehydratisierten Proben wurden mit Methylmethacrylat eingebettet. Nach erfolgreicher Einbettung wurden die Proben geschnitten und besäumt, auf einem Slicer mit Klebstoff zum Schneiden fixiert und abschließend mit Sandpapier auf eine Schnittdicke von ca. 20–30 μm poliert. (1) Toluidinblau-Färbung:Toluidinblau-Farbstoff wurde auf die Oberfläche der Scheibe gegeben und die Scheibe wurde in einem Wasserbad gefärbt. Der Oberflächenfarbstoff wurde mit Filterpapier getrocknet, gespült und natürlich an der Luft getrocknet. Der Film wurde versiegelt und unter einem Lichtmikroskop betrachtet. (2) Fuchsin-Methylenblau-Färbung:Das Verfahren war das gleiche wie bei der Toluidinblau-Färbung. Zuerst wurde die Oberfläche der Schnitte zum Färben mit Methylenblau-Färbelösung versetzt, an der Luft getrocknet und gespült. Dann wurden die Scheiben zum Färben in Fuchsin-Färbelösung getränkt, natürlich an der Luft getrocknet, versiegelt und beobachtet.

Statistische Analyse

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt, bestimmt durch die Software SPSS 16.0. Einweg-ANOVA und der SNK-Test wurden verwendet, um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu vergleichen. P < 0,05 zeigt einen signifikanten Unterschied an.

Ergebnisse

Oberflächenmorphologie, Phasen- und chemische Elementzusammensetzung der Probe

Abbildung 1 zeigt die SEM-Oberflächenmorphologien verschiedener Proben. Die Morphologien der Ti-Gruppe und anderer Gruppen sind signifikant unterschiedlich. Die Ti-Gruppe weist keine Löcher auf der Oberfläche auf, und die Oberfläche ist relativ flach und hinterlässt nur einige Kratzer. Die TCP-Gruppe weist eine typische Mikroarc-Oxidationsoberflächenmorphologie auf, und die Oberfläche ist mit Mikroporen unterschiedlicher Größe bedeckt. Diese Mikroporen kreuzen sich und haben eine ungefähre "dreidimensionale Struktur". Große und kleine Poren sind ineinander verschachtelt und die Poren haben keine festen Regeln. Die Form ist unregelmäßig. Außerdem befinden sich Brandspuren in den Lücken zwischen den Löchern. Ähnlich der Oberflächenmorphologie der TCP-Gruppe sind auch die Oberflächen der TCP Cu I- und TCP Cu II-Gruppen von unregelmäßig geformten Mikroporen bedeckt, und es gibt keinen offensichtlichen Unterschied in der Oberflächenmorphologie zwischen den Gruppen. Die Dotierung von Kupfer beeinflusst die Struktur und Morphologie der Mikroporen nicht.

Oberflächenmorphologien von Ti, TCP, CP Cu I und TCP Cu II

Abbildung 2 zeigt die Kartierung und das EDS-Diagramm des mikroporösen Cu-TiO₂ . Beschichtung Wie im EDS-Diagramm zu sehen, ist das mikroporöse Cu-TiO₂ Beschichtung besteht aus Cu, Ti, Ca, P und O. Die Lösung mit Cu, Ca und P wurde vollständig in die Beschichtung eingearbeitet. Noch wichtiger ist, dass wir keine anderen giftigen und schädlichen Elemente gefunden haben. Die Kartierungsergebnisse des mikroporösen Cu-TiO₂ Beschichtung zeigen, dass Kupfer, Calcium und Phosphor gleichmäßig in der Beschichtung verteilt sind.

Kartierung und EDS-Diagramm des Cu-TiO₂ Beschichtung (TCP Cu II)

Abbildung 3 zeigt die XRD-Muster von Ti, TCP, TCP Cu I und TCP Cu II. Alle Beschichtungen sind hauptsächlich Ti, Rutil und Anatas. Noch wichtiger ist, dass CuO im mikroporösen Cu-TiO₂ . vorkommt Beschichtung, die darauf hinwies, dass Kupfer in Form von CuO existierte.

