Chondroitinsulfat/Polycaprolacton/Gelatine elektrogesponnene Nanofasern mit Antithrombogenität und erhöhter Endothelzell-Affinität als potenzielles Gerüst für das Gewebe-Engineering von Blutgefäßen

Einführung

Die Entwicklung von Nanofasermaterialien hat aufgrund ihrer einzigartigen (bio)physikalisch-chemischen Eigenschaften, einschließlich ihrer extrazellulären Matrix (ECM)-ähnlichen ultrafeinen Faserstruktur, hervorragenden mechanischen Eigenschaften, großer spezifischer Oberfläche und hohe Porosität mit Interkonnektivität [1, 2]. Es wurde gezeigt, dass nanofaserige Strukturen eine Schlüsselrolle bei der Vermittlung zellulärer Reaktionen wie Zelladhäsion, Morphologie (z. B. Ausbreitung, Ausrichtung, Elongation usw.), Anordnung, Migration, Proliferation, Phänotyp und Differenzierung über Kontaktführung spielen [3 ,4,5]. Während zahlreiche Nanofabrikationsstrategien (z. B. Nanoskiving, Templatsynthese, Phasentrennung usw.) eine verfügbare Technologie zur Herstellung von Nanofasermaterialien bereitgestellt haben, ist das Elektrospinnen eine der effektivsten Methoden zur Herstellung von Nanofasern aus verschiedenen Materialien (Metalle, Keramik, Polymer , Verbundwerkstoffe usw.) im industriellen Maßstab [6,7,8].

Neben (bio)physikalischen Signalen kann die Auswahl geeigneter Biomaterialien die Zellaktivitäten sowie die Gewebereparatur und -regeneration maßgeblich beeinflussen [9]. Einige Schlüsselmerkmale wie Biokompatibilität, Bioresorbierbarkeit, mechanische Eigenschaften und Biofunktion sollten berücksichtigt werden [9, 10]. Im Vergleich zu natürlich/natürlichen und synthetisch/synthetischen Kompositen haben Komposit-Nanofasermaterialien aus natürlichen und synthetischen Polymeren aufgrund der Kombination der hervorragenden biologischen Eigenschaften natürlicher Polymere und der mechanischen Festigkeit synthetischer Polymere mehr Aufmerksamkeit erhalten [9]. Darunter ist die Gelatine (Gt)/Polycaprolacton (PCL)-Kombination eines der am repräsentativsten untersuchten natürlich-synthetischen Hybridsysteme und wird häufig im Blutgefäß-Tissue Engineering eingesetzt [11,12,13,14]. Gt/PCL-Komposit-Nanofasern weisen jedoch noch einige Einschränkungen auf, wie z. B. langsame Endothelialisierung und Thrombose. Vor kurzem ist Chondroitinsulfat (CS) ein sulfatiertes Polysaccharid, das Glykosaminoglykan und Galaktosamin enthält, von dem gezeigt wurde, dass es eine hohe Adhäsion an Endothelzellen (ECs), eine schwache Wechselwirkung mit Proteinen und Blutplättchen sowie eine elektrostatische Abstoßung von negativ geladenen Blutbestandteilen besitzt [15 ,16,17]. Darüber hinaus könnte CS die zelluläre Apoptose hemmen und die Heilung von Gefäßwunden erleichtern [18, 19]. Daher wären elektrogesponnene Gt/PCL (PG)-Nanofasern, die CS enthalten, ausgezeichnete Kandidaten als bioinstruktives Gewebe-Engineering-Gerüst für die Reparatur und Regeneration von Blutgefäßen.

In der vorliegenden Arbeit wurden biomimetische PG-Komposit-Nanofasern mit unterschiedlichen CS-Verhältnissen über einstufiges Elektrospinnen entwickelt. Die Morphologie, die Porosität der chemischen Eigenschaften und der Abbau von CS/PG-Komposit-Nanofasern wurden durch verschiedene Charakterisierungstechniken nachgewiesen. Das Antikoagulans von PG/CS-Komposit-Nanofasern wurde bewertet. Darüber hinaus wurden diese zusammengesetzten Nanofasern mit unterschiedlichen CS-Verhältnissen mit humanen Aorten-Endothelzellen (HAECs) beimpft, um ihre Auswirkungen auf zelluläre Reaktionen zu untersuchen.

