Hydroxylapatit-Nanopartikel fördern MSC-Osteogenese durch Endothelzell-Interaktion

Zusammenfassung

Nano-Hydroxylapatit (nano-HA) hat im Bereich der regenerativen Medizin erhebliche Aufmerksamkeit erregt. Endothelzellen (EC)-mesenchymale Stammzellen (MSC)-Interaktionen sind für den Knochenaufbau notwendig, aber die Art und Weise, wie nano-HA in diesen Prozess eingreift, bleibt unbekannt. Hier untersuchten wir die Zytotoxizität und osteoinduktiven Effekte von HA-Nanopartikeln (HANPs) auf MSCs mittels eines indirekten Co-Kultur-Modells, vermittelt durch ECs, und beleuchteten die zugrundeliegenden Mechanismen. Es zeigte sich, dass bei einer subzytotoxischen Dosis HANPs die Vitalität und Expression von Osteoblasten-Genen sowie mineralisierte Noduli und alkalische Phosphatase-Produktion von MSCs erhöhten. Diese Phänomene beruhten auf HIF-1α, sekretiert von ECs, welches die ERK1/2-Signaltransduktionskaskade auslöste. Zusätzlich wurde ein zweistufiges Zelllinien-Mathematikmodell etabliert, um den Einfluss von HIF-1α auf die osteogene Differenzierung von MSCs quantitativ zu analysieren. Es demonstrierte, dass HIF-1α einen dosisabhängig stimulierenden Effekt auf die osteogene Differenzierungsrate von MSCs bis zu 1500 pg/mL ausübte, was mit den obigen Ergebnissen übereinstimmte. Unsere Daten implizierten, dass kooperative Interaktionen zwischen HANPs, ECs und MSCs wahrscheinlich die Knochenregeneration stimulieren. Darüber hinaus ist das zweistufige Zelllinien-Modell ein hilfreiches In-vitro-System zur Bewertung des potenziellen Einflusses von Effektor-Molekülen in der Knochengewebetechnik.

Einleitung

Die Rekonstruktion von Knochendefekten, verursacht durch Trauma, angeborene Fehlbildungen oder chirurgische Resektion, stellt eine große Herausforderung für die Orthopädie dar. Hydroxylapatit (HA), ein repräsentatives bioaktives Keramikmaterial, wurde als Knochenersatz eingesetzt. Allerdings schränken unerwünschte mechanische und osteoinduktive Eigenschaften seine klinische Anwendung ein. In jüngeren Jahren hat nano-HA aufgrund seiner einzigartigen bionischen Eigenschaften eine optimalere Bioaktivität und verbesserte mechanische Leistungen demonstriert und erhebliches Interesse in biomedizinischen Bereichen im Zusammenhang mit regenerativer Medizin geweckt. Wenn nano-HA in Knochendefekte implantiert wird, werden mehrere an der Knochenreparatur beteiligte Zellen damit in Kontakt kommen. Daher ist es notwendig, das biologische Verhalten von nano-HA zu bewerten. Mehrere Beweislinien haben direkt demonstriert, dass HA-Nanopartikel (HANPs) von humanen Nabelschnur-Wharton'schen Gelee-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (hWJ-MSCs) und Osteoblastenzellen aufgenommen werden können, was zu verstärkter osteogener Differenzierung führt. Dua et al. berichteten zuvor über die Fähigkeit von HANPs, die Integration von konstruiertem Knorpel in de novo Knorpel zu fördern; conversely hemmen HANPs die angiogene Fähigkeit humaner Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs). Im Hinblick auf die menschliche Gesundheit ist ein umfassenderes Verständnis der Auswirkungen von HANPs auf die Knochenregeneration geboten, und laufende Anwendungen von ingenieurtechnisch hergestellten nano-basierten künstlichen Knochen erhöhen die Dringlichkeit solcher Studien.

Knochenregeneration wird unweigerlich von der Invasion von Neovaskeln begleitet. ECs sind die innere zelluläre Auskleidung des Gefäßsystems, die nicht nur passiv Blut liefern, sondern auch eine Rolle bei der Induktion, Spezifizierung und Führung der Organregeneration sowie bei der Aufrechterhaltung von Homöostase und Stoffwechsel spielen. MSCs sind Teil der periendothelialen Nische und besitzen Selbstverjüngungs- und Multidifferenzierungsfähigkeiten unter Induktion spezifischer physiologischer und biochemischer Mikroumgebungen in ihren ansässigen Nischen. Tsai et al. fanden, dass ECs Endothelin-1 sezernieren können, um MSCs in osteo- und chondro-lineage Differenzierung zu lenken. Zusätzlich nutzten Saleh et al. Microarray-Datenanalysen, um HUVEC-sezernierte Proteine und verwandte Crosstalk-Signalwege zu identifizieren, die mit MSC-membrangebundenen Rezeptoren interagieren, um Proliferation und osteogene Differenzierung zu verstärken. In der Knochengewebetechnik können HANPs mit Neovaskeln in Kontakt kommen und von ECs endozytiert werden, was gezeigt hat, die physiologische Funktion dieser Zellen zu verändern. Dies kann auch die umliegenden Osteoprogenitorzellen beeinflussen und die Knochenreparatur durch Veränderung parakriner Signalgebung beeinflussen. Während der direkte Einfluss von HANPs auf MSCs erforscht wurde, fehlt dennoch ein klares Verständnis darüber, ob HANPs die osteogene Differenzierung von MSCs indirekt über ECs induzieren können, was für unser Verständnis der Wirkung von HANPs auf die Knochenreparatur essenziell ist.

In dieser Studie wurde, um weitere Einblicke in die biologischen Effekte von HANPs auf die Interaktion zwischen ECs und MSCs zu gewinnen, ein indirektes Co-Kultur-Modell unter Verwendung von HUVECs und hWJ-MSCs etabliert. Mit diesem System wurden die Zytotoxizität und osteoinduktiven Effekte von HANPs auf hWJ-MSCs über HUVEC-vermittelte parakrine Signalgebung bewertet. Um Schlüsselfaktoren zu identifizieren, die HANP-induzierte Endothelzellen-MSC-Interaktionen beeinflussen, wurden lösliche Faktoren im Überstand von HUVECs, die mit HANPs stimuliert wurden, mit Schwerpunkt auf den zugehörigen Mechanismen auf Gen- und Proteinebene evaluiert. Die Ergebnisse demonstrierten, dass der Hypoxie-induzierbare Faktor (HIF)-1α eine kritische Rolle in diesen Interaktionen spielt.