XRD-Muster von Ti, TCP, TCP CuI und TCP CuII

Abbildung 4 ist das XPS-Bild des mikroporösen Cu-TiO₂ . Glasur. Abbildung 3a zeigt das gesamte Spektrum des mikroporösen Cu-TiO₂ . Beschichtung durch Röntgen-Photoelektronenspektroskopie bestimmt, die dem EDS-Ergebnis ähnlich ist, außer für Titan, Sauerstoff, Calcium und Phosphor. Neben den charakteristischen Kupferspitzen gibt es auch charakteristische Kupferspitzen. Der Gipfel im Ti2p Spektrum entspricht TiO₂ , und der Peak von Cu2p bei 932,7 eV gilt als Hinweis auf CuO [17, 18].

XPS-Bild des mikroporösen Cu-TiO₂ Glasur. a XPS-Spektrum, b Ti2p , c Cu2p , d Ca2p , e P2p und f O1s Spektren

Abbildung 5 zeigt die Profilometermorphologie verschiedener Proben. Mit Ausnahme der Ti-Proben ist die Oberflächenmorphologie der Profilometer jeder Gruppe ähnlich, was eine vulkanische mehrstufige Porenhohlraumstruktur zeigt. Eine weitere Analyse der Rauheit Ra jeder Gruppe zeigte, dass die Rauheit von TCP, TCP CuI und TCP CuII größer war als die von Ti. Die Rauheit von TCP, TCP CuI und TCP CuII ist ähnlich und der Unterschied ist nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass die Mikrolichtbogenoxidation die Rauheit von Ti erhöht, aber die Kupferdotierung die Rauheit der Proben nicht beeinflusst.

Profilometer-Morphologie verschiedener Proben

Zelladhäsion und -proliferation

Abbildung 6a zeigt zelladhärente Bilder 1, 2 und 6 h nach der Färbung mit DAPI. Abbildung 6b zeigt die Anzahl der MC3T3-E1-Zellen, die zu verschiedenen Zeiten an den Oberflächen verschiedener Proben hafteten. Die Anzahl anhaftender Zellen in verschiedenen Probengruppen zu verschiedenen Zeitpunkten ist in der folgenden Reihenfolge angeordnet:TCP Cu II'>  TCP Cu I'>  TCP'>  Ti. Im Vergleich zu den Ti- und TCP-Gruppen nahm die Anzahl anhaftender Zellen in den TCP Cu I- und TCP Cu II-Gruppen signifikant zu. Daher ist das mikroporöse Cu-TiO₂ Beschichtung kann die Zelladhäsion deutlich fördern.

Adhäsion und Proliferation von MC3T3-E1-Zellen auf den Oberflächen verschiedener Proben. a Zelladhärente Bilder 1, 2 und 6 h nach der Färbung mit DAPI, b Balkendiagramm adhärenter Zellen und c Balkendiagramm der Zellproliferation (Daten werden als Mittelwert ± SD, n . dargestellt = 5. **p < 0.01 im Vergleich zu Gruppen-TCP)

Abbildung 6c zeigt die Proliferation von MC3T3-E1-Zellen auf der Oberfläche verschiedener Proben zu unterschiedlichen Zeiten. Ähnlich dem Adhäsionstrend der obigen Zellen war die Zellproliferation der TCP Cu I- und TCP Cu II-Gruppen signifikant höher als die der Ti- und TCP-Gruppen. Die Oberflächenmorphologie des mikroporösen Cu-TiO₂ Beschichtung und Kupferionen förderten zusammen die Zellproliferation.

Abbildung 7 zeigt die EdU-Färbeergebnisse. Das Verhältnis der EdU-positiven Kerne folgte dieser Reihenfolge:TCP CuII >  TCP CuI >  TCP >  Ti. Im Vergleich zur Ti-Gruppe unterschied sich die Zellproliferation in der TCP-CuII-Gruppe signifikant.

