Biokompatible Chitosan-Nanobläschen für die ultraschallvermittelte gezielte Abgabe von Doxorubicin

Hintergrund

Die Chemotherapie wird derzeit als primäre Behandlungsmethode für bösartige Neoplasien eingesetzt und verbessert die Überlebensrate von Krebspatienten erheblich. Dennoch wird die Wirksamkeit von Chemotherapeutika durch unerwünschte Nebenwirkungen wie systemische Toxizität eingeschränkt [1]. Die lokale Verabreichung von Chemotherapeutika kann ihre Toxizität verringern, indem ihre therapeutische Dosis an den Zielorten erhöht und die Plasmaspiegel der zirkulierenden Arzneimittel verringert werden. Aufgrund ihrer Nicht-Invasivität und Zielgerichtetheit wird die ultraschallgezielte Nano-/Mikrobläschenzerstörung (UTN/MD) häufig als wirksames System zur Wirkstoffabgabe eingesetzt.

Im Vergleich zu herkömmlichen Mikrobläschen können Nanopartikel die Kapillarwand leichter passieren und somit effizienter an die Zielstelle abgegeben werden. NBs wurden in der Studie zur gezielten Therapie verwendet, wie zum Beispiel 5-Fluorouracil-beladene NBs, die für den Einsatz beim hepatozellulären Karzinom getestet wurden [2]. Shen et al. haben kürzlich ultraschallvermittelte NBs verwendet, um Resveratrol an Nucleus pulposus-Zellen zu liefern [3], und NBs wurden auch bei der Behandlung von Brustkrebs eingesetzt [4].

Die in UTN/MD verwendeten Nanoblasen (NBs) bestehen normalerweise aus einem Gaskern und einer stabilisierten Hülle. Lipide, Tenside, Polymere oder andere Materialien werden in der Zusammensetzung der Hülle verwendet. In früheren Studien wurden verschiedene Arten von NBs hergestellt. Viele der Chemikalien, die zur Bildung von NBs oder Nanopartikeln verwendet werden, stellen jedoch eine potenzielle Bedrohung für den menschlichen Körper dar. Folglich hat der Transport einiger Nanopartikel eine unbefriedigende therapeutische Wirksamkeit und Toxizität in normalen Geweben und Zellen gebracht [5]. Chemische Wirkstoffe wie Tween 80 und Glutaraldehyd haben eine hohe Toxizität und bergen mutagene Risiken, wodurch ihre klinische Anwendung eingeschränkt wird [6, 7]. PLA, ein weiteres Material, das in NBs verwendet wird, kann in einigen Fällen klinische Nebenwirkungen haben [8]. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, die Biokompatibilität und Sicherheit der zum Zusammenbau von NBs verwendeten Materialien zu berücksichtigen.

Das Polysaccharid Chitosan hat aufgrund seines natürlichen Ursprungs, seiner biologischen Abbaubarkeit, seiner Biokompatibilität, seiner außergewöhnlich geringen Immunogenität, seiner antibakteriellen Aktivität und seiner praktischen Anwendbarkeit Aufmerksamkeit auf sich gezogen [9, 10]. Chitosan ist das N-deacetylierte Derivat von Chitin, das eines der am häufigsten vorkommenden biologischen Materialien auf der Erde ist [11]. Darüber hinaus zeigte eine frühere Studie, dass wasserlösliche Chitosan-Oligomere in Gegenwart von IFN-γ Makrophagen aktivieren können, um Krebszellen abzutöten [12]. Daher hat Chitosan selbst sowohl direkte als auch indirekte Antitumorwirkungen, was es als Träger für Krebsmedikamente besser geeignet macht. Die anderen Materialien, die wir in unseren NBs verwendet haben, waren Lecithin und Palmitinsäure, die ausgezeichnete Kandidaten für die Verwendung in NBs sind [13]. Palmitinsäure ist eine der am häufigsten vorkommenden gesättigten 14-, 16- und 18-Kohlenstoff-Fettsäuren und wird normalerweise durch Acetyl-CoA synthetisiert und besitzt eine geringe Toxizität und eine hohe Biokompatibilität [14]. Lecithin ist ein natives Tensid, das hauptsächlich aus Sojabohnen gewonnen wird [15]. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass Sojalecithin aufgrund seiner hypocholesterinämischen Eigenschaften gesundheitliche Vorteile hat. Sojalecithin ist beispielsweise hilfreich bei der Verringerung des Risikos von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, während gereinigtes Soja zur Einkapselung von Nisin verwendet werden könnte [16, 17]. In dieser Studie haben wir die oben genannten Materialien verwendet, um biokompatible NBs herzustellen. Mit Hilfe von Ultraschall zur Abgabe wurde Doxorubicinhydrochlorid (DOX) als Modellarzneimittel verwendet, um die Arzneistoffbeladungskapazität der neuartigen biogenen Chitosan-NBs zu testen, die vor der Evaluierung in der humanen Michigan Cancer Foundation-7 (MCF- 7) Brustkrebszellen. Darüber hinaus wurden die Antitumorwirkungen von DOX-NBs auch nach UTN/MD bewertet.

