¹³¹I-markierte PLGA-Lipid-Nanopartikel für gezielte Paclitaxel-Verabreichung und Bildgebung in der Melanom-Therapie

Zusammenfassung

Hierin wurden Folsäure (FA) konjugierte Poly(d,l-lactid-co-glycolid) (PLGA)-Lipid-Komposite (FA-PL) als Nanoträger für die gezielte Verabreichung des unlöslichen Anti-Krebs-Medikaments Paclitaxel (PTX) entwickelt, was FA-PLP-Nanopartikel ergab. Darüber hinaus wurde ¹³¹I als radioaktiver Tracer verwendet, um FA-PLP-Nanopartikel zu markieren (FA-PLP-¹³¹I), um ihre Zellaufnahme-Aktivität, in vivo Blutkreislauf und Biodistribution zu evaluieren. Die FA-PLP-¹³¹I-Nanopartikel wiesen eine kugelförmige Morphologie mit großer Stabilität, enger Größenverteilung (165,6 und 181,2 nm) und -22,1 mV durchschnittlichem Zeta-Potenzial auf. Konfokal-Laserscanning-Mikroskopie zeigte, dass das Targeting-Molekül FA die PLP-¹³¹I-Aufnahme durch Melanom-B16F10-Zellen fördert, was durch die Zellinkorporationsrate via ¹³¹I-Aktivitätsdetektion mittels Gammazähler weiter bestätigt wurde. FA-PLP-¹³¹I ohne PTX (FA-PL-¹³¹I) zeigt geringe Zytotoxizität, gute Biokompatibilität, während FA-PLP-¹³¹I im Vergleich zu freiem PTX und PLP-¹³¹I effiziente Zelllebensfähigkeits-Unterdrückung demonstrierte. Nach intravenöser Injektion wurde die Blutkreislauf-Halbwertszeit von freiem PTX (t₁/₂ = 5,4 ± 0,23 h) durch FA-PLP-¹³¹I auf 18,5 ± 0,5 h verlängert. Durch FA-Targeting war die Tumoraufnahme von FA-PLP-¹³¹I ungefähr 4,41- und 12,8-fach höher im Vergleich zu PLP-¹³¹I und freiem PTX-¹³¹I. Zudem zeigte FA-PLP-¹³¹I nach 40 Tagen Behandlung eine verbesserte Tumormhemmung im Vergleich zu freiem PTX und PLP-¹³¹I, ohne Rezidiv und ohne bemerkenswerte systemische in vivo Toxizität. Die Ergebnisse demonstrieren, dass ¹³¹I-markierte PLGA-Lipid-Nanopartikel simultan für gezielte Arzneimittelverabreichung und zuverlässiges Tracking von Medikamenten in vivo angewendet werden können.

Hintergrund

Einer der aggressivsten Hautkrebsarten, Melanom, entsteht durch maligne Transformation von Melanozyten [1, 2]. Angesichts seiner leichten Rezidivneigung und hohen Metastasierungsrate beträgt die 5-Jahres-Überlebensrate von metastasierten Melanom-Patienten nur 10 %. Bis heute ist die häufigste Behandlung für Melanom-Patienten Chemotherapie, die von unerwünschten schweren Nebenwirkungen, niedriger Bioverfügbarkeit, schlechter Tumorselektivität und dosislimitierender systemischer Toxizität begleitet wird, was große Herausforderungen in der Tumorchemotherapie darstellt [3, 4].