EdU-Färbung, gemessen nach 3 Tagen der Kultivierung (Daten sind als Mittelwert ± SD, n . angegeben = 5. **p < 0.01 im Vergleich zu Gruppen-TCP)

Lebend-/Totfärbung

Zytokompatibilität ist die Grundvoraussetzung von Implantatmaterialien. Lebend/tot-Fluoreszenzfärbung kann die Zytotoxizität und Biokompatibilität von Materialien bewerten. Abbildung 8 zeigt die Ergebnisse der Färbung lebender/toter Zellen, nachdem Zellen 3 Tage lang auf der Oberfläche verschiedener Proben kultiviert wurden. Es gab nur wenige tote Zellen (rot) auf der Oberfläche jeder Probengruppe, was auf keine offensichtliche Zytotoxizität hinweist. Kupferdotierung im mikroporösen Cu-TiO₂ Die Beschichtung erhöht die Zytotoxizität nicht offensichtlich und hat eine gute Zellkompatibilität.

Färbung lebender/toter Zellen auf den Oberflächen verschiedener Proben (Daten werden als Mittelwert ± SD, n . dargestellt = 5. **p < 0.01 im Vergleich zu Gruppen-TCP)

Expression von osteogenen Differenzierungsgenen

Abbildung 9 zeigt die mRNA-Expressionsniveaus der osteogenen Differenzierungsgene (BMP , OCN , ALP und COL-I ) auf den Oberflächenzellen jeder Probengruppe zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Im Laufe der Zeit nahm die Expression von osteogenen Differenzierungsgenen auf der Oberfläche jeder Probengruppe allmählich zu. Gleichzeitig zeigte die Expression jeder Gengruppe den folgenden Trend:TCP Cu II > TCP Cu I >  TCP >  Ti. Im Vergleich zu den Ti- und TCP-Gruppen war die Expression von knochenbezogenen Differenzierungsgenen, die aus TCP Cu I und TCP Cu II bestehen, signifikant erhöht, was darauf hindeutet, dass das mikroporöse Cu-TiO₂ Beschichtung kann die osteogene Differenzierung fördern.

Die mRNA-Expression von BMP , OCN , ALP und COL-I nach 1, 3 und 10 Tagen Inkubation (Daten als Mittelwert ± SD, n = 5.*p < 0,05 im Vergleich zu Gruppen-TCP, **p < 0.01 im Vergleich zu Gruppen-TCP)

Bruttobeobachtung und Mikro-CT-Analyse

Abbildung 10 zeigt die Ergebnisse der Gesamtbeobachtung und der Mikro-CT-Rekonstruktion des Femurkondylus. Die grobe Beobachtung zeigte, dass sich die Implantate in den beiden Gruppen nach 4 und 8 Wochen in der Mitte des Femurkondylus befanden, mit guter Positionierung, ohne offensichtliche Infektion und ohne Implantatlockerung. Die dreidimensionale Mikro-CT-Rekonstruktion zeigt, dass im Laufe der Zeit das neue Knochengewebe auf der Oberfläche der beiden Probengruppen nach 8 Wochen größer war als nach 4 Wochen, und zu verschiedenen Zeitpunkten wurde neues Knochengewebe auf der Oberfläche gebildet des mikroporösen Cu-TiO₂ -beschichtetes Titanimplantat, und die Menge war größer als die der Kontrollgruppe. Durch Vergleich des Knochenvolumenanteils der beiden Gruppen wird der Knochenvolumenanteil (BV/TV) von mikroporösem Cu-TiO₂ -beschichtetes Titan war signifikant höher als das der Blindkontrollgruppe. Mikroporöses Cu-TiO₂ -beschichtetes Titan kann die Osseointegration von Titanimplantaten fördern.

4 und 8 Wochen nach der Implantation wurden eine grobe Beobachtung und eine Mikro-CT-Rekonstruktion des Femurkondylus beobachtet.