Materialien und Methoden

Materialien

CS (Trachea vom Rind, Typ A, Reinheit:95%) wurde von Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd. (China) geliefert. PCL wurde von Aladdin Biochemical Polytron Technologies Inc. (China) bezogen. Gt (Rinderhaut, Typ B) wurde von Sigma-Aldrich Biochemical Technology Co., Ltd., (China) bezogen. Das Kit mit aktivierter partieller Thromboplastinzeit (APTT) wurde von Leigen Biotechnology Co., Ltd (China) bezogen. Essigsäure (Reinheit:99,5%) wurde von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (China) bezogen. Die menschlichen Aorten-Endothelzellen (HAECs) wurden vom angeschlossenen Krankenhaus der Universität Qingdao (China) bezogen. Kulturmedium Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nährstoffmischung F-12 (DMEM/F-12), fötales Rinderserum (FBS), 0,25% Trypsin-EDTA wurden von Biological Industries (Israel) bezogen. Alle Reagenzien wurden von Sigma Aldrich (China) bezogen, sofern nicht anders angegeben. Das in allen Experimenten verwendete Wasser war entionisiert.

Elektrospinnen von Nanofasern

PCL (10 % w/v) wurde in Essigsäure unter mechanischem Rühren bei Raumtemperatur 4 h lang gelöst. Gt (10 % w/v) wurde in 90 % Essigsäure unter konstantem Rühren 2 h lang gelöst. CS in unterschiedlichen Konzentrationen wurde der Gt-Lösung zugesetzt und 1 h bei Raumtemperatur leicht gerührt, um homogene Lösungen zu erhalten, die 5, 10 und 15 Gew.-% CS bezogen auf die Gesamtpolymerkonzentration enthielten. Dann wurde eine PG-Lösung hergestellt durch Mischen der beiden obigen Lösungen in einem Gewichtsverhältnis von 50/50 (w/w) unter Rühren für 2 h, benannt als 5%CS@PG, 10%CS@PG und 15%CS@PG .

Die hergestellten homogenen Lösungen wurden dem Elektrospinnverfahren unterzogen, ausgestattet mit einer 1 ml-Spritze mit 21 G-Nadel und einem mit Aluminiumfolie bedeckten Kollektor. In dieser Studie wurde der Abstand zwischen Kollektorplatte und Nadelspitze auf etwa 18 cm festgelegt, die Spannung auf 23 kV eingestellt und die Polymerlösungen mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/h abgepumpt. Alle Lösungen wurden in einem Elektrospinn-Instrument (Technology, Tk602TH, China) bei Raumtemperatur und sorgfältig kontrollierter Feuchtigkeit (<40%) elektrogesponnen. Vor weiteren Experimenten wurden die Proben mindestens 72 Stunden lang in einen Vakuumtrockenschrank gestellt, um restliches Lösungsmittel zu entfernen.

Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Die Morphologie von CS@PG-Nanofasergerüsten wurde mit einem REM (VEGAS, TESCAN, Tschechien) bei einer Beschleunigungsspannung von 20 kV bei Raumtemperatur untersucht. Der Durchmesser von Nanofasern (n = 100) wurde weiter aus SEM-Bildern unter Verwendung einer Bildanalysesoftware (Image J) gemessen.

Die TEM-Beobachtungen und energiedispersiven Röntgenspektroskopie (EDS)-Analysen wurden unter Verwendung eines JEOL JEM-2100 plus (Japan) durchgeführt.

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR)

FTIR wurde mit einem Nicolet iN10 FTIR-Spektrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) durchgeführt, um die charakteristischen funktionellen Gruppen von CS-, PG-Nanofasern und CS@PG-Nanofasern zu bewerten. Die Spektren der Proben wurden im Transmissionsmodus über einen Wellenlängenbereich von 4000–500 cm ⁻¹ . aufgenommen mit einer Auflösung von 2 cm ⁻¹ .

Porosität und Absorption von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)

Die Porosität von Nanofasern wurde mit dem Liquid-Displacement-Verfahren durchgeführt. Zuerst wurde das Trockengewicht der Nanofasern als W₁ . gewogen . Dann wurden vier Gruppen von Nanofasern 2 h lang bei 25 °C in Ethanol getaucht und mit W₂ . gewichtet . Das Ethanol auf der Probenoberfläche wurde durch Filterpapier entfernt und die Gewichte der Proben wurden dann als W₃ . notiert . Die Porosität der Nanofasern wurde nach folgender Formel berechnet:

Für den PBS-Lösungs-Absorptionstest wurden die erhaltenen Nanofasern im trockenen Zustand gewogen und als Wd aufgezeichnet. Dann wurden die Nanofasern 24 h lang bei 25 °C in PBS eingeweicht und das Gewicht im nassen Zustand wurde als Ww nach Entfernen der überschüssigen Flüssigkeit von der Probenoberfläche aufgezeichnet. Das Quellverhältnis kann mit der folgenden Gleichung gemessen werden:

Alle Werte in den obigen Experimenten sind als Mittelwert  ± SD (n = 3).