Um den Einfluss von HIF-1α auf den Osteogenese-Prozess quantitativ zu beobachten und vorherzusagen, wurde ein mathematisches Modell etabliert, das eine zweistufige Zelllinie mit HIF-1α kombiniert. Hier wurde durch Analyse der empirischen Daten das zweistufige Zelllinien-Modell verwendet, um die MSC-Anzahl und den Differenzierungsgrad zu jedem Zeitpunkt basierend auf der definierten initialen Zellaussaatdichte und HIF-1α-Konzentration vorherzusagen, was wiederum geeignete Vorschläge für initiale Kulturbedingungen und Inkubationszeiten liefern kann. Die Ergebnisse dieser Studie werden helfen, Licht auf die Interaktionen zwischen nano-basierten Knochenersatzmaterialien und biologischen Systemen zu werfen, was der Entwicklung innovativer Biomaterialien für die regenerative Medizin dienen kann.

Materialien und Methoden

Präparation und Charakterisierung der Partikel

HANPs mit 20 nm (np20), 20×80 nm (np80) und mikrogroße HA-Partikel (m-HAP) mit ≥ 99,0 % Reinheit wurden von der Nanjing Emperor Nano Material Company Ltd (Nanjing, China) gekauft. Größe und Form der Partikel wurden mittels Transmissionelektronenmikroskopie (TEM; FEI Tecnai G2 Spirit Bio-Twin, FEI, Hillsboro, OR, USA) und Rasterelektronenmikroskopie (SEM; LEO1530VP, Deutschland) betrachtet. Die hydrodynamische Größe und das Zeta-Potenzial der HA-Partikel (HAPs) wurden über Zetasizer Nano ZS90 und Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, Malvern, UK) bestimmt.

Zellpräparation und Kultur

Alle experimentellen Protokolle wurden vom Ethikkomitee der Nanjing Medical University genehmigt. HUVECs und hWJ-MSCs wurden aus frischen menschlichen Nabelschnüren gewonnen, wie zuvor beschrieben, nach Erhalt schriftlicher Einwilligung der Spender. Kurz gesagt, die Nabelschnur und Nabelschnurvene wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 1 % Penicillin und Streptomycin (PS; Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, Pasching, Österreich) gespült. Dann wurde die Nabelschnurvene mit 0,1 % Kollagenase I (Sigma, St. Louis, MO, USA) gefüllt und 15 min bei 37 °C inkubiert. Nach Sammlung wurden die HUVECs in EC-Medium (ECM) (Sciencell, San Diego, CA, USA) kultiviert.

Anschließend wurden die Blutgefäße entfernt, und das Wharton'sche Gelee wurde in 1 mm² Stücke geschnitten und in 25 cm² Zellkulturflaschen (Corning Incorporated, Corning, NY, USA) gelegt. Diese Zellen wurden in L-DMEM (GIBCO Life Technology, Grand Island, NY, USA) mit 10 % fötalem Kälberserum (GIBCO) und 1 % PS inkubiert.

hWJ-MSCs wurden phänotypisch mittels monoklonaler Antikörper gegen CD13, CD29, CD34, CD44, CD45, CD51 und CD105 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) charakterisiert. HUVECs wurden mittels Von-Willebrand-Faktor (vWF; Shanghai ChangDao Biotech Co, Ltd., Shanghai, China) beurteilt. HUVECs zwischen Passage 3–7 und hWJ-MSCs zwischen Passage 3–5 wurden in diesen Experimenten verwendet.

Partikelsuspensionen bei 1 mg/ml in PBS wurden dann in L-DMEM auf die Endkonzentration verdünnt. Wie in Abb. 1 gezeigt, wurden HUVECs 18 h in der angegebenen HAP-Konzentration inkubiert. Das Kulturmedium wurde bei 15.000 U/min bei 4 °C für 15 min zentrifugiert, und die Überstände, ergänzt mit 10 % FBS, wurden als konditioniertes Medium (CM) für hWJ-MSCs verwendet, um die folgenden Experimente durchzuführen. Das CM bestand aus osteogenem Medium, ergänzt mit osteogenem Induktionsfluid, das 10 mM β-Glycerophosphat, 50 µg/ml L-Ascorbinsäure-2-phosphat und 0,1 µM Dexamethason (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) enthielt. Zusätzlich wurde 2-Methoxyestradiol (2-MeOE2) (Selleck Chemicals, Houston, TX, USA) als spezifischer HIF-1α-Inhibitor verwendet. In der 2-MeOE2(+) Gruppe wurden hWJ-MSCs mit CM von HUVECs kultiviert, die 40 min vor HAP-Zugabe mit 5 µM 2-MeOE2 vorbehandelt wurden. PD98059 wurde als spezifischer MEK-Inhibitor verwendet. In der PD98059-Gruppe wurden hWJ-MSCs mit CM kultiviert, das 5 µM PD98059 enthielt.

Bestimmung der Zellvitalität und -zahl

Die Zellvitalität wurde mittels MTS-Assay-Kit (MTS; Bestbio, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) bewertet. hWJ-MSCs wurden 24 h anhaften gelassen und dann 24 und 72 h mit CM kultiviert. Die Absorption von Formazan wurde bei 490 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (SpectraMax M2; Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, USA) ausgewertet. Die Absorption wurde auch in Zellzahlen unter Verwendung von Standardkalibrierungskurven unter gleichen Bedingungen umgerechnet.

Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)

TRIzol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) wurde verwendet, um die GesamtrNA aus hWJ-MSCs-Zellen zu isolieren, die für die angegebene Zeit in CM inkubiert waren. Komplementäre DNA wurde aus 1,0 µg RNA mit einem PrimeScript First Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, Tokyo, Japan) in einem T3-Thermocycler (Mastercycler 5333; Eppendorf, Hamburg, Deutschland) transkribiert. Die Expressionslevel der angegebenen Gene wurden mit FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) Kit (Roche, Basel, Schweiz) auf einem quantitativen Echtzeit-Verstärkungssystem (7900HT Fast; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) analysiert. Die relative mRNA-Expression des Zielgens wurde auf GAPDH normiert und dann mit der 2^(-ΔΔCt)-Methode bestimmt. Primer-Sequenzen für die Zielgene sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Alizarin-Rot-S (ARS) Färbung und quantitative Analyse

hWJ-MSCs wurden in 12-Well-Platten mit osteogenem Medium bis zu 14 Tage kultiviert, und dann wurde die extrazelluläre Matrix-Mineralisierung mittels ARS-Färbung (Leagene, Leagene Biotechnology, Beijing, China) beobachtet. Kurz gesagt, die Proben wurden 15 min mit absolutem Ethanol fixiert und dann bei Raumtemperatur 5 min in 1 % (Gew./Vol.) ARS (pH 4,2) gefärbt. Die gefärbten Zellen wurden zweimal mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen und dann fotografiert. Für die quantitative Analyse des Mineralisationsprozesses wurden 300 µl 10 % (Gew./Vol.) Cetylpyridiniumchlorid-Monohydrat (BOMEI, BOMEI Biotechnology, Hefei, China) zu jedem Well hinzugefügt, und die Platten wurden 30 min inkubiert. Insgesamt 90 µl aus jeder Probe wurden in eine 96-Well-Platte übertragen, und die Absorption wurde in Triplicate bei 405 nm gemessen.

Alkalische Phosphatase (ALP) Färbung und quantitative Analyse

Nachdem hWJ-MSCs in 12-Well-Platten mit osteogenem Medium bis zu 14 Tage kultiviert wurden, wurde ALP-Färbung mit einem BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit (Beyotime) durchgeführt. Kurz gesagt, hWJ-MSCs wurden in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Dann wurden Proben in einer Mischung aus Nitroblau-Tetrazolium und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat für 4 h gefärbt und fotografiert. Zur Quantifizierung der ALP-Synthese wurden Zellen in eiskaltem RIPA-Lysepuffer (Beyotime) 30 min lysiert. Zelllysate wurden bei 12.000 U/min bei 4 °C für 10 min zentrifugiert, und die Überstände wurden mittels ALP-Assay-Kit (Beyotime) quantitativ analysiert. Die Absorption wurde in Triplicate bei 405 nm gemessen und mithilfe einer Standardkurve in ALP-Aktivität umgerechnet.

Enzymgebundener Immunosorbenten-Assay (ELISA)

HUVECs wurden mit 2 × 10⁵ Zellen/Well ausgesät. CM wurde von HUVECs gesammelt, die 18 h mit HAPs kultiviert wurden (Zusatzdatei 1), und der Überstand wurde einer ELISA-Analyse unterzogen (Abb. 1). Ein humanes HIF-1α ELISA-Kit (Anhui Joyee Biotechnics, Anhui, China) wurde gemäß den Herstelleranweisungen verwendet.

Immunfluoreszenz

HUVECs wurden auf Objektträgern in 12-Well-Platten (7,6 × 10⁴ Zellen/Well) ausgesät. Nach 18 h Exposition gegenüber CM wurden Zellen in 4 % Paraformaldehyd (Biosharp, Beijing, China) fixiert und mit 0,1 % Triton X-100 (Beyotime) in PBS permeabilisiert vor Inkubation mit 1 % Anti-HIF-1α-Antikörper [EPR16897] (ab179483, Abcam, UK) über Nacht bei 4 °C. Anschließend wurden die Zellen 1 h im Dunkeln mit 1 % CoraLite594-konjugiertem Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) (Proteintech, USA) inkubiert. Dann wurden die Zellkerne mit DAPI (Beyotime, Shanghai, China) gefärbt, was den Zellen zugesetzt wurde und 30 s reagierte. Proben wurden mit einem Laserkonfokalmikroskop (Olympus, Japan) untersucht. Die Fluoreszenzintensität wurde mit ImageJ v.1.4 Analysesoftware (Bethesda, MD, USA) quantifiziert.

Western-Blot-Analyse

hWJ-MSCs wurden 24 h in CM inkubiert (extrazellulär signal-regulierte Kinase (ERK)1/2, p-ERK1/2) oder 7 Tage in osteogenem Medium (runt-bezogene Transkriptionsfaktor (RUNX)-2, Typ-1-Kollagen/Kollagen 1 (COL I)). Dann wurden die Zellen in RIPA-Lysepuffer 30 min lysiert. Zelllysate wurden zentrifugiert, und die Überstände wurden bei -20 °C für die Analyse gelagert. Nach 12 % SDS-PAGE wurden die Proteine auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran transferiert. Die verwendeten Primärantikörper waren Anti-p-ERK1/2, Anti-ERK1/2, Anti-RUNX-2, Anti-COL I und GAPDH (1:1.000, Kaninchen-polyklonale Antikörper; Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA). Nach Entfernen ungebundener Antikörper wurde die Membran 1 h mit Sekundärantikörpern inkubiert. Das Signal auf den Membranen wurde mit einem Chemilumineszenz-Gel-Imaging-System (LAS4000M; GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Schweden) detektiert. Das Verhältnis von p-ERK zu ERK und RUNX-2/COL I zu GAPDH wurde mit ImageJ v.1.4 Analysesoftware (Bethesda) quantifiziert.

Bewertung der Zellapoptose

hWJ-MSCs wurden mit einer Dichte von 10⁵ Zellen pro Well in 6-Well-Platten ausgesät. Adhärente Zellen wurden mit den angegebenen HIF-1α-Konzentrationen für die angegebene Zeit behandelt. Zellen wurden dann gesammelt und mit FITC-Annexin V und PI (Fcmacs, Nanjing, China) 15 min im Dunkeln markiert. Alle Proben wurden mit einem FACScan-Durchflusszytometer (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) getestet. Die Daten wurden mit FlowJo v10 (BD Biosciences) analysiert.

