Chondroitinsulfat-verstärkte Gelatin/Polycaprolacton-Nanofasern: Antithrombogener Gerüst mit überlegener Endothel-Affinität für Blutgefäß-Gewebetechnik

Zusammenfassung

Elektrogesponnene Polymer-Nanofasern haben in der Blutgefäß-Gewebetechnik viel Aufmerksamkeit erlangt. Herkömmliche Nanofaser-Materialien mit den Mängeln langsamer Endothelisierung und Thrombose sind jedoch nicht effektiv bei der Förderung der Reparatur und Regeneration von Blutgefäßgewebe. Hier wurden biomimetische Gelatin (Gt)/Polycaprolacton (PCL) Komposit-Nanofasern, die unterschiedliche Mengen an Chondroitinsulfat (CS) enthielten, mittels Elektrospinn-Technologie entwickelt, um ihre Auswirkungen auf Antithrombogenität und Endothelzell-Affinität zu untersuchen. Unterschiedliche CS-Konzentrationen in PG-Nanofasern beeinflussen Faser-Morphologie und -Durchmesser. Die CS/Gt/PCL-Nanofasern weisen geeignete Porosität (~ 80%) und PBS-Lösungsaufnahme (bis zu 650%) auf. Die Einführung von CS in Gt/PCL-Nanofasern verbessert deren Antikoagulantieneigenschaften erheblich, verlängert ihre Gerinnungszeit und erleichtert Zellantworten. Insbesondere 10% CS/Gt/PCL-Nanofasern zeigen günstige Zellanhaftung, -ausdehnung und -proliferation. Somit könnten Gt/PCL-Nanofasern, die eine bestimmte Menge CS enthalten, hervorragende Kandidaten als vielversprechendes Gewebetechnik-Gerüst in der Blutgefäß-Reparatur und -Regeneration sein.

Einleitung

Die Entwicklung nanofasriger Materialien hat als biomimetische Gerüste in der Gewebereparatur und -regeneration viel Aufmerksamkeit erregt, aufgrund ihrer einzigartigen (bio)physikochemischen Eigenschaften, einschließlich ihrer extrazellulären Matrix (ECM)-ähnlichen ultrakleinen Faserstruktur, ausgezeichneten mechanischen Eigenschaften, großer spezifischer Oberfläche und hoher Porosität mit Vernetzung [1, 2]. Es wurde gezeigt, dass nanofasrige Strukturen eine Schlüsselrolle bei der Vermittlung zellulärer Antworten spielen, wie Zelladhäsion, Morphologie (z.B. Ausbreitung, Ausrichtung, Ausdehnung etc.), Anordnung, Migration, Proliferation, Phänotyp und Differenzierung durch Kontaktführung [3,4,5]. Während zahlreiche Nano-Fertigungsstrategien (z.B. Nanoskiving, Templatesynthese, Phasentrennung etc.) eine verfügbare Technologie zur Herstellung nanofasriger Materialien bereitgestellt haben, ist Elektrospinnen eine der effektivsten Methoden, um Nanofasern aus verschiedenen Materialien (Metalle, Keramik, Polymer, Kompositmaterialien etc.) im industriellen Maßstab herzustellen [6,7,8].

Zusätzlich zu (bio)physikalischen Signalen kann die Auswahl geeigneter Biomaterialien Zellaktivitäten sowie Gewebereparatur und -regeneration signifikant beeinflussen [9]. Einige Schlüsseleigenschaften wie Biokompatibilität, Bioresorbierbarkeit, mechanische Eigenschaften und Biofunktionalität sollten berücksichtigt werden [9, 10]. Im Vergleich zu natürlich/natürlich und synthetisch/synthetisch Kompositen haben Komposit-Nanofaser-Materialien, die aus natürlichen und synthetischen Polymeren bestehen, mehr Aufmerksamkeit erhalten aufgrund der Kombination der ausgezeichneten biologischen Eigenschaften natürlicher Polymere und der mechanischen Festigkeit synthetischer Polymere [9]. Unter ihnen ist die Gelatin (Gt)/Polycaprolacton (PCL) Kombination eines der am meisten repräsentativ untersuchten natürlich-synthetischen Hybridsysteme und wird breit in der Blutgefäß-Gewebetechnik verwendet [11,12,13,14]. Allerdings haben Gt/PCL Komposit-Nanofasern immer noch einige Einschränkungen, wie langsame Endothelisierung und Thrombose. Kürzlich ist Chondroitinsulfat (CS) ein sulfatiertes Polysaccharid, das Glykosaminoglykan und Galactosamin enthält, welches nachgewiesen wurde, hohe Adhäsion an endotheliale Zellen (ECs), schwache Interaktion mit Proteinen und Thrombozyten sowie elektrostatische Abstoßung negativ geladener Blutkomponenten zu besitzen [15,16,17]. Zusätzlich könnte CS zelluläre Apoptose inhibieren und die Heilung vaskulärer Wunden erleichtern [18, 19]. Daher wären Gt/PCL (PG) elektrogesponnene Nanofasern, die CS enthalten, hervorragende Kandidaten als bio-instruktives Gewebetechnik-Gerüst für die Blutgefäß-Reparatur und -Regeneration.