In-vitro-Abbauverhalten

Um die Lysozymresistenz der erhaltenen Nanofasern zu bestimmen, wurde die Abbaubarkeit der Proben zu einem festgelegten Zeitpunkt (1, 4, 7, 10 und 14 Tage) gemessen. Das Anfangsgewicht der Nanofasern wurde als W_i . aufgezeichnet . Anschließend wurden die Proben in PBS-Lösung (pH 7,4) mit Lysozym (500 μg/ml) eingetaucht und in vitro bei 37 °C inkubiert. In den vorgegebenen Abbauintervallen wurde jede Probengruppe entnommen und mit entionisiertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet, um das Endgewicht (W _f ). Die Lysozymlösung wurde dreimal wöchentlich gewechselt. Die verbleibende Masse (%) der Nanofasergerüste wurde wie in der folgenden Formel definiert geschätzt:

Um das Abbauverhalten der Probe nach 7 Tagen zu bewerten, wurde die Morphologie der Nanofasern durch SEM beobachtet.

Blutkompatibilitätsanalyse

Koagulationszeiten

Die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) wurde verwendet, um die Aktivität intrinsischer und gemeinsamer Gerinnungswege zu bewerten, indem die Gerinnungszeiten von plättchenarmem Plasma (PPP) nach der Inkubation mit elektrogesponnenen Nanofasern auf Deckgläsern getestet wurden. Dazu wurde antikoaguliertes Blut (ca. 10 ml) gesammelt und 20 min bei 3000 U/min zentrifugiert, um thrombozytenarmes Plasma (PPP) zu erhalten. Jede Probe wurde mit 200 μl PPP 10 min bei 37 °C inkubiert und mit dem APTT-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert (n = 3).

Hämolysetest

Die Hämolyserate wurde bewertet, indem die Konzentration von Hämoglobin gemessen wurde, die aus Erythrozyten in verdünntem Vollblut, das den elektrogesponnenen Nanofasern ausgesetzt war, in die Lösungsphase freigesetzt wurde. Die Proben auf Deckgläsern wurden einzeln in 24-Well-Platten gegeben und 30 Minuten lang bei 37 °C in 2 ml PBS eingetaucht. Die Negativkontrollgruppen enthielten nur 2 ml PBS, während die Positivkontrollgruppen aus 2 ml entionisiertem Wasser bestanden, um eine maximale Lyse von Erythrozyten zu induzieren (n = 3 für jede Testgruppe). Dann wurden 40 μl des oben genannten antikoagulierten frischen Vollbluts in jede Vertiefung gegeben und 60 min bei 37 °C inkubiert, wonach die Suspensionen in Zentrifugenröhrchen entfernt und bei 100 ×  g . zentrifugiert wurden für 5 Minuten Die Überstände wurden einer Messung der Extinktion bei 570 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (SynergyH1/H1M, BioTek, China) unterzogen.

Thrombogenität

Das thrombogene Potenzial wurde in vitro nach Inkubation von elektrogesponnenen Proben mit dem plättchenreichen Plasma (PRP) untersucht. PRP wurde durch Zentrifugation (1500 U/min, 20 min) hergestellt und die obere Hälfte des Plasmas wurde verworfen. Dann wurden die Nanofasern auf Deckgläsern in 100 μL PRP bei 37 °C für 2 h inkubiert und für nachfolgende Experimente dreimal vorsichtig mit PBS gespült. Um die Thrombozytenaktivität nach der Inkubation mit PRP zu bewerten, wurden elektrogesponnene Nanofasern 2 h und 24 h lang in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, aufbewahrt, und dann wurde ein CCK-8-Assay-Kit verwendet, um die Lebensfähigkeit der Thrombozyten auf den Nanofasern zu messen. CCK-8 (20 µl) wurde zu 200 µl serumfreiem DMEM-Medium in 24-Well-Platten gegeben und 1 h inkubiert. Schließlich wurden Suspensionen mit einem Mikroplatten-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen.

