Apoptose-Wege treiben Zytotoxizität von frischen vs. gealterten Zinkoxid-Nanopartikeln

Zusammenfassung

Zinkoxid-Nanopartikel (ZnO NPs) werden in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt, einschließlich Industrie, kommerziellen Produkten und Medizin. Zahlreiche mechanistische Studien zur Toxizität von ZnO NPs wurden an reinen (frischen) NPs durchgeführt. Die Zytotoxizität, die durch transformierte (gealterte) ZnO NPs induziert wird, und die zugrundeliegenden Mechanismen bleiben jedoch unklar. Hier beobachteten wir die physikochemische Transformation von ZnO NPs über die Zeit, gefolgt von der Bewertung der Zytotoxizität von frischen und gealterten NPs. Wir fanden, dass frische ZnO NPs höhere Apoptose-Niveaus induzierten als ihre gealterten Gegenstücke. Entsprechend zeigten RNA-Sequenzierungsdaten von gealterten ZnO NP-behandelten menschlich-hamster Hybrid (A_L) Zellen, dass p53, PI3k-Akt, FoXO, Glutathion, ErbB, HIF-1, Oxytocin und Jak-STAT Signalwege angereichert waren, aber kein Apoptoseweg. Quantitative PCR-Ergebnisse zeigten signifikant höhere mRNA-Level von IL1B und CD69 in frischen NP-behandelten Gruppen im Vergleich zu gealterten ZnO NP- und Zinkchlorid-behandelten Gruppen. Die oben genannten Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die geringere Zytotoxizität gealterter ZnO NPs teilweise auf ihre reduzierte Potenz zur Induktion von Apoptose zurückzuführen ist. Die transkriptionelle Regulation mehrerer Signalwege, die durch gealterte NPs aktiviert werden, kann helfen, die zelluläre Homöostase aufzubauen. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse den Einfluss des Alterungsprozesses (Umwelttransformation) von ZnO NPs auf ihre Toxizitäten und biologischen Konsequenzen.

Einleitung

Mit der rasanten Entwicklung der Nanotechnologie in den letzten Jahrzehnten wurden Nanopartikel (NPs) in verschiedenen Bereichen angewendet, einschließlich Industrie, menschlichem Alltag und Nanomedizin [1, 2]. Das Nanotechnology Consumer Product Inventory (CPI) zeigt einen 30-fachen Anstieg zwischen 2005 und 2015 in der Anzahl von Nanoprodukten, einschließlich 762 Gesundheits-(Fitness-)Produkte, 72 Lebensmittel-(Getränke-) und 23 Babyprodukte [2]. Die wachsende Anwendung von NPs in Verbraucherprodukten und verschiedenen Bereichen erhöhte die Möglichkeit, dass NPs in die Umwelt gelangen, was Sicherheitsbedenken hinsichtlich ihrer potenziellen negativen Auswirkungen aufwirft. Zinkoxid (ZnO) NPs gehören zu den am häufigsten verwendeten NPs, und die globale Jahresproduktion hat fast 3400 Tonnen erreicht [3, 4]. Einige Substanzen, die zuvor als biologisch inert galten, könnten in ihrem nanopartikulären Zustand toxisch werden. Eine zunehmende Zahl von Studien zeigte, dass ZnO NPs signifikante Risiken für Säugetierzellen und Tiere darstellen können, indem sie signifikante Toxizität induzieren [5-7].

Verschiedene Strategien einschließlich Beschichtung, Oberflächenfunktionalisierung und Oxidationszustandsmodifikation wurden verwendet, um die potenzielle Toxizität von NPs durch Modifikation ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften (wie Auflösung, Agglomeration und Störung von Zellmembranen) zu verringern [8-11]. Obwohl diese Modifikationen von NPs ihre toxischen Effekte in gewissem Maße abschwächen, ist die Verwendung von NPs nicht immer sicher, besonders unter bestimmten Expositionsbedingungen und Umgebungen [12-14]. Tatsächlich sind viele Arten von NPs nicht stabil und neigen dazu, nach absichtlicher oder unabsichtlicher Freisetzung in die natürliche Umwelt "zu altern" oder "sich umweltbedingt zu transformieren" [14-17]. In den letzten Jahren wurden viele Arbeiten durchgeführt, um den Umwelttransformationsprozess von NPs zu erforschen; die Forschung zu den toxischen Effekten "transformierter (gealterter)" NPs ist jedoch immer noch sehr begrenzt, ganz zu schweigen von ihren toxischen Mechanismen.

