MALAT1/miR-143/VEGFA-Achse treibt endotheliale Schädigung und intrakranielle Aneurysmen

Zusammenfassung

Die Rolle einiger long non-coding RNAs (lncRNAs) bei intrakraniellen Aneurysmen (IA) wurde in vielen Studien untersucht. Ziel dieser Studie ist die Aufklärung des Mechanismus der lncRNA Metastase-assoziierten Lungenadenokarzinom-Transkript 1 (MALAT1) / microRNA-143 (miR-143) / vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-A (VEGFA) Signalachse bei vaskulärer endothelialer Verletzung induzierter IA. MALAT1, miR-143 und VEGFA Expression in IA-Geweben und normalen Arteriengeweben wurden detektiert. Matrix-Metalloproteinase 9 (MMP-9) in Geweben, von-Willebrand-Faktor (vWF) in Serum und Geweben sowie Endothelin-1 (ET-1) im Serum wurden gemessen. Modellierte IA-Ratten erhielten injiziertes silenciertes oder überexprimiertes MALAT1 zur Detektion vaskulärer endothelialer Verletzung. Vaskuläre Endothelzellen von IA-Patienten wurden isoliert und mit silenciertem oder überexprimiertem MALAT1 transfiziert, um die Auswirkungen von MALAT1 auf Zelllebensfähigkeit und Apoptose zu verifizieren. Die Zusammenhänge zwischen MALAT1, miR-143 und VEGFA wurden durch Online-Vorhersage, Luciferase-Aktivitäts- und RNA-Pull-Down-Assays verifiziert. In IA-Geweben fand man Überexpression von MALAT1 und VEGFA sowie verminderte Expression von miR-143. Downregulation von MALAT1 hemmte Blutdruck, Expression von ET-1, vWF und MMP-9 sowie den apoptotischen Index vaskulärer Endothelzellen von IA-Ratten. Herunterreguliertes MALAT1 hemmte Apoptose und förderte Lebensfähigkeit vaskulärer Endothelzellen in IA. MALAT1 band an miR-143, und miR-143 zielte auf VEGFA. Diese Studie legt nahe, dass MALAT1 die VEGFA-Expression durch kompetitives Binden an miR-143 erhöht, wodurch Apoptose gesteigert und Lebensfähigkeit vaskulärer Endothelzellen in IA abgeschwächt wird.

Einleitung

Intrakranielle Aneurysmen (IA), auch zerebrale Aneurysmen genannt, entstehen durch erhöhten intrakraniellen Druck, verursacht durch lokale abnormale Erweiterung des zerebralen Arterienlumens oder der Arterienwand [1]. IA ist eine schwere Erkrankung mit hoher Mortalität und Morbidität; die Prävalenzrate beträgt etwa 1–3 % in der Allgemeinbevölkerung [2]. Hauptklinische Merkmale sind zerebrale Vaskospasmen, spontane zerebrale Blutungen und Okulomotoriusparesen [3]. Bisher bekannte Risikofaktoren für Entstehung und Fortschreiten von IA umfassen hämodynamische Störungen, Gene, Alterung, Infektionen und angeborene Faktoren [4]. Hauptklinische Behandlungen – hauptsächlich chirurgisches Clipping und/oder endovaskuläres Coiling – zielen auf die Verhinderung von Aneurysmaruptur ab [5]. Der detaillierte Mechanismus von IA bleibt jedoch ungeklärt, was den dringenden Bedarf an effektiveren Methoden im IA-Management reflektiert.

Long non-coding RNAs (lncRNAs) sind länger als 200 Nukleotide und gehören zu einer Spezies nicht-codierender RNAs [6]. Es wird berichtet, dass die Expression von lncRNA growth arrest-associated lncRNA 1 in IA herunterreguliert ist. Metastase-assoziiertes Lungenadenokarzinom-Transkript 1 (MALAT1) ist ein hochangereichertes, breit exprimiertes lncRNA von etwa 8000 nt Länge [7]. MALAT1 wurde dokumentiert, glatte Muskelfunktionsstörungen bei thorakalen Aortenaneurysmen zu modulieren [8]. Eine Studie präsentierte die abnormale Expression von lncRNAs und messenger RNA (mRNA) in IA, und lncRNA-mRNA-Co-Expressionsnetzwerke lieferten Hinweise zur Pathogenese von IA [9]. MALAT1 wurde vorgeschlagen, Osterix-Expression zu fördern und osteogene Differenzierung über Targeting von microRNA-143 (miR-143) Expression in menschlichen Knochenmark-Mesenchymstammzellen zu modulieren [10]. Eine Studie präsentierte die Rolle des miR-143/145-Clusters bei der Umkehr der Regulation von Krüppel-like Factor 5 in glatten Muskelzellen und dessen Kontraktilität und Proliferation in IA [11]. Laut Feng et al. könnte Downregulation von miR-143/145 und erhöhter Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9)-Spiegel im Kreislauf mit Bildung und Ruptur von IA zusammenhängen [12]. Eine Analyse ergab, dass die am stärksten dysregulierten miRNAs (miR-143 und miR-145) gemeinsame Zielgene in Signalwegen wie vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und anderen Genen, die zelluläre Bewegung oder Adhäsion regulieren, haben [13]. Eine Studie enthüllte die prädiktive Bedeutung von vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor-A (VEGFA) Variationen in IA [14]. Daher suchten wir den Mechanismus der MALAT1/miR-143/VEGFA-Signalachse in IA, induziert durch vaskuläre endotheliale Verletzung, zu evaluieren.