Zellkultur und Zelllebensfähigkeit

Humane Aorten-Endothelzellen (HAECs) wurden in DMEM, ergänzt mit FBS (10 %, v/v) und Streptomycin/Penicillin (1 %, v/v) in einer Atmosphäre von 37 °C und 5 % CO_{2 . kultiviert} . Das Kulturmedium wurde dreimal pro Woche ausgetauscht. Die Zellen wurden im Allgemeinen mit 0,05 % Trypsin/EDTA für 3 Minuten isoliert, bei 1000 U/min zentrifugiert und in frischem Medium suspendiert, um eine Zellpassage oder Zellaussaat durchzuführen.

Vor der Zellaussaat wurden alle Nanofasermaterialien in einer 24-Well-Platte 1 h lang unter UV-Bestrahlung sterilisiert und 1 h lang in 75 % Ethanol (v/v, %) eingetaucht. Dann wurden die Nanofasern viermal mit PBS-Lösung gespült und 12 h lang in DMEM in CO₂ . eingeweicht Inkubator. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen pro Vertiefung auf Nanofasern und das Medium wurde jeden Tag ausgetauscht. Nach 24 h Co-Kultivierung wurden die Zellen dreimal mit PBS-Lösung gewaschen und dann mit einem Calcein-AM/PI-Doppelfärbungskit (YEASEN Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China) gefärbt. PI wurde verwendet, um tote Zellen zu färben und Calcein-AM wurde für lebende Zellen gefärbt.

Zellmorphologie auf den Nanofasern

Um die Zelladhäsion an den Nanofasern zu beobachten, wurde die Morphologie der Zellen nach 24 h co-kultiviert mit dem Fluoreszenzmikroskop (Nikon A1 MP, Japan) beobachtet. Zuerst wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur 30 Minuten lang fixiert. Dann wurde 0,5 % Triton X-100-Lösung 5 Minuten lang verwendet, um die Zellmembran zu permeabilisieren. Schließlich wurde 4′6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) verwendet, um Zellkerne zu färben, und Rhodamin-Phalloidin wurde verwendet, um das F-Aktin zu färben. Die quantitative Analyse (Zelldichte, Einzelzellfläche, Zelldehnung) wurde mit Image J weiter durchgeführt.

Zellproliferation

Die Zellproliferationsaktivität auf den zusammengesetzten Nanofasern wurde mit einem CCK-8 Assay Kit durchgeführt. Die HAECs wurden auf Nanofasern mit einer Dichte von 8 × 10 ³ . geimpft Zellen/Well. Das Kulturmedium wurde alle zwei Tage gewechselt. Nach 1, 4, 7 Tagen Co-Kultivierung wurden die Zellen mit PBS-Lösung gewaschen, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Anschließend wurden 20 μL CCK-8 und das komplette Medium im Volumenverhältnis 1:10 für 1 h am Inkubator in die 24-Well-Platte gegeben. Die Absorption wurde mit Elisa Reader bei 450 nm getestet.

Die Zellfärbung mit DAPI und Rhodamin-Phalloidin wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop durchgeführt, um die Veränderungen der Zellzahl nach der Kokultivierung mit verschiedenen Nanofasern für zwei Tage und sechs Tage direkt zu beobachten.

Statistische Analyse

Alle Proben in den Experimenten wurden dreifach verarbeitet. Alle Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen (SD) dargestellt. Die statistische Analyse der Proben wurde durch Einweganalyse-Varianz (ANOVA) bestimmt, um die Unterschiede mit der bei p . zugewiesenen Signifikanz zu vergleichen < 0.05.

Ergebnis und Diskussion

Herstellung und Charakterisierung von CS@PG-Nanofasern

Abbildung 1 zeigt das schematische Diagramm des Elektrospinnverfahrens für CS@PG-Nanofasergerüste und die In-vitro-Bewertung der Antikoagulation und Zytokompatibilität. Um künstliche Gefäßgewebegerüste zur Förderung der Proliferation von Endothelzellen zu entwickeln, wurden verschiedene CS-Verhältnisse (5, 10 und 15 Gew.-%) in PG-Lösungen (10 %, v/v) eingebracht, um durch Elektrospinnverfahren hergestellte Verbundnanofasern herzustellen.