Zweistufiges Zelllinien-Modell

In Anbetracht des enormen Potenzials von HAPs und der Schwierigkeit, das Co-Kultur-System zu analysieren, war ein mathematisches Modell erforderlich, das quantitative Analysen und vertrauenswürdige Vorhersagen liefern konnte, um die Rolle von HIF-1α in der osteogenen Differenzierung von hWJ-MSCs zu verstehen.

hWJ-MSCs wurden mit 0, 300, 500, 1000, 1500, 2000, 3000 und 4000 pg/ml HIF-1α sowie osteogenem Induktionsfluid kultiviert. Nach Anpassung der Daten bei diesen Konzentrationen verwendeten wir die HIF-1α-Konzentrationen (produziert von HUVECs) in der Kontrolle, m-HAP, np80 und np20 Gruppen (240, 300, 325 und 375 pg/ml) zum Testen der Anpassungsgleichungen mit MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA). Um das Modell zu vereinfachen, betrachteten wir ihre ähnlichen Wachstumsmuster bei den unterschiedlichen HIF-1α-Konzentrationen als identisch. Der durchschnittliche Differenzierungsgrad wurde verwendet, um die Differenzierungsgrad-Zeit-Gleichung anzupassen. Die Proliferationsrate, Apoptoserate und osteogenen Differenzierungsgrade der hWJ-MSCs in den verschiedenen Gruppen wurden zu definierten Zeitpunkten detektiert.

Ein vereinfachtes zweistufiges Zelllinien-Modell, ähnlich einem mehrstufigen Zelllinien-Modell, wurde gemäß den experimentellen Daten etabliert. C₀ und C₁ repräsentieren die Zellzahl der hWJ-MSCs und terminalen Zellen. C₀ und C₁ werden durch folgende Gleichungen gesteuert:

dC₀/dt = [(K - C₀ - C₁)/K * p - (p - 1)] * v₀ * C₀

dC₁/dt = (2 - (K - C₀ - C₁)/K * p - p) * v₀ * C₀ - A * C₁

Hier repräsentiert p, beeinflusst durch HIF-1α und Zeit, die Replikationswahrscheinlichkeit der hWJ-MSCs. Entsprechend ist d = 1 - p die Differenzierungsrate, die durch Anpassung der geschätzten und experimentellen Zellzahlendaten ermittelt werden kann. Der Parameter v₀ quantifiziert, wie schnell sich die Zellen in jedem Linienstadium teilen (insbesondere v = ln2/c, wobei c die Dauer eines Zellzyklus ist). Die Apoptoserate der terminalen Zellen wird durch A symbolisiert. Zur Vereinfachung vernachlässigten wir, dass die Apoptoserate sich leicht über die Zeit ändert, und setzen A = 4,5 % als konstant. K bezeichnet die Umweltkapazität, da sich Zellen nicht unbegrenzt proliferieren können. HIF-1α erhöht die Differenzierungsrate der hWJ-MSCs, was zu einer durch HIF-1α modellierten Differenzierungsrate führt:

d = d₀ / (1 + (r*H)^m)

p = 1 - d

Hierin repräsentiert H die HIF-1α-Konzentration; d₀ bezeichnet die Differenzierungsrate bei 0 pg/ml HIF-1α; r stellt die Regulationsintensität dar (hier die Regulationsintensität von HIF-1α auf MSCs); und m entspricht dem Hill-Koeffizienten, scilicet der Beziehung zwischen MSC-Differenzierungsrate und HIF-1α-Konzentration.

Statistische Analyse

Alle Daten, die Normalverteilung und Homoskedastizität erfüllen, werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus drei oder mehr unabhängigen Experimenten ausgedrückt. SPSS 24.0 Software (SPSS Inc., Chicago, USA) wurde verwendet, um statistische Analysen mittels ein- oder zweifaktorieller ANOVA durchzuführen. Ein P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet. Die statistische Analyse wird mit GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA) präsentiert.

Ergebnisse

Charakterisierung der HAPs

Wie in Abb. 2 gezeigt, wurden HAPs mit spezifischer Größe und Form präpariert. Die Durchmesser der np20 mit annähernd kugelförmiger Form betrugen durchschnittlich 20 nm, und np80 war stäbchenförmig mit einer durchschnittlichen Länge von 80 nm und Breite von 20 nm. Die m-HAPs waren ebenfalls annähernd kugelförmig und etwa 12 µm im Durchmesser. Alle Partikel wiesen eine negative Oberflächenladung in L-DMEM auf. Es wurde vorgeschlagen, dass negative Werte des Zeta-Potenzials einen signifikant günstigen Effekt auf die Anheftung und Proliferation von Knochenzellen sowie auf die direkte Knochenbindung und Neubildung haben. Partikel, die in L-DMEM beobachtet wurden, neigen dazu, in wässrigen Systemen zu aggregieren. Ihre hydrodynamische Größe wurde ebenfalls getestet, was ebenfalls ein wichtiger Faktor für ihre biologischen Verhaltensweisen sein könnte.

Indirekte Toxizität von HAPs gegenüber hWJ-MSCs

Um die indirekte Toxizität von HAPs auf hWJ-MSCs zu bewerten, wurde die Zellvitalität mittels MTS-Assays gemessen. CM mit 50 µg/ml HANPs konnte die hWJ-MSC-Vitalität nach 24 h und 72 h signifikant stimulieren, besonders nach 24 h. CM mit 100 µg/ml HANPs verringerte die Zellvitalität jedoch um 15–20 % im Vergleich zur Kontrolle nach 72 h. Zudem stimulierte CM mit 25 µg/ml np20, aber nicht np80, die Zellvitalität nach 24 h. Diese Phänomene bestätigten, dass 50 µg/ml HANPs eine subzytotoxische Konzentration war, die in allen nachfolgenden Experimenten verwendet wurde (Abb. 3).