Als typischer Vertreter nicht-persistenter NPs haben ZnO NPs eine sehr hohe Reaktivität und neigen dazu, nach Freisetzung in die Umwelt oder Aufnahme durch Tiere physikalisch-chemische Eigenschaften und Auftretenszustände zu transformieren, was ihre toxikologischen Effekte signifikant beeinflussen könnte [17, 18]. Zum Beispiel zeigten Studien, dass der Sulfidierungsprozess von ZnO NPs Ladung, Hydrophobie und Aggregationszustand veränderte, was zur Adsorption von sulfidischen NPs in menschlichem Speichel, Schweiß und bronchoalveolärem Lavageflüssigkeit führte. Darüber hinaus bildet das von ZnO NPs adsorbierte Protein eine spezielle Proteinkrone, die üblicherweise ihre biologische Wirkung beeinflusst [19]. Phosphate in physiologischen Lösungen könnten ZnO NPs innerhalb von etwa 5–10 h in metastabiles ZnHPO₄ und Zn₃(PO₄)₂ umwandeln [20]. Der Prozess der vollständigen Transformation von ZnO NPs (≤ 3 μg/mL) im in vitro Expositionsystem zu menschlichen T-Lymphozyten (37 °C, Zellkulturmedium RPMI1640 mit 10 % FBS für 24 h) wurde mittels Synchrotronstrahlung Röntgenabsorptions-Nahkantenstruktur-Spektroskopie (XANES) untersucht [21]. Die oben genannten Studien deuten auf eine Unterschätzung der umwelt- und gesundheitlichen Risiken von ZnO NPs hin, wenn ausschließlich die biologischen Effekte von reinen (frischen) ZnO NPs bewertet werden. Angesichts dieses Problems besteht ein dringender Bedarf, die Alterungs- und Umwelttransformationsprozesse von NPs umfassend zu verstehen [22].

Unsere frühere Studie zeigte, dass ZnO NPs, die 40–120 Tage in ultrareinem Wasser gealtert sind, physikochemische Transformation durchlaufen und in Zn₅(CO₃)₂(OH)₆, Zn(OH)₂ und Zn²⁺ übergehen [23]. Interessanterweise zeigten gealterte ZnO NPs geringere Zytotoxizität als ihre frischen Gegenstücke [23], doch die Toxizitätsmechanismen einer solchen Variation sind unklar. In der vorliegenden Studie setzten wir uns zum Ziel, die zugrundeliegenden Gründe für die unterschiedlichen Zytotoxizitäten zwischen frischen und gealterten ZnO NPs zu erforschen. ZnO NPs mit zwei unterschiedlichen Partikelgrößen (20 nm und 90–200 nm) wurden systematisch angewendet. Die Zytotoxizitätsassays zeigten, dass gealterte ZnO NPs weniger ausgeprägte morphologische Anomalien und relativ höhere Zelllebensfähigkeiten induzierten als ihre frischen Gegenstücke. RNA-Sequenzierungsdaten zeigten, dass apoptotische Gene in frischen ZnO NP-behandelten Zellen angereichert waren, während diese Gene durch gealterte ZnO NP-Behandlungen viel weniger beeinflusst wurden. Zusätzlich zeigten Zellen, die gealterten ZnO NPs ausgesetzt waren, reduzierte Level von gespaltenem Caspase-3-Protein, was weiterhin die höhere Potenz frischer ZnO NPs zur Auslösung von Apoptose in kultivierten Zellen anzeigt. In Kombination mit unseren früheren Ergebnissen deutete diese Studie darauf hin, dass die verringerte Zytotoxizität gealterter ZnO NPs auf ihre abgeschwächte Fähigkeit zur Auslösung von Zellapoptose zurückzuführen ist.

Materialien und Methoden

Nanopartikel und Reagenzien

Kommerziell erhältliche ZnO-Nanopulver (ZnO NPs) mit herstellerseitig angegebenem durchschnittlichem Durchmesser 20 nm (99,5 % Reinheit, nahezu kugelförmig) und 90–200 nm (99,9 % Reinheit, unregelmäßige Morphologie) wurden von Nanostructured & Amorphous Materials (Houston, TX) gekauft. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Reagenzien und Chemikalien in dieser Studie von Sigma-Aldrich (Shanghai, China) erworben.

Nanopartikel-Dispersion, Alterung und Charakterisierung

ZnO NP-Stocksuspensionen (1 mg/mL) wurden durch Dispergieren von trockenen Nanopulvern in Milli-Q H₂O (Millipore, 18 MΩ cm) hergestellt und durch Autoklavieren (120 °C, 30 min) sterilisiert und dann bei 25 °C für natürliche Alterungszeiträume von 0 bis 60 Tagen gelagert. Die 0- und 60-tägigen natürlich transformierten ZnO NPs wurden als frische und gealterte NPs bezeichnet. Um eine ordnungsgemäße Dispersion zu gewährleisten, wurden die frischen und gealterten Suspensionen vor Charakterisierung oder Inkubation mit Zellen 30 min in einem Ultraschallbad (100 W) soniziert. Morphologie, Partikelgröße und Aggregation von frischen und gealterten ZnO NPs wurden mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, JEOL JEM-2010, Tokyo, Japan) charakterisiert. Die Kristallstruktur von frischen und gealterten ZnO NPs wurde mittels Pulver-Röntgenbeugung (XRD, PANalytical B.V., Shanghai, China) durch Vergleich mit authentischen Standards bestimmt. Die Details des natürlichen Alterungsprozesses und der Charakterisierung von ZnO NPs wurden zuvor beschrieben [23].