In der vorliegenden Arbeit wurden biomimetische PG Komposit-Nanofasern, die unterschiedliche CS-Verhältnisse enthielten, mittels Eintopf-Elektrospinnen entwickelt. Die Morphologie, chemischen Eigenschaften, Porosität und Degradation von CS/PG Komposit-Nanofasern wurden durch verschiedene Charakterisierungstechniken detektiert. Die Antikoagulanz von PG/CS Komposit-Nanofasern wurde evaluiert. Weiterhin wurden diese Komposit-Nanofasern mit unterschiedlichen CS-Verhältnissen mit humanen aortalen Endothelzellen (HAECs) besät, um ihre Auswirkungen auf zelluläre Antworten zu untersuchen.

Materialien und Methoden

Materialien

CS (Rinderluftröhre, Typ A, Reinheit: 95%) wurde von Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd. (China) geliefert. PCL wurde von Aladdin Biochemical Polytron Technologies Inc. (China) bezogen. Gt (Rinderhaut, Typ B) wurden von Sigma-Aldrich Biochemical Technology Co., Ltd. (China) bezogen. Das aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) Kit wurde von Leigen Biotechnology Co., Ltd (China) gekauft. Essigsäure (Reinheit: 99,5%) wurde von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (China) gekauft. Humane aortale Endothelzellen (HAECs) wurden vom angeschlossenen Krankenhaus der Qingdao University (China) erhalten. Kulturm medium Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12), fötales Kälberserum (FBS), 0,25% Trypsin-EDTA wurden von Biological Industries (Israel) gekauft. Alle Reagenzien wurden von Sigma Aldrich (China) bezogen, sofern nicht anders angegeben. Das in allen Experimenten verwendete Wasser war deionisiert.

Elektrospinnen von Nanofasern

PCL (10% w/v) wurde in Essigsäure unter mechanischem Rühren bei Raumtemperatur für 4 h gelöst. Gt (10% w/v) wurde in 90% Essigsäure mit konstantem Rühren für 2 h gelöst. CS in verschiedenen Konzentrationen wurde zur Gt-Lösung hinzugefügt und 1 h bei Raumtemperatur sanft gerührt, um homogene Lösungen mit 5, 10 und 15 Gew.-% CS relativ zur Gesamtpolymkonzentration zu erhalten. Dann wurde die PG-Lösung durch Mischen der beiden obigen Lösungen in einem Gewichtsverhältnis von 50/50 (w/w) unter Rühren für 2 h hergestellt, benannt als 5%CS@PG, 10%CS@PG und 15%CS@PG.

Die hergestellten homogenen Lösungen wurden dem Elektrospinn-Prozess unterzogen, ausgestattet mit einer 1 mL Spritze mit 21 G Nadel und einem Kollektor, der mit Aluminiumfolie bedeckt war. In dieser Studie wurde der Abstand zwischen Kollektorplatte und Nadelspitze auf ca. 18 cm festgelegt, die Spannung auf 23 kV eingestellt, und die Polymerlösungen wurden mit einer Rate von 1 mL/h ausgepumpt. Alle Lösungen wurden in einem Elektrospinn-Instrument (Technology, Tk602TH, China) bei Raumtemperatur und sorgfältig kontrollierter Luftfeuchtigkeit (< 40%) elektrogesponnen. Vor weiteren Experimenten wurden die Proben mindestens 72 h in einem Vakuum-Trockenschrank getrocknet, um eventuelle Lösungsmittelreste zu entfernen.

Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Die Morphologie der CS@PG nanofasrigen Gerüste wurde mit einem SEM (VEGAS, TESCAN, Tschechien) bei einer Beschleunigungsspannung von 20 kV bei Raumtemperatur untersucht. Der Nanofaserdurchmesser (n = 100) wurde weiterhin aus SEM-Bildern mit Bildanalysesoftware (Image J) gemessen.

TEM-Beobachtungen und energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDS) Analysen wurden mit einem JEOL JEM-2100 plus (Japan) durchgeführt.

Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR)

FTIR wurde mit einem Nicolet iN10 FTIR-Spektrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) durchgeführt, um die charakteristischen Funktionsgruppen von CS, PG-Nanofaser und CS@PG-Nanofasern zu evaluieren. Die Spektren der Proben wurden im Transmissionsmodus über einen Wellenlängenbereich von 4000–500 cm⁻¹ mit einer Auflösung von 2 cm⁻¹ aufgezeichnet.

Porosität und Absorption von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)

Die Porosität der Nanofasern wurde mit der Flüssigkeitsverdrängungsmethode durchgeführt. Zuerst wurde das Trockengewicht der Nanofasern als W₁ gewogen. Dann wurden vier Gruppen von Nanofasern 2 h bei 25 °C in Ethanol getaucht und als W₂ gewogen. Das Ethanol auf der Probenoberfläche wurde durch Filterpapier entfernt, und die Gewichte der Proben wurden dann als W₃ notiert. Die Porosität der Nanofasern wurde durch folgende Formel berechnet:

Porosität (%) = (W₃ - W₁) / (W₃ - W₂) × 100

Für den PBS-Lösungsaufnahmetest wurden die erhaltenen Nanofasern im trockenen Zustand gewogen und als Wd notiert. Dann wurden die Nanofasern 24 h bei 25 °C in PBS eingeweicht, und das Gewicht im nassen Zustand wurde als Ww notiert, nachdem die überschüssige Flüssigkeit auf der Probenoberfläche entfernt wurde. Das Quellverhältnis kann durch folgende Gleichung gemessen werden:

PBS-Absorption (%) = (Ww - Wd) / Wd × 100

Alle Werte in den obigen Experimenten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) ausgedrückt.

In-vitro-Degradationsverhalten

Um den Widerstand der erhaltenen Nanofasern gegen Lysozym zu bestimmen, wurde die Degradierbarkeit der Proben zu festgelegten Zeitpunkten (1, 4, 7, 10 und 14 Tage) gemessen. Das Anfangsgewicht der Nanofasern wurde als Wᵢ notiert. Dann wurden die Proben in PBS-Lösung (pH 7,4) mit Lysozym (500 µg/mL) getaucht und in vitro bei 37 °C inkubiert. Zu den vorbestimmten Degradationsintervallen wurde jede Probengruppe entnommen, mit deionisiertem Wasser gewaschen und gefriertrocknet, um das Endgewicht (W_f) zu erhalten. Die Lysozymlösung wurde dreimal wöchentlich gewechselt. Die verbleibende Masse (%) der nanofasrigen Gerüste wurde wie folgt definiert:

Masse remaining (%) = (1 - (wᵢ - w_f) / wᵢ) × 100%

Zur Bewertung des Degradationsverhaltens der Probe nach 7 Tagen wurde die Morphologie der Nanofasern mit SEM beobachtet.

Blutkompatibilitätsanalyse

Aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT)

APTT wurde verwendet, um die Aktivität der intrinsischen und gemeinsamen Gerinnungspfade durch Testen der Gerinnungszeiten von thrombozytenarmem Plasma (PPP) nach Inkubation mit elektrogesponnenen Nanofasern auf Deckgläsern zu bewerten. Hierfür wurde antikoaguliertes Blut (ca. 10 mL) gesammelt und bei 3000 U/min für 20 Min zentrifugiert, um thrombozytenarmes Plasma (PPP) zu erhalten. Jede Probe wurde 10 Min bei 37 °C mit 200 µL PPP inkubiert und mit APTT-Kit gemäß Herstelleranweisung analysiert (n = 3).