Indirekter osteoinduktiver Effekt von HAPs auf hWJ-MSCs

Um die indirekten osteoinduktiven Effekte von HANPs auf hWJ-MSCs zu identifizieren, wurde die Expression osteogener Gene durch quantitative RT-PCR-Analyse bewertet. Der Transkriptlevel für runt-bezogenen Transkriptionsfaktor 2 (RUNX-2) in den HANP-Gruppen, besonders np20, zeigte eine bemerkenswerte Zunahme von Tag 7 bis Tag 21 (Abb. 4a). Die Genexpression von Typ-I-Kollagen (Col I) in der np20-Gruppe zeigte eine Verstärkung von Tag 7 bis Tag 21, während die np80-Gruppe eine anhaltende Zunahme von Tag 7 bis Tag 14 demonstrierte (Abb. 4b). Osteocalcin (OCN) mRNA war in den HANP-Gruppen an Tag 14 deutlich upreguliert, was eine beschleunigte Osteogenese-Rate anzeigte (Abb. 4c). Die mRNA-Level von alkalischer Phosphatase (ALP) stiegen in den HANP-Gruppen offensichtlich an (Abb. 4d), was die osteogene Differenzierung von hWJ-MSCs anzeigte. Die m-HAP-Gruppe zeigte jedoch begrenzte Veränderungen bezüglich der Level dieser drei osteogenen Gene im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 4). Zusätzlich nahm die Expression von Pluripotenz-Markern NANOG, OCT3/4 und SOX2 in den HANP-Gruppen im Vergleich zur Kontrolle ab (Abb. 4e-g), was impliziert, dass die hWJ-MSCs in den HANP-Gruppen differenziert hatten, besonders in der np20-Gruppe. Ähnliche Ergebnisse wurden durch Western-Blot-Analyse erhalten (Abb. 5c, d), was anzeigte, dass die np20-Gruppe die Expression von RUNX-2 und COL I in hWJ-MSCs indirekt verstärken konnte.

Um den indirekten osteoinduktiven Effekt von HANPs auf hWJ-MSCs visuell zu beobachten, wurden die Zellen 14 Tage mit dem angegebenen osteogenen Medium inkubiert, gefolgt von ARS- und ALP-Färbung. Wie in Abb. 5a, b gezeigt, wurden eine erhöhte Anzahl mineralisierter Noduli und höhere ALP-Aktivität der hWJ-MSCs in den HANP-Gruppen im Vergleich zu m-HAP- und Kontrollgruppen beobachtet. Zudem zeigte m-HAP, ähnlich wie die Kontrolle, begrenzte Effekte auf die osteogene Differenzierung der hWJ-MSCs.

HAPs aktivierten ERK1/2-Signalgebung in hWJ-MSCs indirekt Co-kultiviert mit HUVECs

Um die Auswirkungen auf die parakrine Funktion von HUVECs durch HAPs zu untersuchen, wurden Immunfluoreszenz- und ELISA-Assays verwendet, um das mögliche Protein zu identifizieren, das die osteogene Differenzierung der hWJ-MSCs fördert. Wie in Abb. 6a-c gezeigt, wurde die intrazelluläre und extrazelluläre Produktion von HIF-1α durch HANPs (besonders np20) signifikant gefördert, während m-HAP nur einen begrenzten Effekt auf seine Produktion hatte.

Um den Differenzierungssignalweg der hWJ-MSCs, aktiviert durch HIF-1α, genauer zu verstehen, untersuchten wir die Schlüsseregulatoren des ERK1/2-Weges mittels Western-Blot-Analyse. Wie in Abb. 6d, e gezeigt, blieben die Proteinlevel von gesamtem ERK1/2 unverändert, während p-ERK1/2-Level in den hWJ-MSCs, die mit HANPs kultiviert wurden, deutlich erhöht waren, besonders in der np20-Gruppe. m-HAP hatte jedoch wenig Einfluss auf p-ERK1/2-Level in hWJ-MSCs, ähnlich wie sein Effekt auf HIF-1α-Produktion in HUVECs. Wichtig: Die erhöhten p-ERK1/2-Level in hWJ-MSCs, aktiviert durch HIF-1α, konnten durch 2-MeOE2, einen spezifischen HIF-1α-Inhibitor, blockiert werden, was anzeigte, dass HIF-1α upstream des ERK1/2-Signalwegs in hWJ-MSCs funktionierte.

HIF-1α förderte osteogene Differenzierung von hWJ-MSCs über den ERK1/2-Weg

Um zu bestimmen, ob HIF-1α für die beobachtete Stimulation der hWJ-MSC-osteogenen Differenzierung notwendig war, wurde ein spezifischer HIF-1α-Inhibitor (2-MeOE2) auf diese Zellkulturen angewendet. Wie in Abb. 7 gezeigt, waren die mineralisierte Matrix-Ablagerung und ALP-Aktivität der 2-MeOE2 (+)-behandelten Gruppe hWJ-MSCs, die in osteogenem Medium kultiviert wurden, abgeschwächt, was anzeigte, dass HIF-1α unentbehrlich für die osteogene Differenzierung der hWJ-MSCs war. Basierend auf diesen Ergebnissen untersuchten wir weiter die Rolle des ERK1/2-Weges in der osteogenen Differenzierung der hWJ-MSCs, aktiviert durch HIF-1α. Die mineralisierte Matrix-Ablagerung und ALP-Aktivität in hWJ-MSCs, die mit osteogenem Medium kultiviert wurden, wurden nach Verabreichung von PD98059, einem spezifischen MEK-Inhibitor, unterdrückt.

Zweistufige Zelllinien-Modelle

Um den intrinsischen Zusammenhang zwischen HIF-Konzentration und osteogener Differenzierung von hWJ-MSCs quantitativ zu enthüllen, wurden 0–4000 pg/ml HIF-1α verwendet, um acht Gruppen von hWJ-MSCs zu behandeln. Ein zweistufiges Zelllinien-Mathematikmodell wurde verwendet, um die Proliferations-, Apoptose- und osteogenen Differenzierungsraten dieser hWJ-MSCs, behandelt mit unterschiedlichen HIF-1α-Konzentrationen, zu analysieren. Wie in Abb. 8a gezeigt, wurden Anpassungsdaten verwendet, um die simulierte Formel (d/d₀ = 1/(0,14H² - 0,43H + 1)) und Kurve (blaue Kurve) zu erhalten, die zeigte, dass die Differenzierungsrate zunächst anstieg und dann mit steigender HIF-Konzentration abfiel. Spezifischer erreichte die Differenzierungsrate einen Peak bei 1500 pg/ml HIF-1α.

