Die Rolle des Apoptose-Wegs bei der durch frische und gealterte Zinkoxid-Nanopartikel induzierten Zytotoxizität

Einführung

Mit der rasanten Entwicklung der Nanotechnologie in den letzten Jahrzehnten wurden Nanopartikel (NPs) in verschiedenen Bereichen eingesetzt, darunter in der Industrie, im menschlichen Alltag und in der Nanomedizin [1, 2]. Das Nanotechnology Consumer Product Inventory (CPI) weist zwischen 2005 und 2015 einen 30-fachen Anstieg der Anzahl von Nanoprodukten aus, darunter 762 Gesundheitsprodukte (Fitnessprodukte), 72 Lebensmittel (Getränke) und 23 Babyprodukte [2]. Die zunehmende Anwendung von Nanopartikeln in Konsumgütern und in verschiedenen Bereichen erhöht die Möglichkeit, dass Nanopartikel in die Umwelt gelangen, was Sicherheitsbedenken hinsichtlich ihrer möglichen negativen Auswirkungen aufwirft. Zinkoxid (ZnO) NPs gehören zu den am häufigsten verwendeten NPs und ihre globale Jahresproduktion hat fast 3400 Tonnen erreicht [3, 4]. Einige Stoffe, die bisher als biologisch inert galten, könnten in ihrem nanopartikulären Zustand toxisch werden. Eine zunehmende Zahl von Studien zeigte, dass ZnO-NPs erhebliche Risiken für Säugetierzellen und Tiere darstellen können, indem sie eine signifikante Toxizität hervorrufen [5,6,7].

Verschiedene Strategien, einschließlich Beschichtung, Oberflächenfunktionalisierung und Oxidationszustandsmodifikation, wurden verwendet, um die potenzielle Toxizität von NPs durch Modifizierung ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften (wie Auflösung, Agglomeration und Störung von Zellmembranen) abzuschwächen [8,9,10, 11]. Obwohl diese Modifikationen von NPs ihre toxischen Wirkungen bis zu einem gewissen Grad abschwächen, ist die Verwendung von NPs nicht immer sicher, insbesondere unter bestimmten Expositionsbedingungen und Umgebungen [12,13,14]. Tatsächlich sind viele Arten von NPs nicht stabil und neigen dazu, einer „Alterung“ oder einer „Umwelttransformation“ zu unterliegen, nachdem sie absichtlich oder unabsichtlich in die natürliche Umgebung freigesetzt wurden [14,15,16,17]. In den letzten Jahren wurde viel daran gearbeitet, den Umwelttransformationsprozess von NPs zu erforschen; Allerdings ist die Erforschung der toxischen Wirkungen von „transformierten (gealterten)“ NPs noch sehr begrenzt, ganz zu schweigen von ihren toxischen Mechanismen.

Als typischer Vertreter nicht persistenter NPs weisen ZnO-NPs eine sehr hohe Reaktivität auf und neigen dazu, sich in ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften und ihrem Vorkommenszustand zu verändern, nachdem sie in die Umwelt freigesetzt oder von Tieren aufgenommen wurden, was ihre toxikologischen Wirkungen erheblich beeinflussen könnte [17 , 18]. Studien haben beispielsweise gezeigt, dass der Sulfidierungsprozess von ZnO-NPs die Ladung, Hydrophobie und den Aggregationszustand verändert, was zur Adsorption von NPs im Sulfidzustand in menschlichem Speichel, Schweiß und bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit führt. Darüber hinaus bildet das von ZnO-NPs adsorbierte Protein eine spezielle Proteinkrone, die in der Regel seine biologische Wirkung beeinflusst [19]. Phosphate in physiologischen Lösungen könnten ZnO-NPs in metastabiles ZnHPO umwandeln₄ und Zn₃ (PO₄ )₂ innerhalb von ca. 5–10 h [20]. Der Prozess der vollständigen Transformation von ZnO-NPs (≤ 3 μg/ml) im In-vitro-Expositionssystem mit humanen T-Lymphozyten (37 °C, Zellkulturmedium RPMI1640 mit 10 % FBS für 24 h) wurde mit Synchrotronstrahlung untersucht. Strahlenabsorptions-Nah-Edge-Strukturspektroskopie (XANES) [21]. Die oben genannten Studien legen nahe, dass die Umwelt- und Gesundheitsrisiken von ZnO-NPs unterschätzt werden, indem ausschließlich die biologischen Wirkungen von unberührten (frischen) ZnO-NPs bewertet werden. Angesichts dieses Problems ist es dringend erforderlich, die Alterungs- und Umwelttransformationsprozesse von NPs umfassend zu verstehen [22].