Histologische Auswertung

Abbildung 11 zeigt die Ergebnisse der Färbung mit Toluidinblau und Fuchsin-Methylenblau. An der Knochen-Implantat-Grenzfläche war keine Faserumhüllung zu sehen, was darauf hindeutet, dass das Titanimplantat keine entzündliche Reaktion an der Grenzfläche mit dem Knochen aufwies. Weiße Lücken sind an den Lücken der Titanimplantat-Knochen-Grenzfläche in den beiden Gruppen zu sehen. Die Breite der weißen Lücken in der Kontrollgruppe war größer als die von mikroporösem Cu-TiO₂ beschichtetes Titan. Je breiter der Spalt, desto schwächer die Induktion von neuem Knochengewebe durch die Implantate. Die Toluidinblau-Färbung zeigt das blaue Band an der Implantat-Knochen-Grenzfläche, bei der es sich um den neuen Knochen handelt. Mikroporöses Cu-TiO₂ beschichtetes Titan wies mehr Knochengewebe auf als die Kontrollgruppe, was darauf hindeutet, dass mikroporöses Cu-TiO₂ Beschichtung kann die Osteogenese besser fördern und hat eine bessere Osseointegrationswirkung. Die Knochenmatrix um das mikroporöse Cu-TiO₂ beschichtetes Titan war dicker und durchgehend, und das Knochengewebe war signifikant erhöht. Im Gegensatz dazu hatte die Kontrollgruppe weniger Knochen. Dieses Ergebnis zeigt, dass mikroporöses Cu-TiO₂ beschichtetes Titan kann die Osteogenese besser fördern und hat eine bessere Osseointegrationswirkung.

Toluidinblau- und Fuchsin-Methylenblau-Färbung der Knochenneubildung 4 und 8 Wochen nach der Implantation

Diskussion

Metall-Titan und seine Legierungen werden aufgrund ihrer hervorragenden mechanischen Eigenschaften und Biokompatibilität in der Zahnheilkunde, plastischen Chirurgie und anderen Bereichen häufig verwendet; Titan kann sich als Implantat jedoch nur passiv mit Knochengewebe verbinden. Diese Kombination ist oft eine mechanische Kombination, die dazu neigt, das Implantat zu lockern und einzusinken, was zu einem Implantatversagen führt. Gegenwärtig wird die Methode der Oberflächenmodifikation von Implantaten hauptsächlich verwendet, um die Osseointegrationsfähigkeit zu verbessern [19]. Die Oberfläche des idealen Implantats sollte sowohl Osteokonduktivität als auch Osteoinduktivität aufweisen, eine gute Biokompatibilität aufweisen und die Ausbildung der Osseointegration zwischen Implantat und Knochengewebe fördern [20]. In dieser Studie haben wir ein innovatives mikroporöses Cu-TiO₂ . hergestellt Beschichtung auf der Oberfläche von Titan, in der Hoffnung, die biologische Aktivität und Biokompatibilität von Titan zu verbessern und die Mängel von Titanimplantaten in aktuellen klinischen Anwendungen zu überwinden.

Für Kupferionen und Titandioxid wurde eine gute biologische Aktivität nachgewiesen [21]. In dieser Studie wurde das mikroporöse Cu-TiO₂ Die durch Microarc-Oxidation auf der Titanoberfläche hergestellte Beschichtung zeigte den größten Vorteil der engen Verbindung zwischen der Beschichtung und dem Titansubstrat, was in der Literatur bestätigt wurde [22]. Die gute Haftkraft der Microarc-Oxidationsbeschichtung hängt eng mit dem Entstehungsprozess zusammen. Im Prozess der Mikrolichtbogenoxidation koexistieren chemische Oxidation, elektrochemische Oxidation und Plasmaoxidation. Unter der Einwirkung der momentanen hohen Temperatur und des hohen Drucks, die durch die Bogenentladung erzeugt werden, wächst die Titanoberfläche auf der Oberfläche des Substrats auf eine "Wachstums"-Weise, hauptsächlich das Substratoxid. Die keramische Beschichtung, Beschichtung und das Substrat der Eckzähne sind gegeneinander versetzt und haben eine gute Haftkraft [23].