Zellkultur und Behandlung mit ZnO NPs

A_L Zelllinie, eine Art menschlich-hamster Hybridzellen, die durch Fusion des gly2A Mutanten von Chinesischem Hamster-Ovar (CHO) und menschlichen Fibroblasten gebildet wurden, wurde in dieser Studie verwendet. Diese Hybridzellen enthielten einen Standardsatz CHO-K1-Chromosomen und eine einzelne Kopie des menschlichen Chromosoms 11 und wurden in Ham's F12-Medium (Hyclone, Grand Island, NY) mit fötalem Kälberserum (8 %, Hyclone, Grand Island, NY), Gentamicin (25 g/mL) und Glycin (2 × 10⁻⁴ M) bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO₂ Inkubator kultiviert [24]. Die Stocksuspensionen von frischen und gealterten ZnO NPs wurden durch 30 min Ultraschall (100 W) dispergiert, um Agglomeration zu verhindern, anschließend mit Zellkulturmedium auf geeignete Konzentrationen verdünnt für die Zellexposition. Zellen, die in Zellkulturmedium ohne NPs gehalten wurden, dienten als Kontrolle in jedem Experiment.

Assay zum Nachweis der Zytotoxizität

A_L Zellen in logarithmischer Wachstumsphase wurden auf Glasscheiben in 35-mm-Petrischalen (6 × 10⁴ Zellen/Schale) 24 h vor Stimulation kultiviert, gefolgt von Behandlung mit 2 mL Kultivierungsmedium containing 1, 5, 10, 12, 15 und 20 µg/mL frische oder gealterte ZnO NPs für 72 h. Nach Abschluss der Behandlungszeit wurden Bilder der Zellmorphologie mit einem Leica DM4B Mikroskop (Leica, Deutschland) aufgenommen. ZnCl₂ wurde als Zinkionen-Referenz für den Vergleich der Zytotoxizität mit ZnO NPs eingeschlossen.

Das Zellzählkit (CCK-8) (APExBIO, Shanghai, China) wurde zum Nachweis der Zelllebensfähigkeit verwendet. Im Detail wurden A_L Zellen in 96-Well-Platten (4 × 10³ Zellen/Well) mit Zellkulturmedium für 24 h ausgesät und mit Medium behandelt, das verschiedene Konzentrationen von ZnCl₂, frischen und gealterten ZnO NPs für 24, 48 und 72 h enthielt. Für die Arbeitslösung betrug das Volumen der zugesetzten NPs aus der Stocksuspension weniger als 5 % des Gesamtvolumens des Kultivierungsmediums in jedem Well. Nach Abschluss der Behandlungszeit wurde das Kultivierungsmedium aspiriert, und die Zellen wurden 2 h bei 37 °C gemäß den Anweisungen des Herstellers mit 100 µL CCK-8-Arbeitslösung inkubiert. Dann wurde die Absorption bei 450 nm mit einem Spectra Max M2 Fluoreszenzreader (Molecular Devices, Wokingham, Berks, UK) aufgezeichnet. Die Zelllebensfähigkeit wurde als Prozentsatz der Absorption in Wells berechnet, wobei jede NP-Konzentration auf die Absorption der Kontrollzellen (100 %) normiert wurde.

RNA-Extraktion, Reverse Transkription und Quantitative PCR

A_L Zellen in logarithmischer Wachstumsphase wurden in 35-mm-Petrischalen (6 × 10⁴ Zellen/Schale) mit Zellkulturmedium für 24 h ausgesät. Dann wurde das Medium durch 2 mL Kultivierungsmedium ersetzt, das 12 µg/mL ZnCl₂, frische und gealterte ZnO NPs für 72 h enthielt. Nach Abschluss der Behandlungszeit wurde das Kultivierungsmedium aspiriert, und die Zellen wurden 3-mal mit PBS gewaschen. Anschließend wurde 1 mL Trizol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) zu jeder Schale gegeben, um GesamtrNA gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren. Konzentration und Reinheit des nach Extraktion erhaltenen GesamtrNA wurden mit einem Q5000 UV-Vis Spektrophotometer (Quawell, USA) quantifiziert. Nach Quantifizierung wurde Reverse Transkription mit TransGene RT-PCR Kit (TransGene Biotech, Beijing, China) durchgeführt, um cDNA aus der RNA-Vorlage gemäß den Protokollen des Herstellers zu erhalten. Die resultierenden cDNA-Proben wurden mit dem Q5000 UV-Vis Spektrophotometer quantifiziert und dann mit SYBR-Green als Fluoreszenzfarbstoff (TransGene Biotech, Beijing, China) auf Roche RT-PCR System (Applied Biosystems) analysiert [25].