Unsere vorherige Studie ergab, dass ZnO-NPs, die 40–120 Tage in Reinstwasser gealtert wurden, physikalisch-chemische Umwandlungen durchlaufen und sich in Zn₅ . verwandeln (CO₃ )₂ (OH)₆ , Zn (OH)₂ , und Zn ²⁺ [23]. Interessanterweise zeigten gealterte ZnO-NPs eine geringere Zytotoxizität als die frischen Gegenstücke [23], jedoch sind die Toxizitätsmechanismen dieser Art von Variation unklar. In der vorliegenden Studie wollten wir die zugrunde liegenden Gründe für die unterschiedlichen Zytotoxizitäten zwischen frischen und gealterten ZnO-NPs untersuchen. ZnO-NPs mit zwei unterschiedlichen Partikelgrößen (20 nm und 90–200 nm) wurden systematisch aufgebracht. Die Zytotoxizitätstests zeigten, dass gealterte ZnO-NPs weniger ausgeprägte morphologische Anomalien und eine relativ höhere Zelllebensfähigkeit als ihre frischen Gegenstücke induzierten. RNA-Sequenzierungsdaten zeigten, dass apoptotische Gene in frischen ZnO-NP-behandelten Zellen angereichert waren, während diese Gene durch gealterte ZnO-NP-Behandlungen viel weniger beeinflusst wurden. Darüber hinaus zeigten die Zellen, die gealterten ZnO-NPs ausgesetzt waren, einen reduzierten Gehalt an gespaltenem Caspase-3-Protein, was weiter auf die höhere Wirksamkeit frischer ZnO-NPs beim Auslösen von Apoptose in kultivierten Zellen hinweist. In Kombination mit unseren früheren Ergebnissen deutet diese Studie darauf hin, dass die verringerte Zytotoxizität von gealterten ZnO-NPs auf ihre abgeschwächte Fähigkeit zur Auslösung der Zellapoptose zurückgeführt wird.

Materialien und Methoden

Nanopartikel und Reagenzien

Die kommerziell erhältlichen ZnO-Nanopulver (ZnO-NPs) mit einer vom Hersteller angegebenen durchschnittlichen Größe von 20 nm (99,5% Reinheit, fast kugelförmig) und 90–200 nm (99,9% Reinheit, unregelmäßige Morphologie) wurden von Nanostructured &Amorphous Materials (Houston, TX .) erworben ). Sofern nicht anders angegeben, wurden alle in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Chemikalien von Sigma-Aldrich (Shanghai, China) bezogen.

Nanopartikel-Dispersion, Alterung und Charakterisierung

ZnO-NPs-Stammsuspensionen (1 mg/ml) wurden hergestellt, indem trockene Nanopulver in Milli-Q . suspendiert wurden H₂ O (Millipore, 18 MΩ cm) und sterilisiert durch Autoklavieren (120 °C, 30 min) und dann bei 25 °C für eine natürliche Alterung von 0 bis 60 Tagen gelagert. Die natürlich transformierten ZnO-NPs nach 0 und 60 Tagen wurden als frische bzw. gealterte NPs bezeichnet. Um eine ordnungsgemäße Dispersion sicherzustellen, wurden die frischen und gealterten Suspensionen vor der Charakterisierung oder Inkubation mit Zellen 30 Minuten lang in einem Ultraschallbad beschallt (100 W). Die Morphologie, Partikelgröße und Aggregation frischer und gealterter ZnO-NPs wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, JEOL JEM-2010, Tokio, Japan) charakterisiert. Die Kristallstruktur frischer und gealterter ZnO-NPs wurde mittels Power-Röntgenbeugung (XRD, PANalytical B. V., Shanghai, China) durch Vergleich mit authentischen Standards bestimmt. Die Details des natürlichen Alterungsprozesses und der Charakterisierung von ZnO-NPs wurden zuvor beschrieben [23].

Zellkultur und Behandlung mit ZnO-NPs

A _L Zelllinie, eine Art Mensch-Hamster-Hybridzelle, die durch Fusion des gly2A . gebildet wird In dieser Studie wurde eine Mutante von Ovarien des Chinesischen Hamsters (CHO) und menschlichen Fibroblasten verwendet. Diese Hybridzellen enthielten einen Standardsatz von CHO-K1-Chromosomen und eine einzelne Kopie des menschlichen Chromosoms 11 und wurden in Hams F12-Medium (Hyclone, Grand Island, NY), ergänzt mit fötalem Rinderserum (8%, Hyclone, Grand Island, NY .) kultiviert ), Gentamicin (25 g/ml) und Glycin (2 × 10 ^–4 M) bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO₂ Inkubator [24]. Die Vorratssuspensionen frischer und gealterter ZnO-NPs wurden durch 30 Minuten Ultraschall (100 W) dispergiert, um eine Agglomeration zu verhindern, und anschließend mit Zellkulturmedien auf geeignete Konzentrationen für die Exposition der Zellen verdünnt. Zellen, die in Zellkulturmedien ohne NPs gehalten wurden, dienten in jedem Experiment als Kontrolle.