Hämolyse-Test

Die Hämolyserate wurde durch Messen der Konzentration von Hämoglobin bewertet, das in die Lösungsphase aus Erythrozyten in verdünntem Vollblut freigesetzt wurde, das den elektrogesponnenen Nanofasern ausgesetzt war. Die Proben auf Deckgläsern wurden einzeln in 24-Well-Platten gelegt und 30 Min bei 37 °C in 2 mL PBS eingetaucht. Die Negativkontrollgruppen enthielten nur 2 mL PBS, während Positivkontrollgruppen aus 2 mL deionisiertem Wasser bestanden, um maximale Lyse der Erythrozyten zu induzieren (n = 3 für jede Testgruppe). Dann wurden 40 µL des oben genannten antikoagulierten frischen Vollbluts in jedes Well gegeben und 60 Min bei 37 °C inkubiert, wonach die Suspensionen in Zentrifugenröhrchen überführt und bei 100× g für 5 Min zentrifugiert wurden. Die Überstände wurden auf Absorption bei 570 nm mit einem Mikroplattenleser (SynergyH1/H1M, BioTek, China) gemessen.

Thrombogenität

Das thromogene Potenzial wurde in vitro nach Inkubation der elektrogesponnenen Proben mit thrombozytenreichem Plasma (PRP) evaluiert. PRP wurde durch Zentrifugation (1500 U/min, 20 Min) hergestellt und die obere Hälfte des Plasmas verworfen. Dann wurden die Nanofasern auf Deckgläsern 2 h bei 37 °C in 100 µL PRP inkubiert und dreimal vorsichtig mit PBS gespült für nachfolgende Experimente. Zur Bewertung der Thrombozytenaktivität nach Inkubation mit PRP wurden elektrogesponnene Nanofasern 2 h und 24 h in DMEM mit 10% FBS gehalten, und dann wurde ein CCK-8 Assay Kit verwendet, um die Thrombozytenvitalität auf den Nanofasern zu messen. CCK-8 (20 µL) wurde zu 200 µL serumfreiem DMEM-Medium in 24-Well-Platten gegeben und 1 h inkubiert. Schließlich wurden die Suspensionen an einem Mikroplattenleser bei 450 nm Wellenlänge gemessen.

Zellkultur und Zellvitalität

Humane aortale Endothelzellen (HAECs) wurden in DMEM mit FBS (10%, v/v) und Streptomycin/Penicillin (1%, v/v) in einer Atmosphäre von 37 °C und 5% CO₂ kultiviert. Das Kulturmmedium wurde dreimal wöchentlich gewechselt. Die Zellen wurden generell mit 0,05% Trypsin/EDTA für 3 Min isoliert, bei 1000 U/min zentrifugiert und in frischem Medium resuspendiert, um Zellpassage oder Zellaussaat durchzuführen.

Vor der Zellaussaat wurden alle nanofasrigen Materialien in einer 24-Well-Platte 1 h unter UV-Bestrahlung sterilisiert und 1 h in 75% Ethanol (v/v, %) eingetaucht. Dann wurden die Nanofasern viermal mit PBS-Lösung gespült und 12 h in DMEM im CO₂-Inkubator eingeweicht. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 10⁴ Zellen pro Well auf Nanofasern ausgesät und das Medium wurde täglich gewechselt. Nach 24 h Ko-Kultur wurden Zellen dreimal mit PBS-Lösung gewaschen und dann mit einem Calcein-AM/PI Doppel-Färbe-Kit (YEASEN Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China) gefärbt. PI wurde verwendet, um tote Zellen zu färben, und Calcein-AM für lebende Zellen.

Zellmorphologie auf den Nanofasern

Um die Zelladhäsion auf den Nanofasern zu beobachten, wurde die Morphologie der Zellen nach 24 h Ko-Kultur mit Fluoreszenzmikroskop (Nikon A1 MP, Japan) beobachtet. Zuerst wurden die Zellen mit 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 30 Min fixiert. Dann wurde 0,5% Triton X-100-Lösung für 5 Min verwendet, um die Zellmembran zu permeabilisieren. Schließlich wurde 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) zum Färben der Zellkerne und Rhodamin-Phalloidin zum Färben des F-Actins verwendet. Quantitative Analyse (Zelldichte, Einzelzellfläche, Zellausdehnung) wurde weiterhin mit Image J durchgeführt.

Zellproliferation

Zellproliferationsaktivität auf den Komposit-Nanofasern wurde mit einem CCK-8 Assay Kit durchgeführt. Die HAECs wurden mit einer Dichte von 8 × 10³ Zellen/Well auf Nanofasern ausgesät. Das Kulturmmedium wurde alle zwei Tage gewechselt. Nach 1, 4, 7 Tagen Ko-Kultur wurden die Zellen mit PBS-Lösung gewaschen, um nicht-anhaftende Zellen zu entfernen. Dann wurden 20 µL CCK-8 und das vollständige Medium im Volumenverhältnis 1:10 in die 24-Well-Platte für 1 h im Inkubator gegeben. Die Absorption wurde mit einem ELISA-Reader bei 450 nm getestet.

