Nanopartikel-Zufuhr von Artesunat verbessert die Anti-Tumor-Effizienz durch Aktivierung der Mitochondrien-vermittelten Zell-Apoptose

Hintergrund

Artemisinin und seine Derivate werden aufgrund ihrer hohen Anti-Malaria-Aktivität und geringen Toxizität häufig bei der Behandlung von Malaria eingesetzt. Die Forscher fanden auch heraus, dass Artemisinin und seine Derivate aufgrund ihrer wenigen toxischen Nebenwirkungen und einer größeren Toleranz durch die Patienten eine signifikante Anti-Tumor-Aktivität zeigten [1]. Es wurde berichtet, dass Artesunat (Ats) definitiv das Wachstum von Tumorzellen hemmt und darüber hinaus signifikante Anti-Krebs-Wirkungen in Tumorzellen hervorruft [2,3,4]. Einige Experimente zeigten, dass Ats nach 48 h in Tumorzellen unterschiedliche Grade von Apoptose und Onkose verursachte und dass die Grade von Apoptose und Onkose von der Ats-Dosis abhingen. Bei niedrigen Konzentrationen induzierte Ats keine offensichtliche Apoptose in Tumorzellen und der Ats-induzierte Zelltod wurde von onkoseähnlichem Tod begleitet [5,6,7,8]. Um eine stärkere Antitumorwirkung zu erzielen, wurde eine höhere Dosierung von Ats verabreicht, was jedoch seine ernsthafte Toxizität und Knochenmarksuppression weiter bestätigte. Daher ist es notwendig, eine wirksame Behandlung zu finden, um die wirksame Dosierung von Ats zu reduzieren, um seine Anti-Tumor-Wirkung zu verbessern [9,10,11]. Es wurde festgestellt, dass die Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der Regulierung der apoptotischen und onkotischen Wirkungen von Ats spielten. Die Mitochondrien waren auch an der Regulierung des Transduktionsprozesses einer Vielzahl von apoptotischen Signalen beteiligt [12,13,14,15,16,17]. Wenn die Mitochondrien durch Medikamente angegriffen wurden, wurde ihre Permeabilität erhöht und das Membranpotential war verringert, was zu einer Endometriumschwellung der Mitochondrienmembran und einer schnellen Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien in das Cytoplasma führte [18,19,20]. Außerdem wurden einige Proteine ​​der Caspase-Familie aktiviert und die Kaskadenreaktion der Zellapoptose induziert.

Um die Antitumorwirkung von Ats zu verstärken, wurden viele neue Techniken versucht, um die Verteilung des Wirkstoffs in Tumorzellen zu erhöhen oder die gezielte Abgabe von Wirkstoffen in Zellorganellen zu verbessern, um den Zelltod zu induzieren [21,22,23]. Nanopartikel (NPs) als Schlüsselwerkzeug in der gezielten Krebsbehandlung wurden umfassend untersucht und haben ein vielversprechendes Potenzial gezeigt. Da NPs eine kleinere Partikelgröße und eine große Oberfläche aufwiesen, konnten sie über die Kapillaren in den Blutkreislauf gelangen und durch die Endothelzelllücke wandern und zum Tumorort wandern, wodurch eine gezielte Verteilung des Wirkstoffs erreicht und die Bioverfügbarkeit des Wirkstoffs erhöht wurde . Darüber hinaus könnten NPs die Freisetzung des Wirkstoffs durch den Abbau von Biomaterial in einem langen und gleichmäßigen Muster steuern, was letztendlich die Eliminationshalbwertszeit verlängert, die effektive Blutkonzentration verbessert und die Dosierungshäufigkeit verringert. Vor allem könnten wirkstoffbeladene NPs an bestimmte Stellen innerhalb der Zellen abgegeben werden, was die Behandlungswirksamkeit verbessert [24,25,26].