Assay zum Nachweis der Zytotoxizität

A _L Zellen in einer logarithmischen Wachstumsphase wurden auf Glasobjektträgern in 35-mm-Petrischalen (6 × 10 ⁴ Zellen/Schale) für 24 h vor der Stimulation, gefolgt von einer Behandlung mit 2 ml Kulturmedium mit 1, 5, 10, 12, 15 und 20 µg/ml frische oder gealterte ZnO-NPs 72 h. Nach Beendigung der Behandlungszeit wurden die Bilder der Zellmorphologie unter Verwendung eines Leica DM4B-Mikroskops (Leica, Deutschland) erhalten. ZnCl₂ wurde als Zinkionen-Referenz zum Vergleich der Zytotoxizität mit ZnO-NPs aufgenommen.

Zum Nachweis der Zellviabilität wurde das Cell Counting Kit (CCK-8) (APExBIO, Shanghai, China) verwendet. Im Detail, A _L Zellen wurden in 96-Well-Platten ausgesät (4 × 10 ³ Zellen/Well) mit Zellkulturmedium für 24 h und behandelt mit Medium, das verschiedene Konzentrationen von ZnCl₂ . enthält , frische und gealterte ZnO-NPs für 24, 48 bzw. 72 h. Für die Arbeitslösung betrug das Volumen der zugegebenen NPs aus der Vorratssuspension weniger als 5 % des Gesamtvolumens des Kulturmediums in jeder Vertiefung. Nach Beendigung der Behandlungszeit wurde das Kulturmedium abgesaugt und die Zellen mit 100 µL CCK-8 Arbeitslösung 2 h bei 37 °C nach Herstellerangaben inkubiert. Dann wurde die Absorption bei 450 nm mit einem Spectra Max M2-Fluoreszenzlesegerät (Molecular Devices, Wokingham, Berks, UK) aufgezeichnet. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde als Prozentsatz der Absorption in den Vertiefungen berechnet, wobei jede Konzentration von NPs auf die Absorption von Kontrollzellen (100%) normalisiert wurde.

RNA-Extraktion, reverse Transkription und quantitative PCR

A _L Zellen in einer logarithmischen Wachstumsphase wurden in eine Petrischale mit 35 mm Durchmesser (6 × 10 ⁴ Zellen/Schale) mit Zellkulturmedien für 24 h. Dann wurde das Medium durch 2 ml Kulturmedium mit 12 µg/ml ZnCl₂ . ersetzt , frische und gealterte ZnO-NPs für 72 h. Nach Beendigung der Behandlungszeit wurde das Kulturmedium abgesaugt und die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurde jeder Schale 1 ml Trizol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) zugesetzt, um die Gesamt-RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren. Konzentration und Reinheit der nach der Extraktion erhaltenen Gesamt-RNA wurden unter Verwendung eines Q5000UV-Vis-Spektrophotometers (Quawell, USA) quantifiziert. Nach der Quantifizierung wurde eine reverse Transkription mit dem TransGene RT-PCR-Kit (TransGene Biotech, Peking, China) durchgeführt, um cDNA aus der RNA-Vorlage gemäß den Protokollen des Herstellers zu erhalten. Die resultierenden cDNA-Proben wurden mit dem Q5000 UV-Vis-Spektrophotometer quantifiziert und dann mit SYBR-Green als Fluoreszenzfarbstoff (TransGene Biotech, Peking, China) auf einem Roche RT-PCR-System (Applied Biosystems) analysiert [25].

Das Housekeeping-Gen, das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (Gapdh ) wurde als interne Kontrolle für die Bewertung von Il-1α . verwendet , Il-1β , Caspase 3 , CD69 , Juni und MT1 mRNA-Expression. Die Ergebnisse wurden als relatives Expressionsverhältnis zwischen dem Zielgen und Gapdh . ausgedrückt . Die in dieser Studie verwendeten Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

RNA-Sequenzierungsdatenanalyse

Die Gesamt-RNA-Proben von A _L Zellen der Kontrollgruppe, gealterte ZnO-NP-behandelte Gruppe und ZnCl₂ behandelte Gruppe wurden von BangFei Bioscience (Beijing, China) sequenziert. Kurz gesagt, die Gesamt-RNA von A _L Zellen wurden gemäß den TRIZOL-Protokollen bis zur isoproponalen Präzipitation extrahiert. Anschließend wurden die RNA-Proben vor der Sequenzierung im Extraktionspuffer resuspendiert. Die rohen RNA-Sequenzierungsdaten wurden mit dem R-Paket Deseq2 [Eric1] analysiert. Das Venn-Diagramm wurde mit dem R-Paket VennDiagram [Eric1.2] generiert. Die signifikant veränderten Gene wurden für weitere Pathway-Anreicherungsanalysen verwendet. Die Experimente wurden in drei unabhängigen Wiederholungen durchgeführt. rRNA-Gene, mitochondriale Gene und die Gene mit weniger als 40 bp wurden von der Analyse ausgeschlossen.