Zellfärbung mit DAPI und Rhodamin-Phalloidin wurde mit Fluoreszenzmikroskop durchgeführt, um direkt die Veränderungen der Zellzahlen nach 2 und 6 Tagen Ko-Kultur mit verschiedenen Nanofasern zu beobachten.

Statistische Analyse

Alle Proben in den Experimenten wurden in Triplikaten verarbeitet. Alle Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen (SD) dargestellt. Die statistische Analyse der Proben wurde durch einseitige Varianzanalyse (ANOVA) bestimmt, um Unterschiede mit Signifikanz bei p < 0,05 zu vergleichen.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung und Charakterisierung von CS@PG Nanofasern

Abbildung 1 zeigt das schematische Diagramm des Elektrospinn-Prozesses für CS@PG nanofasrige Gerüste und die in-vitro-Evaluation von Antikoagulation und Zytokompatibilität. Um konstruierte vaskuläre Gewebegerüste zur Förderung der Proliferation von Endothelzellen zu entwickeln, wurden unterschiedliche Verhältnisse von CS (5, 10 und 15 Gew.-%) in PG (10%, v/v) Lösungen eingearbeitet, um Komposit-Nanofasern mittels Elektrospinn-Prozess herzustellen.

SEM wurde durchgeführt, um die Struktur der CS@PG elektrogesponnenen Nanofasern zu beobachten. Wie in Abb. 2 gezeigt, wiesen die SEM-Bilder von PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG, 15%CS@PG Nanofasern eine dichte fasrige Architektur auf, die kontinuierliche, glatte und nanoskalige Fasern durch Elektrospinn-Technik enthielt. Die PG-Nanofasern (Abb. 2a) zeigten viele unregelmäßige Perlen auf den Nanofasern durch den Elektrospinn-Prozess, mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 406,01 ± 146,28 nm. Dies könnte dadurch erklärt werden, dass 10% w/v der elektrogesponnenen Lösung eine niedrige Viskosität aufwies, was zur Bildung inhomogener Nanofasern mit Perlen führte [20]. Mit zunehmender CS-Menge in der Polymerlösung von 5 auf 10 Gew.-% konnten homogene Nanofasern ohne Perlen aufgrund der erhöhten Lösungsviskosität erreicht werden (Abb. 2b, c). Entsprechend wiesen 5%CS@PG und 10%CS@PG einen kleineren durchschnittlichen Durchmesser von 382,35 ± 152,99 nm bzw. 300,29 ± 100,85 nm auf. Dieses Ergebnis ist hauptsächlich darauf zurückzuführen, dass die Erhöhung des CS-Gehalts die Leitfähigkeit der Elektrospinn-Lösung entsprechend erhöhte [20]. Als die Polymerkonzentration jedoch auf 15% anstieg, war die Viskosität der Polymerlösung zu hoch, um im elektrischen Feld gestreckt zu werden. Bei derselben Flussrate von 1 mL/h wie bei den vorherigen Gruppen beobachteten wir, dass unter der angewendeten Spannung von 23 kV das Nadelspitzenverstopfungsphänomen auftrat und der Taylor-Kegel nicht beobachtet werden konnte. Daher wurden die Flussrate der elektrogesponnenen Lösung und die angewendete Spannung auf 0,9 mL/h bzw. 20 kV angepasst. Die 15%CS@PG Nanofasern wurden erfolgreich mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 266,92 ± 105,43 nm hergestellt.

Wie in Abb. 3a dargestellt, wurde festgestellt, dass CS in den 5%CS@PG und 10%CS@PG Nanofasern gleichmäßig verteilt war. Allerdings wurde CS-Aggregation in den 15%CS@PG Fasern detektiert. Wie in Abb. 3b angegeben, wurde EDX-Elementaranalyse durchgeführt, um den Schwefelgehalt der hergestellten Fasern zu detektieren. Wie erwartet, stieg der Schwefelgehalt mit zunehmender CS-Konzentration in den erhaltenen Fasern.

