Thiacalix[4]arene entfernen die hemmende Wirkung von Zn-Kationen auf die Myosin-ATPase-Aktivität

Hintergrund

Das Problem der Belastung der Umwelt mit Schwermetallen und die Suche nach Möglichkeiten, deren Auswirkungen auf lebende Objekte zu reduzieren, ist relevant [1, 2].

Zink ist für die meisten Organismen ein essentielles biogenes Element. [3]. Zinkionen bilden mit mehreren Proteinen Komplexe, die lebenswichtige Stoffwechselfunktionen ausführen. Das Zinkion ist Bestandteil von mindestens 300 Metalloenzymen, die mehr als 50 verschiedene biochemische (physiologische) Reaktionen katalysieren [4, 5].

Zink ist jedoch ein Schwermetall. Es ist zusammen mit den beiden giftigen Metallen Cadmium und Quecksilber in der Gruppe IIb des Periodensystems der Elemente zu finden. Dennoch gilt Zink als relativ ungiftig für den Menschen [6]. Dieses Element ist nur in übermäßigen Dosen schädlich [7].

Die mündliche LD₅₀ für Zink liegt laut der TOXNET-Datenbank der US National Library of Medicine bei 3 g/kg Körpergewicht. Es ist mehr als 10-fach höher als Cadmium und 50-fach höher als Quecksilber [6]. Die Überschreitung der normalen Konzentration dieses Mikroelements beim Menschen wird am häufigsten durch die Einnahme von Medikamenten und biologisch aktiven Zusatzstoffen verursacht, die in ihrer Zusammensetzung überflüssiges Zink enthalten. Er wurde als Einzelfälle einer Zinkvergiftung durch den Verzehr von Lebensmitteln erfasst, die in verzinkten oder vollverzinkten Behältern gelagert wurden. Zinkoxid, Chlorid und Zinksulfat werden in der Industrie in großem Umfang verwendet zur Herstellung von Glas; bei der Herstellung von Kunstfasern, Zinkfarben, Keramik, Streichhölzern und Zahnzement; in der Zellstoff- und Papierindustrie, zur Holzkonservierung sowie zum Verzinnen und Löten.

Eine hohe Zinkaufnahme veränderte die Immunantwort [8]. Die erhöhten Werte von Zn, Al, Cu und Fe im Gehirn können laut einigen epidemiologischen Studien die Entwicklung oder das Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit begünstigen [9, 10].

Schwermetalle können die weibliche Fortpflanzung in verschiedenen Stadien wie dem Beginn des fetalen Lebens, der frühen Entwicklung und der Reifung beeinträchtigen. Kationen von Schwermetallen können auch die Ursache für Subfertilität, Unfruchtbarkeit, intrauterine Wachstumsverzögerung, Spontanaborte, Fehlbildungen, Geburtsfehler, postnatalen Tod, vorzeitiges Altern sowie Lern- und Verhaltensstörungen sein [11, 12].

Die kontraktile Funktion des Uterus ist mit der Aktivität des Proteinkomplexes – Actomyosin – verbunden, in dem Myosin eine Enzymaktivität aufweist, nämlich die Fähigkeit, ATP zu hydrolysieren. Myosin-ATPase, die in der katalytischen Domäne des Subfragments-1 (S1 oder Kopf) lokalisiert ist, wandelt chemische Energie, die in makroergen Bindungen von ATP gespeichert ist, in mechanische Bewegung um. Infolgedessen bewegt sich Myosin entlang des Aktinfilaments und verursacht die Muskelkontraktion. Daher wird die durch Myosin katalysierte ATP-Hydrolyse als einer der wesentlichen Prozesse im molekularen Mechanismus der Myometriumfunktion angesehen [13, 14].

Das Myosin-Subfragment-1 ist ein N-terminaler Teil der Myosin-Schwerkette, der aus zwei Domänen besteht:der N-terminalen globulären motorischen (katalytischen) Domäne, die die ATP-ase-Stelle und die Aktin-Bindungsstelle enthält, und die regulatorische Domäne, oder Hebelarm, der für die Bewegung von Myosin entlang der Aktinfilamente verantwortlich ist. Den Kern der Myosin-Motordomäne bildet ein zentrales, siebensträngiges β-Faltblatt, das von α-Helices umgeben ist. Eine große strukturelle Domäne, die sechs der sieben Stränge des zentralen β-Faltblatts ausmacht, wird normalerweise als obere 50-kDa-Domäne (U50) bezeichnet. Ein großer Spalt trennt die obere 50-kDa-Domäne von der wohldefinierten strukturellen unteren 50-kDa-Domäne (L50), die von den Aminosäureresten 465 bis 590 gebildet wird. Die Aktinbindungsregion und die Nukleotidbindungsstelle von Myosin sind auf gegenüberliegenden Seiten des siebensträngigen β-Faltblatts mit der Phosphateinheit des Nukleotids an der Rückseite der Nukleotid-Bindungstasche. Die P-Schleife, Schalter 1 und Schalter 2 befinden sich in der oberen 50-kDa-Domäne nahe der Spitze der großen Spalte. Alle drei Nukleotid-bindenden Motive kontaktieren die Phosphat-Einheit des Nukleotids an der Rückseite der Nukleotid-Bindungstasche und wirken als γ-Phosphat-Sensoren [15].

