Nanopartikel-verabreichtes Artesunat steigert antitumorale Wirksamkeit durch Aktivierung mitochondrialer Apoptose

Zusammenfassung

Artemisinin und seine Derivate weisen ein breites Spektrum antikarzinogener Aktivitäten auf und induzieren signifikante Antikrebs-Effekte in Tumorzellen. Sie werden schnell absorbiert, weit verteilt und töten Tumorzellen selektiv. Da niedrige Artesunat-Konzentrationen primär über Onkose Zelltod induzieren, sind ihre antitumorale Wirkung begrenzt. Um bessere Effekte zu erzielen, nutzten wir eine neue Nanotechnologie, um neuartige Artesunat-beladene Rinder-Serumalbumin-Nanopartikel (BSA-NPs) zu entwerfen, die mitochondriale Anreicherung von Artesunat erreichen und mitochondrien-vermittelte Apoptose auslösen. Die Ergebnisse zeigten: Im Vergleich zur onkotischen Zelltod durch freies Artesunat wiesen Artesunat-BSA-NPs höhere Zytotoxizität auf und ihre signifikanten apoptotischen Effekte wurden durch die Verteilung von Artesunat in den Mitochondrien vermittelt. Dies deutet darauf hin, dass Artesunat-BSA-NPs die mitochondriale Integrität schädigen und mitochondrien-vermittelte Zellapoptose durch Hochregulierung apoptose-relevanter Proteine und beschleunigte Freisetzung von Cytochrom C aktivieren.

Hintergrund

Artemisinin und Derivate werden wegen hoher antimalarischer Aktivität und geringer Toxizität breit in der Malariabehandlung eingesetzt. Forscher fanden auch signifikante antitumorale Aktivität aufgrund geringer Nebenwirkungen und guter Verträglichkeit. Artesunat (Ats) hemmt definitiv Tumorzellwachstum und induziert signifikante Antikrebs-Effekte. Experimente zeigten, dass Ats nach 48 h unterschiedliche Grade von Apoptose und Onkose in Tumorzellen verursacht, dosisabhängig. Bei niedrigen Konzentrationen induziert Ats keine offensichtliche Apoptose, der Zelltod geht mit onkose-ähnlichem Tod einher. Um größere antitumorale Effekte zu erzielen, wurde höhere Ats-Dosierung angewendet, was aber schwere Toxizität und Knochenmarksuppression bestätigte. Daher ist eine effektive Behandlung nötig, um die effektive Ats-Dosis zu reduzieren und die antitumorale Effizienz zu steigern. Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation apoptotischer und onkotischer Effekte von Ats und sind an der Transduktion vielfältiger apoptotischer Signale beteiligt. Werden Mitochondrien von Medikamenten angegriffen, steigt ihre Permeabilität, das Membranpotenzial sinkt, was zu mitochondrialer Schwellung und schneller Freisetzung von Cytochrom C ins Zytoplasma führt. Daraufhin werden Caspase-Familien-Proteine aktiviert und die Apoptose-Kaskade ausgelöst.

Um die antitumorale Wirkung von Ats zu steigern, wurden viele neue Techniken versucht, um die Verteilung des Medikaments in Tumorzellen zu erhöhen oder die gezielte Lieferung in Zellorganellen zu verbessern. Nanopartikel (NPs) als Schlüsselinstrument der gezielten Krebstherapie wurden breit untersucht und zeigen vielversprechendes Potenzial. Durch kleinere Partikelgröße und große Oberfläche können NPs in die Blutkreislauf gelangen, durch Endothelzelllücken wandern und zum Tumorort migrieren, was gezielte Arzneimittelverteilung und erhöhte Bioverfügbarkeit ermöglicht. NPs können die Arzneimittelfreisetzung durch Biomaterialabbau langfristig und gleichmäßig steuern, was die Eliminationshalbwertszeit verlängert, die effektive Blutkonzentration verbessert und die Dosierfrequenz reduziert. Vor allem können medikamentenbeladene NPs an spezifische intrazelluläre Orte geliefert werden, was die therapeutische Wirksamkeit verbessert.