Gemäß unserer Studie betrugen die HIF-1α-Konzentrationen, produziert von HUVECs in der Kontrolle, m-HAP, np80 und np20 Gruppen, 240, 300, 325 und 375 pg/ml. Das schwarze Quadrat repräsentiert die durch 240, 300, 325 und 375 pg/ml HIF-1α geförderte Differenzierungsrate, und dies stimmt gut mit der simulierten Kurve überein. Zusätzlich stiegen die Differenzierungsgrade der hWJ-MSCs (relative ALP-Aktivität), behandelt mit unterschiedlichen HIF-1α-Konzentrationen, ähnlich mit der Zeit an. Daher vereinfachten wir das Modell, indem wir ihre Wachstumsmuster als ähnlich oder sogar identisch betrachteten. Wir fanden, dass der Anstieg der ALP-Aktivität von Tag 0 bis Tag 7 proportional zur Anzahl der Osteoblasten war, und Osteoblasten-Zellen erreichten ihren Peak im Plateauzeitraum. Daher erhielten wir nach Anpassung der ALP-Aktivität an die relative Osteoblasten-Zellzahlkurve (Osteoblasten-Zellzahl / maximale Osteoblasten-Zellzahl) das Maximum der ALP-Aktivität und die relative ALP-Aktivität (ALP-Aktivität / Maximum der ALP-Aktivität), die den Differenzierungsgrad darstellt (Abb. 8b). Durch Kombination dieser beiden Studien wurde die dreidimensionale Oberfläche des Differenzierungsgrades, der sich mit Zeit und HIF-1α entwickelt, erhalten (Abb. 8c).

Um die optimale Kulturzeit zu schätzen, war es notwendig, Zellzahlen zu simulieren. Nach Aufklärung der Differenzierungsrate unter verschiedenen HIF-1α-Konzentrationen simulierten wir die Größe jeder Population. Die Simulation nutzte eine initiale Aussaatdichte von 1500 Zellen pro Well (in einer 96-Well-Platte) mit unterschiedlichen HIF-1α-Konzentrationen. Wie in Abb. 8d-f gezeigt, stimmen die experimentellen Daten (schwarzes Quadrat) gut mit den simulierten Gesamtzellzahlen (blaue Kurve) überein, was die Summe der hWJ-MSCs- und Osteoblasten-Zahlen ist, und dies unterstützt die Fähigkeit dieses Modells, die Anzahl der hWJ-MSCs und Osteoblasten zu jedem Zeitpunkt vorherzusagen. Zudem näherte sich die Osteoblasten-Zellzahl dem Plateauzeitraum bei 21, 18 und 15 Tagen mit 0, 375 und 1500 pg/ml HIF-1α. Dieses Modell liefert die optimale Kulturzeit für die Gewebetechnik und liefert auch direkte Beweise dafür, dass HIF-1α die osteogene Differenzierung von hWJ-MSCs beschleunigt.

Diskussion

Mit jüngsten Fortschritten in Nanobiomaterialien waren nano-basierte künstliche Knochenersatzstoffe ein Bereich intensiver Untersuchungen. Die sich anhäufenden Beweise deuten darauf hin, dass es komplexe Interaktionen zwischen Zellen und Nanobiomaterialien aufgrund ihrer Kapazität gibt, Zellmembranen zu durchdringen und interne Retentionszeiten zu erhöhen. Eine frühere Studie zeigte, dass Kollagen/Alginat-Nanofilme an die MSC-Membran adsorbieren können, um intrazelluläre Signal-Kaskaden zu aktivieren und osteogene Differenzierung zu fördern. Elegante Experimente von Wu und Kollegen demonstrierten klar, dass TiO₂-Nanoröhren die Vaskularisierung und osteogene Differenzierung verbessern können, indem sie parakrine Effekte und Zellverbindungen über EC-MSC-Interaktionen erleichtern. Zum Zweck der Entwicklung exzellenter Kandidaten für Knochengewebetechnik ist es notwendig, den direkten Crosstalk zwischen nano-basierten Knochenersatzstoffen und an der Knochenreparatur beteiligten Zellen sowie ihre indirekten Interaktionen zu klären. Unser aktuelles Verständnis davon ist jedoch noch begrenzt. In der vorliegenden Studie nutzten wir ein indirektes Co-Kultur-Modell, um die biologischen Effekte von HANPs auf MSCs in Bezug auf die indirekten, durch ECs vermittelten Interaktionen weiter zu elucidieren.

Zytotoxizität ist ein primäres Problem bei der Bewertung der Biokompatibilität jedes Nanobiomaterials. Obwohl unsere frühere Studie fand, dass HANPs die Vitalität oder Apoptose von hWJ-MSCs nicht direkt beeinflussten, können sie dennoch unterschiedliche Auswirkungen über die Vermittlung anderer Zellen ausüben. Daher war es notwendig, die zytotoxischen Effekte von HANPs auf hWJ-MSCs, vermittelt durch HUVECs, zu bewerten. Interessanterweise wurde nach Inkubation in CM für 24 h und 72 h die hWJ-MSC-Vitalität in den 0–50 µg/ml HANP-Gruppen aufrechterhalten und sogar erhöht, besonders in der np20-Gruppe, was die Existenz von Effektor-Molekülen im CM anzeigte. Wenn die HANP-Konzentration 100 µg/ml erreichte, wurden sie zytotoxisch für hWJ-MSCs. Allerdings hatten 0–100 µg/ml m-HAP keinen Einfluss auf die hWJ-MSC-Vitalität (Abb. 3). Jiang et al. zeigten, dass ingenieurtechnisch hergestellte Nanopartikel einer bestimmten Größe unterschiedliche endozytotische Wege und Kinetiken haben können, die mit veränderter nachgeschalteter Signalgebung assoziiert sind, die die Zielzellfunktionen reguliert. In unserer früheren Studie zeigten wir, dass np20 und np80 von HUVECs endozytiert wurden, gefolgt von morphologischen Veränderungen und dem Auftreten großer Vakuolen, was den aktivierten Zustand der HUVECs anzeigte. Zudem könnten np20 mit ihrer schnelleren Aufnahmerate und erhöhter Anreicherung zu einer stärkeren Aktivierung der HUVECs führen, was möglicherweise die hWJ-MSC-Vitalität über parakrine Signalgebung erhöht. Umgekehrt können wenige m-HAPs von HUVECs endozytiert werden, was für ihren begrenzten Einfluss auf den Stoffwechsel der hWJ-MSCs verantwortlich sein könnte.