Das Housekeeping-Gen für Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Gapdh) wurde als interne Kontrolle für die Bewertung von Il-1α, Il-1β, Caspase 3, CD69, Jun und MT1 mRNA-Expression verwendet. Die Ergebnisse wurden als relatives Expressionsverhältnis zwischen dem Zielgen und Gapdh ausgedrückt. Die in dieser Studie verwendeten Primersequenzen sind in Tabelle 1 angegeben.

RNA-Sequenzierungsdatenanalyse

GesamtrNA-Proben von A_L Zellen aus Kontrollgruppe, gealterte ZnO NP-behandelte Gruppe und ZnCl₂ behandelte Gruppe wurden von BangFei Bioscience (Beijing, China) sequenziert. Kurz gesagt, das GesamtrNA von A_L Zellen wurde nach TRIZOL-Protokollen extrahiert, bis zur Isopropanol-Fällung. Dann wurden die RNA-Proben in Extraktionspuffer resuspendiert vor Sequenzierung. Die rohen RNA-Sequenzierungsdaten wurden mit R-Paket Deseq2 [Eric1] analysiert. Das Venn-Diagramm wurde mit R-Paket VennDiagram [Eric1.2] erstellt. Die signifikant veränderten Gene wurden für weitere Pfad-Anreicherungsanalyse verwendet. Experimente wurden in drei unabhängigen Replikaten durchgeführt. rRNA-Gene, mitochondriale Gene und Gene mit weniger als 40 bp Detektion wurden von der Analyse ausgeschlossen.

Die RNA-Sequenzierungsdaten, Referenzserien GSE97852, GSE60159 und GSE39444, wurden von Gene Expression Omnibus [Eric 2, 3, 4] bezogen. Der Gene Set Enrichment Analysis Plot wurde mit R (Version 3.6.2) mit Paket fgsea [Eric 5] erstellt. Apoptosegene mit 1,5-facher signifikanter Änderung & p-Wert < 0,05 wurden für weitere Analyse verwendet. Die Heatmap mit Genbaum wurde mit R-Paket "ComplexHeatmap" [Eric 6] erstellt. Durchschnittliche Verknüpfung wurde als Clustermethode verwendet, und euklidische Distanz als Distanzmaß. Die Pfad-Anreicherungsanalyse wurde mit STRING2.0 [Eric 7] durchgeführt.

Western Blotting

A_L Zellen in logarithmischer Wachstumsphase wurden in 60-mm-Petrischalen (1,5 × 10⁵ Zellen/Schale) mit Zellkulturmedium für 24 h ausgesät. Dann wurde das Medium durch 4 mL Kultivierungsmedium ersetzt, das 12 µg/mL frische oder gealterte ZnO NPs für 24 h enthielt. Am Ende der Expositionsperiode wurde das Kultivierungsmedium aspiriert, und die Zellen wurden 3-mal mit PBS gewaschen und auf Eis mit RIPA-Lysepuffer (Beyotime, China) lyisiert, um zelluläre Proteine zu sammeln. Gleiche Mengen zellulärer Proteine wurden auf 12 % SDS-PAGE-Gelen getrennt und dann auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran (Roche, Schweiz) transferiert. Kurz gesagt, nach 2 h Blockierung mit 5 % fettfreier Milch in TBST bei 25 °C wurden die Membranen anschließend mit Primärantikörper bei geeigneten Verdünnungen (gemäß Protokollen des Herstellers) über Nacht bei 4 °C inkubiert, gefolgt von Inkubation mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern (1:5000, Promega, Madison, USA) für 2 h bei 25 °C. Schließlich wurde die Immunmarkierung mit einer Enhanced Chemiluminescence (ECL) (BOSTER, China) Lösung detektiert. Die Primärantikörper gegen pro/gespaltenes Caspase-3 und Anti-Actin wurden von Cell Signaling Technology und ImmunoWay gekauft.

Statistik

Statistische Analyse wurde auf den Mittelwerten der Ergebnisse aus mindestens drei unabhängigen Experimenten durchgeführt. Alle Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) dargestellt und mit einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) statistisch verglichen. In allen Plots wurden p-Werte < 0,05 als * dargestellt und als statistisch signifikant betrachtet.