Um die antitumorale Wirkung von Ats bei niedrigen Konzentrationen zu erhöhen, entwarfen wir neuartige Ats-beladene BSA-NPs. Aufgrund des niedrigen pH in Tumorzellen reichern sich viele Wasserstoffprotonen an der äußeren Mitochondrienmembran oder im Intermembranraum an, während die innere Mitochondrienmembran negativ geladen ist, was ein transmembranes Potential (außen positiv, innen negativ) erzeugt, das die BSA-Lieferung begünstigt. Die massive Anreicherung von Ats in Mitochondrien kann dann effektiv mitochondrien-vermittelte Apoptose auslösen. Die Ergebnisse zeigten: Im Vergleich zum typischen onkotischen Tod durch freies Ats wurde Ats spezifisch in Mitochondrien über BSA-NPs transferiert und förderte die mitochondrien-vermittelte Aktivierung apoptotischer Caspase-Proteine. Dies löste signifikante Zellapoptose aus, was die höhere Zytotoxizität unterstreicht.

Methoden

Materialien

BSA von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), Ats von Guilin Pharmaceutical (Guilin, China). SMMC-7721 und Plc Zellen vom Institut für Biochemie und Zellbiologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China). Alle anderen Chemikalien waren analytischer Grade.

Herstellung und Charakterisierung von Ats-beladenen BSA-NPs

Nach vorheriger Literatur wurden Ats-BSA-NPs via Entsalzungsmethode hergestellt. Kurz: 1,0 mL anhydres Ethanol mit Ats wurde schnell in 0,5 mL BSA-Lösung bei 37 °C getropft bis Opaleszenz. Nach Ethanol-Entfernung durch Rotationsverdampfung wurden NPs gefällt, dann 8 % Glutaraldehyd (0,5 µL/mg BSA) zur Vernetzung unter 24 h Rühren zugegeben. Schließlich wurden NPs gesammelt, dreimal mit deionisiertem Wasser gewaschen und physikalisch charakterisiert: hydrodynamischer Durchmesser, Polydispersitätsindex (PDI), Zeta-Potenzial, Morphologie mittels Brookhaven Zetasizer und TEM (JEM-1200EX). Die Einkapselungseffizienz wurde nach bekannter Methode bestimmt.

MTT-Test

SMMC-7721 und Plc Zellen wurden mit 20 % FBS inkubiert, Zelldichte auf 1 × 10⁶ Zellen/mL eingestellt, dann auf 1 × 10⁵ Zellen/mL verdünnt. 100 µL pro Well (ca. 1 × 10⁴ Zellen) in 96-Well-Platten für 24 h bei 37 °C, 5 % CO₂, 95 % O₂. Medium wurde durch serumfreies Medium mit freiem Ats oder Ats-BSA-NPs unterschiedlicher Konzentration ersetzt, 24 h Inkubation. 50 µL MTT (5 mg/mL) pro Well, 4 h Inkubation. Nach Zentrifugation (1000 rpm, 5 min) wurde Überstand entfernt, 150 µL DMSO zugesetzt zum Auflösen der Kristalle. Absorption bei 490 nm mit Microplate-Reader (Syneray-2, BioTek) gemessen.

Intrazelluläre Verteilung der BSA-NP-Gruppe in Zellen

SMMC-7721 und Plc Zellen in logarithmischer Phase, Trypsin-Verdauung, Konzentration 1 × 10⁶ Zellen/mL. In 6-Well-Platten zur Adhärenz, Medium entfernt, rhodamin B-markierte BSA-NPs zugegeben. Zellkern mit Hoechst (blau) 15 min bei 37 °C gefärbt, Mitochondrien mit MitoTracker Green FM. Verteilung der BSA-NPs in Zellen per konfokaler Lasermikroskopie (FluoView FV10i, Olympus) verfolgt.

Mitochondriales Membranpotenzial

JC-1 detektiert Änderungen des mitochondrialen Membranpotenzials. Hohes Potenzial: JC-1 passiert Zellmembran, bildet Aggregate in Mitochondrien, rote Fluoreszenz (Ex 525 nm, Em 590 nm). Niedriges Potenzial: JC-1 wandert in Zytoplasma, grünes Monomer (Ex 490 nm, Em 530 nm). SMMC-7721 und Plc Zellen in Konfokal-Schälchen (1 × 10⁶ Zellen/mL) 12 h inkubiert. Medium entfernt, serumfreies Medium mit Ats oder Ats-BSA-NPs zugegeben. Nach 9 h Medium entfernt, 2× PBS gewaschen, 2 mL JC-1 (2 µmol/L) zugegeben, 30 min bei 37 °C im Dunkeln. Laser-Scanning-Konfokalmikroskop (FluoView FV10i) zur Beobachtung.