In unseren früheren Studien wurde festgestellt, dass Schwermetallkationen die Myosin-ATPase-Aktivität der glatten Uterusmuskulatur [16, 17] hemmen, was die kontraktilen Eigenschaften des Myometriums negativ beeinflussen kann.

Die nachteilige Wirkung von Schwermetallen auf die Kontraktilität der Gebärmutter erfordert die Entwicklung pharmakologischer Substanzen, die diese schädlichen Wirkungen beseitigen können.

Calixarene haben derzeit die Aufmerksamkeit der Forscher als potenzielle künstliche Effektoren für verschiedene biochemische Prozesse auf sich gezogen. Diese Verbindungen sind synthetische makrocyclische Phenololigomere, die eine becherförmige Struktur aufweisen. Ihre oberen und unteren Ränder können mit verschiedenen chemischen Substituenten funktionalisiert werden. Calix[4]arene bestehen aus vier funktionalisierten Arenfragmenten und zeichnen sich durch eine recht flexible Makrocyclus-Konformation aus. Calix[4]arene zeigten eine geringe Toxizität der Matrix und die Fähigkeit, in die Zellen einzudringen. Daher gelten diese Verbindungen als vielversprechende Wirkstoffe für die Entwicklung neuer wirksamer Medikamente [18, 19].

Eine vielversprechende Klasse solcher Substanzen sind wasserlösliche Thiacalixarene [18] mit metallkomplexierenden Gruppen an der makrocyclischen Molekülplattform. Die Calixarene wurden aufgrund ihrer Fähigkeit, supramolekulare Komplexe mit (Bio)Metallkationen zu bilden, auch in der biomedizinischen Forschung als Extraktionsmittel von Schwermetallen verwendet [20,21,22].

Wir haben zuvor gezeigt, dass Tetrahydroxy-thiacalix[4]aren-tetrasulfonat (С-798) die hemmende Wirkung von Pb ²⁺ . eliminiert , Cd ²⁺ , und Ni ²⁺ zur ATP-Hydrolyse, die durch Myosin S1 aus Schweinemyometrium katalysiert wird [23].

Ziel dieser Studie war es, die Wirkung hoher Konzentrationen von Zinkkationen und ihre gemeinsame Wirkung mit Tetrahydroxy-Thiacalix[4]aren-tetrasulfonat (С-798) und Tetrahydroxy-thiacalix[4]aren-tetraphosphonat (C-800) auf das Myosin zu untersuchen S1-ATPase-Aktivität aus der Gebärmutter. Diese Studie war erforderlich, um die Fähigkeit dieser Thiacalixarene zu testen, die negativen Auswirkungen hoher Zinkkonzentrationen auf die enzymatische Aktivität des Uterusmyosins zu beseitigen.

Thiacalix[4]arene C-798 und C-800 bestehen aus einer Schale, die aus vier phenolischen Fragmenten besteht, die am oberen Rand mit vier anionischen Sulfonat- bzw. vier Phosphonatgruppen modifiziert sind. Beide Thiacalix[4]arene haben Hydroxylgruppen und zweiwertige Schwefelatome, die dicht am unteren Rand angeordnet sind, sodass sie Schwermetalle unter Bildung stabiler Metallkomplexe chelatisieren können [21] (Abb. 1).

Die chemische Struktur des Tetrahydroxy-thiacalix[4]aren-tetrasulfonats (C-798) (a ), Tetrahydroxy-thiacalix[4]aren-tetraphosphonat (C-800) (b ) und das Schema des Chelatkomplexes des Thiacalixarens mit Metallkation am unteren Rand (invertierte Position) (c )

Diese Arbeit ist das Ergebnis eines gemeinsamen Projekts des Palladin-Instituts für Biochemie und des Instituts für Organische Chemie der NAS der Ukraine, das sich auf die Interaktion der Myosin-ATPase des Myometriums mit Calix[4]arenen konzentriert, die Inhibitoren oder Aktivatoren (Effektoren) der Uterusmyosin-ATPase sind.

Ergebnisse

Abhängigkeit der Myosin-S1-ATPase-Aktivität von Zn ²⁺ Konzentration

Es wurde festgestellt, dass die stärkste Hemmwirkung auf die Myosin-S1-ATPase-Aktivität aus der Gebärmutter bei 5 mM (43 ± 8%, M ± SD) für Zn-Kationen lag. Der Konzentrationsbereich von Zn ²⁺ war 0,5–5 mM im Inkubationsmedium (mit 3 mM ATP, 5 mM Mg ²⁺ , und 0,01 mM Ca ²⁺ ). Einhundert Prozent ist der Wert der ATPase-Aktivität ohne Zugabe von Zn-Kationen (Kontrolle) (Abb. 2). Daher wurden die negativen Auswirkungen von Zn-Kationen auf die Myosin-S1-ATP-Hydrolyse mit 5 mM Zn ²⁺ . weiter untersucht .