Um die Antitumorwirkung von Ats bei niedrigen Konzentrationen zu verstärken, haben wir versucht, neuartige Ats-beladene Rinderserumalbumin (BSA)-NPs zu entwickeln. Aufgrund des niedrigen pH-Wertes in den Tumorzellen, der Ansammlung einer großen Anzahl von Wasserstoffprotonen, die auf der äußeren Mitochondrienmembran oder im Intermembranraum vorhanden sind, ist die intermitochondriale Membran aufgrund ihrer chemischen Zusammensetzung und Mitochondrienmatrix dagegen reich an negativer Ladung Sekretion, die ein elektropositives äußeres und ein negatives inneres Transmembranpotential erzeugt, das eine begünstigende Abgabe von BSA bewirken kann. Dann könnte die massive Ansammlung von Ats in Mitochondrien effektiv die mitochondrienvermittelte Apoptose auslösen. Die Ergebnisse zeigten, dass Ats im Vergleich zum typischen onkotischen Tod durch freie Ats unter Vermittlung von BSA-NPs spezifisch in die Mitochondrien transferiert wurde und die Mitochondrien-vermittelte Aktivierung von Apoptose-assoziierten Caspase-Proteinen förderte. Dies entzündete eine signifikante Zellapoptose, wodurch die höhere Zytotoxizität hervorgehoben wurde.

Methoden

Materialien

BSA wurde von Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) bezogen und Ats wurde von Guilin Pharmaceutical Corporation (Guilin, Volksrepublik China) bezogen. SMMC-7721-Zellen und Plc-Zellen wurden vom Institut für Biochemie und Zellbiologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, Volksrepublik China) bezogen. Alle anderen gekauften Chemikalien waren von analytischer Qualität; sie wurden von verschiedenen Anbietern bezogen.

Vorbereitung und Charakterisierung von Ats-beladenen BSA-NPs

Gemäß der bereits veröffentlichten Literatur [27] wurden Ats-beladene BSA-NPs über eine Desolvatationsmethode hergestellt. Kurz gesagt, Ats-beladene BSA-NPs wurden hergestellt, indem schnell 1,0 ml wasserfreier Alkohol, der eine bestimmte Menge Ats enthielt, in 0,5 ml BSA-Lösung bei 37 °C bis zur Opaleszenz getropft wurde. Durch die Entfernung von Ethanol durch Rotationsverdampfung wurden Ats-beladene BSA-NPs weiter aus dem Medium ausgefällt und dann wurden 8 % Glutaraldehyd in Wasser (0,5 μL/mg BSA) zugegeben, um die Partikelvernetzung unter Rühren der Suspension über einen Zeitraum zu induzieren von 24 h. Schließlich wurden die NPs gesammelt und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen, um ihre physikalischen Charakterisierungen, einschließlich hydrodynamischer Durchmesser, Polydispersitätsindex (PDI), Zetapotential und Morphologie, mit einem Brookhaven Zetasizer (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, USA) weiter zu analysieren. und ein Transmissionselektronenmikroskop (JEM-1200EX; JEOL, Tokio, Japan). Die Bestimmung der Einkapselungseffizienz von Ats in BSA-NPs wurde unter Verwendung einer zuvor beschriebenen Methode geschätzt [27].

MTT-Assay

Zwei Arten von Tumorzelllinien, SMMC-7721-Zellen und Plc-Zellen, wurden getrennt mit 20 % fötalem Rinderserum (FBS) inkubiert. Die Zellwachstumsdichte wurde auf l × l0 ⁶ . eingestellt Zellen/ml durch Zellzahl, und dann wurden die Zellsuspensionen auf 1 × 10 ⁵ . verdünnt Zellen/ml. Die verdünnten Suspensionen wurden weiter separat in eine 96-Well-Platte (100 μl pro Well, etwa 1 × 10 ⁴ Zellen/Well) zur kontinuierlichen Inkubation für 24 h bei 37 °C unter Bedingungen von 5 % CO₂ und 95 % O₂ . Das Medium wurde in Gegenwart von entweder freien Ats oder Ats-beladenen BSA-NPs mit unterschiedlichen Ats-Konzentrationen durch serumfreies Medium ersetzt und anschließend 24 h inkubiert. Insgesamt wurden 50 μl 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (5 mg/ml) in jede Vertiefung gegeben und 4 h lang zur Beendigung der Kultur inkubiert. Als der Tetrazoliumfarbstoff MTT zu seinem unlöslichen Formazan reduziert wurde, wurden 96-Well-Platten bei 1000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde aus jedem Well dekantiert, gefolgt von der Zugabe von 150 μL Dimethylsulfoxid (DMSO), was vollständig löste die Kristalle auf. Die Extinktion der Lösung wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Syneray-2; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) bei 490 nm gemessen.