ROS-Messung und ER-Färbung

Zellen mit 20 % FBS, Dichte 1 × 10⁶ Zellen/mL, verdünnt auf 1 × 10⁵ Zellen/mL, in 96-Well-Platten (100 µL/Well, ~1 × 10⁴ Zellen) 24 h bei 37 °C, 5 % CO₂, 95 % O₂. Freies Ats und Ats-BSA-NPs 6, 12, 24 h inkubiert, dann 10 µM DCFH-DA (Sigma) 30 min. Eis-kaltes PBS 3× waschen. Intrazelluläre DCF-Fluoreszenz (Ex 485 nm, Em 530 nm) per Microplate-Reader (Synergy-2, BioTek) gemessen. Testgruppen 24 h mit SMMC-7721 und Plc, ER-Tracker Blue–White DPX (Molecular Probes) 30 min inkubiert. Nach Entfernen und PBS-Waschen ER-Morphologie per Konfokalmikroskopie beobachtet.

Zell-Onkose und Apoptose per Durchflusszytometrie

Nach vorherigem Protokoll: Annexin V-FITC/PI-Färbung zur Bewertung von Onkose und Apoptose durch freies Ats und Ats-BSA-NPs. Zellen mit Trypsin lysiert, in 6-Well-Platten (1 × 10⁶ Zellen/mL) 24 h. Medium entfernt, serumfreies Medium mit freiem Ats und Ats-BSA-NPs. Nach Behandlung Zellen gesammelt, in Nicoletti-Puffer (Beijing 4A Biotech) mit PI und FITC-markiertem Annexin V (AV-FITC) suspendiert. Morphologische Änderungen per Konfokalmikroskopie. Apoptose- und Onkose-Raten (früh apoptotisch Q4, onkotisch Q2, nekrotisch Q1, lebend Q3) per Durchflusszytometrie quantifiziert.

Western Blot von Apoptose-Proteinen und Cytochrom C

Western Blot zur Bestimmung relativer Proteinlevel nach 24 h Inkubation von freiem Ats oder Ats-NPs mit SMMC-7721 Zellen. Zellen in ice-cold RIPA-Puffer mit Protease-Inhibitor-Cocktail und Phosphatase-Inhibitoren (Roche) lysiert. Proteinkonzentration via modifizierter BSA-Assay (Thermo Fisher) bestimmt, normalisiert, auf 10 % SDS-PAGE. Zielproteine fotografiert und analysiert mit UVP-Gel-Analysesystem (iBox Scientia 600, UVP).

Ergebnisse

Charakterisierung von Ats-BSA-NPs und Zelllebensfähigkeit

Abb. 1a,b: Ats-BSA-NPs zeigen kugelige Form, homogen dispergiert, niedriger PDI 0,016. Durchschnittliche Partikelgröße ~99,9 ± 2,3 nm, Zeta-Potenzial negativ ~−25,6 ± 4,3 mV. Freisetzungsprofil (Abb. 1c) zeigt gleichmäßige, nachhaltige Freisetzung. Im Vergleich zur schnellen Freisetzung freien Ats in vitro diffundiert Ats im Kern der BSA-NPs langsam in das Medium – gleichmäßiges, nachhaltiges Freisetzungsmuster durch kontinuierlichen BSA-Abbau. >85 % freies Ats innerhalb 6 h freigesetzt, während kumulativ 78,9 % aus NPs in 48 h freigesetzt. NPs steuern also Freisetzung über Biomaterialabbau langfristig, verlängern Eliminationshalbwertszeit, verbessern effektive Blutkonzentration, reduzieren Dosierfrequenz.

MTT-Test untersuchte hemmende Effekte von freiem Ats und Ats-BSA-NPs in SMMC-7721 und Plc Zellen. Ergebnisse (Abb. 1d,e): Zytotoxizität freien Ats stieg mit Konzentration, Ats-BSA-NPs zeigten graduell erhöhte Zytotoxizität. Beides hemmte Tumorzellwachstum dosisabhängig. Im Vergleich zu freiem Ats zeigten Ats-BSA-NPs höhere Zytotoxizität und Sensitivität in beiden Zelllinien, größere Zellinhibition. Behandlung mit Ats-BSA-NPs verursachte signifikanten Rückgang der Zelllebensfähigkeit nach 24 h vs. freies Ats. IC50-Werte für SMMC-7721: 50,1 µg/mL (Ats-BSA-NPs) vs. 69,2 µg/mL (freies Ats); für Plc: 44,9 vs. 74,9 µg/mL. Dies deutet darauf hin, dass Ats in BSA-NPs seine intrazelluläre Lokalisation ändert und mehr Zellen tötet.