Paclitaxel (PTX), ein natürlicher Pflanzenextrakt aus getrockneten Wurzeln, Zweigen, Blättern und Rinde von Taxus, einer Gattung von Koniferen [5, 6], zeigt effektive antitumorale Aktivität gegen verschiedene Tumorarten, einschließlich Ovarialkarzinom und Lungenkrebs [7–9]. Zusätzlich wurde PTX auch als effizient gegen menschliches Melanom berichtet [10, 11]. Dennoch führt neben den oben genannten Nachteilen chemotherapeutischer Medikamente in der aktuellen klinischen Praxis ein Cremophor EL und dehydrierter Alkohol (1:1, v/v) Gemisch als Verdünnungsmedium für PTX, was zu schweren Nebenwirkungen einschließlich Überempfindlichkeit führen kann [12, 13]. Daher ist die Entwicklung neuer Strategien zur Verbesserung der wässrigen Löslichkeit und Tumorakkumulation chemotherapeutischer Wirkstoffe zur Reduzierung ihrer peripheren Exposition und Minimierung ihrer in vivo Toxizität von größter Bedeutung. Die jüngste Entwicklung biokompatibler Arzneimittel-Nanoträger bietet das Potenzial, die physiologische Stabilität von PTX zu verbessern [14–16]. Zusätzlich würde die Konjugation von Targeting-Molekülen an diese Nanoträger die selektive Verabreichung chemotherapeutischer Wirkstoffe an Tumorstellen mit reduzierter peripherer Exposition durch einen tumorzelloberflächenrezeptor-vermittelten Targeting-Effekt ermöglichen [17–19].

Hierin bereiteten wir ein Poly(d,l-lactid-co-glycolid) (PLGA)-Lipid-Komposit vor, das kovalent Folsäure (FA: ein Tumor-Targeting-Molekül) konjugiert und PTX als chemotherapeutisches Medikament für Melanombehandlung einkapselt. Zudem wurde ¹³¹I, ein radioaktiver Marker, verwendet, um die PLGA-Lipid-Nanopartikel radiologisch zu markieren, um ihr in vivo Verhalten klar zu bewerten. Aufgrund seiner negativen Beta-Emission, physikalischen Halbwertszeit und breiten Zerfallseigenschaften wird ¹³¹I häufig als Radiomarker in der Klinik verwendet [20–22]. Die Morphologie, Stabilität und Dispergierbarkeit der ¹³¹I-markierten PLGA-Lipid-Nanopartikel (FA-PLP-¹³¹I) wurden in vitro evaluiert. Darüber hinaus wurden Zellaufnahme, Blutkreislauf und Biodistribution von FA-PLP-¹³¹I durch Messung der ¹³¹I-Radioaktivität untersucht. Zudem wurde die gezielte antikrebs Wirksamkeit von FA-PLP-¹³¹I in vitro und in vivo studiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass FA-PLP-¹³¹I eine vielseitige Nanoplattform für den potenziellen Einsatz als Tumor-Arzneimittelverabreichungs-Nanoträger für chemotherapeutische Medikamente sein könnte.

Methoden

Materialien

Poly(d,l-lactid-co-glycolid) (PLGA, MW: 5000–15.000, Lactid:Glycolid (50:50)) und Chloramin-T wurden von Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Na¹³¹I wurde von Atomic Hitech (Beijing, China) erhalten. PTX (99 %) und 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) wurden von Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China) gekauft. Sojalecithin bestehend aus 90–95 % Phosphatidylcholin, 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[Folat (Polyethylenglykol)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀-FA) und 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[Carboxy (Polyethylenglykol)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH) wurden von Avanti (Alabaster, AL, USA) bezogen. Alle Zellkultur-Reagenzien wurden von Sigma Aldrich gekauft.

Herstellung von FA-PLP Nanopartikeln

FA-PLP-Nanopartikel wurden durch eine Selbstassemblierungs-Nanofällungsmethode [23] synthetisiert. Im Detail wurden 10 mg PTX in 1 ml Ethanol und 2 mg PLGA in 1 ml Dichlormethan gelöst. Nach dem Mischen wurde Lecithin/DSPE-PEG₂₀₀₀-FA (4:1) ethanolische wässrige Lösung (4 Gew.-%) tropfenweise in die Mischungslösung für 4 h sanftes Rühren bei 25 °C gegeben. Die Mischung wurde filtriert und dreimal mit deionisiertem Wasser unter Verwendung einer Millipore Ultrafiltrations-Zentrifugenröhre gewaschen, um nicht einkapseltes Medikament und organisches Lösungsmittel zu entfernen. Als Kontrolle wurden Nanopartikel ohne FA-Molekül-Grafting durch die gleiche Methode hergestellt, wobei DSPE-PEG₂₀₀₀-FA durch DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH ersetzt wurde. Die gereinigten FA-PLP-Nanopartikel wurden bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

