Lange nicht kodierende RNA MALAT1/microRNA-143/VEGFA Signalachse moduliert vaskuläre endotheliale Verletzung-induzierte intrakranielle Aneurysmen

Einführung

Das intrakranielle Aneurysma (IA), auch als zerebrales Aneurysma bekannt, wird durch die Erhöhung des intrakraniellen Drucks verursacht, die durch die lokale abnormale Erweiterung der Hirnarterienhöhle oder der Arterienwand hervorgerufen wird [1]. IA ist eine schwere Erkrankung mit hoher Mortalität und Morbidität, und die Prävalenzrate beträgt in der Allgemeinbevölkerung etwa 1–3% [2]. Die wichtigsten klinischen Merkmale der IA sind zerebraler Vasospasmus, spontane Hirnblutung und okulomotorische Nervenparese [3]. Bisher sind die häufigsten Risikofaktoren, die zum Auftreten und zur Entwicklung von IA führen, hämodynamische Störungen, Gene, Alterung, Infektionen und angeborene Faktoren [4]. Die wichtigsten klinischen Behandlungen, hauptsächlich chirurgisches Clipping und/oder endovaskuläres Coiling, dienen der Verhinderung einer Aneurysmaruptur [5]. Der detaillierte Mechanismus der IA muss jedoch noch aufgeklärt werden, was den dringenden Bedarf an effektiveren Methoden für das Management von IA widerspiegelt.

Lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) sind länger als 200 Nukleotide und gehören zu einer Spezies von nicht-kodierenden RNAs [6]. Es wird berichtet, dass die Expression der lncRNA-Wachstumsstopp-assoziierten lncRNA 1 in IA herunterreguliert ist und das Adenokarzinom-Transkript 1 (MALAT1) eine stark angereicherte und weit verbreitet exprimierte lncRNA ist, deren Länge etwa 8000  nt beträgt [7]. Es wurde dokumentiert, dass MALAT1 die Dysfunktion der glatten Muskulatur bei thorakalen Aortenaneurysmen moduliert [8]. Eine Studie hat auch die abnormale Expression von lncRNAs und Messenger-RNA (mRNA) in IA präsentiert, und die lncRNA-mRNA-Co-Expressionsnetzwerke liefern Hinweise, um die Pathogenese von IA zu finden [9]. Es wurde vorgeschlagen, dass MALAT1 die Osterix-Expression fördert und die osteogene Differenzierung moduliert, indem es auf die Expression von miRNA-143 (miR-143) in mesenchymalen Stammzellen des menschlichen Knochenmarks abzielt [10]. Eine Studie hat auch die Rolle des miR-143/145-Clusters bei der Umkehr der Regulation des Krüppel-ähnlichen Faktors 5 in den glatten Muskelzellen und seiner Kontraktilität und Proliferation bei IA vorgestellt [11]. Laut Feng et al. kann die Herunterregulierung von miR-143/145 und ein höherer Matrix-Metalloproteinase-9-(MMP-9)-Spiegel während des Kreislaufs mit der Bildung und Ruptur von IA zusammenhängen [12]. Eine Analyse hat gezeigt, dass die am wenigsten kontrollierten miRNAs (miR-143 und miR-145) Zielgenen gemeinsam sind, die Signalwege sind, wie dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und anderen Genen, die die Zellbewegung oder Adhäsion regulieren [13] . Eine Studie hat die prädiktive Bedeutung von Variationen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors A (VEGFA) bei IA gezeigt [14]. Daher versuchten wir, den Mechanismus der MALAT1/miR-143/VEGFA-Signalachse bei IA zu untersuchen, die durch vaskuläre Endothelverletzungen induziert wurde.

Materialien und Methoden

Ethikerklärung

Die Studie wurde vom Institutional Review Board of The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, gebilligt und folgte den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki. Die Teilnehmer gaben ihr schriftliches Einverständnis zu dieser Studie. Alle Tierversuche standen im Einklang mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren der National Institutes of Health. Das Protokoll wurde vom Committee on the Ethics of Animal Experiments of The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, genehmigt.

Studienfächer

Für unsere Experimente wurden zwanzig IA-Patienten (IA-Gruppe) ausgewählt, die durch bildgebende Untersuchungen diagnostiziert und neurochirurgische Clippings im First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China erhalten hatten. Es gab 11 Männer und 9 Frauen im Alter von 43,27 ± 6,25  Jahren. Von den IA-Geweben wurden Proben genommen. Inzwischen wurde das temporale kortikale arterielle Gefäßgewebe vom Schläfenpol von 20 Patienten (Kontrollgruppe) mit Temporallappenepilepsie, die durch Amygdala und Hippocampussklerose verursacht wurde, reseziert. Die resezierten Gewebe wurden nach der Operation histopathologisch als normales arterielles Gewebe untersucht, und es gab 13 Männer und 7 Frauen im Alter von 44,18 ± 5,91 Jahren. Zwischen der IA-Gruppe und der Kontrollgruppe wurde keine signifikante Diskrepanz in Bezug auf Geschlecht und Alter festgestellt (beide P> 0,05). Am Morgen vor der Operation wurden von allen nüchternen Probanden gleichzeitig venöse Blutproben (2 Röhrchen) entnommen.