In vitro zelluläre Aufnahme von BSA-NPs

Intrazelluläre Verteilung und Lokalisation von BSA-NPs in beiden Tumorzelltypen per Konfokalmikroskopie (Abb. 2). Nach 3 h Ko-Kultur mit rhodamin B-markierten NPs war rote Fluoreszenz im Zytoplasma sichtbar; mit der Zeit wurden die meisten NPs internalisiert, diffundierten in Zytoplasma, zeigten zeitabhängig verstärkte rote Fluoreszenz. BSA-NPs im Zytoplasma kolokalisierten mit Mitochondrien (gelbe Fluoreszenz durch Überlagerung roter NP-Fluoreszenz und grüner MitoTracker-Fluoreszenz). Dies beweist, dass internalisierte BSA-NPs spezifisch in Mitochondrien anreichern, was die Möglichkeit zeigt, dass Ats über BSA-NPs in Mitochondrien geliefert werden kann.

Mitochondriales Membranpotenzial

Um zu klären, ob Ats-BSA-NPs die Mitochondrienfunktion durch Ats-Lieferung beeinträchtigen, wurde das Membranpotenzial bestimmt. Abb. 3: Nach JC-1-Färbung zeigten Mitochondrien in Zellen mit freiem Ats starke rote, schwache grüne Fluoreszenz – JC-1 mostly aggregiert, intakte Membran, hohes Potenzial. Im Gegensatz dazu zeigten Ats-BSA-NP-behandelte Zellen stärkere grüne Fluoreszenz – Mitochondrienmembran stark geschädigt, Potenzial signifikant gesunken. Zusammengefasst: Ats wurde erfolgreich über BSA-NPs in Mitochondrien geliefert, was Depolarisation der Mitochondrienmembran verursachte.

ROS-Messung und ER-Färbung

Weithin bestätigt: Hohe ROS-Mengen verursachen Phospholipidperoxidation in der inneren Mitochondrienmembran, senken Membranpotenzial, führen zu schneller Cytochrom-C-Freisetzung. DCFH-DA als fluoreszente Sonde zur ROS-Detektion. DCFH-DA passiert Zellmembran, wird durch Esterasen zu DCFH hydrolysiert. DCFH kann Membran nicht passieren, wird leicht in Zellen geladen. Intrazelluläres ROS oxidiert nicht-fluoreszierendes DCFH zu grün-fluoreszierendem DCF. DCF-Fluoreszenz detektiert intrazelluläres ROS-Level.

Bei Behandlung beider Zellen mit freiem Ats und Ats-BSA-NPs stieg intrazelluläres ROS zeitabhängig an. Im Vergleich zu freiem Ats war ROS-Generierung in SMMC-7721 und Plc Zellen mit Ats-BSA-NPs signifikant erhöht. Abb. 4a: ROS-Level in SMMC-7721 und Plc nach 48 h Ats-BSA-NPs erhöht um 1,53-fach bzw. 1,28-fach vs. freies Ats. Dies stützt, dass NPs intrazelluläre ROS-Produktion beschleunigen. Im Vergleich zu Kontrolle und freiem Ats war Fluoreszenzintensität von ER-Tracker Blue–White DPX nach Ats-BSA-NPs signifikant erhöht, was ER-Stress bei NP-behandelten Zellen bei entsprechend erhöhtem ROS-Level anzeigt. Dies unterstreicht: Ats wurde spezifisch in Mitochondrien über BSA-NPs lokalisiert, führte zu signifikantem Anstieg Sauerstofffreiradikale, löste ER-Stress aus und aktivierte mitochondrialen Apoptoseweg über Caspase-abhängige Zellapoptose.

Bewertung von Zellapoptose und Nekrose

Annexin V-FITC/PI-Färbung. Lebende Zellen binden weder Annexin V-FITC noch PI – keine Fluoreszenz. Apoptotische Zellen binden nicht PI, aber Annexin V-FITC – grüne Fluoreszenz. Onkotische Zellen: Membran geschädigt, Kern dilatiert, zerfällt – sowohl grüne als auch rote Fluoreszenz. Abb. 5a: Im Vergleich zu Kontrolle zeigten Zellen nach 24 h mit freiem Ats und Ats-NPs starke grüne und rote Fluoreszenz – beide induzierten Onkose und Apoptose. Besonders nach Ats-BSA-NPs waren Fluoreszenzintensitäten von Annexin V-FITC und PI signifikant erhöht – Onkose und Apoptose signifikant verstärkt.