Ergebnisse

Charakterisierung von ZnO NPs

Um die Unterschiede in detaillierten physikochemischen Eigenschaften zwischen frischen und gealterten ZnO NPs zu bestimmen, beobachteten wir zuerst die Morphologie der NPs mit TEM (Abb. 1A). Unsere Ergebnisse zeigten, dass 20 nm frische ZnO NPs nahezu kugelförmige Kristalle waren und 90–200 nm frische ZnO NPs unregelmäßig stab-/würfelförmige Kristalle waren. Die Einzelpartikelgröße war konsistent mit der vom Hersteller angegebenen Größe. Offensichtlich neigten sowohl 20 nm als auch 90–200 nm ZnO NPs zur Aggregation in ultrareinem Wasser. Auch unabhängig von Form und Größe der ursprünglichen NPs wurde die Mikrostruktur sowohl von 20 nm als auch 90–200 nm ZnO NPs nach 60 Tagen Alterung dramatisch von einer klaren Kristallstruktur in einen amorphen oder blatt-/nadelartigen Zustand verändert. Darüber hinaus wurden die kristalline Natur und Phasenreinheit sowohl von frischen als auch gealterten NPs durch Röntgenbeugung (XRD) mit Cu Kα-Strahlung (λ = 0,15418 nm) bei 25 °C bestimmt, wie in Abb. 1B gezeigt. Das XRD-Muster frischer ZnO NPs zeigte, dass die Proben aus kristalliner Wurtzit-Struktur bestanden und keine charakteristischen Verunreinigungspeaks identifiziert wurden, was auf hohe Qualität frischer NPs hindeutete. Für gealterte NPs zeigte das XRD-Muster die Neoformation von Zn₅(CO₃)₂(OH)₆ (Kartennummer 00-011-0287) und Zn(OH)₂ (Kartennummer 00-003-0888) Festphasen, was die chemische Transformation von ZnO NPs (20 und 90–200 nm) während des Alterungsprozesses anzeigte.

Morphologische Beobachtung von A_L Zellen Exponiert Gegenüber Frischen und Gealterten ZnO NPs

NP-Behandlung führt zu einer bemerkbaren Veränderung der zellulären Form oder Morphologie in vitro [26]. Daher wurden A_L Zellen, die frischen oder gealterten ZnO NPs bei 10 & 15 µg/mL für 72 h ausgesetzt waren, unter einem Stereomikroskop untersucht. Wie in Abb. 2 gezeigt, blieb die Zellmorphologie in der Kontrollgruppe normal. Die Zellen hafteten gut, wobei die meisten innerhalb von 2 h anhafteten. Die meisten Zellen waren spindelförmig oder polygonal, mit wenigen neu teilenden Zellen, die ein transparenteres Zytoplasma und bessere Dispersion während des Anhaftungsprozesses zeigten. Behandlung mit 12 μg/mL frischen ZnO NPs (20 nm & 90–200 nm) für 72 h veränderte die Zellmorphologie signifikant. Obwohl die meisten Zellen innerhalb von 3–5 h anhafteten, konnten sie sich nicht gut ausbreiten, und einige Zellen wurden rund und verloren die polygonale Form. Als die Konzentration von ZnO NPs auf 15 μg/mL erhöht wurde, atrophierten die behandelten Zellen und konnten nicht anhaften, was ihre signifikant niedrigere Zelllebensfähigkeit als die der mit 10 μg/mL behandelten Zellen nahelegt. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass der LC100 für frische ZnO NPs wahrscheinlich unter 15 μg/mL bei 72-h-Behandlung liegt. Im Gegensatz dazu wurde die Zellmorphologie in 20 nm und 90–200 nm gealterten NP-behandelten Gruppen (15 μg/mL) nicht signifikant beeinflusst, und die meisten überlebenden Zellen konnten anhaften und sich ausbreiten, mit weniger als der Hälfte toter Zellen, was enthüllte, dass gealterte ZnO NPs viel geringere Zytotoxizität als frische ZnO NPs haben.

Gealterte ZnO NPs Induzierten Geringere Zytotoxizität als Frische NPs

Um den Unterschied in der Zytotoxizität zwischen frischen und gealterten ZnO NPs weiter zu untersuchen, untersuchten wir die Zelllebensfähigkeit mit CCK-8-Kits. Wie in Abb. 3 gezeigt, zeigten A_L Zellen, die mit Gradienten-Dosen von frischen und gealterten ZnO NPs (0 bis 20 μg/mL, 20 nm und 90–200 nm) für 24 h, 48 h oder 72 h inkubiert wurden, eine dosisabhängige Abnahme der Zelllebensfähigkeit. Keine offensichtliche Zytotoxizität wurde bei Behandlung der Zellen mit ZnO NPs ≤ 10 μg/mL beobachtet. Wenn die Dosis frischer und gealterter ZnO NPs auf 12 und 15 μg/mL erhöht wurde, zeigte die Zelllebensfähigkeit eine zeitabhängige Abnahmetendenz. Offensichtlich war die Zelllebensfähigkeit in gealterten NP-behandelten Gruppen signifikant höher als in frischen NP-behandelten Gruppen. Zusätzlich beeinträchtigte ZnCl₂-Behandlung die Zelllebensfähigkeit in dosis- und zeitabhängiger Weise, wobei die Zytotoxizität von ZnCl₂ viel geringer war als die sowohl von frischen als auch gealterten ZnO NPs.