Intrazelluläre Verteilung der BSA-NP-Gruppe in Zellen

SMMC-7721-Zellen und Plc-Zellen in der logarithmischen Phase wurden selektiert und mit Trypsinverdau behandelt; die Zellkonzentration wurde auf l × l0 ⁶ . eingestellt Zellen/ml. Als nächstes wurden die kultivierten Zellen zur Adhärenz in eine 6-Well-Zellkulturplatte gegeben, und das Kulturmedium wurde entfernt, gefolgt von der Zugabe von Rhodamin B-markierten BSA-NPs. Der Zellkern wurde mit Hoechst (blau) für 15 min bei 37 °C gefärbt und die Mitochondrien wurden mit Mitotracker Green FM gefärbt. Die Position von BSA-NPs in Zellen wurde innerhalb der Zellen unter Verwendung von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (FluoView FV10i; Olympus Corporation, Tokio, Japan) verfolgt.

Änderung des mitochondrialen Membranpotenzials

JC-1 kann verwendet werden, um Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials zu bestimmen. Wenn das mitochondriale Membranpotential hoch war, konnte JC-1 die Zellmembran frei passieren und bildete Aggregate innerhalb der Mitochondrien, die eine rote Fluoreszenz zeigten (Anregungswellenlänge 525 nm; Emissionswellenlänge 590 nm); Wenn das mitochondriale Membranpotential verringert wurde, wurde JC-1 von der mitochondrialen Matrix in das Zellzytoplasma übertragen, um ein grün fluoreszierendes Monomer zu bilden (Anregungswellenlänge 490 nm; Emissionswellenlänge 530 nm). SMMC-7721-Zellen und Plc-Zellen wurden jeweils in konfokale Schalen ausgesät, um eine Dichte von l × l0 ⁶ . zu erreichen Zellen/ml für kontinuierliche Inkubation für 12 h. Als nächstes wurde das Kulturmedium verworfen und serumfreies Kulturmedium, das die Dispersion von Ats oder Ats-beladenen BSA-NPs enthielt, wurde in die Schale gegeben. Nach 9 h wurde das Medium verworfen und die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 2 ml JC-1 in einer Konzentration von 2 μmol/l; die Zellen wurden dann 30 min bei 37 °C unter dunklen Bedingungen inkubiert. Ein konfokales Laserscanning-Mikroskop (FluoView FV10i; Olympus Corporation) wurde verwendet, um die bildgebenden Veränderungen in der Mitochondrienmembran zu beobachten.

ROS-Produktionsmessung und Färbung des Endoplasmatischen Retikulums (ER)

Die Zellen wurden mit 20 % FBS inkubiert und die Zellwachstumsdichte wurde auf 1 × 10 ⁶ . eingestellt Zellen/ml nach Zellzahl; und dann wurden die Zellsuspensionen auf l × l0 ⁵ . verdünnt Zellen/ml. Die verdünnten Suspensionen wurden weiter in 96-Well-Platten (100 μl pro Well, etwa 1 × 10 ⁴ .) gegeben Zellen/Well) zur kontinuierlichen Inkubation für 24 h bei 37 °C unter 5 % CO₂ und 95 % O₂ . Zweitens wurden freies Ats und Ats-beladene BSA-NPs mit den Zellen für 6, 12 und 24 h inkubiert, gefolgt von einer kontinuierlichen Inkubation mit 10 μM 2,7-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA; Sigma-Aldrich Co.) für etwa 30 Minuten Eiskalter PBS-Puffer wurde verwendet, um die Zellen dreimal zu waschen, um die nicht internalisierten NPs zu entfernen. Die intrazelluläre DCF-Fluoreszenzintensität, die bei 485 nm angeregt und bei 530 nm emittiert wird, wurde mit einem Mikroplatten-Reader (Synergy-2; BioTek Instruments) erfasst, um das Ausmaß des oxidativen Stresses zu untersuchen. Die Testgruppen wurden 24 h mit SMMC-7721-Zellen und Plc-Zellen behandelt, und die ER-Tracker Blue-White DPX-Sonde (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) wurde zur Inkubation für 30 Minuten in die Zellen gegeben. Nach Verwerfen der Beladungslösung und Waschen der Zellen mit PBS wurde die Morphologieänderung des ER durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie beobachtet.