Schematische Darstellung der Herstellung von Nanofasern und In-vitro-Evaluierung

SEM wurde durchgeführt, um die Struktur von CS@PG elektrogesponnenen Nanofasern zu beobachten. Wie in Abb. 2 gezeigt, zeigten die SEM-Bilder von PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG, 15%CS@PG Nanofasern die dichte Faserarchitektur, die kontinuierliche, glatte und nanoskalige Fasern durch Elektrospinntechnik enthielt . Die PG-Nanofasern (Abb. 2a) zeigten durch das Elektrospinnen viele unregelmäßige Perlen auf den Nanofasern mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 406,01 ± 146,28 nm. Es könnte erklärt werden, dass 10 % w/v der elektrogesponnenen Lösung eine niedrige Viskosität aufwiesen, was zur Bildung von inhomogenen Nanofasern mit Kügelchen führte [20]. Bei Erhöhung der CS-Menge in der Polymerlösung von 5 auf 10 Gew.-% konnten aufgrund der erhöhten Lösungsviskosität homogene Nanofasern ohne jegliche Kügelchen erzielt werden (Abb. 2b, c). Dementsprechend zeigten 5 % CS@PG und 10 % CS@PG einen kleineren durchschnittlichen Durchmesser von 382,35 ±   152,99 nm bzw. 300,29 ±  100,85 nm. Dieses Ergebnis ist hauptsächlich darauf zurückzuführen, dass der Anstieg des CS-Gehalts die Leitfähigkeit der Elektrospinnlösung entsprechend erhöht [20]. Wenn die Polymerkonzentration jedoch bis zu 15 % betrug, ist die Viskosität der Polymerlösung zu hoch, um im elektrischen Feld gestreckt zu werden. Bei der gleichen Flussrate von 1 ml/h wie in den vorherigen Gruppen beobachteten wir, dass bei einer angelegten Spannung von 23 kV das Phänomen der Nadelspitzenobstruktion auftrat und der Taylor-Konus nicht beobachtet werden konnte. Daher wurden die Flussrate der elektrogesponnenen Lösung und die angelegte Spannung auf 0,9 ml/h bzw. 20 kV eingestellt. Die 15 %CS@PG-Nanofasern mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 266,92 ± 105,43 nm wurden erfolgreich hergestellt.

SEM-Bilder und Durchmesserverteilung von CS@PG elektrogesponnenen Gerüsten bei verschiedenen CS-Verhältnissen. a PG, b 5 %CS@PG, c 10 %CS@PG, d 15%CS@PG

Wie in Abb. 3a dargestellt, wurde festgestellt, dass CS gleichmäßig in den 5 %CS@PG- und 10 %CS@PG-Nanofasern verteilt war. In den 15 % CS@PG-Fasern wurde jedoch eine CS-Aggregation nachgewiesen. Wie in Abb. 3b angegeben, wurde eine EDX-Elementaranalyse durchgeführt, um den Schwefelgehalt der präparierten Fasern nachzuweisen. Erwartungsgemäß stieg der Schwefelgehalt mit steigender CS-Konzentration in den erhaltenen Fasern.

TEM-Bilder (a ) und EDX-Elementaranalyse von CS@PG elektrogesponnenen Gerüsten bei verschiedenen CS-Verhältnissen, d. h. PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG und 15%CS@PG

FTIR-Spektrenanalyse

Zur Bestimmung der charakteristischen Absorptionspeaks der chemischen Gruppe der präparierten Nanofasergerüste wurde eine FTIR-Spektrenanalyse durchgeführt. Das FTIR-Spektrum von PG und CS wurde als Kontrollgruppe zum Vergleich mit CS@PG-Nanofasergruppen betrachtet. Im PG-Spektrum starke Absorptionsbanden, die bei 3300 cm ⁻¹ . auftraten und 2935 cm ⁻¹ kann dem –NH₂ . zugeschrieben werden und –OH-Streckschwingung und CH₂ asymmetrische Dehnung bzw. Bei 1652 cm ⁻¹ . traten mehrere charakteristische Absorptionspeaks auf (Amid I) für C=O-Streckschwingung, 1542 cm ⁻¹ (Amid II) für N-H-Biegeschwingung, 1441 cm ⁻¹ für CH₂ Dehnung und 1267 cm ⁻¹ (Amid III) für C-N-Streckschwingungen [21, 22]. Das CS-Spektrum zeigte eine charakteristische Absorptionsbande bei 1245 cm ⁻¹ , repräsentiert die S=O-Streckschwingung in negativ geladenem SO₄ ²⁻ [23, 24].