Aufstellung von Rattenmodellen der IA

Sechzig reine männliche Sprague-Dawley-Ratten (Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd., Hunan, China) mit einem Gewicht zwischen 200 und 250 g wurden 7 Tage lang (25 ± 2 °C, relative Luftfeuchtigkeit von 65–70 .) aufgezogen %, 12 h Hell-Dunkel-Zyklus, freie Wasser- und Nahrungsaufnahme). Ratten wurden mit der pankreatischen Elastase vom Schwein auf die äußere Halsschlagader und um die Wand der Gabelungsarterie herum fallen gelassen. Die A. carotis externa wurde mit zwei chirurgischen Linien am Ast der A. carotis externa etwa 1,5 mm ligiert. Die A. carotis externa wurde zwischen den beiden Linien durchtrennt, um ein Aneurysma der A. carotis interna im blinden Segment der A. carotis externa zu bilden. Die Ratten wurden 1 Woche nach der Operation mit 1 % Kochsalzlösung gefüttert. Nach 1 Monat wurde eine zerebrale Angiographie durchgeführt und die Bildung eines Aneurysmas wurde beobachtet.

Nach der Etablierung von IA-Rattenmodellen wurden 50 Ratten zufällig in eine leere Gruppe (n =10, modellierte Ratten wurden mit einer stereotaktischen Injektion von 100 µl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) einmal täglich behandelt), kurze Haarnadel-RNA (sh)-negative Kontrolle (NC) Gruppe (n =10, modellierte Ratten wurden mit einer stereotaktischen Injektion von 100 µl sh-MALAT1 NC einmal täglich behandelt), sh-MALAT1-Gruppe (n =10, modellierte Ratten wurden mit einer stereotaktischen Injektion von 100 µl sh-MALAT1-Plasmid einmal täglich behandelt), Überexpression (Oe)-NC-Gruppe (n =10, modellierte Ratten wurden einmal täglich mit einer stereotaktischen Injektion von 100 μL Oe-MALAT1 NC-Plasmid behandelt) und die Oe-MALAT1-Gruppe (n =10, modellierte Ratten wurden einmal täglich mit einer stereotaktischen Injektion von 100 μL Oe-MALAT1-Plasmid behandelt) [15]. Die obigen Plasmide wurden von Shanghai Genechem Co., Ltd. (Shanghai, China) zusammengestellt.

Blutdrucktest bei Ratten

Der Blutdruck der Schwanzarterie der Ratte wurde in der 1., 4. und 12. Woche nach der Operation gemessen. Vor der Blutdruckmessung wurden die Ratten für einen Moment in ein Heizgerät mit konstanter Temperatur gelegt, um eine Störung der Außentemperatur zu verhindern. Zweitens wurden die Ratten mehrere Minuten in einem speziellen Rattenkäfig ruhig gehalten, um eine Störung der Aktivität zu verhindern. Wenn der Blutdruck stark schwankte, wurde er zweimal oder dreimal zu verschiedenen Zeiten bestimmt, um den Durchschnittswert zu erhalten.

Aneurysma-Gewebegewinnung

Nach 3 Monaten wurden die Ratten mit 1% Pentobarbital-Natrium (40 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion anästhesiert, um Blutproben aus den Venen zu entnehmen. Die Ratten wurden euthanasiert, und die Brust wurde geöffnet, der linke Ventrikel wurde in die Aorta intubiert und die Cava wurde geschnitten, um das Blut freizusetzen. In der Zwischenzeit wurden 30 ml normale Kochsalzlösung mit Heparin-Natrium für eine schnelle Herzdurchblutung verwendet, um das Blut zu spülen, und dann wurden 10 ml 10 % Polyformaldehyd/0,1 M PBS (pH 7,4) in das Gehirn injiziert. Nach Perfusion und Fixierung wurde das Gehirn der Ratte geöffnet. Der arterielle Kreislauf in der Schädelbasis wurde sorgfältig beobachtet, das Aneurysmagewebe wurde abgetrennt und die Veränderungen des Aneurysmas wurden unter dem Mikroskop beobachtet.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Serumbezogene Indizes wurden mit dem ELISA-Kit getestet. Die gesammelten Blutproben wurden 1 Stunde lang in einen 37 °C-Thermostat gegeben und 10 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert. Der Nachweis der Endothelin-1 (ET-1) und von Willebrand Faktor (vWF) Expression wurde gemäß den Anweisungen des Kits durchgeführt (alle Kits wurden vom NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Jiangsu, China bezogen).

Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung

Die Proben wurden mit 10 % Formalin für mehr als 24 h fixiert und in Paraffinblöcken konserviert. Die Paraffinblöcke wurden mit Xylol 20 min entparaffiniert, mit einer absteigenden Alkoholreihe (100 %, 95 %, 80 %, 75 %) 1 min dehydratisiert und 10 min mit Hämatoxylin gefärbt. Dann wurden die Gewebe mit destilliertem Wasser gespült, mit Chlorwasserstoffsäure-Ethanol für 30 Sekunden differenziert und in warmem Wasser bei 50 °C für 5 Minuten eingeweicht. Mit Eosinlösung gefärbt, wurden die Gewebe mit destilliertem Wasser gespült, mit 70 % und 90 % Alkohol entwässert, mit Xylol geklärt und mit neutralem Gummi versiegelt. Die Morphologie der Gewebe wurde unter einem Hochleistungsmikroskop beobachtet.