Prozente (Abb. 5b): Bei freiem Ats stiegen onkotische Raten auf 24,4 % und 4,6 %, apoptotische Raten blieben bei 4,9 % und 7,1 % (SMMC-7721, Plc) – freies Ats löst Onkose und Apoptose aus. Ats-BSA-NPs verbesserten Apoptose- und Onkose-Raten signifikant: Apoptose auf 10,9 % (SMMC-7721) und 11,5 % (Plc); Onkose auf 29,0 % und 21,6 %. Dies zeigt: Mitochondriale Ats-Lieferung über BSA-NPs beschleunigt Tumorzelltod durch Verstärkung onkotischer und apoptotischer Effekte. Ats-BSA-NPs lösten apoptotische Signaltransduktion aus und förderten mitochondrien-vermittelte Kaskade.

Western Blot

Um Abhängigkeit des Zelltods von Apoptose durch freies Ats und Ats-NPs zu untersuchen, Western Blot für Apoptose-Proteine. In Ats-NP-behandelten SMMC-7721 Zellen war intrazellulärer Bax-Protein-Level signifikant erhöht (Abb. 6). Dies deutet darauf hin: Mit BSA-NPs reichert sich Ats in Mitochondrien an, verursacht Mitochondrienfunktionsstörung. Zytoplasmatisches Bax-Monomer translokiert in äußere Mitochondrienmembran, oligomerisiert, bildet Proteinkanäle, erhöht Membranpermeabilität. Cytochrom C im Zytoplasma signifikant erhöht, Caspase-3 und -9 Expression steigend. Durch höhere Mitochondrienpermeabilität wird Cytochrom C schnell ins Zytoplasma freigesetzt, aktiviert Caspasen, fördert Apoptose-Kaskade. Im Gegensatz dazu zeigte freies Ats keine signifikanten Unterschiede in Apoptose-Proteinen und Cytochrom C – freies Ats löst keine mitochondrien-vermittelte Apoptose aus, beruht primär auf Onkose. BSA-NPs steigern Arzneimittelanreicherung in Mitochondrien und aktivieren mitochondrien-vermittelte Apoptose, was zu signifikanter Apoptose und erhöhter Expression primärer Apoptose-Proteine führt.

Diskussion

Onkose und Apoptose sind zwei verschiedene Zelltodwege. Apoptose ist aktiver, programmierter Zelltod in Mehrzellern. Onkose beschreibt caspase-unabhängigen Zelltod, charakterisiert durch Schwellung, erhöhte Permeabilität, Membranruptur – oft als Nekrose bezeichnet, als zufällig und unkontrolliert angesehen. Unsere Untersuchung zeigte: Ats hemmte Tumorzellwachstum dosisabhängig. Ats beruhte primär auf Onkose und induzierte caspase-unabhängigen Zelltod. Im Gegensatz dazu wurden Ats-BSA-NPs internalisiert, schnell in Mitochondrien lokalisiert, um Ats freizusetzen. Ats in Mitochondrien generierte ROS, löste ER-Stress aus, aktivierte mitochondrien-vermittelten caspase-abhängigen Apoptoseweg durch Senkung des Membranpotenzials, Freisetzung von Cytochrom C, Förderung von Bax, cleaved Caspase-3 und -9 Expression. Zusammenfassend erhöhten Ats-BSA-NPs die mitochondriale Ats-Lieferung und verstärkten Onkose und Apoptose, steigerten Zytotoxizität und induzierten signifikanten Zelltod.

Schlussfolgerungen

Kurz: Freies Ats in Tumorzellen hing stark von Onkose ab, um Proliferation durch onkose-ähnlichen Tod zu hemmen; Zytotoxizität war begrenzt. Im Gegensatz dazu aktivierten Ats-BSA-NPs den mitochondrialen Apoptoseweg und lösten gleichzeitig onkotische Effekte aus; zusammen steigerten sie die synergistische antitumorale Wirksamkeit von Ats. Die Studie unterstreicht die Bedeutung von Ats-BSA-NPs zur Steigerung zytotoxischer und apoptotischer Effekte von Ats und die Rolle von BSA-NPs bei Diversifizierung der Zelltodwege. Im Vergleich zu freiem Ats induzierten Ats-BSA-NPs größere Zytotoxizität und signifikante Zellapoptose in Tumorzellen.