Wie in Abb. 4 gezeigt, zeigten die FTIR-Spektren von 5 % CS@PG-, 10 % CS@PG- und 15 % CS@PG-Nanofasern charakteristische Peaks von PCL, Gt und CS zusammen. Verglichen mit den Spektren der PG-Gruppe zeigten CS@PG-Gruppen die charakteristische CS-Bande bei 1245 cm ⁻¹ , und die Intensität der CS-Bande wurde durch das Vorhandensein von CS in Nanofasern erhöht. Dieser Befund bestätigte das Vorhandensein unterschiedlicher CS-Gehalte in den elektrogesponnenen CS@PG-Nanofasern.

FT-IR-Spektrum der CS@PG elektrogesponnenen Gerüste

Porosität, Quellverhältnis und Abbaubarkeit von Nanofasern

Die hohe Porosität der Faser weist auf eine hervorragende Interkonnektivität des Materials hin, die die Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen in die Poren begünstigt und die Zellinfiltration fördert [25, 26]. Abbildung 5a zeigt die Porosität von Nanofaserfolien. Die Porosität der erhaltenen Nanofasern mit unterschiedlichen CS-Verhältnissen betrug ungefähr bis zu 80%. Die hochporöse Architektur, die durch elektrogesponnene Nanofasern erhalten wird, kann die natürliche ECM nachahmen und bietet so eine günstige 3D-Mikroumgebung für Zellen [27]. Es wurde berichtet, dass Gerüste im Tissue Engineering mit einer Porosität von bis zu 80 % für den Transport von Nährstoffen und Metaboliten von Vorteil waren.

a Die Porosität präparierter Nanofasern. b PBS-Absorption von präparierten Nanofasern. c Verbleibende Masse der CS@PG-Nanofasern nach Abbau in PBS-Lösung für bis zu 14 Tage. d REM-Aufnahmen von Nanofaserfolien in PBS-Lösung bei 37 °C für 7 Tage

Das PBS-Absorptionsverhältnis der CS@PG-Nanofasergerüste wurde verglichen, um die Wirkung von CS auf die PBS-Aufnahme der Filme zu bewerten. Wie in Abb. 5b angegeben, betrug das PBS-Absorptionsverhältnis des PG-Gerüsts 586,34 ± 49,44 % und die 5 % CS@PG- und 10 % CS@PG-Nanofasern 492,86 ±   21,99 % bzw. 510,04 ±   69,55 %. Das PBS-Absorptionsverhältnis von 15 % CS@PG-Gruppen (665,07 ± 59,81 %) war signifikant höher als das von 5 % CS@PG und 10 % CS@PG. Dieses Ergebnis zeigte, dass der erhöhte Gehalt an CS in den Verbundnanofasern die PBS-Aufnahmeeigenschaft der Filme verbessern könnte, was auf die hohe Hydrophilie in CS-Molekülen mit hydrophilen Gruppen (Carboxyl und Hydroxyl) zurückzuführen sein könnte [28].

Die Daten des In-vitro-Abbaubarkeitsexperiments sind in Abb. 5c dargestellt, und es wurde festgestellt, dass mit der Erhöhung des CS-Verhältnisses auch die Abbaurate von CS@PG-Nanofasergerüsten zunahm. Dies könnte auf das Vorhandensein von SO₄ . zurückgeführt werden ²⁻ Gruppen [29]. Wie in Abb. 5c gezeigt, begann die Abbaurate der meisten Gerüste nach 7 Tagen zuzunehmen, und die Abbauergebnisse am Tag 14 betrugen 8,45 %, 11,39 %, 13,97 % und 15,10 % für PG, 5 % CS@PG, 10 %CS@PG bzw. 15%CS@PG Nanofasergerüste. Die REM-Bilder von Nanofasergerüsten (Abb. 5d) zeigten nach 7 Tagen Eintauchen in PBS-Lösung eine leichte Schwellung. Die REM-Bilder zeigen, dass die entwickelten Nanofasern stabil genug waren, um einen ernsthaften Abbau und eine Ausdehnung für bis zu 7 Tage zu vermeiden, was die Zellreaktion in vivo oder in vitro beeinflusst.