Materialien und Methoden

Ethikstatement

Die Studie wurde vom Institutional Review Board des First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China genehmigt und folgte den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki. Teilnehmer gaben schriftliche Einwilligung. Alle Tierexperimente entsprachen dem Guide for the Care and Use of Laboratory Animals der National Institutes of Health. Das Protokoll wurde vom Committee on the Ethics of Animal Experiments des First Affiliated Hospital of USTC genehmigt.

Studienteilnehmer

Zwanzig IA-Patienten (IA-Gruppe), die durch Bildgebung diagnostiziert wurden und neurochirurgisches Clipping im First Affiliated Hospital of USTC erhielten, wurden für unsere Experimente ausgewählt. Es waren 11 Männer und 9 Frauen im Alter von 43,27 ± 6,25 Jahren. IA-Gewebe wurden entnommen. Gleichzeitig wurden temporale kortikale arterielle Gefäßgewebe vom Temporalpol von 20 Patienten (Kontrollgruppe) mit temporaler Epilepsie durch Amygdala- und Hippocampus-Sklerose reseziert. Die resezierten Gewebe wurden postoperativ histopathologisch als normale Arteriengewebe untersucht; es waren 13 Männer und 7 Frauen im Alter von 44,18 ± 5,91 Jahren. Kein signifikanter Unterschied in Geschlecht und Alter zwischen IA-Gruppe und Kontrollgruppe (beide P > 0,05). Venöse Blutproben (2 Röhrchen) wurden von allen Probanden nüchtern morgens vor der Operation zur gleichen Zeit entnommen.

Etablierung von Ratten-IA-Modellen

Sechzig reinrassige Sprague-Dawley-Männchen (Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd., Hunan, China), 200–250 g, wurden 7 Tage gehalten (25 ± 2 °C, relative Luftfeuchtigkeit 65–70 %, 12 h Licht/Dunkel, freies Wasser und Futter). Ratten erhielten porzines Pankreaselastase in die externe Halsschlagader und um die Bifurkation der Arterienwand. Die externe Halsschlagader wurde mit zwei chirurgischen Fäden an der Verzweigung ca. 1,5 mm ligiert. Die externe Halsschlagader wurde zwischen den beiden Fäden durchtrennt, um ein internes Halsschlagader-Aneurysma im blinden Segment der externen Halsschlagader zu formen. Ratten erhielten 1 % Kochsalzlösung für 1 Woche postoperativ. Nach 1 Monat wurde zerebrale Angiographie durchgeführt und Aneurysmabildung beobachtet.

Nach Etablierung der IA-Rattenmodelle wurden 50 Ratten randomisiert in Blank-Gruppe (n = 10, modellierte Ratten erhielten stereotaktische Injektion von 100 µL Phosphat-gepuffertem Salzlösung (PBS) einmal täglich), sh-Negativkontrolle (NC)-Gruppe (n = 10, stereotaktische Injektion von 100 µL sh-MALAT1 NC einmal täglich), sh-MALAT1-Gruppe (n = 10, stereotaktische Injektion von 100 µL sh-MALAT1-Plasmid einmal täglich), Überexpression (Oe)-NC-Gruppe (n = 10, stereotaktische Injektion von 100 µL Oe-MALAT1 NC-Plasmid einmal täglich) und Oe-MALAT1-Gruppe (n = 10, stereotaktische Injektion von 100 µL Oe-MALAT1-Plasmid einmal täglich) [15]. Die Plasmide wurden von Shanghai Genechem Co., Ltd. (Shanghai, China) hergestellt.

Blutdruckmessung bei Ratten

Der Blutdruck der Schwanzarterie der Ratten wurde in der 1., 4. und 12. Woche postoperativ gemessen. Vor der Messung wurden Ratten kurz in ein Konstanttemperatur-Heizgerät gelegt, um Störungen durch Außentemperatur zu vermeiden. Anschließend wurden Ratten einige Minuten in einem speziellen Rattenkäfig ruhig gehalten, um Aktivitätsstörungen zu vermeiden. Bei starker Blutdruckvariation wurde die Messung zwei- bis dreimal zu verschiedenen Zeitpunkten wiederholt, um den Mittelwert zu erhalten.