Myosin-S1-ATPase-Aktivität aus dem Myometrium in Gegenwart von 0,5–5,0 mM Konzentrationen von Zn-Kationen (M ± SD, n = 6). 100 % ist der Wert der ATPase-Aktivität ohne Zugabe von Zn-Kationen

Abhängigkeit der Myosin-S1-ATPase-Aktivität von der ATP-Konzentration in Gegenwart von 5 mM Zn ²⁺

Das Zn ²⁺ Wirkung auf die Affinität der Myosin-S1-ATPase-Aktivität zu seinem Substrat (ATP) wurde untersucht. Erhöhung der ATP-Konzentration im Inkubationsmedium von 0,5 auf 5 mM bei einem fixierten MgCl₂ Konzentration (5 mM) sowohl in der Kontrolle als auch in Gegenwart von 5 mM Zn ²⁺ führte zu einem kuppelförmigen Diagramm mit einem maximalen Wert der ATPase-Aktivität bei 3 mM ATP. Der Wert der enzymatischen Aktivität bei diesem Peak in Gegenwart von Zink war 30% niedriger als der der Kontrolle (Fig. 3). Die Diagramme der Abhängigkeit der Myosin-S1-ATPase-Aktivität von der ATP-Konzentration in der Kontrolle und der Anwesenheit von 5 mM Zn ²⁺ im aufsteigenden Teil wurden nach der Lineweaver-Burk-Methode [27] linearisiert. Die Berechnung der kinetischen Parameter, nämlich der imaginären Konstante von Michaelis (K _m ) und maximale Rate der Myosin-S1-ATPase für ATP (V _{max, ATP} ) hat ergeben, dass V _{max, ATP} der enzymatischen Aktivität von Myosin in Gegenwart von 5 mM Zn ²⁺ um das 1,6-Fache verringert (38 ± 7 und 22 ± 6 nmol Pi/min pro 1 mg Protein in der Kontrolle und das Vorhandensein von Zn ²⁺ bzw. n = 5). Der Wert von К _m für die ATP-Hydrolyse durch Myosin S1 ändert sich statistisch nicht, obwohl sie tendenziell abnimmt (0,49 ± ± 0,15 mM in der Kontrolle, 0,38 ± ± 0,12 mM in Gegenwart von Zn ²⁺ ; M ± SD; n = 5).

Der Einfluss von 0,5–5 mM ATP auf die Myosin-S1-ATPase-Aktivität aus der Gebärmutter in Gegenwart von 5 mM Zn ²⁺ im Vergleich zu einer Kontrolle (M ± SD, n = 5)

Abhängigkeit der Myosin-S1-ATPase-Aktivität von Mg ²⁺ Konzentration in Gegenwart 5 mM Zn ²⁺

Die Wirkung von 5 mM Zn ²⁺ auf Mg ²⁺ Die Konzentrationsabhängigkeit von der ATPase-Aktivität von Uterusmyosin wurde untersucht. Erhöhung des Mg ²⁺ Konzentration im Inkubationsmedium von 0,5 bis 5 mM bei einer festen ATP-Konzentration (3 mM) in Gegenwart von 5 mM Zn ²⁺ führt nicht zu einer Änderung der Myosin-S1-ATPase-Aktivität. Gleichzeitig ist das Mg ²⁺ Konzentrationsabhängigkeit der ATPase-Aktivität in der Kontrolle (unter den Standardbedingungen) wurde nachgewiesen. Der höchste Grad an Myosin-ATP-Hydrolyse in der Kontrolle wurde bei 3 mM Mg ²⁺ . erreicht (Abb. 4). Daher hängt die Myosin-S1-Enzymaktivität der Gebärmutter nicht von der Konzentration von Mg ²⁺ . ab in Gegenwart von hohen Zn-Konzentrationen (5 mM).

Abhängigkeit der Myosin-S1-ATPase-Aktivität von Mg ²⁺ Konzentration in Gegenwart von 5 mM Zn ²⁺ im Vergleich zu einer Kontrolle (M ± SD, n = 6)

Zn-Bindungsstellen in Myosin S1

Die Computersimulation zeigt, dass Zn-Kationen mehrere Bindungsregionen im Myosinkopf aufweisen. Einer von ihnen befindet sich im unteren Teil des Spalts zwischen der oberen und unteren 50-kDa-Subdomäne, nahe der Nukleotid-Bindungsstelle und direkt in der Nähe der P-Schleife. Zn ²⁺ ist mit den Sauerstoffatomen Glu177 (Bindungslänge 0,23 und 0,39 nm), mit dem Ser178-Sauerstoffatom (Bindungslänge 0,31 nm) und Arg236 (Bindungslänge 0,32 nm) koordiniert.