Zell-Onkose- und Apoptose-Bewertung durch Durchflusszytometrie

Gemäß dem Protokoll unserer vorherigen Studie [28] wurde ein Annexin V-Fluoresceinisothiocyanat (FITC)/Propidiumiodid (PI)-Färbungsassay verwendet, um die durch freie Ats und Ats-beladene BSA-NPs induzierte Zellonkose und Apoptose zu bewerten. Die Zellen wurden mit Typsin lysiert und in einer Konzentration von l × l0 ⁶ . in Sechs-Well-Platten ausgesät Zellen/ml für 24 h kontinuierliche Inkubation. Als nächstes wurde das Kulturmedium entfernt und Serum-freies Medium, das freie Ats und Ats-beladene BSA-NPs enthielt, wurde in die Vertiefungen gegeben. Nach der Behandlung wurden die Zellen gesammelt und in Nicoletti-Puffer (Beijing 4A Biotech Co., Ltd., Peking, Volksrepublik China) mit PI- und FITC-markiertem Annexin V (AV-FITC) suspendiert. Die morphologische Veränderung der Zellen wurde durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie beobachtet. Um die von den Ats-beladenen NPs induzierten Zellapoptose- und Onkoseraten zu überprüfen, wurden die Prozentsätze der frühen apoptotischen (Q4), onkotischen (Q2), nekrotischen (Q1) und lebenden Zellen (Q3) durch Durchflusszytometrie quantifiziert.

Western Blot-Analyse von Apoptose-bezogenen Proteinen und Cytochrom C in Zellen

Ein Western-Blot-Assay wurde durchgeführt, um die relativen Proteinspiegel zu bestimmen, wenn freie Ats oder Ats-beladene NPs mit SMMC-7721-Zellen für 24 Stunden inkubiert wurden. Die Zellen wurden mit eiskaltem Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA)-Puffer lysiert, der einen Protease-Inhibitor-Cocktail und Phosphatase-Inhibitoren (Roche, Basel, Schweiz) enthielt. Die Proteinkonzentrationen wurden mit einem modifizierten BSA-Assay-Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bestimmt und vor dem Laden auf 10 % Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) normalisiert. Die Konzentrationen der Zielproteine ​​wurden fotografiert und unter Verwendung eines UVP-Gelanalysesystems (iBox Scientia 600; UVP, LLC., Upland, CA, USA) analysiert.

Ergebnisse

Eigenschaften von Ats-beladenen BSA-NPs und zelluläre Lebensfähigkeitsstudie

In Abb. 1a, b wurde beobachtet, dass Ats-beladene BSA-NPs eine Kugelform aufwiesen und mit einem niedrigeren PDI von 0,016 homogen dispergiert waren. Die durchschnittliche Partikelgröße von Ats-beladenen BSA-NPs betrug etwa 99,9 ± 2,3 nm und das Zetapotential war negativ und lag bei etwa –25,6 ± 4,3 mV. Das Freisetzungsprofil zeigte eine glatte und anhaltende Freisetzung, die in Abb. 1c gezeigt ist. Verglichen mit der schnellen Freisetzung von freiem At im Medium in vitro wurde im Kern von BSA-NPs eingeschlossenes Ats langsam aus dem Inneren der NPs in das Medium diffundiert und zeigte aufgrund des kontinuierlichen Abbaus von BSA ein glattes und anhaltendes Freisetzungsmuster. Mehr als 85 % der freien Ats wurden innerhalb der ersten 6 Stunden vollständig freigesetzt, während die kumulative Gesamtmenge des von den NPs in die Medien freigesetzten Arzneimittels innerhalb von 48 Stunden 78,9 % betrug. Dies deutete darauf hin, dass NPs die Freisetzung des Arzneimittels über den Abbau von Biomaterialien in einem langen und gleichmäßigen Muster steuern könnten, wodurch die Eliminationshalbwertszeit verlängert, die effektive Blutkonzentration verbessert und die Dosierungshäufigkeit verringert wird.