Materialien und Methoden

Materialien

Die in dieser Studie beschriebenen NBs wurden unter Verwendung von Perfluorpropan (C3F8, R&D Center for Specialty Gases at the Research Institute of Physical and Chemical Engineering of Nuclear Industry, Peking, China) als Kern und einer Chitosanbeschichtung als Hülle konstruiert. Außerdem Epikuron 200 (Sojalecithin mit 95% Dipalmitoylphosphatidylcholin, Lukas Meyer, Hamburg, Deutschland), Ethanol (analytisch, Hushi, China), Doxorubicinhydrochlorid (Sigma-Aldrich, Missouri, USA), Chitosan (100~300 kD , Bozhihuili, Qingdao, China) und Palmitinsäure (JINDU, Shanghai, China) wurden ebenfalls in dieser Studie verwendet. Pluronic F68 wurde von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen.

Zelllinie

Die humane MCF-7-Brustkarzinom-Zelllinie wurde von der American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) erhalten und in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) (Gibco, Carlsbad) kultiviert , CA, USA). Die Zellen wurden bei 37 °C, 5% CO₂ . kultiviert , und 95 % Luftfeuchtigkeit. Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden für Experimente geerntet.

Vorbereitung von DOX-beladenen Chitosan-NBs

Wir haben NBs nach zuvor beschriebenen Methoden hergestellt [18, 19]. Für die Hüllen der DOX-NBs wurde Chitosan mit mittlerem Molekulargewicht (100~300 kD) verwendet, und Perfluorpropan wurde für den Kern verwendet. Um die DOX-Chitosan-Lösung herzustellen, wurde die geeignete Dosis von DOX in Reinstwasser gelöst und 2 ml DOX-Lösung (1 mg/ml) wurden zu der Chitosan-Wasserlösung durch Mischen mit einem Vortex-Mischer für 5 Sekunden zugegeben. Die DOX-Chitosan-Lösung wurde 1 h bei 65 °C inkubiert. Getrennt davon wurde eine Epikuron 200 enthaltende Ethanollösung zu einer wässrigen Palmitinsäurelösung gegeben. Nach Zugabe des entsprechenden Volumens an Reinstwasser wurde das Palmitinsäure-Epikuron 200-System unter Verwendung eines Vortex-Mischers homogenisiert. Anschließend wurde das Palmitinsäure-Epikuron 200-System in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen (EP-Röhrchen) aufgeteilt und die Luft im Röhrchen mit einer 10-ml-Spritze mit langer feiner Nadel durch Perfluorpropan ersetzt. Jedes Rohr wurde 120 s lang in einem mechanischen Oszillator (Ag- und Hg-Mischer, Xi’an, China) in Schwingung versetzt. Als nächstes wurde die gesamte Flüssigkeit in den 1,5-ml-EP-Röhrchen in ein Zentrifugenröhrchen gegossen und mit der DOX-Chitosan-Lösung in einem Eisbad kombiniert. Anschließend wurde die Mischung für 30 min bei – 4 °C inkubiert. Als nächstes wird eine wässrige Lösung von Pluronic F68 (0,01%, w /w ), ein Stabilisierungsmittel, wurde der obigen Mischung unter Rühren zugesetzt. Anschließend wurde ein Dialysereinigungsschritt (Ultrafiltrationszentrifugenröhrchen, Millipore, 30 kDa) durchgeführt, um jegliches restliches freies DOX zu entfernen.