Transmissions-Elektronenmikroskop-Beobachtung

Die Ersatzgewebe wurden mit 2,5% Glutardialdehyd und 1% Osmitinsäure fixiert, dehydratisiert und dann mit Epon812-Harz eingebettet. Die halbdünnen Schnitte wurden mit Toluolblau gefärbt, beschnitten und zu ultradünnen Schnitten verarbeitet. Die Schnitte wurden mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und mit einem JME-2000EX Transmissionselektronenmikroskop (Hitachi High-Technologies Co., Ltd., Shanghai, China) beobachtet.

terminale Desoxynukleotidyltransferase-vermittelte Desoxyuridintriphosphat-Biotin Nick End-Labeling (TUNEL)-Färbung

Die TUNEL-Färbung wurde impliziert, um die Endothelzell-Apoptose in IA-Ratten auf der Grundlage des TUNEL-Kits (Roche, Basel, Schweiz) zu beobachten. Die präparierten Rattenaneurysmaschnitte wurden zweimal mit Xylol gewaschen (5 min/Zeit) und mit absteigenden Alkoholreihen (100 %, 95 %, 80 %, 75 %) dreimal (5 min/Zeit) entwässert. Die Gewebe wurden mit 20 µg/ml Protease K-Lösung ohne DNase für 15–30 Minuten behandelt, mit 50 µl TUNEL-Reaktionslösung für 60 Minuten betropft und mit 50 µl Diaminobenzidin (DAB) bei 25 °C für 10 Minuten entwickelt. Dann wurden die Schnitte mit Hämatoxylin gegengefärbt, mit Gradientenalkohol dehydratisiert, mit Xylol geklärt und mit neutralem Gummi versiegelt. Die Schnitte wurden unter dem Lichtmikroskop betrachtet und der Apoptoseindex wurde berechnet.

Isolierung und Identifizierung von Aneurysma-Gefäß-Endothelzellen

Die Isolierung von Endothelzellen wurde gemäß der Methode von Boscolo et al. [16]. Die IA-Gewebe wurden in 3 mm ² . geschnitten Fragmente. Die Gewebe wurden mit 0,1 % Collagenase B/0,1 % Dispase (Roche) 25 min bei 37 °C inkubiert. Dann wurden die zuvor abgelösten Gewebe 2 min lang mit einer 2 ml-Pipette verrieben und mit einem 100-μm-Sieb (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) filtriert. Anschließend wurde die Zellsuspension zentrifugiert und dann in MV2-Medium (einschließlich Wachstumsfaktoren und 20 % fötalem Rinderserum) (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) resuspendiert. Die Zellen wurden mit 1 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen/ml in einer Kulturflasche beschichtet mit 1 μg/cm ² Fibronektin. Nach dem von Jackson et al. [17] wurden die Zellen mit 80–100 % Konfluenz mit den mit Ulex europaeus Agglutinin I (UEA) beschichteten Beads (Dynabeads M-450 Tosylactived, Oxoid, Hampshire, UK) (Vector Laboratories, Ltd., Peterborough, UK) getrennt. . Die an den lektinbeschichteten Kügelchen anhaftenden Endothelzellen wurden mit einem Magnetpartikelkonzentrator angehäuft und die unkonjugierten Zellen wurden mit einem Basalmedium gewaschen. Die UEA-positiven Zellen wurden im Kulturmedium resuspendiert und in die mit Fibronektin beschichtete Kulturflasche ausgesät, um die Adhäsion und Wachstumsrate der Zellen zu verbessern.

Zellen wurden in MV2 auf Fibronektin-beschichteten Kammer-Objektträgern gezüchtet. Als die Zellkonfluenz 80–100 % erreichte, wurden die Zellen in Aceton bei 4 °C fixiert und 5 min mit 1 % Triton X-100 und dann 15 min mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) behandelt. Die Zellen wurden mit primärem Antikörper gegen vWF (1:300, Abcam, Cambridge, MA, USA) beträufelt und 2 h inkubiert (NC wurde in Abwesenheit von primärem Antikörper durchgeführt), mit Meerrettichperoxidase-vermutetem Immunglobulin G (1:150, Abcam) und 30 min inkubiert. Dann wurden die Zellen mit 50 µl DAB bei 25 °C für 5 min entwickelt, mit Hämatoxylin gegengefärbt, mit 0,1% Salzsäure differenziert, mit Alkohol dehydratisiert, gefolgt von Xylol-Clearance und neutraler Zahnfleischversiegelung. Nach dem Trocknen wurden die Zellen unter einem umgekehrten Mikroskop fotografiert.

Zellgruppierung und Transfektion

Die vaskulären Aneurysma-Endothelzellen in der logarithmischen Phase wurden in 5 Gruppen eingeteilt:Leergruppe (vaskuläre Aneurysma-Endothelzellen ohne jegliche Behandlung), sh-NC-Gruppe (Aneurysma-vaskuläre Endothelzellen transfiziert mit sh-MALAT1 NC-Plasmid), sh-MALAT1-Gruppe ( vaskuläre Aneurysma-Endothelzellen, die mit sh-MALAT1-Plasmid transfiziert sind), Oe-NC-Gruppe (vaskuläre Aneurysma-Endothelzellen, die mit Oe-MALAT1-NC-Plasmid transfiziert sind) und Oe-MALAT1-Gruppe (vaskuläre Aneurysma-Endothelzellen, transfiziert mit Oe-MALAT1-Plasmid). Die obigen Plasmide wurden von Genechem synthetisiert. Die Zelltransfektion wurde gemäß den Anweisungen des Lipofectamine ^TM . durchgeführt 2000 Reagenz (11668-027, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA).