Charakterisierung von Ats-beladenen BSA-NPs. a TEM-Bild von Ats-beladenen BSA-NPs. b Dynamische Lichtstreuung (DLS)-Analyse der erhaltenen Ats-beladenen BSA-NPs. c Das In-vitro-Freisetzungsprofil von Ats-beladenen BSA-NPs in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 bei 37 °C für 48 Stunden. Lebensfähigkeit von SMMC-7721-Zellen (d ) und Plc-Zellen (e ) nach Inkubation mit unterschiedlichen Mengen an freien Ats und Ats-beladenen BSA-NPs für 24 h. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3). ^# P < 0,05 im Vergleich zu den entsprechenden kostenlosen Ats

MTT wurde verwendet, um die hemmenden Wirkungen von freien Ats und Ats-beladenen BSA-NPs in SMMC-7721-Zellen und Plc-Zellen in verschiedenen Zeitintervallen zu untersuchen. Die Ergebnisse (Abb. 1d, e) zeigten, dass die Zytotoxizität von freien Ats mit steigender Wirkstoffkonzentration zunahm, und Ats-beladene BSA-NPs zeigten eine allmählich erhöhte Zytotoxizität. Dies bewies, dass Ats und Ats-beladene BSA-NPs das Wachstum von Tumorzellen hemmten und dass das Hemmungsverhältnis von der Ats-Dosis abhängig war. Im Vergleich zu freien Ats zeigten Ats-beladene BSA-NPs eine höhere Zytotoxizität und eine höhere Sensitivität in beiden Zellen und führten zu einer stärkeren Zellhemmung. Wie in Abb. 1d, e gezeigt, verursachte die Behandlung beider Zellen mit Ats-beladenen BSA-NPs eine signifikante Abnahme der Zelllebensfähigkeit nach 24 Stunden im Vergleich zu der von freien Ats. Die Werte der maximalen Hemmkonzentration (IC50) von 50 % für die mit Ats-beladenen BSA-NPs behandelten SMMC-7721-Zellen und Plc-Zellen betrugen 50,1 bzw. 44,9 μg/ml nach 24 Stunden, was mit den erhaltenen Werten von 69,2 und 74,9  verglichen wird μg/ml bei 24 h in Zellen, die mit freien Ats behandelt wurden. Dies deutete darauf hin, dass Ats, wenn es in BSA-NPs geladen wurde, seine intrazelluläre Position ändern könnte, wie durch die NPs vermittelt, und letztendlich mehr Zellen tötete.

In-vitro-zelluläre Aufnahme von BSA-NPs

Die intrazelluläre Verteilung und Lage von BSA-NPs in beiden Arten von Tumorzellen wurde durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie beobachtet, wie in Abb. 2 gezeigt. Nachdem Rhodamin B-markierte NPs 3 h lang mit Zellen cokultiviert wurden, war deutlich rote Fluoreszenz zu sehen im Zytoplasma; Im Laufe der Zeit wurde die Mehrheit der BSA-NPs intrazellulär internalisiert und in das Zytoplasma diffundiert, wobei sie eine verstärkte zeitabhängige rote Fluoreszenz zeigten. Es wurde auch beobachtet, dass im Zytoplasma lokalisierte BSA-NPs zusammen mit den Mitochondrien lokalisiert waren, was durch das Auftreten einer gelben Fluoreszenz deutlich wird, die darauf hindeutete, dass die inhärente rote Fluoreszenz von Rhodamin B-markierten NPs und die grüne Fluoreszenz, die von der mitochondriale Indikator MitoTracker® green FM wurde zusammengelegt. Dies bewies, dass die internalisierten BSA-NPs spezifisch in den Mitochondrien akkumuliert werden können, was die Möglichkeit unterstreicht, dass Ats mit der Vermittlung von BSA-NPs an die Mitochondrien abgegeben werden könnte.

Die in vitro zelluläre Verteilung von BSA-NPs nach Inkubation mit verschiedenen Tumorzellen. Fluoreszenzbild von SMMC-7721-Zellen (a ) und Plc-Zellen (b ). Skalierungsleiste , 100 μm

Mitochondriale Membranpotentialanalyse

Um zu klären, ob Ats-beladene BSA-NPs die mitochondriale Funktion nach der Abgabe von Ats in die Mitochondrien störten, wurden Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials bestimmt. Abbildung 3 zeigte, dass nach der JC-1-Färbung die Mehrheit der Mitochondrien in Tumorzellen, die mit freien Ats behandelt wurden, eine starke rote Fluoreszenz und eine schwache grüne Fluoreszenzintensität aufwiesen. Dies deutete darauf hin, dass die Mehrheit von JC-1 in einem aggregierten Zustand existierte, was die Integrität der mitochondrialen Membran und ein höheres Potenzial verstärkte. Im Gegensatz dazu, wenn JC-1 die mit Ats beladenen BSA-NPs-behandelten Zellen färbte, zeigten die Mitochondrien in beiden Tumorzellen eine stärkere grüne Fluoreszenz, was darauf hindeutet, dass die Mitochondrienmembran ernsthaft geschädigt und ihr Potenzial signifikant verringert war. Zusammenfassend bewies es, dass Ats mit der Vermittlung von BSA-NPs erfolgreich an die Mitochondrien abgegeben wurde, was zu einer Depolarisation der mitochondrialen Membran führte.