Beobachtung der physikalischen Eigenschaften der NBs

Die Suspension von DOX-NBs wurde durch Zugabe einer geeigneten Menge PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) verdünnt. Die Form der DOX-NBs wurde dann beobachtet und unter einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einer x 100 Ölimmersionsobjektivlinse (OLYMPUS BX41, Olympus Corporation, Japan) ausgestattet war, abgebildet. Die Fluoreszenzbilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon TE2000-S, Japan) ausgewertet. Die Morphologie der DOX-NBs wurde auch durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (JEOL, Tokio, Japan) beobachtet. Die wässrigen Suspensionen der verdünnten Nanobläschen wurden auf ein mit Formvar beschichtetes Kupfergitter gesprüht und mit 4% w . gefärbt /v Uranylacetat für 10 min. Dann wurden die Proben mit TEM visualisiert und abgebildet. Die Größe und das Oberflächen-Zeta-Potential der DOX-NBs wurden mit einem Delsa Nano C-Partikelgrößen- und Zeta-Potential-Analysator (Beckmann Instruments, USA) gemessen. Alle Messungen wurden dreifach durchgeführt, um den Mittelwert zu berechnen.

Stabilität von DOX-NBs

Die Größe und Morphologie von DOX-NBs wurden im Laufe der Zeit gemessen, um die Stabilität dieser Nanobläschen zu beobachten. Einige Teile der DOX-NBs wurden im Kühlschrank bei 4 °C für 24 oder 48 Stunden gelagert. Die anderen wurden 6 h bei Raumtemperatur gehalten. Die Stabilität von Nanobläschen bei 25 °C wurde auch in lyophilisiertem Humanserum (Seronorm™ Human, Norwegen) untersucht. Zu diesem Zweck wurde 1 ml der wässrigen DOX-NBs-Suspension zu 1 ml des Serums gegeben und 6 h bei 25 °C inkubiert. Dann wurden alle DOX-NBs durch Morphologieanalyse unter Verwendung optischer Mikroskopie gemessen, um die Integrität ihrer Strukturen zu bewerten. Die Größe der NBs wurde mit einem Delsa Nano C Partikelgrößen- und Zetapotential-Analysator (Beckmann Instruments, USA) gemessen.

Bestimmung der DOX-Belastbarkeit von NBs

Eine Standardkurve der DOX-Konzentration wurde unter Verwendung von seriellen DOX-Verdünnungen bei Konzentrationen von 0,025, 0,05, 0,1 und 0,2 µg/ml erstellt und unter Verwendung eines UV-Spektrophotometers (UV-2450, SHIMADZU) gemessen. Anschließend wurde die DOX-Beladungseffizienz bei 480  nm unter Verwendung von leeren NBs als Kontrolle bewertet, und die DOX-Konzentration in DOX-NBs wurde basierend auf der oben erstellten Standardkurve berechnet. Um den Photoabbau von DOX während des Reinigungs- und Messvorgangs zu vermeiden, wurden alle Verfahren lichtgeschützt durchgeführt. Anschließend wurde die Suspension von DOX-NBs 1,5  Tage lang mit einem Gefriertrockner bei − 55 °C und unter 0,080 mbar gefriergetrocknet [20]. Gefriergetrocknete DOX-NBs wurden dann gewogen, um die Wirkstoffbeladungskapazität hinsichtlich der Wirkstoffverkapselungseffizienz (EE) wie folgt zu berechnen:EE = A /B × 100 %, wobei A ist die Menge an DOX, die in NBs geladen ist, und B ist die anfängliche Menge an DOX in der Lösung. Die Experimente wurden dreimal wiederholt.