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-Yl)-2, 5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay

Die vaskulären Endothelzellen jeder Gruppe wurden auf einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 3 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen/ml und kultiviert bei 37 °C, 5% CO₂ für 48 h. Jede Gruppe wurde mit 5 parallelen Vertiefungen ausgestattet, und jede Vertiefung wurde mit 20 μl frischer MTT-Lösung (5 μg/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) angehängt. Nach 4-stündiger Reaktion wurden die Zellen mit 200 µl Dimethylsulfoxid vermischt. Nach vollständiger Auflösung wurde der optische Dichtewert der Zellen in jeder Gruppe mit einem Mikroplatten-Lesegerät (BioRad, Hercules, Kalifornien, USA) bei 490 nm gemessen

Durchflusszytometrie

Die Zellzyklusverteilung wurde durch Propidiumiodid (PI)-Färbung getestet. Gefäßendothelzellen wurden abgelöst, zentrifugiert, mit vorgekühltem 75%igem Ethanol resuspendiert und über Nacht bei –20°C befestigt. Die Zellen wurden zentrifugiert, um den Überstand zu verwerfen. Die Zellen wurden in 450 µl PBS angehängt, mit 100 µl Rnase A versetzt und mit 400 µl PI bei 4 °C für 30 Minuten unter Vermeidung von Licht gefärbt. Ein Durchflusszytometer (FACSCalibur, Becton, Dickinson and Company, NJ, USA) wurde verwendet, um die Zellzyklusverteilung zu testen.

Die Zellapoptose wurde durch Annexin V/PI-Doppelfärbung getestet. Abgelöste Endothelzellen wurden gesammelt und dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit 100 µl vorgekühltem 1 × Bindungspuffer resuspendiert und mit 5 µl Annexin bzw. 5 µl PI gemischt. Die Zellapoptose wurde mit einem Durchflusszytometer getestet. Mit AnnexinV als Querachse und PI als Längsachse stand der linke obere Quadrant für mechanisch verletzte Zellen (AnnexinV ⁻ /PI ⁺ ), der rechte obere Quadrant für spätapoptotische Zellen oder nekrotische Zellen (AnnexinV ⁺ /PI ⁺ ), der linke untere Quadrant für negative normale Zellen (AnnexinV ⁻ /PI ⁻ ) und der rechte untere Quadrant für frühe apoptotische Zellen (AnnexinV ⁺ /PI ⁻ ). Die gesamten apoptotischen Zellen (AnnexinV ⁺ /PI ⁻ und AnnexinV ⁺ /PI ⁺ ) wurden berechnet und in Prozent ausgedrückt.

Quantitative Reverse Transkription der Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)

Die Gesamt-RNAs in den Geweben und Zellen wurden von Trizol (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China) abstrahiert und die Konzentration und Reinheit der RNA bestimmt. Der Prozess der reversen Transkription von RNA in komplementäre DNA wurde gemäß den Anweisungen des reversen Transkriptionskits (K1621, Fermentas, Maryland, NY, USA) durchgeführt. MALAT1-, miR-143- und VEGFA-Primersequenzen (Tabelle 1) wurden von Genechem entwickelt und zusammengestellt. Um die Expression von lncRNA, miRNA oder mRNA zu bewerten, wurde RT-qPCR mit dem SYBR GreenPCR Master Mix (Takara, Tokio, Japan) mit dem Roche Real-Time PCR System (Roche) durchgeführt. U6 wurde als interner Parameter von miR-143 eingestellt, während MALAT1 und VEGFA mit Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) als interne Parameter eingestellt wurden. Die relativen Transkriptionsspiegel der Zielgene wurden mit 2 ^−△△Ct . berechnet Methode.

Western Blot-Analyse

Das Gesamtprotein aus Geweben und Zellen wurde abstrahiert. Die Proteinkonzentration wurde nach den Anweisungen des Bicinchoninsäure-Kits (Boster Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, Hubei, China) bestimmt. Das Protein wurde durch Elektrophorese mit 10 % Polyacrylamidgel (Boster Biological Technology) aufgetrennt. Die Membran wurde auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran übertragen und dann 1 h mit 5% BSA versiegelt. Die Membran wurde mit primärem Antikörper gegen Ki-67 (1:1000), VEGFA (1:1000), vWF (1:1000) und Matrix-Metalloproteinase (MMP)-9 (1:1000, Abcam, Cambridge, UK) inkubiert. , Cyclin D1 (1:1000), Bax (1:1000) und Bcl-2 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornien, USA) und GAPDH (1:2000, Jackson Immuno Research, Grove, Pennsylvania, USA) und mit dem sekundären Antikörper (1:500, Jackson Immuno Research) markiert mit Meerrettichperoxid. Die Membran wurde mit dem Zweifarben-Infrarot-Fluoreszenz-Scan-Bildgebungssystem von Odyssey erhalten, und die Grauwerte der Banden wurden mit der Bildanalysesoftware Quantity One gemessen.