Die Oberflächeneigenschaften biologischer Materialien wirken sich direkt auf die biologischen Eigenschaften der Materialien aus. Die Microarc-Oxidationsbeschichtung zeigt unter einem Elektronenmikroskop eine raue und poröse Oberflächenmorphologie. Die Morphologie besteht hauptsächlich aus Mikroporen unterschiedlicher Größe, die sich gegenseitig durchdringen. Diese kleinen Poren werden im Prozess der Mikrolichtbogenoxidation gebildet, die Metalloberfläche wird unter Hochspannung aufgebrochen und das sofortige Hochtemperatursintern in der Mikrolichtbogenzone oxidiert und sintert die Titanmatrix direkt zu einem Keramikfilm mit einer kristallinen Keramikphasenstruktur , wo ein elektrischer Ausfall auftritt. Die unter dem Elektronenmikroskop beobachteten Mikroporen werden gebildet. These rough and porous structures can not only increase the attachment area of tissue cells, but these interpenetrating micropores are also equivalent to a three-dimensional scaffold structure, which can induce bone tissue to grow into the pores and promote cell adhesion and extension. Pan et al. [24] prepared micro/nanohierarchical structured TiO₂ coatings on polished titanium by micro-arc oxidation and found that the coatings were favorable for the adhesion and extension of MG63 cells. Zhanget al. [25] prepared a Si–TiO₂ coating by micro-arc oxidation, and further study showed that the adhesion of MC3T3-E1 cells on this silicon-containing TiO₂ coating was significantly higher than that on a Si-free TiO₂ coating and pure Ti.

The greatest advantage of the microarc oxidation coating is that the ions in the electrolyte solution can be introduced into the coating during the microarc oxidation process. In this study, the EDS analysis results of the coating surface showed that the microporous Cu–TiO₂ coating is mainly composed of Cu, Ca, P, O and Ti elements, of which titanium comes from the matrix, calcium and phosphorus come from the basic electrolyte solution, and the copper ions in the electrolyte are deposited in the coating along with the formation of the ceramic film. The calcium and phosphorus components on the surface of the implant can not only improve the surface properties of the material but also induce bone formation. In addition to calcium and phosphorus, the copper ions in the microporous Cu–TiO₂ coating have good biocompatibility and biological activity. Copper-doped coatings on the surface of implants have also been reported in the literature. Astasov-Frauenhoffer et al. [26] deposited copper on Ti via a spark-assisted anodization method and confirmed that the viability of the bacterial cells was strongly inhibited. Zong et al. [27] combined anodization and magnetron sputtering to combine copper into TiO₂ nanotubes and prepare copper (Cu) into TiO₂ NTAs (Cu–Ti–O NTAs), and further study showed that Cu–Ti–O NTAs have excellent long-term antibacterial ability and favorable angiogenic activity.

Biocompatibility is the minimum requirement for measuring implants and is also the basic guarantee for implant safety. In this study, biologically active copper was introduced into the surface of titanium implants through microarc oxidation; however, copper ions, as heavy metal ions, have potential toxicity. Therefore, we must consider whether the microporous Cu–TiO₂ coating is cytotoxic. In this study, live/dead cell staining was used to evaluate the microporous Cu–TiO₂ coating. The results showed no obvious cytotoxicity on the surface of the microporous Cu–TiO₂ coating on the titanium surface, and good cell compatibility was observed. We speculate that this finding may be related to the low copper content of the coating. Huang et al. [28] fabricated gap-bridging chitosan–gelatin nanocomposite coatings incorporated with different amounts of copper (Cu; 0.01, 0.1, 1, and 10 mM for Cu I, II, III, and IV groups, respectively) on Ti and demonstrated that the activities of bone marrow stromal cells were not impaired on Cu-doped coatings except for the Cu IV group.

Cell adhesion and proliferation are the basis of implant osseointegration in the later stage. The more cells that adhere and proliferate on the surface of the implant, the better the effect of implant-bone interface osseointegration. The results of this study showed that on the first day after the material surface was inoculated, the amount of cell adhesion on the surface of the samples of each group differed, and the amount of adhesion on the surface of the microporous Cu–TiO₂ coating group increased significantly. The number of cells that adhered to the sample surface gradually increased, but the number of cells that adhered to the group with microporous Cu–TiO₂ coating was significantly greater than that of the other two groups. The difference was statistically significant, indicating that the microporous Cu–TiO₂ coating was doped with copper ions. A porous, rough surface is most conducive to cell adhesion. Similar to cell adhesion, cell proliferation on the surface of each group of materials also showed similar results. Our research results are similar to previous reports [29].