Hämokompatibilitätsbewertung

APTT ist eine einfache und zuverlässige Methode zum Nachweis von Blut oder Plasma über den intrinsischen Gerinnungsmechanismus. APTT wurde getestet, um den Einfluss der elektrogesponnenen Nanofasern auf die mögliche Verzögerung der Blutgerinnung zu messen. Die durch APTT nachgewiesene Gerinnungszeit zeigte eine statistisch signifikante Abnahme der Gerinnungszeiten zwischen Kontroll-PG und 5 % CS@PG- und 10 % CS@PG-Nanofasern. Im Gegensatz dazu wurde nach der Inkubation von 15 % CS@PG-Nanofasern mit PPP eine verlängerte APTT gefunden, was auf seine verbesserte gerinnungshemmende Eigenschaft hinweist. Wie in Abb. 6a dargestellt, war die Auswirkung der Blutgerinnung vom Durchmesser der Nanofaserproben abhängig. Die niedrigste APTT-Koagulationszeit wurde nach Interaktion mit 5%CS@PG nanofibrös und die höchste APTT mit elektrogesponnenem 10%CS@PG gefunden, ähnlich dem Hämolysegrad. Die Gerinnungszeit wurde mit der Erhöhung des CS-Verhältnisses verlängert.

a APTT von CS@PG-Nanofasern. b Hämolyserate der Proben. c Stoffwechselaktivität der Blutplättchen auf den Nanofasern. n = 3, *p < 0.05

Nach ASTM F756-00 (2000) soll die Hämolyserate der Biomaterialien   <5 % betragen [30]. Der Hämolysegrad in dieser Studie wurde unter Verwendung eines kolorimetrischen Assays von freigesetztem Hämoglobin aus Erythrozyten durchgeführt und kann durch die Gleichung berechnet werden:Hämolyse (%) = (OD_sam − OD_neg )/(OD_pos − OD_neg ) × 100 %. Wie in Abb. 6b angegeben, waren alle Proben nicht hämolytisch und führten zu keiner ausgeprägten Hämolyse (Hämolyserate beträgt weniger als 5 %).

Die Daten des Experiments zur Lebensfähigkeit der Blutplättchen sind in Abb. 6c gezeigt. Nach 2 h war die metabolische Aktivität der angehefteten Thrombozyten am höchsten, wobei maximale Werte nach der Interaktion von PRP mit Nanofasern, insbesondere PG-Nanofasern, erreicht wurden. Interessanterweise nahm die Thrombozytenaktivität nach 24 h in allen Proben ab. Dieses Ergebnis könnte auf die schnelle Thrombozytenaktivierung durch die Struktur von Nanofasern zurückzuführen sein, die im Vergleich zu einer stabilen und langfristigen Thrombozytenaktivierung bei Kontakt mit der glatten Oberfläche zu einer schnellen Aufnahme und Freisetzung von Wachstumsfaktoren führt [31]. Die normale Lebensdauer von Thrombozyten beträgt etwa 8–10 Tage und verkürzt sich, wenn die Blutplättchen zu aktivieren beginnen.

Färbung lebender/toter Zellen

Der Einfluss von CS auf die Zytokompatibilität der Nanofasern wurde 6 Tage lang anhand der Zelllebensfähigkeit, der Adhäsionsmorphologie und der Verbreitung von HAECs auf Nanofasern untersucht. Die angehefteten Zellen wurden unter Verwendung des Calcein-AM/PI-Doppelfärbungskits, der DAPI-Färbung und des CCK-8-Testkits bewertet.

Abbildung 7a–e zeigten die Fluoreszenzbilder von lebenden und toten HAECs, die an die verschiedenen Nanofasern gebunden waren. Calcein-AM (grün) und PI (rot) wurden zum Färben der lebenden Zellen bzw. toten Zellen verwendet. Es konnte beobachtet werden, dass lebende Zellen an den CS@PG-Komposit-Nanofasern anhafteten, was darauf hindeutete, dass die Nanofasern mit unterschiedlichen CS-Verhältnissen keine Toxizität für HAECs aufwiesen. Eine weitere quantitative Analyse der Anzahl lebender/toter Zellen auf den Nanofasern wurde von Image J untersucht (Abb. 7f). Verglichen mit dem Anteil lebender und toter Zellen auf PG-Nanofasern wiesen die anderen drei Gruppen von PG mit unterschiedlichen CS-Verhältnissen, insbesondere 10 % CS@PG- und 15 %CS@PG-Gruppen, einen größeren Anteil an lebenden Zellen auf, und der Prozentsatz war erhöht mit zunehmender CS-Konzentration. Dieses Ergebnis zeigte, dass das Vorhandensein von CS in den Nanofasern für die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen von Vorteil war [32].