Herstellung von ¹³¹I-markierten FA-PLP Nanopartikeln

Radioaktive FA-PLP (FA-PLP-¹³¹I) Nanopartikel wurden durch die Chloramin-T-Oxidationsmethode [24] hergestellt. Ein Gemisch aus 1 ml FA-PLP (1 mg/ml), 500 µCi Na¹³¹I (maximale Radioaktivität, die auf FA-PLP graftet werden kann) und 100 µl 5 mg/ml Chloramin-T wurde in einem pH 7,5 Phosphatpuffer für 10 min bei Raumtemperatur reagiert. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 200 µl Natriummetabisulfit (5 mg/ml) gequencht. ¹³¹I-markierte PLP und PTX wurden nach dem gleichen Verfahren hergestellt. Sie wurden mit einer Zentrifugenröhre (Millipore) gereinigt, um freies Na¹³¹I zu entfernen, bis keine Gammaktivität im Filtrat nachweisbar war. Der Radiomarkierungsausbeute und Reinheit der markierten Nanopartikel wurden mit einem Gammazähler (LKB gamma 1261; LKB Instruments) analysiert.

Charakterisierung

UV-Vis-Absorptionsspektren wurden mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (UV7502, Shanghai Advanced Photoelectric Technology Co., Ltd., Shanghai, China) aufgezeichnet. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Bilder wurden auf einem Zeiss LIBRA 120 TEM aufgenommen. Größe, Zeta-Potenzial und Polydispersitätsindex (PDI) der Nanopartikel wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) Analyse mit einem Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments) detektiert. Optische Fotografien wurden mit einer Nikon D3200 Digitalkamera aufgenommen.

Zellkultur

Die Maus-Melanom-Zelllinie B16F10 wurde von der Zellbank der Typkultursammlung der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erhalten und in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin in einer befeuchteten 5 % CO₂ Atmosphäre bei 37 °C kultiviert.

In Vitro Inkorporationsassays

Zeitabhängige in vitro Inkorporationsassays wurden durchgeführt, um die optimalen Zellbindungs-Effizienz-Zeitpunkte für die ¹³¹I-markierten Verbindungen zu bestimmen [25]. B16F10-Zellen wurden in 24-Well-Platten mit 1 × 10⁵ Zellen pro Well eingesät und bis zur Konfluenz kultiviert. Radiojodierte Proben (¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I) wurden in DMEM-Medium hergestellt und separat den Zellkultur-Wells zugegeben. Nach 0,5, 1, 2, 4 und 6 h Inkubation wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und ihre Radioaktivität mit einem Gammazähler (Science and Technology Institute of China, Jia Branch Innovation Co., Ltd.) gemessen. Inkorporationswerte (%) wurden wie in der vorherigen Literatur [25] beschrieben berechnet. Zusätzlich wurden Nanopartikel mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluoresceinisothiocyanat (FITC, Sigma) markiert und dann mit B16F10-Zellen inkubiert. Die Fluoreszenzbilder der Zellen wurden mit einem kommerziellen Konfokal-Laserscanning-Mikroskop (FV1200, Olympus, Tokyo, Japan) aufgenommen.