Bildgebende Veränderung des mitochondrialen Membranpotentials nach Inkubation von freien Ats und Ats-beladenen BSA-NPs mit SMMC-7721-Zellen und Plc-Zellen. Skalierungsleiste , 100 μm

ROS-Produktionsmessung und Färbung der Notaufnahme

Es wurde allgemein bestätigt, dass die Bildung einer großen Anzahl von ROS eine Phospholipidperoxidation in der inneren mitochondrialen Membran verursachen kann und dass sie auch eine Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials induzieren kann, was zu einer schnellen Freisetzung von Cytochrom C führt. Wir verwendeten DCFH- DA als Fluoreszenzsonde zum Nachweis der ROS-Änderung. DCFH-DA trat frei durch die Zellmembran in die Zelle ein und wurde durch Esterasehydrolyse in DCFH umgewandelt. Das erzeugte DCFH kann die Zellmembran nicht passieren und kann leicht in die Zellen geladen werden. Intrazelluläres ROS oxidierte nicht fluoreszierendes DCFH zu DCF mit einer grün fluoreszierenden Farbe. Daher kann der DCF-Fluoreszenznachweis den intrazellulären ROS-Spiegel anzeigen.

Wenn beide Zellen über einen bestimmten Zeitraum mit freien Ats und Ats-beladenen BSA-NPs behandelt wurden, war auch die Menge an intrazellulärem ROS erhöht, was eine zeitabhängige Beziehung zeigte. Im Vergleich zu freien Ats war die Erzeugung von ROS in SMMC-7721-Zellen und Plc-Zellen, die mit Ats-beladenen BSA-NPs behandelt wurden, signifikant erhöht. Die Abbildungen 4a zeigten, dass die ROS-Spiegel in SMMC-7721-Zellen und Plc-Zellen, die 48 h lang Ats-beladenen BSA-NPs ausgesetzt waren, im Vergleich zu behandelten SMMC-7721-Zellen und Plc-Zellen auf das 1,53-Fache bzw. das 1,28-Fache erhöht waren mit kostenlosen Ats. Dies unterstützte die Idee, dass die NPs die Produktion von intrazellulären ROS beschleunigten. Im Vergleich zur Kontrollgruppe und freien Ats und nach Behandlung mit Ats-beladenen BSA-NPs war die Fluoreszenz-Färbungsintensität des ER-Tracker Blue-White DPX als ER-spezifischer Farbstoff signifikant erhöht, was darauf hindeutet, dass auch ER-Stress ausgelöst wurde in den Ats-beladenen NPs-behandelten Zellen mit einem entsprechenden Anstieg des ROS-Spiegels. Dieser Befund zeigte, dass Ats spezifisch in den Mitochondrien lokalisiert war, vermittelt durch BSA-NPs; Dies führte zu einem signifikanten Anstieg des Gehalts an sauerstofffreien Radikalen in den Zellen, wodurch die Induktion von ER-Stress ausgelöst und der mitochondriale Signalweg aktiviert wurde, um eine Caspase-abhängige zelluläre Apoptose zu induzieren.

Quantifizierung der ROS-Erzeugung in Zellen, die zu verschiedenen Zeiten mit freien Ats und Ats-beladenen BSA-NPs behandelt wurden (a ). ER-Färbung mit der ER-Tracker Blue-White DPX-Sonde (b ). Skalierungsleiste , 100 μm. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3). ⁺ P < 0,05 gegenüber der Kontrollgruppe um 12 Uhr, *P < 0,05 gegenüber der Kontrollgruppe um 24 Stunden, ^# P < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe um 24 Stunden