Ultraschallvermittelte DOX-Version

Die In-vitro-Freisetzungskinetik von DOX aus den DOX-NBs wurde in Gegenwart und Abwesenheit von Ultraschall (US) durch Dialysebeuteltechnik bei 37 °C bestimmt. Die DOX-NBs wurden in eine Dialysemembran (Spectra/Por, Cutoff 12.000–14.000 Da) eingeschlossen, die unter Schütteln bei 100 /min in einen Behälter mit 100 ml PBS gegeben wurde. Die US-Gruppe wurde vor dem Test 40 s lang von US (VCX400, Sonics and Materials, USA; Leistungsdichte 1,0 W/cm2; Frequenz 20 kHz) beschallt [21]. Die DOX-Freisetzung wurde bis zu 24 Stunden lang gemessen, wobei zu jedem festgelegten Zeitpunkt 1 ml entnommen und durch 1 ml frisches PBS ersetzt wurde. Die Konzentrationen von DOX im externen Puffer wurden bei 480 nm mit einem UV-Spektrophotometer gemessen. Die Freisetzungsexperimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt.

In-vitro-Ultraschallbildgebung (Zeit-Intensitäts-Kurve)

Die US-Bildgebung und Stabilität von DOX-NBs unter Ultraschall wurden in vitro auf einem klinischen Ultraschallscannersystem (LOGIQ E9; GE, USA) verifiziert. Das Experiment wurde mit bestimmten Frequenzen, Sendeleistungen und Dauer der Ultraschall-Exposition durchgeführt. Unter Verwendung einer zuvor entwickelten Methode [19] (Abb. 5a) erreichten DOX-NBs eine Ultraschallverstärkung. Die Stabilität der Ultraschallbildgebung von DOX-NBs wurde bewertet, nachdem sie einem Ultraschallreiz mit einem mechanischen Index (MI) von 0,10 und einer Bildgebungstiefe von 4,5 cm ausgesetzt wurden. Alle US-Bilder wurden offline mit Image J analysiert. Anschließend wurde eine Bildanalyse mit der integrierten Software von LOGIQ E9 durchgeführt, um die Graustufenwerte der Proben zu berechnen. Für jeden der 60-s-Clips, die von 0 bis 15 min aufgenommen wurden, wurde zunächst für jeden Frame eine Bewegungskorrektur durchgeführt und der Dezibel-Wert ermittelt. Jeder Dezibelwert wurde auf einer Zeit-Intensitäts-Kurve aufgetragen, um die Änderungen der Kontrastverstärkung vor und nach der Ultraschallbestrahlung widerzuspiegeln. Die Spitzenintensität und die Dauer der Verstärkung wurden durch eine Zeit-Intensitäts-Kurve ausgedrückt. Während der Analyse wurden entfernungskorrigierte Rückstreuwerte durch Subtrahieren der Hintergrundsignale entsprechend einer Wasserprobe erhalten.

Zytotoxizitäts-Assay für leere NBs

Die Biosicherheit von leeren Chitosan-NBs wurde mit einem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay-Kit (Sigma-Aldrich, USA) getestet. Vor dem Assay wurden MCF-7-Zellen mit einer Dichte von 2 × 10 ³ . ausplattiert Zellen/Well in 96-Well-Platten. Die Zellen wurden einer Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen von Chitosan-NBs und Ultraschallbedingungen unterzogen. Die Biosicherheit von Chitosan-NBs wurde durch Inkubieren von MCF-7-Zellen bei seriellen Konzentrationen von NBs von 0 bis 30 % bewertet. Ein Gerät zur Ultraschallstimulation mit niedriger Intensität (US10, Cosmogamma Corporation, Italien) wurde verwendet, um eine Ultraschallstimulation mit einer festen Frequenz von 1 MHz unter Verwendung eines Arbeitszyklus von 70 % und einer Pulsfrequenz von 100 Hz durchzuführen. Jede Gruppe verarbeitet mit unterschiedlicher Bestrahlungszeit und unterschiedlicher Schallintensität. Aus Sicherheitsgründen wurde Ultraschall mit einer Intensität von 0,5 W/cm ² . verwendet oder 1,0 W/cm ² mit einer Pulslänge von 30 oder 60 s (Tabelle 1). Tiefe, Frequenz und andere Ultraschallbedingungen wurden während aller Ultraschallexperimente konstant gehalten [22]. Nach den Behandlungen wurden die Zellen in den 96-Well-Platten für weitere 24 h kultiviert. Anschließend wurde das arzneimittelhaltige Medium durch ein 1% FCS enthaltendes Erhaltungsmedium ersetzt und eine CCK-8-Lösung nach Herstellerangaben in die Platten gegeben. Nach einer zusätzlichen 2,5-stündigen Inkubation bei 37 °C wurde die spektrophotometrische Extinktion in jedem Well mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Bio-Rad, USA) bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt.