FTIR-Spektren-Analyse

FTIR-Spektren-Analyse wurde durchgeführt, um die charakteristischen Absorptionspeaks der chemischen Gruppen der hergestellten nanofasrigen Gerüste zu bestimmen. Das FTIR-Spektrum von PG und CS wurden als Kontrollgruppen betrachtet, um mit CS@PG-Nanofaser-Gruppen zu vergleichen. Im PG-Spektrum können starke Absorptionsbänder, die bei 3300 cm⁻¹ und 2935 cm⁻¹ erschienen, der –NH₂ und –OH Streckschwingung sowie CH₂ asymmetrischer Streckschwingung zugeschrieben werden. Mehrere charakteristische Absorptionspeaks erschienen bei 1652 cm⁻¹ (Amid I) für C=O Streckschwingung, 1542 cm⁻¹ (Amid II) für N–H Biegungsschwingung, 1441 cm⁻¹ für CH₂ Streckung und 1267 cm⁻¹ (Amid III) für C–N Streckschwingung [21, 22]. Das CS-Spektrum zeigte charakteristisches Absorptionsband bei 1245 cm⁻¹, das die S=O Streckschwingung in negativ geladenem SO₄²⁻ repräsentiert [23, 24].

Wie in Abb. 4 gezeigt, zeigten die FTIR-Spektren von 5%CS@PG, 10%CS@PG und 15%CS@PG Nanofasern charakteristische Peaks von PCL, Gt und CS zusammen. Im Vergleich zu den Spektren der PG-Gruppe zeigten CS@PG-Gruppen das charakteristische Band von CS bei 1245 cm⁻¹, und die Intensität des CS-Bands nahm durch das Vorhandensein von CS in den Nanofasern zu. Dieser Befund bestätigte das Vorhandensein variierender CS-Gehalte in den CS@PG elektrogesponnenen Nanofasern.

Porosität, Quellverhältnis und Degradierbarkeit der Nanofasern

Die hohe Porosität der Faser deutet darauf hin, dass das Material eine ausgezeichnete Vernetzung aufweist, was die Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen in die Poren begünstigt und die Zellinfiltration fördert [25, 26]. Abbildung 5a zeigte die Porosität der nanofasrigen Filme. Die Porosität der erhaltenen Nanofasern mit unterschiedlichen CS-Verhältnissen betrug ungefähr bis zu 80%. Die hochporöse Architektur, die durch elektrogesponnene Nanofasern erhalten wurde, kann die natürliche ECM nachahmen und somit eine günstige 3D-Mikroumgebung für Zellen bieten [27]. Es wurde berichtet, dass Gerüste in der Gewebetechnik mit einer Porosität von bis zu 80% für den Transport von Nährstoffen und Metaboliten vorteilhaft waren.

Das PBS-Absorptionsverhältnis der CS@PG nanofasrigen Gerüste wurde verglichen, um den Effekt von CS auf die PBS-Aufnahme der Filme zu evaluieren. Wie in Abb. 5b angegeben, betrug das PBS-Absorptionsverhältnis des PG-Gerüsts 586,34 ± 49,44%, und die 5%CS@PG und 10%CS@PG Nanofasern betrugen 492,86 ± 21,99% bzw. 510,04 ± 69,55%. Das PBS-Absorptionsverhältnis der 15%CS@PG Gruppen (665,07 ± 59,81%) war signifikant höher als das von 5% CS@PG und 10%CS@PG. Dieses Ergebnis zeigte, dass der erhöhte CS-Gehalt in den Komposit-Nanofasern die PBS-Aufnahmeeigenschaft der Filme verbessern konnte, was auf die hohe Hydrophilie in CS-Molekülen mit hydrophilen Gruppen (Carboxyl und Hydroxyl) zurückzuführen sein könnte [28].

Die Daten des in-vitro-Degradationsexperiments wurden in Abb. 5c dargestellt, und es wurde festgestellt, dass mit der Erhöhung des CS-Verhältnisses die Degradationsrate der CS@PG nanofasrigen Gerüste ebenfalls zunahm. Dies könnte dem Vorhandensein von SO₄²⁻ Gruppen zugeschrieben werden [29]. Wie in Abb. 5c demonstriert, begann die Degradationsrate der meisten Gerüste nach 7 Tagen zu steigen, und die Degradationsergebnisse am Tag 14 betrugen 8,45%, 11,39%, 13,97% und 15,10% für PG, 5% CS@PG, 10%CS@PG und 15%CS@PG nanofasrige Gerüste, jeweils. Die SEM-Bilder der nanofasrigen Gerüste (Abb. 5d) zeigten leichtes Quellen nach Einweichen in PBS-Lösung für 7 Tage. Die SEM-Bilder zeigen, dass die entwickelten Nanofasern stabil genug waren, um ernsthafte Degradation und Expansion für bis zu 7 Tage zu vermeiden, was die Zellantwort in vivo oder in vitro beeinflusst.