In Vitro Zytotoxizitätsassay

Der MTT-Zelllebensfähigkeitsassay wurde verwendet, um die Zytotoxizität der Kontroll-Nanoträger PL-¹³¹I und FA-PL-¹³¹I sowie von freiem PTX, PLP-¹³¹I und FA-PLP-¹³¹I gegen B16F10-Zellen zu untersuchen. Kurz gesagt, B16F10-Zellen wurden in 96-Well-Platten für 24 h plattiert und 24 h lang PL-¹³¹I und FA-PL-¹³¹I (mit 0–100 µg/ml PLGA-Lipid) oder freiem PTX, PLP-¹³¹I und FA-PLP-¹³¹I (bei verschiedenen Konzentrationen von 0–40 µg/ml) ausgesetzt. Das Experiment wurde in Triplicate durchgeführt. Alle Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt.

Tiermodell

3- bis 5-wöchige Balb/c-Mäuse wurden von Shanghai Slack Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China) gekauft. Alle Tierexperimente wurden vom Tierpflege- und Nutzungsausschuss der Fudan-Universität genehmigt, der dem NIH-Leitfaden für Pflege und Verwendung von Labortieren entspricht.

B16F10-Zellen (1 × 10⁶) in PBS wurden subkutan in die rechte Flanke der Mäuse injiziert. Das wachsende Tumorvolumen wurde mit einem Schieblehre gemessen, und das Tumorvolumen wurde mit der Formel berechnet: Volumen = (Länge × Breite²)/2. Wenn das Tumorvolumen etwa 80 mm³ erreichte, wurden die Mäuse in die Experimentgruppen randomisiert.

Blutkreislauf- und Biodistributionsstudie

Gesunde Balb/c-Mäuse wurden intravenös mit PTX-¹³¹I und FA-PLP-¹³¹I (100 µl von 10 µCi pro Maus, 5 mg/kg) injiziert. Blutkreislauf wurde durch Entnahme von ca. 10 µl Blut vom Schwanz der Mäuse gemessen. Die Radioaktivität im Blut wurde mit einem Gammazähler gemessen. Um die Nanopartikel-Biodistribution zu detektieren, wurden Mäuse mit B16F10-Tumor mit PTX-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I und FA-PLP-¹³¹I in gleicher Dosis injiziert und 24 h nach Injektion geopfert. Die Hauptorgane wurden gewogen und für Gammazählung gesammelt.

In Vivo Tumor-Chemotherapie

Balb/c-Mäuse mit B16F10-Tumoren wurden mit 150 µl Kochsalzlösung, freiem PTX, PLP-¹³¹I und FA-PLP-¹³¹I (bei gleicher PTX-Konzentration, 5 mg/kg) injiziert. Tumorgröße und Körpergewicht wurden alle 4 Tage mit einer Schieblehre gemessen. Relative Tumorvolumen wurden als V/V₀ berechnet (V₀ war das Tumorvolumen bei Behandlungsbeginn). Nach ca. 40 Tagen Behandlung wurden die Mäuse geopfert und die Hauptorgane gesammelt, in 4 % Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten, mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und unter einem digitalen Mikroskop untersucht.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung und Charakterisierung von ¹³¹I-markierten FA-PLP Nanopartikeln

Das Syntheseschema der FA-PLP-¹³¹I-Nanopartikel ist in Abb. 1 gezeigt. Kurz gesagt, FA-PLP-Nanopartikel wurden durch eine Selbstassemblierungs-Nanofällungsmethode synthetisiert und radioaktive FA-PLP (FA-PLP-¹³¹I) wurde mit der Chloramin-T-Oxidationsmethode [23, 24] hergestellt. PTX wurde vom PLGA-Lipid-Komposit einkapselt, das dann kovalent konjugiertes FA auf der Schalenoberfläche via PEGylierung graftete. Schließlich wurde ¹³¹I auf die äußere Nanopartikeloberfläche graftet. TEM-Bilder zeigten, dass die FA-PLP-¹³¹I-Nanopartikel eine kugelförmige Morphologie mit enger Größenverteilung (165,6 bis 181,2 nm) aufwiesen, was durch dynamische Lichtstreuung bestätigt wurde (Abb. 2a, b). Das Zeta-Potenzial reichte von -39,1 bis -3,2 mV (Abb. 2c). Die UV-Vis-Spektren von freiem PTX und FA-PLP-¹³¹I (mit gleicher PTX-Konzentration) zeigten den gleichen charakteristischen Peak bei 233 nm (Abb. 2d), was anzeigt, dass PTX in FA-PLP-¹³¹I einkapselt wurde und die Einkapselung die Absorptionsintensität von PTX nicht beeinflusste. Nach Berechnung betrug die Einkapselungseffizienz von PTX in FA-PLP-¹³¹I 56,35 ± 1,6 %. Die Radiomarkierungsausbeuten von PTX-¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I und FA-PLP-¹³¹I betrugen 45,6 ± 2,3, 52,1 ± 4,1, 48,9 ± 1,9, 56,3 ± 2,5 und 54,8 ± 2,7, jeweils.