Die RNA-Sequenzierungsdaten, Referenzserien GSE97852, GSE60159 und GSE39444, wurden von Gene Expression Omnibus [Eric 2, 3, 4] erhalten. Der Plot der Gene Set Enrichment Analysis wurde von R (Version 3.6.2) mit dem Paket fgsea [Eric 5] generiert. Die Apoptose-Gene mit 1,5-fach signifikanter Veränderung &p Wert   <0,05 wurden für die weitere Analyse verwendet. Die Heatmap mit Genbaum wurde vom R-Paket „ComplexHeatmap“ [Eric 6] generiert. Als Clustering-Methode wurde die durchschnittliche Verknüpfung verwendet, und als Entfernungsmessverfahren wurde Euklidisch verwendet. Der Pathway-Anreicherungsanalyse ging STRING2.0 [Eric 7] voraus.

Western Blotting

A _L Zellen in einer logarithmischen Wachstumsphase wurden in eine Petrischale mit 60 mm Durchmesser (1,5 × 10 ⁵ Zellen/Schale) mit Zellkulturmedien für 24 h. Dann wurde das Medium für 24 h durch 4 ml Kulturmedium ersetzt, das 12 µg/ml frische oder gealterte ZnO-NPs enthielt. Am Ende der Expositionsperiode wurde das Kulturmedium abgesaugt und dann wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und auf Eis mit RIPA-Lysepuffer (Beyotime, China) lysiert, um zelluläre Proteine ​​zu sammeln. Gleiche Mengen zellulärer Proteine ​​wurden auf 12% SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt und dann auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran (Roche, Swiss) übertragen. Kurz gesagt, nach 2 stündiger Blockierung mit 5% fettfreier Milch in TBST bei 25 °C wurden die Membranen anschließend mit primärem Antikörper in geeigneten Verdünnungen (gemäß den Protokollen des Herstellers) bei 4 °C über Nacht inkubiert, gefolgt von Inkubation mit HRP-konjugiertem sekundärem Antikörper (1:5000, Promega, Madison, USA) für 2 h bei 25 °C. Schließlich wurde die Immunmarkierung unter Verwendung einer Lösung mit verstärkter Chemilumineszenz (ECL) (BOSTER, China) nachgewiesen. Die primären Antikörper von Anti-Pro/gespaltener Caspase-3 und Anti-Actin wurden von Cell Signaling Technology bzw. ImmunoWay bezogen.

Statistik

Die statistische Analyse wurde anhand der Ergebnisse aus mindestens drei unabhängigen Experimenten erstellt. Alle Daten wurden als Mittelwerte ± ± Standardabweichung (SD) dargestellt und unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) statistisch verglichen. In allen Parzellen p Werte < 0,05 wurden als * angezeigt und als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Charakterisierung von ZnO-NPs

Um die Unterschiede in den detaillierten physikalisch-chemischen Eigenschaften zwischen frischen und gealterten ZnO-NPs zu bestimmen, beobachteten wir zunächst die Morphologie der NPs mit TEM (Abb. 1A). Unsere Ergebnisse zeigten, dass 20 nm große frische ZnO-NPs nahezu kugelförmige Kristalle waren und 90–200 nm große frische ZnO-NPs unregelmäßig stäbchenförmige/kubische Kristalle. Die Einzelpartikelgröße stimmte mit der vom Hersteller bereitgestellten Größe überein. Offensichtlich neigten sowohl 20 nm als auch 90–200 nm ZnO-NPs dazu, in Reinstwasser zu aggregieren. Unabhängig von der Form und Größe der ursprünglichen NPs veränderte sich die Mikrostruktur sowohl der 20 nm als auch der 90–200 nm ZnO-NPs nach 60 Tagen Alterung dramatisch von einer klaren Kristallstruktur in einen amorphen oder blatt-/nadelartigen Zustand. Darüber hinaus wurden die kristalline Natur und die Phasenreinheit sowohl frischer als auch gealterter NPs mithilfe von Röntgenbeugung (XRD) mit Cu Kα-Strahlung (λ = 0,15418 nm) Ansatz bei 25 °C, wie in Abb. 1B gezeigt. Das XRD-Muster frischer ZnO-NPs zeigte, dass die Proben eine kristalline Wurtzit-Struktur enthielten und keine charakteristischen Verunreinigungspeaks identifiziert wurden, was auf eine hohe Qualität frischer NPs schließen lässt. Bei gealterten NPs zeigte das XRD-Muster die Neubildung von Zn₅ (CO₃ )₂ (OH)₆ (Kartennummer 00-011-0287) und Zn (OH)₂ (Kartennummer 00-003-0888) feste Phasen, die die chemische Umwandlung von ZnO-NPs (20 und 90–200 nm) während des Alterungsprozesses anzeigen.