Eine andere Zn-bindende Region befindet sich am unteren Ende der oberen 50-kDa-Subdomäne (Leu218-Asp463, Glu605-Phe621) und in der Nähe des Schalters 1 (Gly233-Phe246) und der P-Schleife. Zn ²⁺ kann mit dem Sauerstoffatom Glu327 (Bindungslänge 0,21 nm), mit einem Sauerstoffatom Glu326 (Bindungslänge von 0,34 nm) und einem Sauerstoffatom Asp323 (Bindungslänge 0,32 nm) koordinieren. Das Zn-Kation kann auch mit dem Myosin S1 in der Region interagieren, die den Schalter 2 kontaktiert, und mit Glu 465 (0,24 nm), Asp468 (Bindungslänge 0,31 nm) und Leu653 (Bindungslänge 0,37 nm) interagieren. Diese Bindungsregion befindet sich in der Nähe der Aktinbindungsstelle und der Spalte zwischen den oberen und unteren 50 kDa-Subdomänen. Der Boden dieser Spalte befindet sich in der ATP-Bindungstasche. Diese bindenden Zn ²⁺ Myosin-S1-Domänen spielen eine wesentliche Rolle bei der Bindung und Hydrolyse des ATP. Diese Regionen durchlaufen beim Energietransfer von der ATP-Hydrolysestelle auf die Aktin-bindende Oberfläche komplexe Konformationstransformationen.

Thiacalix[4]arene beseitigen die hemmende Wirkung von Zn ²⁺ zur Myosin-ATPase-Aktivität

Einhundert Mikromolar C-800- oder C-798-Lösungen in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2) wurden dem Inkubationsmedium mit 5 mM Zn-Kationen zugesetzt, um die negativen Auswirkungen von Zn ²⁺ . zu beseitigen auf die ATPase-Aktivität des Myosins S1 der glatten Muskulatur der Gebärmutter. Als Kontrolle wurde es als enzymatische Aktivität ohne Zugabe von Zink und/oder Thiacalix[4]arenen zum Inkubationsmedium verwendet. Es wurde gezeigt (Abb. 5), dass die Verbindung C-800 die ATPase-Aktivität von Myosin S1 des Myometriums nicht beeinflusst. Obwohl die Verbindung C-798 eine geringe hemmende Wirkung auf die Myosin-S1-ATPase-Aktivität zeigt, die höchstwahrscheinlich mit der Extraktion einer bestimmten Menge an Mg ²⁺ . zusammenhängt [21], essentiell für die ATP-Bindung im aktiven Zentrum und seine Hydrolyse, aus dem Inkubationsmedium. Nichtsdestotrotz beseitigten 100 μM C-798 sowie C-800 die hemmende Wirkung von 5 mM Zn ²⁺ über den Prozess der durch Myosin S1 katalysierten ATP-Hydrolyse.

Wirkung von 100 μM C-798 und C-800 auf die Myosin-S1-ATPase-Aktivität in Gegenwart von 5 mM Zn ²⁺ (M ± SD, n = 5–6). 100 % ist der Wert der ATPase-Aktivität ohne Zugabe des Zn-Kations. Der Unterschied zwischen „Zn“ und „Zn + C-798“ sowie zwischen den Werten von „Zn“ und „Zn + C-800“ ist statistisch signifikant (p < 0.05) und als * bzw. ** angezeigt

Wahrscheinliche Mechanismen der Wiederherstellung der Wirkung von C-798 und C-800 auf die Myosin-S1-ATPase-Aktivität in Gegenwart von Zn ²⁺

Einer der wahrscheinlichsten Mechanismen der Wiederherstellung der Aktivität von C-798 und C-800 auf die Myosin-S1-ATPase-Aktivität in Zn ²⁺ Anwesenheit kann die Fähigkeit von Thiacalix[4]arenen sein, Zn-Kationen zu binden und diese Kationen folglich aus dem Inkubationsmedium auszuschließen. Es war interessant, ob diese Thiacalix[4]arene an Zinkkationen binden können, die bereits an Myosin gebunden sind.

Die Computersimulation zeigte, dass die Thiacalix[4]arene C-798 und C-800 mit Brückenschwefelatomen zwischen aromatischen Ringen die Konformation eines „Kegels“ aufweisen, der durch intra-Wasserstoffbrücken zwischen den phenolischen Gruppen stabilisiert wird. Die energieminimierte Struktur dieser Calixe[4]arene wurde erhalten. Die Gesamtenergie von C-798 nach der Minimierung betrug 64,5 kcal/mol. Die Anwesenheit ionisierter Gruppen an den Calix[4]arenrändern (insbesondere den unteren) erhöht den Beitrag elektrostatischer Wechselwirkungen zur Gesamtenergie der Wechselwirkung zwischen Wirt und Gast signifikant. Wir haben auch die „Minimierung“ des C-798 durchgeführt – Zn ²⁺ Komplex; seine Gesamtenergie betrug 83 kcal/Mol.