Intrazelluläre Wirkstoffaufnahme in vitro

Die intrazelluläre Aufnahme von DOX wurde mittels Durchflusszytometrie (Beckman Coulter, Miami, USA) bestimmt. Kurz gesagt, MCF-7-Zellen wurden in Sechs-Well-Platten mit einer Dichte von 2,5 × 10 ⁵ . ausplattiert Zellen/Vertiefung in DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % FBS. Nach der Kultur über Nacht wurde das Medium durch ein Kulturmedium ersetzt, das DOX-NBs oder freies DOX in der gleichen Konzentration enthielt, und die Zellen wurden mit oder ohne Ultraschall behandelt. Unter Berücksichtigung der Zellviabilität und der hohen Sonoporationseffizienz wurde für die nachfolgenden Experimente eine DOX-NBs-Konzentration von 20 % gewählt, während die Ultraschallbehandlung auf eine Intensität von 0,5 W/cm ² . eingestellt wurde mit einer Pulslänge von 30 oder 60 s. Anschließend wurde nach 1-stündiger Inkubation das Zellmedium entfernt und die Zellen wurden dreimal mit frischem PBS gewaschen, um freie und ungebundene DOX-NBs oder DOX zu entfernen. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation (5 min, 1000 Upm) gesammelt, in 500 ul PBS vor der intrazellulären Aufnahme von DOX resuspendiert und auf einem FACSCalibur-Durchflusszytometer analysiert. Während der Analyse wurde das Gate für den Nachweis der roten Fluoreszenz willkürlich eingestellt und 10.000 Zellen wurden für jede Probe analysiert.

Die Auswirkungen von DOX-NBs auf MCF-7-Zellen in vitro

CCK-8-Assays und Durchflusszytometrie wurden verwendet, um eine quantitative Bewertung der MCF-7-Zellproliferation und der Apoptose nach der Aufnahme von DOX durchzuführen. Kurz gesagt, MCF-7-Zellen wurden ausplattiert und in Platten mit 96 Vertiefungen oder Platten mit 6 Vertiefungen inkubiert und unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren behandelt. Für den Proliferationsassay wurden die behandelten Zellen 24 h bei 37 °C inkubiert, gefolgt von einer CCK-8-Färbung für 2 h und Ablesen der Extinktion auf einem Mikroplatten-Lesegerät. Die DOX-induzierte Apoptose wurde durch einen Annexin V-APC-Assay wie folgt bestimmt:Nach einer sechsstündigen Behandlung wurden die Zellen durch Zugabe von 0,5 µl V-APC (Sungene Biotech, Tianjin, China) in jede Vertiefung und durchflusszytometrische Analyse gefärbt (Beckman, Coulter, Fullerton, CA, USA) wurde verwendet, um apoptotische Zellen zu quantifizieren.