Physikochemische Eigenschaften von frischen und gealterten ZnO-NPs. A Repräsentative mikroskopische Aufnahmen von frischen und gealterten NP (100 μg/ml, 20 und 90–200 nm) in Milli-Q Wasser mit niedrigauflösender TEM, B XRD-Muster von frischen NPs, gealterten NPs, ZnO, Zn (OH)₂ und Zn₅ (CO₃ )₂ (OH)₆ Referenzen in getrockneter Form

Morphologische Beobachtung von A _L Zellen, die frischen und gealterten ZnO-NPs ausgesetzt sind

Die Behandlung von NPs führt in vitro zu einer merklichen Veränderung der Zellform oder Morphologie [26]. Daher A _L Zellen, die 72 h lang frischen oder gealterten ZnO-NPs mit 10 &15 µg/ml ausgesetzt waren, wurden unter einem Stereomikroskop untersucht. Wie in Abb. 2 gezeigt, blieb die Zellmorphologie in der Kontrollgruppe normal. Die Zellen hafteten gut, wobei die meisten innerhalb von 2 h anhefteten. Die meisten Zellen waren spindelförmig oder polygonal, wobei einige sich neu teilende Zellen ein transparenteres Zytoplasma und eine bessere Dispersion während des Adhäsionsprozesses zeigten. Die Behandlung mit 12 μg/ml frischen ZnO-NPs (20 nm &90–200 nm) für 72 h veränderte die Zellmorphologie signifikant. Obwohl die meisten Zellen innerhalb von 3–5 h anhafteten, konnten sie sich nicht gut ausbreiten, und einige Zellen wurden abgerundet und verloren die polygonale Form. Wenn die Konzentration der ZnO-NPs auf 15 μg/ml erhöht wurde, atrophierten die behandelten Zellen und konnten nicht anhaften, was auf ihre deutlich geringere Zelllebensfähigkeit als die der mit 10 μg/ml behandelten Zellen hinweist. Diese Ergebnisse zeigten, dass der LC100 für frische ZnO-NPs bei einer 72-stündigen Behandlung wahrscheinlich weniger als 15 μg/ml beträgt. Im Gegensatz dazu war die Zellmorphologie in 20 nm und 90–200 nm gealterten NP-behandelten Gruppen (15 μg/ml) nicht signifikant beeinflusst, und die meisten überlebenden Zellen konnten anhaften und sich ausbreiten, wobei weniger als die Hälfte der toten Zellen beobachtet wurde, was zeigt, dass gealterte ZnO-NPs sind viel weniger zytotoxisch als frische ZnO-NPs.

Morphologische Veränderungen in A _L Zellen nach 72 stündiger Exposition gegenüber frischen oder gealterten ZnO-NPs in zusätzlichem Hams F12-Medium, und nicht-exponierte Zellen wurden als Kontrollgruppen verwendet. A _L Zellmorphologie wurde mit einem optischen Mikroskop bei 10 ×  Vergrößerung beobachtet

Gealterte ZnO-NPs induzierten eine geringere Zytotoxizität als frische NPs

Um den Unterschied in der Zytotoxizität zwischen frischen und gealterten ZnO-NPs weiter zu untersuchen, haben wir die Lebensfähigkeit der Zellen mit CCK-8-Kits untersucht. Wie in Abb. 3 gezeigt, Inkubation A _L Zellen mit Gradientendosen frischer und gealterter ZnO-NPs (im Bereich von 0 bis 20 μg/ml, 20 nm und 90–200 nm) für 24 h, 48 h oder 72 h zeigten eine dosisabhängige Abnahme der Zelllebensfähigkeit. Bei der Behandlung von Zellen mit ZnO-NPs  ≤  10 μg/ml wurde keine offensichtliche Zytotoxizität beobachtet. Wenn die Dosierung frischer und gealterter ZnO-NPs auf 12 und 15 µg/ml erhöht wurde, zeigte die Zelllebensfähigkeit eine zeitabhängige Abnahmetendenz. Offensichtlich war die Zelllebensfähigkeit in gealterten NP-behandelten Gruppen signifikant höher als in frischen NP-behandelten Gruppen. Außerdem ZnCl₂ -Behandlung beeinträchtigte auch die Lebensfähigkeit der Zellen in einer dosis- und zeitabhängigen Weise, während die Zytotoxizität von ZnCl₂ war viel geringer als bei frischen und gealterten ZnO-NPs.

Durch frische und gealterte ZnO-NPs in A . induzierte Zelllebensfähigkeit _L Zellen. A _L Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von frischen und gealterten ZnO-NPs (20 und 90–200 nm) 24 h lang inkubiert (A ), 48 Stunden (B ) und 72 h (C ). D A _L Zellen wurden verschiedenen Konzentrationen von ZnCl₂ . ausgesetzt für verschiedene Zeiten. Die Daten basieren auf 3 unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± SD, *p . ausgedrückt < 0.05

Die Behandlung von frischen ZnO-NPs aktivierte Apoptosewege und regulierte die Expression apoptotischer Gene hoch