C-798 wurde in die Struktur des Myosins S1 eingebettet, das mit dem Zn-Kation kooperiert, das zuvor im Bereich der Schleife P an das Protein gebunden war. In diesem Fall ist Zn ²⁺ interagiert mit den Sauerstoffatomen des unteren Rands und überbrückt den Schwefel von C-798 (O3, 0,21 nm; S1, 0,30 nm; O2, 0,34 nm). Es wird gezeigt, dass Zn ²⁺ weicht in gewissem Maße von den Aminosäureresten der P-Schleife ab und schwächt seine Wechselwirkung mit dem Glu177-Sauerstoffatom (0,43 nm Bindungslänge) (Abb. 6).

Geometrische Parameter der Wechselwirkung von Zn ²⁺ mit der P-Loop-Region von Myosin S1 (a ) und der Einfluss von C-798 auf die Kooperation des Zn-Kations mit dieser Region (b )

Die Fixierung des C-798 im „Hohlraum“ der ATP-bindenden Region von Myosin erfolgt unter Beteiligung mehrerer Aminosäurereste. Insbesondere der hydrophobe Korb aus Thiacalixaren wurde durch die aromatischen Myosin-Aminosäurereste von Phe467 und Phe469 fixiert; negativ geladene Sauerstoffatome von Thiacalixaren interagieren mit positiv geladenen Aminosäureresten von Arg570, Asn572 und His689.

Die Untersuchung des Einflusses von C-798 auf die Veränderung des Zn ²⁺ Position während des Andockens im Bereich nahe der Myosin-ATP-Bindungsstelle zeigte, dass Zn ²⁺ in Gegenwart von Thiacalix[4]aren interagiert mit den Sauerstoffatomen der dritten Sulfonylgruppe (O16–0.26 nm; O15–0.27 nm), fast nicht mit den Sauerstoffatomen Asp134 und Glu326, und die Koordination mit Glu327 ist viel schwächer (0,43 nm Kupplungslänge) (Abb. 7). Dabei wird Thiacalixaren unter Beteiligung mehrerer Aminosäurereste im „Hohlraum“ des Proteins fixiert. Insbesondere negativ geladene Sauerstoffatome von Thiacalixarensulfonylgruppen interagieren mit positiv geladenen Myosin-Aminosäureresten von Lys188, Lys195 und Gln221.

Geometrische Parameter der Wechselwirkung von Zn ²⁺ im Bereich des Myosin-Schalters 1 und des P-Loops von Myosin S1 (a ) und der Einfluss von C-798 auf die Kooperation von Zn ²⁺ mit dieser Region (b )

Es wird gezeigt, dass die bedingte Energiesphäre des Zn-Kations die Oberfläche der Ausbreitung elektrostatischer Wechselwirkungen aufgrund der Anwesenheit von Sauerstoffatomen und Schwefelatomen in C-798 berührt und sogar etwas mit ihr überlappt. Dies deutet darauf hin, dass das untersuchte Kation in ausreichender Wechselwirkung mit negativ geladenen Atomen der oberen und unteren C-798-Kronen steht. Es ist wahrscheinlich, dass Thiacalixaren ein Zn ²⁺ . an sich zieht , wodurch die Wechselwirkung von Kationen mit den Aminosäureresten des Enzyms abgeschwächt wird.

Folglich sind die Ergebnisse des Andockens von C-798 in der Myosin-S1-Region, die Zn ²⁺ . enthält, gebunden, weisen auf die Möglichkeit der Wechselwirkung von C-798-funktionellen Gruppen mit dem Zn-Kation hin. In diesem Fall war die Zn-Kationenbindung mit den Aminosäureresten des Myosins S1 deutlich geschwächt und der Abstand zwischen ihnen vergrößert sich. Als Ergebnis kann die nachteilige Wirkung des Zn-Kations auf die ATPase-Aktivität von Myosin eliminiert werden.

Wir führten auch eine Computersimulation des Effekts von Calix[4]arene C-800 durch, der im Bereich nahe der ATP-bindenden Region von S1-Myosin andockt, um die Geometrie des Kations Zn zu verändern. Gleichzeitig Zn ²⁺ in Kontakt mit Arg236 (0,37 nm Bindungslänge), Glu675 (0,41 nm Bindungslänge) und Atomen der oberen funktionellen Calix[4]aren-Reste (H26, 2,36 nm; H30, 2,96 nm; C30, 0,31 nm; O5, 3,7 nm; O16, 0,4 nm, O7, 0,48 nm und O11, 0,51 nm Bindungslänge). Zn ²⁺ interagiert mit Calix[4]aren C-800, ähnlich wie C-798. Das Kation wird auch von der vorherigen Bindungsstelle in dieser Region abgezogen und steht in Kontakt mit Asp468 (0,2 nm Bindungslänge) und Atomen der unteren Calixaren-Krone (C4, 1,96 nm; C14, 2,07 nm; S3, 2,16 nm; O2 , 2,26 nm; C3, 2,97 nm; C20, 3,10 nm; O4, 4,2 nm; C14, 3,0 nm und O3, 4,1 nm).