Frische ZnO NPs Behandlung Aktivierte Apoptose-Wege und Regulierte Apoptotische Gene Hoch

Um die zugrundeliegenden Mechanismen für die geringere Zytotoxizität gealterter NPs aufzudecken, analysierten wir RNA-Sequenzierungsdaten sowohl von frischen als auch gealterten ZnO NPs. Wie in Abb. 4A, B gezeigt, wurde nach Behandlung mit frischen ZnO NPs der Apoptoseweg in Jurkat-Zellen (p = 0,017) und HMDM-Zellen (p = 0,041) aktiviert. Die Apoptosegene: ANXA1, CYLD, TNFSF10, IER3, CDKN1A, JUN, SAT1, PMAIP1, CD38 und ISG20 waren in frischen ZnO NP-behandelten Jurkat-Zellen signifikant angereichert. Die Apoptosegene: CD38, TNFRSF12A, CCNA1, BMP2, PPP2R5B, EREG, IFNGR1, CD44, CD14, GNA15, GCH1, TIMP1, BTG2, IL1B, IL1A, BTG3, BCL2L11, SC5D und SPTAN1 waren in frischen ZnO NP-behandelten HMDM-Zellen signifikant angereichert (Abb. 4C, D). Da Jurkat-Zellen (periphere Blut-T-Lymphozyten) und HMDM-Zellen (humanes monozyten-abgeleitetes Makrophagen) unterschiedliche Zelltypen sind, könnte die Art, wie sie Apoptose auslösen, unterschiedlich sein. Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass die Exposition gegenüber frischen ZnO NPs verschiedene Apoptosewege in verschiedenen Zelltypen aktivieren konnte.

Gealterte ZnO NPs Regulierten Apoptotische Gene Nicht Wie Frische ZnO NPs Hoch

Unsere RNA-Sequenzierungsdaten von gealterten ZnO NP-behandelten A_L Zellen zeigten, dass p53, PI3k-Akt, FoXO, Glutathion, ErbB, HIF-1, Oxytocin und Jak-STAT Signalwege angereichert waren (Abb. 5A). Die in Jurkat- und HMDM-Zellen angereicherten Apoptosegene wurden in gealterten ZnO NP-behandelten Zellen nicht signifikant beeinflusst (Abb. 5B). Um die Ergebnisse zu bestätigen, testeten wir die Expression verwandter Gene durch Echtzeit-PCR. Wir fanden, dass einige Apoptosegene: BMP2, PMAIP1, IL1α, CD69, CCNA1, CD38 und IL1β in gealterten ZnO NP-behandelten A_L Zellen nicht nachweisbar waren (Daten nicht gezeigt), wahrscheinlich weil die meisten dieser Gene in Immunsystemzellen exprimiert werden. Die anderen hochregulierten Apoptosegene (IL1α, IL1β und CD59), die in frischen ZnO NP-behandelten Gruppen beobachtet wurden, wurden in ihren Expressionsleveln durch gealterte ZnO NPs Behandlung nicht signifikant verändert. Während MT1, das als positiver Kontrolle dient, signifikant in der Expressionslevel erhöht war, wurde die Expression von Caspase 3 nicht signifikant verändert (Abb. 5C). Diese Daten legten nahe, dass gealterte ZnO NPs, im Gegensatz zu ihren frischen Gegenstücken, weniger potent in der Aktivierung von Apoptoseweg-Genen in A_L Zellen sind.

Frische Aber Nicht Gealterte ZnO NPs Erhöhten Den Expressionslevel Des Aktivierten Caspase 3 Proteins

Der Nachweis der Genexpression von Caspase 3 allein kann nicht direkt die Aktivierung des Apoptosewegs anzeigen. Um weiter zu analysieren, ob ZnO NPs Behandlung apoptotische Proteinebenen verändern könnte, wurde die Expression von gespaltenem Caspase 3 Protein, einem häufig verwendeten Biomarker zur Anzeige der Aktivierung von Zellapoptose [27], durch Western-Blot-Analyse untersucht. Wie in Abb. 6 gezeigt, erhöhte die Behandlung mit frischen ZnO NPs (20 nm) im Vergleich zur Kontrollgruppe den zellulären Level von gespaltenem Caspase 3 Protein um 1,31 ± 0,023-fach, was signifikant höher war als die von gealterten 20 nm ZnO NPs-behandelten Gruppe (1,12 ± 0,039-fach). Als die Partikelgröße frischer ZnO NPs auf 90–200 nm erhöht wurde, wurde die Expression von gespaltenem Caspase 3 Protein durch frische NPs um 1,46 ± 0,078-fach erhöht, signifikant größer als die von gealterten NPs (1,07 ± 0,075-fach). Diese Daten illustrierten weiter die höhere Potenz frischer ZnO NPs zur Induktion von Zellapoptose im Vergleich zu ihren gealterten Gegenstücken.