Um die zugrunde liegenden Mechanismen aufzudecken, die zu einer geringeren Zytotoxizität gealterter NPs führen, analysierten wir RNA-Sequenzierungsdaten von frischen und gealterten ZnO-NPs. Wie in Abb. 4A, B gezeigt, wurde nach Behandlung mit frischen ZnO-NPs der Apoptoseweg in Jurkat-Zellen aktiviert (p = 0.017) und HMDM-Zellen (p = 0,041). Die Apoptose-Gene:ANXA1 , CYLD , TNFSF10 , IER3 , CDKN1A , JUN , SAT1 , PMAIP1 , CD38 und ISG20 wurden in frischen ZnO NP-behandelten Jurkat-Zellen signifikant angereichert. Die Apoptose-Gene:CD38 , TNFRSF12A , CCNA1 , BMP2 , PPP2R5B , EREG , IFNGR1 , CD44 , CD14 , GNA15 , GCH1 , TIMP1 , BTG2 , IL1B , IL1A , BTG3 , BCL2L11 , SC5D und SPTAN1 wurden in frischen ZnO NP-behandelten HMDM-Zellen signifikant angereichert (Fig. 4C, D). Da Jurket-Zellen (periphere Blut-T-Lymphozyten-Zellen) und HMDM-Zellen (menschliche Monozyten-abgeleitete Makrophagen) unterschiedliche Arten von Zellen sind, kann die Art und Weise, wie sie Apoptose auslösen, unterschiedlich sein. Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass die Exposition von frischen ZnO-NPs verschiedene Apoptosewege in verschiedenen Zellarten aktivieren könnte.

Der Apoptoseweg wurde in RNA-seq-Daten von frischen ZnO-NP-behandelten Jurket- und HMDM-Zellen angereichert. Der Anreicherungsscore signifikant exprimierter Gene aus dem Apoptoseweg frischer ZnO NP-behandelter Jurket-Zellen (A ) und HMDM-Zellen (B ). Die Heatmap der apoptotischen Genexpression frischer ZnO NP-behandelter Jurket-Zellen (C ) und HMDM-Zellen (D ) und ihre Kontrollgruppen

Gealterte ZnO-NPs haben die Expression apoptotischer Gene als frische ZnO-NPs nicht hochreguliert

Unsere RNA-Sequenzierungsdaten von gealterten ZnO-NP-behandelten A _L Zellen zeigten, dass p53, PI3k-Akt, FoXO, Glutathion, ErbB, HIF-1, Oxytocin und der Jak-STAT-Signalweg angereichert waren (Abb. 5A). Die in Jurket- und HMDM-Zellen angereicherten Apoptose-Gene waren in den gealterten ZnO-NP-behandelten Zellen nicht signifikant betroffen (Fig. 5B). Um die Ergebnisse weiter zu bestätigen, haben wir die Expression verwandter Gene durch Real-Time-PCR getestet. Wir fanden heraus, dass einige der Apoptose-Gene:BMP2 , PMAIP1 , IL1α , CD69 , CCNA1 , CD38 und IL1β waren in gealterten ZnO-NPs, die mit A behandelt wurden, nicht nachweisbar _L Zellen (Daten nicht gezeigt), wahrscheinlich weil die meisten dieser Gene in Zellen des Immunsystems exprimiert werden. Die anderen hochregulierten Apoptose-Gene (IL1α , IL1β und CD59 ), die in den mit frischem ZnO NP behandelten Gruppen beobachtet wurden, wurden in den Expressionsspiegeln durch die Behandlung mit gealterten ZnO NPs nicht signifikant verändert. Während der MT1 die als Positivkontrolle dienen, war in einem Expressionslevel signifikant erhöht, die Expression von Caspase 3 wurde nicht wesentlich verändert (Abb. 5C). Diese Daten legten nahe, dass gealterte ZnO-NPs im Gegensatz zu ihren frischen Gegenstücken weniger wirksam bei der Aktivierung der Gene des Apoptosewegs in A . sind _L Zellen.

Der Apoptoseweg war in den RNA-Seq-Daten von gealtertem ZnO-NP-behandeltem A . nicht angereichert _L Zellen. (A ) Die genontologische Analyse angereicherter Signalwege aus gealtertem ZnO NP-behandeltem A _L Zellen. (B ) Die Heatmap der apoptotischen Genexpression von gealtertem ZnO NP-behandeltem A _L Zellen und Kontrollgruppe. (C ) Die Expression ausgewählter apoptotischer Gene und Kontrollgene (MT1 ) in frischem und gereiftem ZnO NP-behandeltem A _L Zellen

Frische, aber nicht gealterte ZnO-NPs erhöhten das Expressionsniveau des aktivierten Caspase-3-Proteins

Nachweis der Genexpression von Caspase 3 allein kann die Aktivierung des Apoptosewegs nicht direkt anzeigen. Um weiter zu analysieren, ob die Behandlung von ZnO-NPs den Spiegel apoptotischer Proteine ​​verändern könnte, wurde die Expression von gespaltenem Caspase-3-Protein, einem häufig verwendeten Biomarker, um die Aktivierung der Zellapoptose anzuzeigen [27], durch Western-Blotting-Analyse untersucht. Wie in Abb. 6 gezeigt, erhöhte die Behandlung mit frischen ZnO-NPs (20 nm) im Vergleich zur Kontrollgruppe den zellulären Spiegel des gespaltenen Caspase-3-Proteins um das 1,31 ± 0,023-fache, was signifikant höher war als der von ZnO-NPs im Alter von 20 nm. behandelte Gruppe (1,12 ± 0,039-fach). Wenn die Partikelgröße frischer ZnO-NPs auf 90–200 nm erhöht wurde, war die Expression von gespaltenem Caspase-3-Protein, die durch frische NPs induziert wurde, um das 1,46 ± 0,078-Fache erhöht, signifikant höher als die von gealterten NPs (1,07 ± 0,075-fach). . Diese Daten veranschaulichten weiter die höhere Wirksamkeit frischer ZnO-NPs bei der Induktion der Zellapoptose im Vergleich zu ihren gealterten Gegenstücken.