Stabilität ist essenziell für die biomedizinische Anwendung von Nanopartikeln [26]. Nach 4 Wochen Lagerung zeigten FA-PLP-¹³¹I in Wasser, Zellmedium, fötalem Kälberserum und PBS keine Änderungen in durchschnittlicher Größe, Zeta-Potenzial, PDI-Index (Abb. 3a–c), was große Stabilität und Dispergierbarkeit anzeigt. Zusätzlich wurde die Radiomarkierungsstabilität von FA-PLP-¹³¹I in Mäusplasma bei 37 °C detektiert (Abb. 3d), wobei weniger als 15 % De-Iodierung innerhalb von 7 Tagen auftrat.

In Vitro Zelluläre Aufnahme

Abbildung 4 zeigt die in vitro zeitabhängige Inkorporation von ¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I und FA-PLP-¹³¹I in B16F10-Zellen, gemessen mit einem Gammazähler. FA-PLP-¹³¹I sowie FA-PL-¹³¹I zeigten höhere Inkorporationswerte als alle getesteten Zeitpunkte, steigend mit der Zeit. Die Inkorporationswerte von FA-PLP-¹³¹I nach 6 h waren 3,12- und 23,4-fach höher als die von ¹³¹I und PLP-¹³¹I, in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Konfokal-Laserscanning-Mikroskopie-Bilder von B16F10-Zellen, inkubiert mit Fluoresceinisothiocyanat-markierten FA-PLP-¹³¹I und PLP-¹³¹I-Nanopartikeln (Zusatzdatei 1: Abbildung S1). Diese Ergebnisse demonstrieren die hohe zelluläre Aufnahme von FA-PLP-¹³¹I, wahrscheinlich aufgrund des FA-vermittelten Targeting-Effekts auf B16F10-Zellen.

In Vitro Zytotoxizität

Die Zytotoxizität der Kontroll-Nanoträger PL-¹³¹I und FA-PL-¹³¹I wurde durch MTT-Assay getestet. Zellen, die 24 h mit PL-¹³¹I und FA-PL-¹³¹I behandelt wurden, zeigten eine ähnliche Lebensfähigkeit wie die Kontrolle (Abb. 5a), was gute Biokompatibilität anzeigt. Zusätzlich war FA-PLP-¹³¹I bei gleicher PTX-Konzentration viel effektiver bei der Unterdrückung der B16F10-Zellproliferation als freies PTX und PLP-¹³¹I (Abb. 5b), was exzellente zielgerichtete Chemotherapie anzeigt. Die Ergebnisse demonstrieren, dass FA-PLP-¹³¹I eine hohe chemotherapeutische Wirkung ohne Radiotoxizität und Zytotoxizität hat.