Diskussion

ZnO NPs wurden berichtet, sich während des natürlichen Alterungsprozesses in Zn₅(CO₃)₂(OH)₆ mit Freisetzung von Zn²⁺ physikochemisch zu transformieren [23, 28]. Die Zytotoxizität, die durch transformierte (gealterte) ZnO NPs induziert wird, und die zugrundeliegenden Mechanismen bleiben jedoch unklar. Hier, um den Mechanismus der unterschiedlichen Zytotoxizität zwischen frischen und gealterten ZnO NPs aufzudecken, wurden RNA-Sequenzierungsanalyse und RT-PCR-Test durchgeführt. Auch wurde Western Blotting angewendet, um den Proteinspiegel von Caspase 3, dem Schlüsselexekutor in der Zellapoptose, zu untersuchen.

Unsere Daten zeigten, dass gealterte ZnO NPs viel weniger Zytotoxizität als frische ZnO NPs in A_L Zellen induzierten. Der LC₁₀₀ sowohl frischer ZnO NPs (90–200 nm und 20 nm) in unserer vorliegenden Studie war niedriger als 15 μg/mL (Abb. 3), was mit früheren Ergebnissen konsistent war, dass der LC₁₀₀ von ZnO NPs mit 19–36 nm für NIH-3T3 oder MSTO Zellen etwa 15 μg/mL beträgt [29]. Wir bestätigten, dass Umwelttransformationen physikochemischer Eigenschaften in NPs ihre Toxizität dramatisch verändern können. Es wurde berichtet, dass der Sulfidierungsprozess von ZnO NPs ihre Ladung, Hydrophobie und Aggregationszustand verändert, was zur Adsorption von sulfidischen NPs in menschlichem Speichel, Schweiß und bronchoalveolärem Lavageflüssigkeit führt. Und das von ZnO NPs adsorbierte Protein bildet eine spezielle Proteinkrone, die seine biologische Wirkung beeinflusst [19]. Phosphate, die in physiologischen Lösungen (wie Speichel) weit verbreitet sind, könnten ZnO NPs innerhalb von etwa 5–10 h in metastabiles ZnHPO₄ und Zn₃(PO₄)₂ umwandeln und zeigten Zytotoxizität für Verdauungstrakt-Epithelzellen [20]. Ivask et al. bewiesen das Auftreten vollständiger Transformation von ZnO NPs (≤ 3 μg/mL) im in vitro Expositionsystem zu menschlichen T-Lymphozyten (37 °C, Zellkulturmedium RPMI1640 mit 10 % FBS für 24 h) mittels Synchrotronstrahlung Röntgenabsorptions-Nahkantenstruktur-Spektroskopie (XANES). Das Spektrum und die Zytotoxizität der Transformationsprodukte waren konsistent mit denen von ZnSO₄ [21]. Unsere Ergebnisse zeigten die dosis- und zeitabhängige Toxizität von ZnCl₂ für A_L Zellen, wobei seine Zytotoxizität viel niedriger war als die sowohl von frischen als auch gealterten ZnO NPs (Abb. 3). Die Beobachtung erklärt weiter das Ergebnis, dass die Zytotoxizität frischer ZnO NPs nicht vollständig auf ihre freigesetzten Zn²⁺ zurückzuführen ist [30].