Apoptoselevel in A _L Zellen, die mit frischen und gealterten ZnO-NPs (20 und 90–200 nm) inkubiert wurden. Western Blotting-Analyse (A ) und Quantifizierung (B ) der gespaltenen Caspase-3-Proteinspiegel, wenn Zellen mit 12 μg/ml frischen und gealterten ZnO-NPs (20 und 90–200 nm) 72 h lang inkubiert wurden. Die Daten basieren auf 3 unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± SD, *p . ausgedrückt < 0.05

Diskussion

Es wurde berichtet, dass ZnO-NPs eine physikalisch-chemische Umwandlung in Zn₅ . eingehen (CO₃ )₂ (OH)₆ mit der Freisetzung von Zn ²⁺ während des natürlichen Alterungsprozesses [23, 28]. Die durch die transformierten (gealterten) ZnO-NPs induzierte Zytotoxizität und die zugrunde liegenden Mechanismen bleiben jedoch unklar. Um den Mechanismus der unterschiedlichen Zytotoxizität zwischen frischen und gealterten ZnO-NPs aufzudecken, wurden hier eine RNA-Sequenzierungsanalyse und ein RT-PCR-Test durchgeführt. Außerdem wurde Western-Blotting angewendet, um den Proteingehalt von Caspase 3 zu untersuchen, dem wichtigsten Executor bei der Zellapoptose.

Unsere Daten zeigten, dass gealterte ZnO-NPs viel weniger Zytotoxizität als frische ZnO-NPs in A . induzierten _L Zellen. Der LC₁₀₀ der beiden frischen ZnO-NPs (90–200 nm und 20 nm) in unserer vorliegenden Studie lag unter 15 μg/ml (Abb. 3), was mit früheren Erkenntnissen übereinstimmt, dass der LC₁₀₀ von ZnO-NPs mit 19–36 nm zu NIH-3T3- oder MSTO-Zelle beträgt etwa 15 μg/mL [29]. Wir haben bestätigt, dass die umweltbedingten Veränderungen der physikalisch-chemischen Eigenschaften von Nanopartikeln deren Toxizität dramatisch verändern können. Es wurde berichtet, dass der Sulfidierungsprozess von ZnO-NPs ihre Ladung, Hydrophobie und Aggregationszustand ändert, was zur Adsorption von Sulfid-NPs in menschlichem Speichel, Schweiß und bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit führt. Und das von ZnO-NPs adsorbierte Protein bildete eine spezielle Proteinkrone, die seine biologische Wirkung beeinflusste [19]. Phosphate, die in physiologischen Lösungen (wie Speichel) weit verbreitet sind, könnten ZnO-NPs in metastabiles ZnHPO umwandeln₄ und Zn₃ (PO₄ )₂ innerhalb von etwa 5–10 h und zeigte Zytotoxizität gegenüber Epithelzellen des Verdauungstrakts [20]. Ivasket al. bewiesen das Auftreten einer vollständigen Transformation von ZnO-NPs (≤ 3 μg/ml) im In-vitro-Expositionssystem mit humanen T-Lymphozyten (37 °C, Zellkulturmedium RPMI1640 mit 10 % FBS für 24 h) unter Verwendung von Synchrotronstrahlung Röntgenabsorption Near-Edge-Strukturspektroskopie (XANES). Das Spektrum und die Zytotoxizität der Transformationsprodukte stimmten mit denen von ZnSO₄ . überein [21]. Unsere Ergebnisse zeigten die dosis- und zeitabhängige Toxizität von ZnCl₂ zu A _L Zellen, deren Zytotoxizität viel geringer ist als bei frischen und gealterten ZnO-NPs (Abb. 3). Die Beobachtung erklärt weiter den Befund, dass die Zytotoxizität von frischem ZnO-NP nicht vollständig auf sein freigesetztes Zn ²⁺ . zurückgeführt wird [30].