Dualer Luciferase-Reporter-Gen-Assay

Die Bindungsstellen von MALAT1 und miR-143 wurden von der Bioinformatik-Website (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) vorhergesagt und erläutert. Die Bindungsbeziehung zwischen MALAT1 und miR-143 wurde weiter durch Luciferase-Reportergen-Assay verifiziert. Das synthetische MALAT1 3'-untranslatierte Region (3'UTR)-Genfragment wurde in pmiR-Report Luciferase-Reportervektoren (Thermo Fisher Scientific) eingeführt, um MALAT1-Wildtyp (MALAT1-WT) durch die Endonukleasestelle Bamh1 und Ecor1 zu erzeugen. Die Mutationsstelle der komplementären Sequenz der Sequenz wurde auf MALAT1-WT entwickelt, und das Zielfragment wurde in die pmiR-Report Luciferase-Reportervektoren inseriert, um MALAT1-Mutantentyp (MALAT1-MUT) durch T4-DNA-Ligase nach Restriktionsendonuklease-Verdau zu produzieren. Die korrekt sequenzierten MALAT1-WT und MALAT1-MUT wurden mit mimischen NC und miR-143 mimischen in vaskuläre Endothelzellen cotransfiziert. Die Zellen wurden geerntet und 48 Stunden nach der Transfektion lysiert, und die Luciferase-Aktivität wurde mit einem Luciferase-Nachweiskit (BioVision, San Francisco, CA, USA) mit einem Luminometer (Glomax20/20, Promega, Madison, Wisconsin, USA) getestet.

Die Zielbeziehung von miR-143 und VEGFA und die Bindungsstelle von miR-143 und VEGFA 3′UTR wurden über die Bioinformatik-Website (http://www.targetscan.org/vert_72/) vorhergesagt. Die Sequenz der VEGFA-3'UTR-Promotorregion, die die miR-143-Bindungsstelle enthält, wurde zusammengesetzt und in pmiR-Report-Luciferase-Reportervektoren kloniert, um VEGFA-WT zu erzeugen. Auf Basis dieses Reporters wurde die Bindungsstelle von VEGFA-WT und miR-143 zu VEGFA-MUT mutiert. Der VEGFA-WT- oder VEGFA-MUT-Reporter wurde mit mimischen NC- oder miR-143-Mimetika gemischt und dann 48 h lang in vaskuläre Endothelzellen cotransfiziert. Danach wurden die Zellen lysiert und die Luciferase-Aktivität wurde mit einem Luciferase-Nachweiskit getestet.

RNA-Pull-Down-Assay

Um die Bindungsbeziehung zwischen miR-143 und MALAT1 zu überprüfen, wurde ein RNA-Pull-Down-Assay implementiert. Drei Biotin-markierte miRNA-Sequenzen Bio-miR-143-WT, Bio-miR-143-MUT und Bio-miR-NC wurden entwickelt und der GenePharma Company (Shanghai, China) anvertraut. Diese biotinylierten Oligonukleotide wurden 48 Stunden lang in Zellen transfiziert. Dann wurden die Zellen geerntet und mit einem spezifischen Zelllysat (Ambion, Austin, Texas, USA) 10 min inkubiert. Danach wurde das Lysat mit M-280 Streptavidin-Kügelchen, die mit RNase-freier und Hefe-tRNA (alle von Sigma) vorbeschichtet waren, bei 4 °C für 3 Stunden ausgebrütet, dann zweimal mit einer kalten Lyselösung gereinigt, dreimal mit einer niedrigen Salzpuffer und einmal mit salzreicher Pufferlösung. Als NC wurde eine antagonistische miR-143-Sonde etabliert. Die Gesamt-RNA wurde mit Trizol abstrahiert und dann wurde der MALAT1-Anreicherungsspiegel mit RT-qPCR getestet.

Statistische Analyse

Alle Daten wurden mit der Software SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) dargestellt. Die Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden von einer unabhängigen Stichprobe durchgeführt t Test, während Vergleiche zwischen mehreren Gruppen durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) bewertet wurden und paarweise Vergleiche durch Tukeys Mehrfachvergleichstest implementiert wurden. Die Beziehung zwischen der MALAT1-Expression und den klinisch-pathologischen Merkmalen von IA wurde durch Chi-Quadrat-Test bestimmt. P Ein Wert von weniger als 0,05 war ein Hinweis auf einen statistisch signifikanten Unterschied.

Ergebnisse

MALAT1 und VEGFA werden überexprimiert und miR-143 wird in IA-Gewebe herunterreguliert

Die ET-1- und vWF-Expression im Serum in der IA-Gruppe und der Kontrollgruppe wurde durch ELISA nachgewiesen, und die Ergebnisse zeigten, dass die ET-1- und vWF-Expression in der IA-Gruppe gegenüber der Kontrollgruppe anstieg (beide P <0,05) (Abb. 1a, b).

MALAT1 und VEGFA werden überexprimiert und miR-143 wird in IA-Geweben herunterreguliert. a ET-1-Expression im Serum von IA-Patienten und Patienten mit Temporallappenepilepsie durch ELISA. b vWF-Expression im Serum von IA-Patienten und Patienten mit Temporallappenepilepsie durch ELISA. c Pathologische Beobachtung von IA-Geweben und normalen arteriellen Geweben durch HE-Färbung. d Morphologische Beobachtung von IA-Geweben und normalem arteriellem Gewebe durch ein Transmissionselektronenmikroskop. e MALAT1-, miR-143- und VEGFA-mRNA-Expression in IA-Geweben und normalen arteriellen Geweben durch RT-qPCR. f VEGFA-, MMP-9- und vWF-Proteinexpression in IA-Geweben und normalen arteriellen Geweben durch Western-Blot-Analyse. Endothelzellen (ECs), innere elastische Lamina (IEL), glatte Muskelzellen (SMC). Die Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt; Vergleiche zwischen den Gruppen wurden von einer unabhängigen Stichprobe durchgeführt t testen

Die pathologischen Veränderungen von IA-Geweben wurden durch HE-Färbung beobachtet. In normalen arteriellen Geweben wurde kein offensichtlicher Schaden in Endoderm, Endothelzellen und glatten Muskelzellen beobachtet, und die Zellen waren ordentlich angeordnet und hatten eine vollständige Struktur. Die IA-Gewebe zeigten geschädigte Endothelzellen, degenerierte glatte Muskelzellen, eine abgeschwächte Arterienwand, gerissene elastische Fasern und infiltrierte Entzündungszellen (Abb. 1c).