Bewertung von Zell-Apoptose und -Nekrose

Die Zellen wurden mit einem Annexin V-FITC/PI-Färbeassay behandelt. Lebende Zellen banden nicht an Annexin V-FITC/PI, daher trat keine Fluoreszenz auf. Apoptotische Zellen banden nicht an PI, aber sie wurden mit Annexin V-FITC gefärbt, was eine grüne Fluoreszenz ergab. Im Gegensatz dazu wurden die Zellmembranen der onkotischen Zellen bis zu einem gewissen Grad geschädigt und die Zellkerne wurden erweitert, um in Stücke zu zerfallen, wodurch sowohl grüne als auch rote Fluoreszenz gezeigt wurde. Wie in Abb. 5a gezeigt, wurden im Vergleich zur Kontrollgruppe, wenn freie Ats- und Ats-beladene NPs mit Zellen für 24 h inkubiert wurden, starke grüne und rote Fluoreszenz in den Zellen beobachtet, was darauf hinweist, dass freie Ats- und Ats-beladene BSA-NPs induzierte Tumorzellonkose und Apoptose. Insbesondere nach der Behandlung mit Ats-beladenen BSA-NPs waren die Fluoreszenzintensitäten von Annexin V-FITC und PI signifikant erhöht, was darauf hindeutet, dass die Grade der Onkose und Apoptose in den mit Ats-beladenen NPs behandelten Zellen signifikant erhöht waren.

Morphologie der ultrastrukturellen Veränderungen von Zellen, die mit freien Ats und Ats-beladenen BSA-NPs unter Verwendung des Annexin V-FITC/PI-Färbeassays behandelt wurden (a ). Skalierungsleiste , 100 μm. Durchflusszytometer-Analyse der zellulären Apoptose und Onkose nach 24 Stunden Inkubation mit den freien Ats- bzw. Ats-beladenen BSA-NPs (b )

Die Prozentsätze der frühen apoptotischen (Q4), onkotischen (Q2), nekrotischen (Q1) und lebenden Zellen (Q3) wurden in Abb. 5b gezeigt. Dieser Befund zeigte, dass bei Behandlung der Zellen mit freien Ats die onkotischen Raten allmählich auf 24,4 bzw. 4,6 % angestiegen waren und die Apoptoserate in SMMC-7721-Zellen bzw das Auftreten von Onkose und Apoptose zum Zelltod führen. Im Gegenteil, Ats-beladene BSA-NPs verbesserten die Rate der Zellapoptose und -onkose signifikant. Die apoptotischen Verhältnisse waren signifikant erhöht auf 10,9% in SMMC-7721-Zellen und auf 11,5% in Plc-Zellen. Die onkotischen Verhältnisse wurden in SMMC-7721-Zellen auf 29,0 % und in Plc-Zellen auf 21,6 % erhöht. Dies deutete darauf hin, dass die mitochondriale Abgabe von Ats unter Vermittlung von BSA-NPs den Tod von Tumorzellen beschleunigte, indem sie die onkotischen und apoptotischen Wirkungen verstärkte. Ats-beladene BSA-NPs lösten den apoptotischen Signaltransduktionsprozess aus und förderten die mitochondrial vermittelte Kaskadenreaktion der zellulären Apoptose.

Western Blot-Analyse

Um die Abhängigkeit des Zelltods von der durch freie Ats und Ats-beladene NPs induzierten Apoptose zu untersuchen, wurde ein Western-Blot-Assay durchgeführt, um die Expression von Apoptoseproteinen nachzuweisen. Es wurde festgestellt, dass in Ats-beladenen NPs-behandelten SMMC-7721-Zellen das intrazelluläre Expressionsniveau des Bax-Proteins signifikant erhöht war (Abb. 6). Dieser Befund deutete darauf hin, dass mit Hilfe von BSA-NPs Ats in den Mitochondrien akkumuliert wurde und eine mitochondriale Dysfunktion verursachte. Das zytoplasmatische Bax-Monomerprotein wurde auf die äußere Membran der Mitochondrien übertragen und durchlief eine Oligomerisierung, wodurch ein Proteinkanal in der äußeren Membran der Mitochondrien gebildet wurde, was zu einer weiteren Erhöhung der Membranpermeabilität führte. Der Expressionsspiegel von Cytochrom C im Cytoplasma war ebenfalls besonders und signifikant erhöht, und die Expressionen von Caspase-3 und Caspase-9 zeigten einen Aufwärtstrend. Aufgrund der höheren Membrandurchlässigkeit der Mitochondrien wurde Cytochrom C daher schnell in das Zytoplasma freigesetzt, wodurch Zelltod-Signalproteine ​​(Caspasen) aktiviert und die Kaskadenreaktion der zellulären Apoptose gefördert wird. Im Gegensatz dazu hatten freie Ats keinen signifikanten Unterschied in der Expression von Apoptose-verwandten Proteinen und Cytochrom C, was darauf hindeutet, dass freie Ats keine Mitochondrien-vermittelte Zellapoptose auslösten und hauptsächlich auf Onkose beruhten, um zum Zelltod zu führen. BSA-NPs verstärkten die Akkumulation des Arzneimittels in den Mitochondrien und aktivierten mitochondrial vermittelte apoptotische Effekte, was zu einer signifikanten Apoptose und einer erhöhten Expression der primären Apoptose-relevanten Proteine ​​führte, wie in unseren Western-Blot-Analysen gezeigt.