Um den potenziellen osteoinduktiven Effekt aktivierter HUVECs weiter zu erforschen, wurde eine subzytotoxische Dosis von 50 µg/ml HAPs in nachfolgenden Studien verwendet. Das CM, gesammelt von aktivierten HUVECs, förderte extrazelluläre Kalziumablagerung, ALP-Aktivität und osteogene Proteinexpression in hWJ-MSCs sowie die mRNA-Expression osteogener Gene (Abb. 4, 5). Runx2, ein essenzieller Transkriptionsfaktor, der an der Spezifizierung der Osteoblasten-Linie beteiligt ist, zeigte eine substanzielle Verbesserung in der np20-Gruppe, was einen starken osteoinduktiven Effekt auf hWJ-MSCs anzeigte (Abb. 4a und 5c, d). Die np20-Gruppe demonstrierte eine 1,5-fache Verbesserung der COLI-Expression an Tag 7 (Abb. 4b, 5c, d) und eine Verdopplung an Tag 14, was das Vorhandensein zusätzlicher differenzierter Osteoblasten in den HANP-behandelten Gruppen implizierte (Abb. 4b). OCN ist ein Spätstadium-Knochenmarker, und dieses Gen zeigte eine signifikante Zunahme in den HANP-Gruppen an Tag 14 (Abb. 4c), was anzeigte, dass np20 und np80 die Knochenreifung im Vergleich zu m-HAP beschleunigen können. ALP ist ein Frühmarker der Osteoblasten-Differenzierung, und er stieg offensichtlich mit Kulturzeit in jeder Gruppe an, besonders in der np20-Gruppe, was enthüllte, dass zusätzliche Transformation von MSCs zu Osteoblasten stattfand (Abb. 4d). Pluripotenz-Marker NANOG, OCT3/4 und SOX2 implizieren die Kapazität für Differenzierung. Wie in Abb. 4e-g gezeigt, implizierte die verringerte Expression in den Genen der HANP-Gruppen, dass die meisten hWJ-MSCs in HAP-Gruppen in Osteoblasten transformiert waren.

Unsere Daten demonstrierten, dass die Endozytose von HANPs durch HUVECs mit einer verbesserten osteogenen Differenzierung von hWJ-MSCs assoziiert war. Die Ursache dieses Ergebnisses ist jedoch derzeit unklar. In Bezug auf die parakrine Funktion von HUVECs konzentrierten wir uns auf lösliche Differenzierungs-induzierende Proteine im Überstand aktivierter HUVECs. HIF-1α-Signalgebung ist essenziell für die Kopplung von Ossifikation und Angiogenese während Knochenregeneration. Heikal et al. berichteten, dass verletzte ECs auch unter Normoxie-Bedingungen mehr HIF-1α sezernieren. Es wurde auch gezeigt, dass Exposition gegenüber HANPs die angiogene Fähigkeit von HUVECs hemmt. Daher maßen wir die HIF-1α-Konzentrationen im CM, und die Ergebnisse zeigten, dass der HIF-1α-Gehalt in den HANP-Behandlungsgruppen im Vergleich zu m-HAP- und Kontrollgruppen anstieg (Abb. 6a). Um die Rolle von HIF-1α in der osteogenen Differenzierung von hWJ-MSCs zu identifizieren, wurde 2-MeOE2, ein spezifischer HIF-1α-Inhibitor, verwendet. Die verringerte HIF-1α-Konzentration parallele die beeinträchtigte mineralisierte Matrix-Ablagerung und ALP-Aktivität in diesen hWJ-MSCs, was anzeigte, dass HANPs die HIF-1α-Produktion von HUVECs fördern können, um die Osteogenese von hWJ-MSCs zu erleichtern (Abb. 7).

Um HANPs ordnungsgemäß für die Knochengewebetechnik anzuwenden, ist es notwendig, weitere Einblicke in die Mechanismen zu gewinnen, durch die HANPs die osteogene Differenzierung von hWJ-MSCs, vermittelt durch HUVECs, fördern. Der ERK1/2-Weg ist nachgeschaltet von HIF-1α und fundamental für die Differenzierung von MSCs. In dieser Arbeit korrelierten die HIF-1α-Konzentrationen im CM gut mit den p-ERK1/2-Levels in hWJ-MSCs (Abb. 6b, c). Als 2-MeOE2 angewendet wurde, versagte die p-ERK1/2-Expression in hWJ-MSCs bei der Aktivierung, was anzeigte, dass HIF-1α upstream der ERK1/2-Signalgebung funktionierte. Um die Rolle der ERK1/2-Signalgebung in der osteogenen Differenzierung von hWJ-MSCs direkt anzugehen, wurde PD98059, ein spezifischer MEK-Inhibitor, verwendet. Die Unterdrückung der ERK1/2-Signalgebung führte zur niedrigsten osteogenen Differenzierung von hWJ-MSCs. Ein möglicher Grund dafür ist, dass der ERK1/2-Weg eine Schlüsselrolle in sowohl HIF-1α-Signalgebung als auch in Apoptose- und Proliferations-Signalwegen spielt, was für die beobachteten Veränderungen in der osteogenen Differenzierung dieser Zellen verantwortlich sein könnte. Zudem könnte dies auch mit dem Vorhandensein von vaskulärem Endothelwachstumsfaktor (VEGF) zusammenhängen. VEGF ist einer der nachgeschalteten Effektoren der HIF-1α-Signalgebung und kann auch die osteogene Differenzierung von MSCs über Aktivierung des ERK1/2-Weges fördern. Unsere frühere Studie fand, dass np20 die Produktion von VEGF in HUVECs induzierte; daher ist es möglich, dass die Unterdrückung des ERK1/2-Weges zur Inhibition von VEGF führen könnte, was zu einer verringerten osteogenen Differenzierung von hWJ-MSCs führen würde. Gemäß den verfügbaren experimentellen Ergebnissen können wir zusammenfassen: HANPs sind in der Lage, sowohl direkte als auch indirekte osteoinduktive Effekte optimaler zu verarbeiten als m-HAPs. Im Vergleich zu autologen Knochentransplantaten und Allografts gibt es eine umfangreiche Quelle von HANPs ohne sekundäre Schäden und potenzielle Immunogenität. Im Vergleich zu m-HAPs können HANPs jedoch die angiogene Fähigkeit von HUVECs unterdrücken und zeigen eine leichte Zytotoxizität sowohl zeit- als auch dosisabhängig.