Veränderungen der Ultrastruktur von IA und normalem arteriellem Gewebe wurden mit einem Transmissionselektronenmikroskop beobachtet. Es wurde festgestellt, dass die Endothelzellen vollständig waren und die Adventitia-Struktur intakt war; in normalen arteriellen Geweben wurden keine gebrochene innere elastische Membran oder apoptotische glatte Muskelzellen beobachtet. In IA-Geweben zeigte es sich mit einer schweren Degeneration der Blutgefäßwand, die sich hauptsächlich im Verschwinden der meisten Endothelzellen, einer stark gebrochenen inneren elastischen Schicht, stark geschädigten und degradierten glatten Muskelzellen und der Störung der äußeren Membran des Blutgefäßes manifestierte (Abb. 1d).

RT-qPCR wurde zur Bestimmung der MALAT1-, miR-143- und VEGFA-mRNA-Expression durchgeführt, während Western-Blot-Analysen für die VEGFA-, MMP-9- und vWF-Proteinexpression in IA-Geweben und normalen arteriellen Geweben durchgeführt wurden. Es wurde gezeigt, dass im Gegensatz zu normalen arteriellen Geweben die Expressionslevel von MALAT1, VEGFA, MMP-9 und vWF erhöht und die Expression von miR-143 in IA-Geweben (alle P <0,05) (Abb. 1e, f).

Hunt-Hess-Grad, Grad der Endothelschädigung und Raucheranamnese korrelieren mit der MALAT1-Expression in IA-Geweben

Im Lichte der medianen Expression von MALAT1 wurden die Patienten in zwei Gruppen eingeteilt:Gruppe mit niedriger Expression und Gruppe mit hoher Expression. Die Beziehung zwischen der MALAT1-Expression und den klinisch-pathologischen Merkmalen von Patienten mit IA wurde analysiert. Die Ergebnisse legten nahe, dass Hunt-Hess-Grad, Grad der Endothelschädigung und Raucheranamnese mit der MALAT1-Expression (alle P <0,05), während Alter, Geschlecht und Operationsmodus nicht mit der MALAT1-Expression in Zusammenhang standen (alle P> 0,05) (Tabelle 2).

Herunterreguliertes MALAT1 unterdrückt den Blutdruck, die Expression von ET-1, vWF und MMP-9 sowie den apoptotischen Index vaskulärer Endothelzellen von Ratten mit IA

Wie in Tabelle 3 gezeigt, verschlechterte sich der MALAT1-Knockdown, während die MALAT1-Wiederherstellung den Blutdruck in der 4. und 12. Woche erhöhte.

ELISA zeigte, dass die MALAT1-Herunterregulation reduziert, während die MALAT1-Hochregulierung die ET-1- und vWF-Expression im Serum von Ratten mit IA erhöht (Abb. 2a, b).

Herunterreguliertes MALAT1 unterdrückt den Blutdruck, die Expression von ET-1, vWF und MMP-9 sowie den apoptotischen Index von vaskulären Endothelzellen von Ratten mit IA. a ET-1-Expression im Serum von Ratten durch ELISA. b vWF-Expression im Serum von Ratten durch ELISA. c Pathologische Veränderungen von IA-Geweben bei Ratten, die durch HE-Färbung beobachtet wurden. d Die Ultrastruktur von IA-Geweben bei Ratten, beobachtet mit einem Transmissionselektronenmikroskop. e Apoptose vaskulärer Endothelzellen durch TUNEL-Färbung. f Apoptotischer Index der vaskulären Endothelzellen von Ratten. g MALAT1-, miR-143- und VEGFA-mRNA-Expression in IA-Geweben von Ratten durch RT-qPCR. h VEGFA-, MMP-9- und vWF-Proteinexpression in IA-Geweben von Ratten durch Western-Blot-Analyse. * P <0,05 im Vergleich zur sh-NC-Gruppe, # P <0,05 gegenüber der Oe-NC-Gruppe. Die Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden durch eine einseitige Varianzanalyse gefolgt von Tukeys multiplem Vergleichstest bewertet

Die pathologischen Veränderungen von IA-Geweben in jeder Gruppe wurden mit HE-Färbung untersucht. Die Blank-Gruppe, sh-NC-Gruppe und Oe-NC-Gruppe zeigten eine beschädigte innere Membran, abgeblätterte Endothelzellen, degenerierte glatte Muskelzellen, reduzierte Zellen und Schichten und eine dünnere Arterienwand. In der sh-MALAT1-Gruppe waren die Endodermis, die Endothelzellen, die glatte Muskelzellschicht und die äußere Membranschicht der intrakraniellen Arterie leicht beschädigt, aber sauber angeordnet. Die Oe-MALAT1-Gruppe zeigte eine verschwundene Intimaschicht, abgeblätterte Endothelzellen, gebrochene elastische Fasern und infiltrierte Entzündungszellen (Abb. 2c).