Das Andocken von C-798 und C-800 in die Myosin-Subfragment-1-Region zeigte, dass diese Thiacalix[4]arene mit Zn-Kationen interagieren können, die an Myosin-Aminosäurereste in der Nähe des aktiven Zentrums der ATPase binden. Daher könnte ihre Schutzwirkung auf die Abschwächung der Wechselwirkung zwischen diesen Kationen und Myosin S1 zurückzuführen sein.

Diskussion

Zahlreiche weibliche Fortpflanzungsstörungen werden durch Störungen der glatten Muskulatur (Myometrium) der Gebärmutter verursacht. Schwermetalle haben einen negativen Einfluss auf die Kontraktilität der glatten Muskulatur der Gebärmutter. Das Schwermetall Zink ist für die meisten Organismen ein essentielles biogenes Element; hohe Dosen dieses Elements sind giftig [5]. Mehrere Untersuchungen der millimolaren Konzentrationen von Zn ²⁺ an lebenden Objekten wurden bereits beschrieben [32]. Wir fanden heraus, dass 5 mM Zn die stärkste hemmende Wirkung auf die Myosin-S1-ATPase-Aktivität aus der Gebärmutter haben. Daher wurden die negativen Auswirkungen von Zn-Kationen auf die Myosin-S1-ATP-Hydrolyse mit dieser Konzentration von Zn ²⁺ . weiter untersucht . Die Berechnung der kinetischen Parameter der Myosin-S1-ATPase für ATP ergab, dass V _{max, ATP} der enzymatischen Aktivität von Myosin in Gegenwart von 5 mM Zn ²⁺ um das 1,6-fache verringert. Der Wert von К _m für die ATP-Hydrolyse ändert sich statistisch nicht, obwohl sie tendenziell abnimmt.

Myosin ist unter physiologischen Bedingungen ein Mg ²⁺ -abhängige ATPase. Das Magnesiumkation ist an der ATP-Bindung im aktiven Zentrum des Myosins sowie an der ATP-Hydrolyse beteiligt. Die Mg ²⁺ wird im aktiven Zentrum des Enzyms mit den Seitenketten der Myosin-Aminosäurereste Thr-186 und Ser-237 sowie β- und γ-Phosphatgruppen des ATP-Moleküls unter Bildung der β- und γ- zweizähnigen Komplex sowie mit aktiven Wassermolekülen, von denen eines einen nukleophilen Angriff auf γ-Phosphat ATP ausführt [33, 34]. Mg ²⁺ interagiert mit negativ geladenen ATP-Phosphorgruppen, polarisiert sie und ermöglicht so einen nukleophilen Angriff auf terminales γ-Phosphat [14].

Es wurde festgestellt, dass die Myosin-S1-ATPase-Aktivität nicht empfindlich auf das Vorhandensein von Mg ²⁺ . reagiert bei einer Konzentration von 5 mM von Zn ²⁺ im Gegensatz zur Kontrolle bei Abwesenheit von Zink im Inkubationsmedium [35, 36].

Die Myosin-ATPase-Aktivität hängt von der Natur der Metallkationen ab und korreliert gut mit ihrem Ionenradius. Die Ionenradien Mg ²⁺ und Zn ²⁺ in den Lösungen sind sehr ähnlich (0,070 bzw. 0,076 nm) [37]. Daher ist die Wechselwirkung von Zn ²⁺ Kationen mit Mg ²⁺ -Bindungsstellen von Myosin möglich. Somit ist das Mg ²⁺ -Bindungsstellen können von Zn ²⁺ . besetzt werden Kationen in seinen hohen Konzentrationen. Die ATPase-Aktivität des Myosin S1 unter solchen Bedingungen kann gegenüber Magnesiumkationen unempfindlich sein. Myosin enthält zwei hochaffine Stellen für Mg ²⁺ , und Mg ²⁺ die an diesen Stellen gebunden sind, spielt eine wichtige physiologische Rolle im Energieumwandlungsprozess während der Muskelkontraktion. Es gibt noch mehrere Mg ²⁺ -Bindungsstellen zusätzlich zur ATPase-Stelle im Myosinmolekül, die sich in der Bindungsenergie von Magnesiumionen und ihrer Affinität unterscheiden [35]. Daher kann davon ausgegangen werden, dass Zn ²⁺ kann auch an andere funktionell wichtige Stellen von Myosin S1 binden, die die Bindung und Hydrolyse von ATP beeinflussen.