Statistische Analyse

Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt und die Daten wurden als Mittelwert ausgedrückt. Statistische Analysen wurden mit SPSS Version 18.0 durchgeführt. Ein p Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Physikochemische Charakterisierung von DOX-NBs

Die präparierten NBs zeigten eine kugelförmige Morphologie. Unter einem inversen Mikroskop zeigte die Bildgebung von NBs diskrete und intakte sphärische Umrisse (Abb. 1a), was mit der Fluoreszenzmikroskop-Bildgebung von DOX-NBs (Abb. 1b) übereinstimmte. Ein repräsentatives TEM-Bild der Lösung von DOX-NBs ist in Abb. 1c gezeigt. Die physikalischen Eigenschaften der NBs wurden durch den Partikelgrößen- und Zetapotential-Analysator bestimmt. Wie in Abb. 2 gezeigt, betrug der durchschnittliche Durchmesser der DOX-NBs 641 nm, P.I. 0,256. Das Zeta-Potenzial von DOX-NBs betrug + 67,12 ± 2,1 mV, was ausreichend hoch war, um zu bewirken, dass sie sich gegenseitig abstoßen, wodurch die NB-Aggregation verhindert und ihre Langzeitstabilität unterstützt wird.

Unter einem Lichtmikroskop beobachtete NBs (Vergrößerung × 1000) (a ) und das fluoreszenzmikroskopische Bild von DOX-beladenen NBs (b ) und TEM-Bild von DOX-beladenen NBs (c )

Die Größenverteilung von DOX-beladenen NBs

Stabilität und Wirkstoffbeladungseffizienz von DOX-NBs

Die DOX-NBs waren in Suspension 48 Stunden lang bei 4 °C stabil. Nach Lagerung bei Raumtemperatur wurde festgestellt, dass die Größe der DOX-NBs sowohl in PBS als auch in Humanserum etwas größer war (Abb. 3). Die endgültige Beladungskapazität von DOX-NBs betrug 64,12 mg DOX/g DOX-NBs, was einem EE von 54,18% entsprach.

Optische Bilder von DOX-NBs a bei Raumtemperatur, b nach 6 h bei 25 °C in PBS und c nach 6 h bei 25°C im Serum

DOX-Freigabe durch DOX-NBs in Vitro

Abbildung 4 zeigt das In-vitro-Freisetzungsprofil von DOX aus DOX-NBs in PBS in Gegenwart oder Abwesenheit einer US-Behandlung, um die Auswirkungen der Beschallung auf die DOX-Freisetzung zu beurteilen. Die von DOX-NBs freigesetzte DOX-Menge war zwischen der US-Gruppe und der Nicht-US-Gruppe signifikant unterschiedlich. Nach 5 h hatten die DOX-NBs in der US-Gruppe 46,45 % des verkapselten DOX freigesetzt, verglichen mit nur 9,3 % in der Nicht-US-Gruppe. Die Nicht-US-Gruppe setzte nach 24 Stunden nur 19,4% DOX frei. Im Gegensatz dazu wurden fast 80 % der DOX in der US-Gruppe entlassen. Die Ergebnisse legten nahe, dass US-Bestrahlung die Freisetzung von DOX aus DOX-NBs aufgrund eines Kavitationseffekts fördern kann.

Doxorubicin-Freisetzung aus DOX-NBs mit oder ohne Ultraschallbestrahlung (2 kHz, 1.0 W/cm ² )

Ultraschallstabilität von DOX-NBs

DOX-NBs erzielten in vitro eine Ultraschallverstärkung, wie in Abb. 5b gezeigt. Die Ultraschall-Dezibelwertdämpfung ist in Abb. 5c gezeigt. Die Ergebnisse zeigten, dass DOX-NBs eine gute Ultraschallverstärkung erzielten, und die glatte Kurve zeigt, dass der Ultraschalldämpfungsprozess in den NB-Suspensionen relativ langsam war. Dies weist darauf hin, dass das Ultraschallsignal von DOX-NBs stabil genug für die Bildgebung und Kontrastverstärkung sein kann.