Unsere frühere Studie zeigte auch, dass gealterte ZnO NPs eine höhere Potenz zur Auslösung von ROS (reaktiven Sauerstoffspezies) sowie eine abgeschwächte Fähigkeit zum Töten von Zellen im Vergleich zu frischen ZnO NPs aufweisen [23]. Wir vermuten, dass die geringere Zytotoxizität, die durch gealterte ZnO NPs induziert wird, in Säugetierzellen besser verträglich sein könnte. Die vorliegende Studie der RNA-Sequenzierungsdaten illustrierte, dass apoptotische Gene in frischen ZnO NP-behandelten Zellen hochreguliert waren, wo sie in gealterten NP-behandelten Gruppen viel weniger beeinflusst wurden. IL1α und IL1β sind Mitglieder der Interleukin-1-Zytokinfamilie. Die Freisetzung von IL1α und IL1β aktiviert Caspase 8 teilweise abhängige Apoptose [31]. CD69 kodiert ein Mitglied der calciumabhängigen Lektin-Superfamilie von Typ-II-Transmembranrezeptoren. Erhöhte CD69-Expression war mit erhöhter Expression der Apoptose-Marker Annexin V und CD95 (Fas) assoziiert [32]. JUN ist eine AP-1 Transkriptionsfaktor-Untereinheit. Erhöhte JUN-Aktivität proteolytisch spaltet Alpha-Fodrin, ein Substrat des Interleukin-1beta-konvertierenden Enzyms (ICE), und die CED-3-Familie von Cystein-Proteasen, was weiter programmierten Zelltod verursacht [33]. Die erhöhte Expression dieser apoptotischen Gene zeigte, dass frische NPs Apoptose auf mehrere verschiedene Weisen auslösen. Nach der Erhöhung dieser apoptotischen Genexpressionen werden Apoptoseprozesse schließlich durch apoptotische Proteine ausgeführt (Abb. 7). Caspase 3 ist die Kernprotease für verschiedene apoptotische Szenarien; Spaltung dieses Proteins ist notwendig, um sowohl extrinsische als auch intrinsische apoptotische Wege zu aktivieren [34, 35]. Daher ist der Nachweis von gespaltenem Caspase 3 eine gängige Methode zur Identifizierung von Apoptose, die durch eine Vielzahl von apoptotischen Signalen induziert wird [36]. Unsere Western-Blot-Daten zeigten, dass für sowohl 20 nm als auch 90–200 nm ZnO NPs subletale Exposition den Level von Pro-Caspase 3 in allen Behandlungsgruppen nicht veränderte. Im Gegensatz dazu wurde gespaltenes Caspase 3 signifikant durch frische NPs-Behandlung erhöht, während gealterte NPs wenig (wenn überhaupt) Auswirkungen auf den Level von gespaltenem Caspase 3 zeigten (Abb. 6). In Kombination mit RNA-Expressionsanalyse elucidiere unsere Ergebnisse klar die höhere Potenz frischer ZnO NPs zur Induktion von Zellapoptose.

Fazit

In der vorliegenden Studie wurde die natürliche physikochemische Transformation von ZnO NPs in ultrareinem Wasser bestätigt, und Variationen in der Zytotoxizität, induziert durch frische & gealterte NPs, wurden untersucht. Wir konzentrierten uns auf RNA-Sequenzierungsdaten von unseren gealterten ZnO NP-behandelten A_L Zellen und denen von frischen NPs aus der Datenbank. Wir verglichen jene Signalwege, die spezifisch in gealterten NP-behandelten Gruppen angereichert waren, die sich von denen frischer NP- oder ZnCl₂-behandelter Gruppen unterscheiden. Unsere Daten deuteten darauf hin, dass die geringere Zytotoxizität gealterter ZnO NPs eng mit ihrer abgeschwächten Fähigkeit zur Induktion von Apoptose zusammenhängt, während die transkriptionelle Regulation der mehreren durch NPs aktivierten Wege die Etablierung zellulärer Homöostase in Säugetierzellen fördert.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Nicht anwendbar.

Abkürzungen

NPs:

Nanopulver

ZnO:

Zinkoxid

Zn₅(CO₃)₂(OH)₆:

Hydrozinkit

Zn(OH)₂:

Zinkhydroxid

ZnCl₂:

Zinkchlorid

ZnSO₄:

Zinksulfid

ZnHPO₄:

Zinkhydrogenphosphat

Zn₃(PO₄)₂:

Zinkphosphat

A_L Zellen:

Menschlich-Hamster-Hybridzellen

CHO Zellen:

Chinesische Hamster-Ovarzellen

Jurkat Zellen:

Periphere Blut-T-Lymphozyten

HMDM Zellen:

Humanes monozyten-abgeleitetes Makrophagen

NIH-3T3 Zellen:

Mäuseembryonale Zellen

MSTO Zellen:

Menschliche Lungenkrebszellen

RPMI1640:

Roswell Park Memorial Institute 1640

ICE:

Interleukin-1beta-konvertierendes Enzym

CED-3:

Caenorhabditis elegans Todesgen

IL1α:

Interleukin-1alpha

IL1β:

Interleukin-1beta

mRNA:

Messenger-Ribonukleinsäure

cDNA:

Komplementäre Desoxyribonukleinsäure

FBS:

Fötales Kälberserum

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

XRD:

Röntgenbeugung

RT-PCR:

Echtzeit-Polymerasekettenreaktion

CPI:

Nanotechnology Consumer Product Inventory

XANES:

Synchrotronstrahlung Röntgenabsorptions-Nahkantenstruktur-Spektroskopie

RIPA:

Radioimmunpräzipitationsassay

SDS-PAGE:

Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PVDF:

Polyvinylidenfluorid

ECL:

Enhanced Chemiluminescence

CCK-8:

Zellzählkit-8