Zelllebensfähigkeit von HAECs auf den CS@PG-Gerüsten. a Gewebekulturplatte (TCP), b PG, c 5 %CS@PG, d 10%CS@PG, e 15%CS@PG, f Der Prozentsatz der lebenden/toten Zellzahlen verschiedener Nanofasergerüste, n = 3

Zelladhäsionsverhalten auf Nanofasern

Als wichtigste Voraussetzung für die Bildung von Blutgefäßen gelten nanofaserige Gerüste mit guter Biokompatibilität. PCL mit guter biologischer Abbaubarkeit und natürliches Gt mit ausgezeichneter Biokompatibilität wurden im Tissue Engineering mit unterschiedlichen Strukturen, einschließlich Hydrogelen, elektrogesponnenen Nanofasern und dreidimensionalen Gerüsten, häufig verwendet [21, 33, 34]. Die Morphologie der HAECs auf den zusammengesetzten Nanofasern und die Zell-Material-Wechselwirkung nach 24 h wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die Zelldichte von 10%CS@PG und 15%CS@PG war statistisch signifikant als PG und 5%CS@PG, was darauf hindeutet, dass die Zugabe von CS in einer höheren Konzentration die Zelladhäsion fördert. Wie in Abb. 8c gezeigt, war die Einzelzellfläche von 5 % CS@PG und 15 % CS@PG größer als die der anderen Gruppen von Nanofasern. Allerdings war die Zelldehnung von 10 % CS@PG signifikant höher als die von PG, 5 % CS@PG und 15 % CS@PG (Fig. 8d). Dieses Ergebnis könnte damit erklärt werden, dass die Zugabe von CS in einer Konzentration von 10 % die Verbreitung von HAECs erleichtern kann. Es wurde festgestellt, dass die HAECs auf den zusammengesetzten Nanofasern, insbesondere 10%CS@PG und 15%CS@PG, gut haften, sich ausbreiten und wachsen können. Somit können diese beiden Nanofasermaterialien als sichere und vielversprechende Kandidaten für vaskuläre Materialien in der klinischen Anwendung angesehen werden.

a Zelladhäsionsmorphologie von HAECs auf den CS@PG-Gerüsten (DAPI:Zellkerne; Rhodamin-Phalloidin:Zytoskelett). b Zelldichte. c Einzelzellenbereich, d Zelldehnung in verschiedenen Gruppen von Nanofasern

Zellproliferation

Zellwachstum und Lebensfähigkeit auf CS@PG-Nanofasern wurden in vitro mittels Fluoreszenzmikroskop und CCK-8-Test untersucht (Abb. 9a–c). Als Positivkontrolle wurde das elektrogesponnene PG-Gerüst gewählt. Die Ergebnisse des CCK-8-Assays für verschiedene Nanofaserfilme sind in Abb. 9c dargestellt. In 2, 4, 6 days of cells culturing, the cell number increased with the culture time for all groups. On day 6, the OD value of 10%CS@PG nanofibers was significantly higher than that of the PG scaffold. The cell proliferation comparison of 5%CS@PG, 10%CS@PG, and 15%CS@PG indicated that the cell proliferation rate was increased as the CS presence in composite nanofibers in a certain range. However, the cell proliferation capability was also influenced by the surface morphology of nanofibrous materials. Since the 15%CS@PG nanofiber exhibited strong viscosity due to the higher CS ratio in electrospinning polymeric solution, cell proliferation might be affected.

a HAECs proliferated on the nanofibers detected by cell staining for 2, 6 days, b Cell density on the nanofibrous scaffolds at 2, 6 days, n  = 3, *p  < 0.05, c CCK-8 assay after HAECs cultured on the PG, and CS@PG nanofibers at 2, 4, 6 days

Conclusions

In summary, biomimetic CS@PG composite nanofibers were successfully fabricated using electrospinning technology. Changed fiber morphology and diameter were obtained by varying CS concentrations in PG nanofibers. The CS@PG nanofibers possessed appropriate porosity (~ 80%) and PBS solution absorption (up to 650%). The incorporation of CS in PG nanofibers significantly improved their anticoagulant properties, prolonged their coagulation time, and enhanced cellular responses. Particularly, 10%CS@PG nanofibers exhibited favorable cell adhesion, elongation, and proliferation. Therefore, the PG composite nanofibers incorporated with a certain amount of CS inhibited antithrombogenicity and enhanced endothelial cell responses, which could be developed as a promising tissue-engineering scaffold in blood vessel repair and regeneration.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

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