Eine schematische Darstellung des In-vitro-Versuchsaufbaus (a ), Ultraschallbilder von DOX-beladenen NBs (0, 5, 10 und 15 min) mit einer 9,0-MHz-Sonde (b ) und Zeitintensitätsmessungen von Ultraschallkontrast- und DOX-beladenen NBs (c )

Biosicherheit leerer NBs

Die Lebensfähigkeit der MCF-7-Zellen wurde durch Kultivieren mit leeren NBs (ohne DOX) für 24 h nach Ultraschall gemessen. Wie in Abb. 6 gezeigt, beeinflussten die leeren NBs die Lebensfähigkeit der Zellen bei bestimmten Ultraschallintensitäten nicht signifikant. Bei Verwendung einer Ultraschallintensität von 0,5 W/cm ² und einer Bestrahlungszeit von 30 s waren 99,53 % bzw.> 80 % der MCF-7-Zellen in 10 % bzw. 30 % NB-Suspensionen am Leben (Gruppe 1), und die Abnahme der Lebensfähigkeit der MCF-7-Zellen war dosisabhängig. Darüber hinaus waren die Ultraschallintensität und die Bestrahlungszeit zwei weitere Faktoren, die die Lebensfähigkeit von MCF-7-Zellen beeinflussten. Insbesondere wenn die Konzentration leerer NBs 30 % betrug, wurden die MCF-7-Zellen mit 0,5 W/cm ² . behandelt für 30 s zeigte eine höhere Lebensfähigkeit als diejenigen, die mit 0,5 W/cm ² . behandelt wurden für 60 s oder 1 W/cm ² für 30 s (0,84 % vs. 0,75 % vs. 0,63 %). Daher eine Ultraschallintensität von 0,5 W/cm ² und eine Bestrahlungszeit von 30 s/60 s wurden für Zellaufnahmeexperimente verwendet.

In-vitro-Zytotoxizität verschiedener NBs-Konzentrationen und Schallintensität in MCF-7-Zellen

Verbesserung der In-vitro-DOX-Verabreichung durch DOX-NBs und Ultraschallbestrahlung

Die mit DOX-NBs oder freiem DOX (bei gleichen DOX-Konzentrationen) behandelten MCF-7-Zellen wurden fixiert und ihre Fluoreszenzintensität wurde durch Durchflusszytometrie gemessen. Zellen, die keine DOX-Behandlung erhielten, wurden als Blindkontrollen verwendet. Die zelluläre Aufnahme von DOX in der DOX-NBs-Gruppe wurde mit der von freiem DOX und der Kontrollgruppe verglichen. In Abb. 7 war die mittlere Fluoreszenzintensität von MCF-7-Zellen, die mit DOX-NBs inkubiert wurden, viel niedriger als die Autofluoreszenz von Zellen, die mit freiem DOX inkubiert wurden, was veranschaulicht, dass die Einkapselung von DOX in Chitosan-NBs Zellen vor DOX-Aufnahme und DOX- schützen könnte. induzierte Verletzung.

Durchflusszytometrie-Analyse der DOX-Abgabe in MCF-7-Zellen durch DOX-beladene NBs (US1 0,5 W/cm ² 30 s, US2 0,5 W/cm ² 60 s)

Die Ultraschallbestrahlung führte jedoch zu einem deutlichen Anstieg der DOX-Aufnahme in MCF-7-Zellen, die mit DOX-NBs inkubiert wurden; DOX-NBs könnten mit Hilfe von Ultraschallbestrahlung mehr DOX in MCF-7-Zellen abgeben. Im Gegensatz dazu war die DOX-Aufnahme in mit freiem DOX inkubierten MCF-7-Zellen unter Ultraschallbestrahlung nur geringfügig erhöht. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Aufnahme von DOX in mit DOX-NBs inkubierte MCF-7-Zellen viel höher war als die der Zellen, die mit freiem DOX unter Ultraschallbestrahlung inkubiert wurden.

Außerdem war die DOX-Aufnahme in mit DOX-NBs inkubierten MCF-7-Zellen bei längerer Bestrahlungszeit leicht erhöht. Dies kann auf ein vermehrtes Aufbrechen von DOX-NBs zurückzuführen sein, wodurch vorübergehende Poren auf den Membranen von MCF-7-Zellen erzeugt werden.