Die Computersimulation zeigt, dass Zn-Kationen mehrere Bindungsregionen im Myosinkopf haben, die sich in der Nähe der ATP-Bindungsstelle befinden, nämlich die P-Schleife und die obere und untere 50-kDa-Subdomäne schalten 2. Diese bindenden Zn ²⁺ Myosin-S1-Domänen spielen eine wesentliche Rolle bei der Bindung und Hydrolyse des ATP. Diese Regionen durchlaufen beim Energietransfer von der ATP-Hydrolysestelle auf die Aktin-bindende Oberfläche komplexe Konformationstransformationen.

Die Analyseergebnisse von Zn ²⁺ Andocken an Myosin S1 weisen darauf hin, dass eine Schlüsselrolle bei der Bindung dieses Kations an das Myosin-Molekül seine Wechselwirkung mit negativ geladenen Gruppen der Enzym-Aminosäurereste spielt, insbesondere Glu und Asp.

Der schädliche Einfluss toxischer Konzentrationen von Zn ²⁺ Kationen auf die Myosin-S1-ATPase-Aktivität erfordert die Suche nach pharmakologischen Verbindungen, die die Wirkung dieses Metalls eliminieren können. Gegenstand unserer Studie waren Tetrahydroxythiacalix[4]aren-tetrasulfonat (C-798) und Tetrahydroxythiacalix[4]aren-tetraphosphonat (C-800), die Übergangs- und Schwermetalle unter Bildung stabiler Metallkomplexe chelatisieren können (Abb. 1). Die obere makrocyclische Krone von C-798 und C-800 enthält vier anionische Sulfonatgruppen bzw. vier Phosphonate, die aufgrund elektrostatischer Kontakte mit positiv geladenen Stickstoffatomen von Aminosäurefragmenten für eine gute Wasserlöslichkeit von Thiacalixaren und eine Haftung an Proteinmolekülen sorgen [21 ].

Das Andocken von C-798 und C-800 in die Myosin-S1-Region zeigte, dass diese Thiacalix[4]arene mit Zn-Kationen interagieren können, die an Myosin-Aminosäurereste in der Nähe des aktiven Zentrums der ATPase binden. Daher könnte ihre Schutzwirkung auf die Abschwächung der Wechselwirkung zwischen diesen Kationen und Myosin S1 zurückzuführen sein. Es wurde spekuliert, dass die erhaltenen Ergebnisse für weitere Forschungen mit dem Ziel verwendet werden könnten, diese Thiacalix[4]arene als pharmakologische Verbindungen bei Vergiftungen mit hohen Zinkkonzentrationen einzusetzen.

Schlussfolgerungen

Eine hohe Konzentration (5 mM) des Zn-Kations hemmte die Myosin-S1-ATPase-Aktivität aus der Gebärmutter. Der gehemmte Einfluss von Zn hängt mit einer Abnahme der maximalen Geschwindigkeit der Hydrolyse von ATP zusammen, die durch Myosin S1 in Gegenwart von 5 mM Zn ²⁺ . katalysiert wird . Der Wert von К _m für ATP ändert sich statistisch nicht, obwohl es tendenziell abnimmt.

Tetrahydroxythiacalix[4]aren-tetrasulfosphonat (C-798) und Tetrahydroxythiacalix[4]aren-tetraphosphonat (C-800) stellten die Myosin-S1-ATPase-Aktivität in Gegenwart von 5 mM Zn ²⁺ . auf das Kontrollniveau zurück .

Zn-Kationen haben mehrere Bindungsregionen in Myosin S1, die sich in der Nähe des aktiven Zentrums der ATPase befinden. Das Andocken von C-798 und C-800 in die Myosin-S1-Region, die Zn ²⁺ . enthält gebunden, weist auf die Möglichkeit der Wechselwirkung dieser funktionellen Thiacalix[4]arengruppen mit gebundenen Zn-Kationen hin. Die Zn-Kationenbindung mit den Aminosäureresten des Myosin S1 wurde deutlich geschwächt und der Abstand zwischen ihnen vergrößert. Als Ergebnis kann die nachteilige Wirkung des Zn-Kations auf die ATPase-Aktivität von Myosin eliminiert werden.

Es wird davon ausgegangen, dass die erhaltenen Ergebnisse für weitere Forschungen mit dem Ziel verwendet werden könnten, diese Thiacalix[4]arene als pharmakologische Verbindungen bei Vergiftungen mit hohen Zinkkonzentrationen einzusetzen.

Methoden

Reagenzien

Folgende Reagenzien wurden verwendet:Serumalbumin, EGTA, EDTA, ATP, Ascorbinsäure, Tris, Tricin, Dithiothreitol, Acrylamid, (Sigma, USA), Glycin (Merck, Deutschland), N,N′-Methylenbisacrylamid (Acros Organics, Belgien ) N,N,N′,N′-Tetramethylendiamin (Reanal, Ungarn) und Reagenzien aus inländischer Produktion (R-Klasse). Die Lösungen wurden in Wasser hergestellt, das auf einem Crystal-Bio-System (Adrona, Lettland) gereinigt wurde. Die Wasserleitfähigkeit betrug weniger als 0,1 μS. Die Konzentration der zweiwertigen Metallkationen in Lösung wurde nach der Mohr-Methode bestimmt.