Western-Blot-Analysen der Expressionsniveaus von gespaltener Caspase-3, Caspase-9, Bax und Cytochrom C in SMMC-7721-Zellen. *P <0,05 gegenüber der Bax-Proteinexpression der Kontrollgruppe; ^# P <0,05 gegenüber der gespaltenen Caspase-3-Expression der Kontrollgruppe; ⁺ P <  0,05 gegenüber der Caspase-9-Proteinexpression der Kontrollgruppe; ^x P <  0,05 gegenüber der Cytochrom-C-Proteinexpression der Kontrollgruppe. Die Daten wurden als mittlere  ± SD (n = 3)

Diskussion

Onkose und Apoptose repräsentieren die zwei verschiedenen Arten, auf denen Zellen sterben. Apoptose ist ein aktiver Prozess des programmierten Zelltods, der in vielzelligen Organismen auftritt. Onkose hingegen beschreibt einen Caspase-unabhängigen Zelltod, der durch Schwellung, erhöhte Permeabilität und Membranruptur gekennzeichnet ist, die oft als Nekrose bezeichnet wird. Es wird angenommen, dass diese Form des Zelltods zufällig und unkontrolliert ist. Basierend auf unseren Untersuchungen fanden wir, dass Ats das Wachstum von Tumorzellen hemmte und dass das Hemmungsverhältnis von der Ats-Dosis abhängig war. Ats hing in erster Linie vom Grad der Onkose ab und führte zum Zelltod; es aktivierte auch den Caspase-unabhängigen Zelltod in Form von Onkose. Umgekehrt und unabhängig vom Auftreten eines offensichtlichen onkoseähnlichen Todes wurden bei der Behandlung von Tumorzellen mit Ats-beladenen BSA-NPs Ats-beladene BSA-NPs in das Zytoplasma internalisiert und wurden schnell in den Mitochondrien lokalisiert, um Ats freizusetzen, vermittelt durch die NPs. Ats in den Mitochondrien erzeugte ROS und löste ER-Stress aus; es aktivierte den mitochondrienvermittelten Caspase-abhängigen Zellapoptoseweg weiter, indem es das mitochondriale Membranpotential reduzierte, Cytochrom C freisetzte und die Proteinexpressionen von Bax, gespaltener Caspase 3 und Caspase 9 förderte. Zusammengenommen erhöhten Ats-beladene BSA-NPs die mitochondriale Abgabe von Ats und erhöhte den Grad der Onkose und Apoptose, um den Zelltod zu induzieren, wodurch die Zytotoxizität des Arzneimittels erhöht und ein signifikanter Zelltod induziert wurde.

Schlussfolgerungen

Kurz gesagt stellten wir klar, dass freies Ats in den Tumorzellen stark vom Grad der Onkose abhängig war, um die Proliferation von Tumorzellen in Form eines onkoseähnlichen Todes zu hemmen; daher war die Zytotoxizität des Arzneimittels begrenzt und unerwünscht. Im Gegensatz dazu aktivierten Ats-beladene BSA-NPs den mitochondrialen apoptotischen Signalweg und lösten gleichzeitig onkotische Effekte aus; zusammen verbesserten sie die synergistische Anti-Tumor-Wirksamkeit von Ats. The results of this study highlighted the significance of Ats-loaded BSA NPs in the enhancement of the cytotoxic and apoptotic effects of Ats, and they further signify the role of BSA NPs in diversifying the pathways of cell death induced by Ats. Compared with free Ats, Ats-loaded BSA NPs induced greater cytotoxicity and significant cell apoptosis effects in tumor cells.