Die IA-Gewebe von Ratten in jeder Gruppe wurden mit einem Transmissionselektronenmikroskop beobachtet. Es wurde gezeigt, dass denaturierte Endothelzellen, desintegrierte subendotheliale Schicht, verschwundene innere elastische Schicht und verminderte glatte Muskelzellen in der Blank-Gruppe, Sh-NC-Gruppe und Oe-NC-Gruppe präsentiert wurden. Die sh-MALAT1-Gruppe zeigte flache Endothelzellen, einen ovalen Kern und vermehrte Kollagenfasern, jedoch ohne elastische Schicht. Die Oe-MALAT1-Gruppe zeichnete sich durch verschwundene Endothelzellen und eine getrennte elastische Schicht von der Muskelschicht aus, die in das Lumen zerfiel (Abb. 2d).

Der apoptotische Index von vaskulären Endothelzellen in IA-Ratten wurde durch TUNEL-Färbung getestet. Das Stummschalten von MALAT1 reduzierte den apoptotischen Index von vaskulären Endothelzellen, während überexprimiertes MALAT1 den gegenteiligen Effekt zeigte (Abb. 2e, f).

RT-qPCR-Nachweis der MALAT1-, miR-143- und VEGFA-mRNA-Expression und Western-Blot-Analyse der VEGFA-, MMP-9- und vWF-Proteinexpression in IA-Geweben zeigten, dass die MALAT1-Elimination die MALAT1-, VEGFA-, MMP-9- und vWF-Expression unterdrückte und erhöhte miR-143-Expression. Im Gegenteil, die MALAT1-Erhöhung führte zu den entgegengesetzten Einflüssen auf diese Genexpressionen (Abb. 2g, h).

Geringe Expression von MALAT1 verbessert die Lebensfähigkeit und hemmt die Apoptose von vaskulären Endothelzellen bei IA

Die immunhistochemische Färbung wurde verwendet, um die Expression des Endothel-spezifischen Markers vWF nachzuweisen. Es zeigte sich, dass das Zytoplasma von IA-Gefäß-Endothelzellen mit feinen braunen Partikeln bedeckt war, was positiv war, während das Zytoplasma in seiner NC-Gruppe keine braunen Partikel aufwies. Die Ergebnisse bestätigten, dass die kultivierten Zellen Endothelzellen waren (Abb. 3a, b).

Low expression of MALAT1 advances viability and restrains apoptosis of vascular endothelial cells in IA. a vWF immunohistochemical staining in IA vascular endothelial cells:IA vascular endothelial cells were covered with fine yellow particles. b vWF immunohistochemical staining in IA vascular endothelial cells:IA vascular endothelial cells showed no brown particles in the NC group. c Vascular endothelial cell viability in each group by MTT assay. d Protein expression of CyclinD1 and Ki-67 in each group by western blot analysis. e Cell cycle changes in each group by PI staining. f Cell apoptosis rate in each group by Annexin V/PI double staining. g Bax and Bcl-2 protein expression in each group by western blot analysis. * P <0.05 vs. the sh-NC group, # P <0.05 vs. the Oe-NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way analysis of variance followed with Tukey’s multiple comparisons test

MTT assay, flow cytometry, together with western blot analysis were utilized to test vascular endothelial cell viability and apoptosis. It was displayed that MALAT1 diminution promoted vascular endothelial cell viability (heightened Cyclin D1 and Ki-67 expression) and depressed apoptosis (decreased G0/G1 phase cells and increased S and G2/M phase cells, reduced Bax and elevated Bcl-2 expression). However, MALAT1 upregulation functioned in an opposite way to that of MALAT1 diminution on cell viability and apoptosis (Fig. 3c–g).

MiR-143 Is Bound to MALAT1 and VEGFA Is a Target Gene of miR-143

MALA1, miR-143, and VEGFA expression in vascular endothelial cells of each group were verified through RT-qPCR and western blot analysis. The results presented that MALA1 knockdown depressed MALA1 and VEGFA expression and enhanced miR-143 expression. On the contrary, MALA1 upregulation led to the increment in MALAT1 and VEGFA expression and the reduction in miR-143 expression (Fig. 4a, b).

MiR-143 is bound to MALAT1 and VEGFA is a target gene of miR-143. a MALAT1, miR-143, and VEGFA mRNA expression in vascular endothelial cells of aneurysm in each group. b VEGFA protein expression in vascular endothelial cells of aneurysm in each group. c The binding sites of MALAT1 and miR-143 predicted by the bioinformatics website. d The regulatory relation of MALLA1 and miR-143 validated by dual luciferase reporter gene assay. e The binding relationship between MALAT1 and miR-143 verified by RNA-pull down assay. f The binding sites of miR-143 and VEGFA predicted by the bioinformatics website. g The regulatory relation of miR-143 and VEGFA validated by dual luciferase reporter gene assay. * P <0.05 vs. the sh-NC group, # P <0.05 vs. the Oe-NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, comparisons between two groups were assessed by independent sample t test, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way analysis of variance followed with Tukey’s multiple comparisons test

The specific binding region between MALAT1 and miR-143 was divined by online analysis software (Fig. 4c). The results of dual luciferase reporter gene assay revealed that the luciferase activity was impaired in the MALAT1-WT + miR-143 mimic group versus the MALAT1-WT + mimic-NC group (P <0,05). However, there was no distinct difference in luciferase activity in the MALAT1-MUT + miR-143 mimic group relative to that in the MALAT1-MUT + mimic-NC group (P> 0.05), indicating that miR-143 was specifically bound to MALAT1 (Fig. 4d). The results of RNA-pull down assay reported that the enrichment level of MALAT1 in the Bio-miR-143-WT group was heightened compared to the Bio-miR-NC group (P <0.05), but there was no distinct difference in MALAT1 enrichment level in the Bio-miR-143-MUT group (P> 0.05) (Fig. 4e).