Hämokompatibilitäts-Evaluation

APTT ist eine einfache und zuverlässige Methode zur Detektion von Blut oder Plasma über den intrinsischen Gerinnungsmechanismus. APTT wurde getestet, um den Einfluss der elektrogesponnenen Nanofasern auf die mögliche Verzögerung der Blutgerinnung zu messen. Die durch APTT detektierte Gerinnungszeit zeigte einen statistisch signifikanten Rückgang der Gerinnungszeiten zwischen Kontroll-PG und 5%CS@PG und 10%CS@PG Nanofasern. Im Gegensatz dazu wurde eine verlängerte APTT nach Inkubation von 15%CS@PG Nanofasern mit PPP gefunden, was auf seine verbesserte antikoagulante Eigenschaft hinweist. Wie in Abb. 6a dargestellt, war der Einfluss auf die Blutgerinnung abhängig vom Durchmesser der Nanofaser-Proben. Die niedrigste APTT-Gerinnungszeit wurde nach Interaktion mit 5%CS@PG nanofasrigen gefunden und die höchste APTT mit elektrogesponnenen 10%CS@PG, ähnlich dem Grad der Hämolyse. Die Gerinnungszeit verlängerte sich mit der Erhöhung des CS-Verhältnisses.

Laut ASTM F756-00 (2000) muss die Hämolyserate von Biomaterialien < 5% betragen [30]. Der Hämolysegrad in dieser Studie wurde mit einem kolorimetrischen Assay des freigesetzten Hämoglobins aus Erythrozyten durchgeführt und kann durch die Gleichung berechnet werden: Hämolyse (%) = (OD_sam - OD_neg)/(OD_pos - OD_neg) × 100%. Wie in Abb. 6b angegeben, waren alle Proben nicht-hämolytisch und führten zu keiner markanten Hämolyse (Hämolyserate < 5%).

Die Daten des Thrombozyten-Vitalitätsexperiments sind in Abb. 6c dargestellt. Nach 2 h war die metabolische Aktivität anhaftender Thrombozyten am höchsten mit maximalen Werten, die nach Interaktion von PRP mit Nanofasern erreicht wurden, insbesondere PG-Nanofasern. Interessanterweise reduzierte sich die Thrombozytenaktivität nach 24 h in allen Proben. Dieses Ergebnis könnte auf die schnelle Thrombozytenaktivierung durch die Struktur der Nanofasern zurückzuführen sein, was zu schnellem Verbrauch und Freisetzung von Wachstumsfaktoren im Vergleich zu stabiler und langfristiger Thrombozytenaktivierung bei Kontakt mit glatter Oberfläche führt [31]. Die normale Lebensdauer von Thrombozyten beträgt ca. 8–10 Tage und wird verkürzt, sobald Thrombozyten zu aktivieren beginnen.

Live/Dead Zellfärbung

Der Einfluss von CS auf die Zytokompatibilität der Nanofasern wurde durch Evaluation der Zellvitalität, adhäsiven Morphologie und Proliferation von HAECs auf Nanofasern für 6 Tage erforscht. Die anhaftenden Zellen wurden mit Calcein-AM/PI Doppel-Färbe-Kit, DAPI-Färbung und CCK-8 Assay Kit bewertet.

Abbildung 7a–e zeigte die Fluoreszenzbilder von lebenden und toten HAECs, die an den verschiedenen Nanofasern anhafteten. Calcein-AM (grün) und PI (rot) wurden verwendet, um lebende und tote Zellen zu färben. Es konnte beobachtet werden, dass lebende Zellen an den CS@PG Komposit-Nanofasern anhafteten, was anzeigte, dass die Nanofasern mit unterschiedlichen CS-Verhältnissen keine Toxizität für HAECs aufwiesen. Weitere quantitative Analyse der lebenden/toten Zellzahlen auf den Nanofasern wurde mit Image J untersucht (Abb. 7f). Im Vergleich zum Anteil lebender und toter Zellen auf PG-Nanofasern zeigten die anderen drei Gruppen von PG mit unterschiedlichen CS-Verhältnissen, insbesondere 10%CS@PG und 15%CS@PG Gruppen, einen größeren Prozentsatz lebender Zellen, und der Prozentsatz stieg mit der Erhöhung der CS-Konzentration. Dieses Ergebnis zeigte, dass das Vorhandensein von CS in den Nanofasern vorteilhaft für die Erhaltung der Zellvitalität war [32].