In addition to adhesion and proliferation, the degree of cell differentiation on the surface of the material can further reflect the performance of the implant's osseointegration. The osteogenic differentiation marker genes ALP , BMP , RUNX2 , OCN and COL-I can reflect cell differentiation. In this study, as time went by, the expression of BMP, OCN, ALP and COL-I on the surface of each group of samples increased, but the expression of the microporous Cu–TiO₂ coating group was significantly higher than that of the control group. This finding is closely related to the promotion of osteogenic differentiation by copper ions. Komarova et al. [30] prepared Zn- and Cu-containing CaP-based coatings by microarc oxidation on Ti and showed that low amounts of Cu and Zn in the coatings promoted high motility of human adipose-derived multipotent mesenchymal stromal cells and subsequent ability to differentiate into osteoblasts.

Osseointegration is the key to the success or failure of the implant. This means that there is no fibrous tissue between the implant and the bone tissue. There is direct contact between the implant and the bone tissue, and it can directly bear stress to realize the relationship between the implant and the bone tissue, establishing a functional connection. The osseointegration between orthopedic implants and bone tissue is affected by many factors, such as the initial stability of the implant and the mechanical properties of the implant material, implant surface properties, biocompatibility, biological activity and the condition of the surrounding bone tissue [31].

An ideal implant position and a stable biomechanical environment are the prerequisite and basis for the osseointegration of the implant-bone interface. In this study, the femoral condyle was chosen to be implanted with a copper-doped microporous coating because the abundant blood supply and sufficient bone volume at the femoral condyle can provide a good anatomical basis and a relatively stable mechanical environment for the implant. Moreover, the femoral condyle is mostly cancellous bone. After implantation, bone formation and the effect of implant-bone interface osseointegration can be more intuitively evaluated.

Micro-CT is currently a common method for observing the osteogenesis performance of implants and is also an effective method for evaluating the osseointegration between implants and bone tissue. Bone microstructure is visualized through three-dimensional reconstruction and the region of interest (ROI) analysis with the assistance of related software to obtain the relevant parameters of new bone tissue. Among all the parameters, BV/TV represents the total amount of bone formation and is an important indicator reflecting the osseointegration of the implant. In this study, we chose BV/TV as the detection index. Four weeks after implantation, the BV/TV of the microporous Cu–TiO₂ coating group was higher than that of the control group. Eight weeks after implantation, the BV/TV values of the microporous Cu–TiO₂ coating group and the control group were higher than those at 4 weeks, and the BV/TV of the microporous Cu–TiO₂ coating group was higher than that of the control group. On the basis of micro-CT detection, we performed histological observation and quantitative analysis of the bone tissue around the implant through hard tissue slices. The results of VG staining showed that the microporous Cu–TiO₂ coating group formed more new bone than the control group, and the new bone that formed around it was in direct contact with the internal implant without fibrous tissue infiltration. These results indicate that microporous Cu–TiO₂ coating on the titanium surface can promote the osseointegration of titanium implants. This finding is similar to previous in vitro studies. The rough, porous structure produced by microarc oxidation mimics the micro/nanostructure of normal bone tissue. More importantly, biologically active copper ions promote bone tissue regeneration. Under the action of these common factors, bone tissue regeneration on the surface of the implant is promoted. Our research results are consistent with literature reports. Milan et al. [32] designed a multifunctional Cu/a-C:H thin coating deposited on Ti–6Al–4 V alloy (TC4) via magnetron sputtering and found that the coating composition can stimulate angiogenesis and osteogenesis and control the host response, thereby increasing the success rate of implants.

Conclusion

In summary, we prepared a microporous Cu–TiO₂ coating on a titanium surface by microarc oxidation. The surface of the coating has a porous structure with pores of different sizes and interconnected pores. The coating increases the surface roughness of Ti and copper is evenly distributed on the surface of the coating. In vitro studies revealed that the coating has no obvious cytotoxicity and can promote the adhesion, proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells. In vivo experiments further confirmed that the coating can induce the formation of new bone tissue and promote osseointegration at the titanium implant-bone interface. In view of the biological activity in vivo and in vitro, we believe that the microporous Cu–TiO₂ coating on the surface of titanium implants has potential clinical application value in orthopedics.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Not applicable.

Abkürzungen

MAO:

micro-arc oxidation

Cu:

copper

Zn:

zinc

Cu–TiO₂ coating:

copper–titanium dioxide coating

ROI:

region of interest

ALP:

alkaline phosphatase