Bioinformatics software divined a targeted relationship between miR-143 and VEGFA (Fig. 4f). The results of luciferase activity showed that the relative luciferase activity repressed after VEGFA-WT and miR-143 mimic co-transfected into vascular endothelial cells (P <0,05). However, the relative luciferase activity of vascular endothelial cells was not affected by co-transfection of VEGFA-MUT and miR-143-mimic (P> 0.05) (Fig. 4g). It was indicated that VEGFA was a direct target gene of miR-143.

Discussion

IA is a serious intracranial disease, which mainly leads to subarachnoid hemorrhage [18]. A previous study has demonstrated the involvements of lncRNA-related competitive endogenous RNA networks in IA [19]. Also, a recent study has provided a proof that functional polymorphism in miR-143/145 gene promoter region is connected with the risk of IA [20]. In a study conducted by Xu et al. , it is shown that overexpression of angiogenic factors, such as VEGFA, may be related to IA formation and rupture [21]. In order to explain the molecular mechanism of MALAT1 in IA, a series of assays have been conducted and the results revealed that IA induced by vascular endothelial injury was regulated by MALAT1/miR-143/VEGFA signal axis.

Firstly, our study has provided substantial evidence that MALAT1 and VEGFA are upregulated and miR-143 is downregulated in IA tissues. A recent study has presented that MALAT1 is one of the most upregulated lncRNAs in the process of cerebral ischemia [22]. Another study has presented that MALAT1 is upregulated in ovarian cancer cells and intends to participate in the processes of ovarian cancer cell apoptosis, migration, and proliferation [23]. A study concerning to the expression profile of unruptured and ruptured IA has demonstrated that the expression of angiogenic factors such as VEGFA is upregulated in ruptured aneurysm [21]. Moreover, a clinical study has presented that the miR-143/145 cluster of IA patients is downregulated compared to healthy subjects [11]. In addition, it is previously discussed that miR-143/145 takes part in various biological processes associated with aneurysm formation and is downregulated in patients with IA [20]. All these findings are more or less echoed with the previous exploration outcomes.

Except for the abovementioned findings, this study has also explored the functional role of MALAT1 in IA through gain-off-function and loss-of-function assays. It could be summarized that downregulation of MALAT1 reduced blood pressure, serum levels of ET-1, and vWF and MMP-9 expression in IA tissues. It has been suggested previously that downregulation of MALAT1 restrains the upregulation of the glucose-induced ET-1 transcription product [24]. Also, it is reported that ectopic MALAT1 expression is the inducer of vWF generation [25]. Another study has verified that the depletion of MALAT1 in bone marrow-derived macrophages inhibits the expression of MMP-9 [26].

Also, cell experiments have been conducted for further confirmation of the functions of MALAT1 in IA. The results have suggested that MALAT1 knockdown promoted vascular endothelial cell viability and depressed apoptosis in IA. Similarly, it has been documented that disturbance of MALAT1 improves aortic mural architecture and retards aneurysm growth [8]. Supplementary to our study finding, there is research highlighting that poor expression of MALAT1 induces apoptosis and restrains proliferation of acute myeloid leukemia cells [27]. Another study has also demonstrated the inhibitory effects of MALAT1 knockdown on proliferation of human osteoarthritis cartilage cells [28]. Besides that, a prior research generally confirms that downregulation of MALAT1 can induce apoptosis and attenuate the proliferation of glioma cells [29]. Moreover, low expression of MALAT1 induced by RNA interference promotes apoptosis and suppresses proliferation of multiple myeloma cells [30]. Collectively, these studies have explained the molecular mechanism of MALAT1 in IA to some extent.

In addition, this study has evidenced that miR-143 is bound to MALAT1 and VEGFA is a target gene of miR-143. Similarly, a paper contends that MALAT1 binds directly to miR-143 and suppresses its expression [10]. Zhuet al. have found that MALAT1 exerts its roles via interacting with miR-143 in cervical carcinoma cells [31]. It is further confirmed that MALAT1 indirectly modulate VEGFA via miR-200b-3p [32]. Moreover, another study has suggested that miR-143-3p mediates ZFPM2 effect on a number of protein targets in blood, including VEGFA [33]. Nevertheless, the interactions among MALAT1, miR-143, and VEGFA in IA have not been discussed and need further study.

Conclusion

From these results, it is clear that MALAT1 knockdown depresses apoptosis and promotes viability of vascular endothelial cells in IA by modulating miR-143/VEGFA axis. The co-expression network suggests the connection between MALAT1 and miR-143 with the involvement of VEGFA. The findings in this study partially disclose the pathogenesis of IA initiation and progression, and the studied targets may be a notably potential entry point to reveal pathology of IA from another perspective. Limitedly, further large-scale studies are required to comprehensively illustrate the mechanisms of MALAT1/miR-143/VEGFA axis in IA.