Zelladhäsionsverhalten auf Nanofasern

Nanofasrige Gerüste mit guter Biokompatibilität gelten als primäre Anforderung für die Generierung von Blutgefäßen. PCL mit guter Bioabbaubarkeit und natürliches Gt mit ausgezeichneter Biokompatibilität wurden in der Gewebetechnik mit verschiedenen Strukturen breit verwendet, einschließlich Hydrogele, elektrogesponnene Nanofasern und dreidimensionale Gerüste [21, 33, 34]. Die Morphologie von HAECs auf den Komposit-Nanofasern und Zell-Material-Interaktion nach 24 h wurde mit Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die Zelldichte von 10%CS@PG und 15%CS@PG war statistisch signifikant höher als PG und 5%CS@PG, was anzeigte, dass die Zugabe von CS auf höherem Niveau die Zelladhäsion fördert. Wie in Abb. 8c gezeigt, war die Einzelzellfläche von 5%CS@PG und 15%CS@PG größer als die anderer Nanofasergruppen. Allerdings war die Zellausdehnung von 10%CS@PG signifikant höher als PG, 5%CS@PG und 15%CS@PG (Abb. 8d). Dieses Ergebnis könnte dadurch erklärt werden, dass die Zugabe von CS bei 10% Konzentration die Ausbreitung von HAECs erleichtern kann. Es wurde festgestellt, dass HAECs an den Komposit-Nanofasern anhaften, sich ausbreiten und gut wachsen konnten, insbesondere 10%CS@PG und 15%CS@PG. Daher können diese beiden Nanofasermaterialien als sichere und vielversprechende Kandidaten für vaskuläre Materialien in der klinischen Anwendung betrachtet werden.

Zellproliferation

Zellwachstum und -vitalität auf CS@PG Nanofasern wurden in vitro durch Fluoreszenzmikroskop und CCK-8 Test untersucht (Abb. 9a–c). Der elektrogesponnene PG-Gerüst wurde als Positivkontrolle ausgewählt. Die Ergebnisse des CCK-8 Assays für verschiedene nanofasrige Filme sind in Abb. 9c dargestellt. An Tag 2, 4, 6 der Zellkultur nahm die Zellzahl mit der Kulturdauer für alle Gruppen zu. Am Tag 6 war der OD-Wert von 10%CS@PG Nanofasern signifikant höher als der des PG-Gerüsts. Der Zellproliferationsvergleich von 5%CS@PG, 10%CS@PG und 15%CS@PG zeigte, dass die Zellproliferationsrate mit dem Vorhandensein von CS in Komposit-Nanofasern in einem bestimmten Bereich zunahm. Allerdings wurde die Zellproliferationsfähigkeit auch durch die Oberflächenmorphologie der nanofasrigen Materialien beeinflusst. Da die 15%CS@PG Nanofaser starke Viskosität aufgrund des höheren CS-Verhältnisses in der Elektrospinn-Polymerlösung aufwies, könnte die Zellproliferation beeinträchtigt werden.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend wurden biomimetische CS@PG Komposit-Nanofasern erfolgreich mittels Elektrospinn-Technologie hergestellt. Durch Variation der CS-Konzentrationen in PG-Nanofasern wurden veränderte Faser-Morphologie und -Durchmesser erzielt. Die CS@PG Nanofasern besaßen geeignete Porosität (~ 80%) und PBS-Lösungsaufnahme (bis zu 650%). Die Einarbeitung von CS in PG-Nanofasern verbesserte deren antikoagulante Eigenschaften signifikant, verlängerte ihre Gerinnungszeit und verstärkte zelluläre Antworten. Insbesondere 10%CS@PG Nanofasern zeigten günstige Zelladhäsion, -ausdehnung und -proliferation. Daher hemmten die PG Komposit-Nanofasern, die mit einer bestimmten Menge CS eingearbeitet wurden, Antithrombogenität und verbesserten Endothelzell-Antworten, was als vielversprechendes Gewebetechnik-Gerüst in der Blutgefäß-Reparatur und -Regeneration entwickelt werden könnte.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem Artikel enthalten.