Unsere vorherige Studie zeigte auch, dass gealterte ZnO-NPs im Vergleich zu frischen ZnO-NPs eine höhere Potenz bei der Auslösung von ROS (reaktive Sauerstoffspezies) sowie eine abgeschwächte Fähigkeit zum Abtöten von Zellen aufweisen [23]. Wir argumentieren, dass die geringere Zytotoxizität, die durch gealterte ZnO-NPs induziert wird, in Säugerzellen besser verträglich sein könnte. Die vorliegende Studie von RNA-Sequenzierungsdaten zeigte, dass apoptotische Gene in frischen ZnO-NP-behandelten Zellen hochreguliert wurden, wo sie in gealterten NP-behandelten Gruppen viel weniger betroffen waren. IL1α und IL1β sind Mitglieder der Interleukin-1-Zytokinfamilie. Die Freisetzung von IL1α und IL1β aktiviert die teilweise abhängige Apoptose von Caspase 8 [31]. CD69 kodiert für ein Mitglied der Calcium-abhängigen Lektin-Superfamilie der Typ-II-Transmembranrezeptoren. Eine erhöhte CD69-Expression war mit einer erhöhten Expression des Apoptose-Annexin-V- und CD95-(Fas)-Markers verbunden [32]. JUN ist eine AP-1-Transkriptionsfaktor-Untereinheit. Erhöhte JUN-Aktivität spaltet proteolytisch Alpha-Fodrin, ein Substrat des Interleukin-1beta-konvertierenden Enzyms (ICE), und die CED-3-Familie von Cysteinproteasen, was weiter den programmierten Zelltod verursacht [33]. Die erhöhte Expression dieser apoptotischen Gene zeigte, dass frische NPs auf verschiedene Weise Apoptose auslösen. Nach der Erhöhung dieser apoptotischen Genexpressionen werden schließlich Apoptoseprozesse von apoptotischen Proteinen ausgeführt (Abb. 7). Caspase 3 is the core protease for various apoptotic scenarios; cleavage of this protein is necessary to activate both extrinsic and intrinsic apoptotic pathways [34, 35]. Therefore, detection of cleaved caspase 3 is a common method for identifying apoptosis induced by a wide variety of apoptotic signals [36]. Our Western blotting data revealed that, for both 20 nm and 90–200 nm ZnO NPs, sublethal exposure did not alter the level of Pro caspase 3 in all treatment groups. In contrast, cleaved Caspase 3 was significantly elevated by fresh NPs treatment, where aged NPs showed few (if any) effects on the level of cleaved caspase 3 (Fig. 6). Combined with RNA expression analysis, our results clearly elucidated the higher potency of fresh ZnO NPs in inducing cell apoptosis.

Model for Fresh ZnO NPs but not aged ZnO NPs induces Caspase 8- and Caspase 3-dependent apoptosis. The increased expression of apoptotic gene CD69 activates Fas and apoptosis annexin V expression in fresh ZnO NP-exposed mammalian cells. The increased expression of apoptotic gene IL1α and IL1β partially activates Caspase 8-dependent apoptosis. It further causes activation of Caspase 3 and induces apoptosis. All these changes in mRNA and protein level were not detectable in aged ZnO NPs-exposed mammalian cells

Schlussfolgerungen

In the present study, the natural physicochemical transformation of ZnO NPs in ultrapure water was confirmed, and variations in cytotoxicity induced by fresh &aged NPs were investigated. We focused on RNA sequencing data from our aged ZnO NP-treated A _L cells and that of fresh NPs from database. We compared those signaling pathway specifically enriched in aged NP-treated group, which are different from that of fresh NP- or ZnCl₂ -treated groups. Our data indicated that the lower cytotoxicity of aged ZnO NPs is closely related to its attenuated ability in inducing apoptosis, while the transcriptional regulation of the multiple pathways activated by NPs promotes the establishment of cellular homeostasis in mammalian cells.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Nicht zutreffend.

Abkürzungen

NPs:

Nanopowders

ZnO:

Zinkoxid

Zn₅ (CO₃ )₂ (OH)₆ :

Hydrozincite

Zn (OH)₂ :

Zinc hydroxide

ZnCl₂ :

Zinc chloride

ZnSO₄ :

Zinc sulfide

ZnHPO₄ :

Zinc hydrogen phosphate

Zn₃ (PO₄ )₂ :

Zinc phosphate

A _L cells:

Human–hamster hybrid cells

CHO cells:

Chinese hamster ovary cells

Jurket cells:

Peripheral blood T lymphocyte cells

HMDM cells:

Human monocyte-derived macrophages

NIH-3T3cells:

Mouse embryonic cells

MSTO cells:

Human lung cancer cells

RPMI1640:

Roswell Park Memorial Institute 1640

ICE:

Interleukin 1beta-converting enzyme

CED-3:

Caenorhabditis elegans death gene

IL1α:

Interleukin 1alpha

IL1β:

Interleukin 1beta

mRNA:

Messenger ribonucleic acid

cDNA:

Complementary deoxyribonucleic acid

FBS:

Fötales Rinderserum

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

XRD:

Röntgenbeugung

RT-PCR:

Real-time polymerase chain reaction

CPI:

The Nanotechnology Consumer Product Inventory

XANES:

Synchrotron radiation X-ray absorption near-edge structure spectroscopy

RIPA:

Radio immunoprecipitation assay

SDS-PAGE:

Polyacrylamide gel electrophoresis

PVDF:

Polyvinylidenfluorid

ECL:

Enhanced chemiluminescence

CCK-8:

Cell counting kit-8