Kürzlich haben zunehmende Beweise die Bedeutung von HIF-1α in der Knochenregeneration demonstriert. Wenige Studien konnten jedoch die MSC-Differenzierungsrate unter spezifischen Initialbedingungen, wie HIF-1α-Konzentration, quantitativ vorhersagen. Unter Berücksichtigung von Zellproliferation, Apoptose und osteogener Differenzierung präsentieren wir ein mathematisches Modell, das eine zweistufige Zelllinie mit HIF-1α kombiniert, das hochkorreliert mit unseren experimentellen Daten ist. Durch Anpassung der Differenzierungsrate von hWJ-MSCs in 0–4000 pg/ml HIF-1α erhielten wir die Gleichungen zur Beschreibung der Differenzierungsrate, HIF-1α-Konzentration und Zeit. Wie in Abb. 8d gezeigt, kann dieses Modell die Zellzahl-Landkarte unter verschiedenen HIF-1α-Konzentrationen darstellen, so dass es möglich ist, die intrinsische Dynamik des zweistufigen Systems zu erforschen. Zusätzlich validiert dieses Modell mathematisch den Effekt von HIF-1α auf die osteogene Differenzierung von hWJ-MSCs. Zudem basiert unser Modell auf einem mehrstufigen Zelllinien-Modell und logistischem Modell und ist ausreichend stabil, um langfristige Vorhersagen zu ermöglichen, ohne in die Falle einer unbegrenzten Populationsexplosion zu geraten.

Durch Verwendung der vorhandenen experimentellen Daten können sowohl Zellzahl als auch Differenzierungsrate mit einer definierten initialen Zellaussaatdichte und HIF-1α-Konzentration vorhergesagt werden. Als solches wird auch die optimale Inkubationszeit erhalten. Folglich können wir die optimale HIF-1α-Konzentration vorhersagen und den optimalsten Zeitpunkt für Osteogenese bestimmen, was für effiziente Gewebetechnik wichtig ist. Ein zweistufiges Zelllinien-Modell ist anwendbar für die Vorhersage von Proliferation und Differenzierung von Stammzellen, die zwei Zelllinien haben. Auf dieser Basis kann das Modell, gegründet auf den Initialbedingungen und vorhandenen experimentellen Daten, etabliert werden, um die optimalen Kulturbedingungen in vitro zu identifizieren, was bei der Optimierung der Knochenreparatur in vivo assistieren wird.

Schlussfolgerung

In dieser Studie untersuchten wir die spezifischen biologischen Effekte von HANPs auf hWJ-MSCs, vermittelt durch HUVECs. Im Vergleich zu m-HAPs zeigten sowohl np20 als auch np80 eine leichte Zytotoxizität sowohl zeit- als auch dosisabhängig. Wichtig: Die Größe der HANPs schien keinen signifikanten Einfluss auf diese Zytotoxizität zu haben. Unsere Daten zeigten auch, dass HANPs, besonders np20, in der Lage waren, HUVECs zu veranlassen, erhöhte Level von HIF-1α zu sezernieren, was direkt mit der verstärkten osteogenen Differenzierung von hWJ-MSCs über Aktivierung des ERK1/2-Weges korrelierte (Abb. 9). Bemerkenswerterweise legten die Ergebnisse des zweistufigen Zelllinien-Modells nahe, dass HIF-1α einen dosisabhängig stimulierenden Effekt auf die osteogene Differenzierungsrate von hWJ-MSCs ausübte. Zusätzlich wurden die optimale HIF-1α-Konzentration und Inkubationszeit basierend auf den Initialbedingungen mittels eines In-vitro-Modells geschätzt, was zukünftig für Gewebetechnik-Anwendungen unschätzbar wertvoll sein könnte. Insgesamt liefern diese Beobachtungen Beweise dafür, dass HANPs die Knochenregeneration durch Modulation von Zell-Zell-Interaktionen verbessern können.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Datensätze, die während der aktuellen Studie verwendet und analysiert wurden, sind auf angemessene Anfrage beim korrespondierenden Autor erhältlich.

Abkürzungen

HA:

Hydroxylapatit

HANPs:

HA-Nanopartikel

hWJ-MSCs:

Humane Nabelschnur-Wharton'sche Gelee-abgeleitete mesenchymale Stammzellen

HUVECs:

Humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen

m-HAP:

Mikrogroße HAP-Partikel

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

ECM:

EC-Medium

2-MeOE2:

2-Methoxyestradiol

ELISA:

Enzymgebundener Immunosorbenten-Assay

RUNX-2:

Runt-bezogener Transkriptionsfaktor 2

Col I:

Typ-I-Kollagen

OCN:

Osteocalcin

ALP:

Alkalische Phosphatase

SOX 2:

SRY-bezogener HMG-Box 2

ERK:

Extrazellulär signal-regulierte Kinasen

VEGF:

Vaskulärer Endothelwachstumsfaktor