Verstärkung der DOX-induzierten Tumorzellproliferation und Apoptose durch Ultraschallbestrahlung

Um die Anti-Krebs-Wirkungen der ultraschallunterstützten DOX-NBs-Verabreichung zu untersuchen, wurde die Lebensfähigkeit von MCF-7-Zellen unter Verwendung eines CCK-8-Assays und Durchflusszytometrie gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Lebensfähigkeit von MCF-7-Zellen in der DOX-NBs-Gruppe höher war als in der DOX-Gruppe ohne Ultraschall. Unterdessen war die Lebensfähigkeit von MCF-7-Zellen in der DOX-NBs-Gruppe bei lokaler Ultraschallbestrahlung signifikant niedriger als in der DOX-Gruppe. Das Verhältnis der Zelllebensfähigkeit in der DOX-NBs-Gruppe (21,0 ± 2,2%, p < 0,01) war viel höher als in der Gruppe mit freiem DOX ohne Ultraschallbestrahlung (6,4 ± 0,7%), was darauf hindeutet, dass NBs als Vektoren zur Wirkstoffabgabe die DOX-induzierte Abnahme der Zellproliferation im Blutkreislauf verbessern.

Darüber hinaus war das Verhältnis der Zellviabilität bei mit DOX-NBs + US behandelten Zellen (3,1 ± 0,8%, 2,2 ± 0,9%) im Vergleich zu den mit DOX-NBs allein behandelten Zellen (21,0 ± 2,2%, p<.) signifikant verringert /i> < 0,01), freies DOX allein (6,4 ± 0,7%) und freies DOX + Ultraschall (4,1 ± 0,8%, 3,8 ± 0,6%) (Abb. 8). Die Daten zeigten, dass DOX-NBs + US die zytotoxischen Wirkungen von DOX in MCF-7-Zellen signifikant verstärkten. Die DOX-NBs + US-Gruppe zeigte auch eine höhere Zytotoxizität bei MCF-7-Zellen als die Gruppen mit freiem DOX und freiem DOX + Ultraschall.

Der Vergleich der Zelllebensfähigkeit in verschiedenen Gruppen

Das Verhältnis der Zelllebensfähigkeit in der Gruppe mit freiem DOX + Ultraschall (4,1 ± 0,8 %) war niedriger als in der Gruppe mit freiem DOX (6,4 ± ± 0,7 %). Daher reduzierte Ultraschall auch die Lebensfähigkeit von MCF-7-Zellen, die mit freiem DOX behandelt wurden. Das Verhältnis der Zelllebensfähigkeit betrug 2,2 ±   0,9 %, wenn die Zellen mit DOX-NBs + Ultraschall (60 s) behandelt wurden, was niedriger war als bei Behandlung mit DOX-NBs + Ultraschall (30 s) (3,1 ±   0,8 %). dass die längere Pulslänge (60 s) bei der DOX-NBs-Lieferung effizienter war.

Darüber hinaus wurde die Apoptose von MCF-7-Zellen durch Annexin-V-Färbung 6 h nach freier DOX- oder DOX-NB-Behandlung mit oder ohne Ultraschallbestrahlung bestimmt. Der Prozentsatz apoptotischer MCF-7-Zellen in Gegenwart von freiem DOX betrug 4,4 ± ± 0,9 %, während ein ähnliches Verhältnis bei Zellen beobachtet wurde, die mit freiem DOX und Ultraschall behandelt wurden (30 s, 60 s). Die Abgabe der ultraschallunterstützten DOX-NBs erhöhte den Prozentsatz apoptotischer Zellen im Vergleich zu dem der freien DOX-Gruppe signifikant (45,7 ±   1,1 % vs. 4,4 ± ± 0,9 %, p < 0,01). Darüber hinaus war der Prozentsatz apoptotischer Zellen in der DOX-NBs-Gruppe ohne Ultraschallbestrahlung geringer als in der Gruppe mit freier DOX-Behandlung (3,2 ±   0,9 % vs. 4,4 ± ± 0,9 %). In Übereinstimmung mit dem Zelllebensfähigkeitsassay zeigten diese Daten, dass die ultraschallunterstützte Abgabe von DOX-NBs die krebshemmende Wirkung von DOX verstärkte.