Aktomyosin- und Myosin-Subfragment-1-Isolierung

Actomyosin wurde aus der glatten Muskulatur des Uterus von Schweinen nach der modifizierten Barany-Methode, wie in [17] beschrieben, isoliert. Myosin S1 wurde nach der modifizierten Suzuki-Methode aus Schweine-Actomyosin gewonnen [24]. The purity of the samples was controlled by PAAG-SDS electrophoresis [25].

ATPase Activity Assay

ATPase activity of myosin S1 was determined in a 96-well plate at 37 °C in an incubation medium (total volume 0.1 ml) of the following composition (mM):Tris-HCl buffer (pH 7.2), 20; KCl, 100; CaCl₂ , 0.01; MgCl₂ , 5; and ATP, 3 (standard conditions). Protein (myosin S1) concentration was 20 μg/ml. Incubation time was 5 min. Samples containing all components of the incubation medium without myosin S1 were taken as control of non-enzyme hydrolysis of ATP. The amount of inorganic phosphate released during ATP hydrolysis reaction was determined by the Chen method [26] by the measurement of optical absorbance of the solution at 820 nm using a microplate reader μQuwant (Biotek ^@ Instruments, Inc., USA) and specified as P_i  nmol/min per 1 mg of protein.

The Zn ²⁺ and thiacalix[4]arene effects on the ATPase activity of myosin S1 were studied using standard incubation medium with solutions of ZnCl₂ and thiacalix[4]arenes at the corresponding concentrations. The value of ATPase activity in the absence of ZnCl₂ and/or calix[4]arenes in the incubation medium was taken as 100% (control).

Kinetic and Statistical Analysis

The values of the imaginary constant of Michaelis (K _m ) and maximal rate of myosin S1 ATPase for ATP (V _{max, ATP} ) were calculated using the graph of the dependence of ATPase activity on the ATP concentration according to Lineweaver–Burk method [27]. Statistical processing of the obtained data was performed using standard methods of variation statistics. Experimental data were analyzed by using the standard software “MS Office” and “Statistica 4.5.” The statistical comparisons were performed using two-way analysis of variances (ANOVA).

Thiacalix[4]Arene Synthesis and Characterization

Tetrahydroxy-thiacalix[4]arene-tetrasulphonate and tetrahydroxy-thiacalix[4]arene-tetraphosphonate were synthesized and characterized using NMR techniques and IR spectroscopy in the Phosphoranes Chemistry Department of the Institute of Organic Chemistry, NAS of Ukraine. Infrared and NMR spectroscopy confirmed the structure of these synthesized thiacalix[4]arenes. This thiacalix[4]arenes were dissolved in water.

Computer Modeling

Computer modeling of the interaction between ligands (thiacalix[4]arenes, Zn ²⁺ , model bindings) and receptor (myosin S1) was performed using AutoDock software, version 4.2 [28]. We used the three-dimensional enzyme structure with the 1b7t identifier in RSCB PDB in our research [29]. Computer modeling of the thiacalix[4]arene structural peculiarities was carried out using HyperChem 7.01. Molecular dynamics calculations were performed by the MM2 method with the semi-empirical methods (CNDO).

Program AutoDockTools was used for preliminary “processing” of interacting molecules. One hundred runs of Lamarkian genetic algorithms (population size, 100; the maximal number of energy evaluations, 10 ⁶ ) were conducted. To analyze and visualize the docking results, we used the programs Chimera [30] and Yassara [31]. Calculation of the minimal total binding energy was implemented considering Van der Waals forces, electrostatic and hydrophobic interactions, and hydrogen bonds. The optimal ligand positions in the complex “receptor-ligand” were determined according to the energy values obtained by docking software calculator for binding energy in complex “receptor-ligand.” Thus, we selected a series of complexes with the lowest total energy and then calculated the optimal geometry of the complexes and determined the most energetically preferred arrangement of the ligands in the space of myosin subfragment-1 binding domain.

Abkürzungen

C-798:

Tetrahydroxythiacalix[4]arene-tetrasulfosphonate

C-800:

Tetrahydroxythiacalix[4]arene-tetraphosphonate

CNDO:

Complete Neglect of Differential Overlap (methods)

K _m :

Michaelis constant, the substrate concentration at which the reaction rate of the enzyme is half of the maximal velocity

L50:

Lower 50-kDa domain of myosin

LD₅₀ :

Lethal dose is the amount of an ingested substance that kills 50% of a test sample

MM2:

A class of force fields

Myosin S1:

Myosin subfragment-1

NASU:

National Academy of Science of Ukraine

PDB:

Protein Data Bank

P-loop:

Phosphate-binding loop of myosin

RCSB:

Research Collaboratory for Structural Bioinformatics

U50:

The upper 50-kDa domain of myosin

V _max :

Maximal velocity of the enzyme

V _{max, ATP} :

V _max for ATP