Blutkreislauf- und Biodistributionsstudie

Radiomarkierung wurde als zuverlässiger als Fluoreszenz-Imaging für die quantitative und genaue in vivo Verfolgung von Nanopartikeln berichtet [27, 28]. ¹³¹I-markierte FA-PLP-Nanopartikel wurden hergestellt, um ihr in vivo Verhalten zu untersuchen, einschließlich Blutkreislauf und Biodistribution, gemessen mit einem Gammazähler. Die Blutkreislauf-Halbwertszeit von freiem PTX (t₁/₂ = 5,4 ± 0,23 h) wurde durch FA-PLP-¹³¹I auf 18,5 ± 0,5 h verlängert (Abb. 6a) aufgrund der Nanopartikel-Einkapselung, was für Tumor-Targeting-Akkumulation günstig war [29–31]. Als Nächstes wurde die Biodistribution von freiem PTX-¹³¹I, PLP-¹³¹I und FA-PLP-¹³¹I in B16F10-Tumor-tragenden Mäusen 1 Tag post-Injektion untersucht (Abb. 6b). FA-PLP-¹³¹I sowie FA-PL-¹³¹I zeigten eine offensichtliche Erhöhung der Tumoraufnahme, die 4,41- und 12,8-fach höher war als die von PLP-¹³¹I und freiem PTX-¹³¹I, wahrscheinlich aufgrund des verlängerten Blutkreislaufs von FA-PLP-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I und seines FA-Targeting-Effekts. Zusätzlich zeigten Leber und Milz auch relativ hohe Aufnahme aufgrund ihres Nanopartikel-Metabolismus, was die normalen Stoffwechselorgane waren [32, 33].

In Vivo Tumor-Chemotherapie

Freies PTX-, PLP-¹³¹I- und FA-PLP-¹³¹I-behandelte Mäuse zeigten Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich zur Kochsalzlösung-Kontrollgruppe (Abb. 7a). Insgesamt war FA-PLP-¹³¹I am effektivsten bei der Tumorgewächsunterdrückung ohne Rezidiv im Vergleich zu allen behandelten Gruppen nach ca. 40 Tagen Behandlung. Diese Ergebnisse sind wie erwartet, angesichts des signifikant verlängerten Blutkreislaufs von FA-PLP-¹³¹I und daher seiner Fähigkeit, FA-vermittelte tumorzielgerichtete Akkumulation zu fördern. Weiterhin führte die tumorzielgerichtete Akkumulation auch zu einer Reduktion der peripheren Exposition von PTX, wodurch systemische Toxizität minimiert wurde. Wie erwartet gab es über den gesamten Behandlungsprozess keinen nennenswerten Körpergewichtsverlust (Abb. 7b), und die Hauptorgane, einschließlich Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere, zeigten in keiner Gruppe offensichtliche histologische Läsionen (Abb. 7c).

Fazit

Zusammenfassend haben wir ¹³¹I-markierte PLGA-Lipid-Nanopartikel als Arzneimittelverabreichungs-Träger für Melanom-zielgerichtete Chemotherapie synthetisiert. Durch Messung der ¹³¹I-Radioaktivität wurden die in vitro und in vivo Verhaltensweisen von FA-PLP-¹³¹I-Nanopartikeln untersucht. Die erhaltenen FA-PLP-¹³¹I zeigten große Dispergierbarkeit und kolloidale sowie radiomarkierungsstabilität. Die Kontroll-Nanoträger PL-¹³¹I und FA-PL-¹³¹I zeigten ebenfalls gute Biokompatibilität. Nach Einkapselung von PTX war FA-PLP-¹³¹I am effektivsten bei der Unterdrückung der B16F10-Zellproliferation ohne Zytotoxizität, zugeschrieben dem FA-Targeting-Effekt. Zudem wurde demonstriert, dass FA-PLP-¹³¹I den Blutkreislauf von PTX signifikant verlängert und effektiv im zielgerichteten Tumorregion akkumuliert. Somit hatte FA-PLP-¹³¹I eine exzellente Tumorgewächshémmung und große in vivo Biokompatibilität. Die Ergebnisse unterstreichen das vielversprechende Potenzial dieser vielseitigen FA-PLP-¹³¹I-Nanoträger als zuverlässige Arzneimittel-Tracking-Agenten sowie ihre Anwendung in der tumorzielgerichteten Therapie.