Aneurysmagewebegewinnung

Nach 3 Monaten wurden Ratten mit 1 % Pentobarbital-Natrium (40 mg/kg) intraperitoneall narkotisiert, um Venenblutproben zu erhalten. Ratten wurden euthanasiert, der Brustkorb geöffnet, der linke Ventrikel in die Aorta kanüliert und die Hohlvene durchtrennt, um Blut abzulassen. Gleichzeitig wurden 30 ml normale Kochsalzlösung mit Heparin-Natrium zur schnellen Herzperfusion zur Blutausspülung genutzt, dann 10 ml 10 % Polyformaldehyd/0,1 M PBS (pH 7,4) in das Gehirn injiziert. Nach Perfusion und Fixierung wurde das Rattengehirn geöffnet. Die arterielle Zirkulation an der Schädelbasis wurde sorgfältig beobachtet, das Aneurysmagewebe separiert und die Aneurysmaveränderungen mikroskopisch beobachtet.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Serumindizes wurden per ELISA-Kit getestet. Gesammelte Blutproben wurden 1 h bei 37 °C inkubiert und 10 min bei 3000 r/min zentrifugiert. Detektion von Endothelin-1 (ET-1) und von-Willebrand-Faktor (vWF) Expression erfolgte gemäß Kit-Anweisungen (alle Kits von NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Jiangsu, China).

Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung

Proben wurden > 24 h in 10 % Formalin fixiert und in Paraffinblöcken eingebettet. Paraffinblöcke wurden 20 min mit Xylol entwachst, mit absteigender Alkoholreihe (100 %, 95 %, 80 %, 75 %) 1 min dehydriert und 10 min mit Hämatoxylin gefärbt. Dann mit destilliertem Wasser gespült, 30 s mit Salzsäure-Ethanol differenziert, 5 min in 50 °C warmem Wasser eingeweicht. Mit Eosinlösung gefärbt, mit destilliertem Wasser gespült, mit 70 % und 90 % Alkohol dehydriert, mit Xylol geklärt und mit neutralem Gummi versiegelt. Gewebemorphologie wurde unter Hochleistungsmikroskop beobachtet.

Transmissionselektronenmikroskopie

Reservegewebe wurden mit 2,5 % Glutaraldehyd und 1 % Osmiumsäure fixiert, dehydriert und in Epon812-Harz eingebettet. Semidünne Schnitte wurden mit Toluidinblau gefärbt, getrimmt und zu ultradünnen Schnitten verarbeitet. Schnitte wurden mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und mit einem JME-2000EX Transmissionselektronenmikroskop (Hitachi High-Technologies Co., Ltd., Shanghai, China) beobachtet.

TUNEL-Färbung

TUNEL-Färbung wurde verwendet, um Endothelzellapoptose bei IA-Ratten basierend auf TUNEL-Kit (Roche, Basel, Schweiz) zu beobachten. Präparierte Ratten-Aneurysmaschnitte wurden zweimal mit Xylol (5 min/je) gewaschen und mit absteigender Alkoholreihe (100 %, 95 %, 80 %, 75 %) 3-mal (5 min/je) dehydriert. Gewebe wurden 15–30 min mit 20 µg/ml Protease K-Lösung ohne DNase behandelt, mit 50 µl TUNEL-Reaktionslösung 60 min getropft und mit 50 µl Diaminobenzidin (DAB) bei 25 °C 10 min entwickelt. Dann mit Hämatoxylin gegengefärbt, mit Gradientalkohol dehydriert, mit Xylol geklärt und mit neutralem Gummi versiegelt. Schnitte wurden unter Lichtmikroskop beobachtet und apoptotischer Index berechnet.

Isolierung und Identifizierung von Aneurysma-Vaskulären Endothelzellen

Endothelzellisolierung erfolgte nach der Methode von Boscolo et al. [16]. IA-Gewebe wurden in 3 mm² Fragmente geschnitten. Gewebe wurden 25 min bei 37 °C mit 0,1 % Collagenase B / 0,1 % Dispase (Roche) inkubiert. Vor-detachierte Gewebe wurden 2 min mit 2 ml Pipette trituriert und durch 100-µm-Sieb (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) filtriert. Zellsuspension wurde zentrifugiert und in MV2-Medium (inkl. Wachstumsfaktoren und 20 % fötales Kälberserum) (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) resuspendiert. Zellen wurden mit 1 × 10⁴ Zellen/ml in Kulturflaschen mit 1 µg/cm² Fibronectin beschichtet ausgesät. Nach der Methode von Jackson et al. [17] wurden Zellen bei 80–100 % Konfluenz mit Perlen (Dynabeads M-450 Tosylactivated, Oxoid, Hampshire, UK) separiert, die mit Ulex europaeus Agglutinin I (UEA) (Vector Laboratories, Ltd., Peterborough, UK) beschichtet waren. An Lektin-beschichteten Perlen haftende Endothelzellen wurden mit magnetischem Partikelkonzentrator gesammelt, unkonjugierte Zellen mit Basalmedium gewaschen. UEA-positive Zellen wurden in Kulturmedium resuspendiert und in fibronectin-beschichtete Kulturflaschen ausgesät, um Adhäsion und Wachstumsrate zu verbessern.

Zellen wuchsen in MV2 auf fibronectin-beschichteten Kammer-Slides. Bei 80–100 % Konfluenz wurden Zellen in Aceton bei 4 °C fixiert, 5 min mit 1 % Triton X-100 und 15 min mit 0,5 % bovinem Serumalbumin (BSA) behandelt. Zellen wurden mit primärem Antikörper gegen vWF (1:300, Abcam, Cambridge, MA, USA) betröpfelt und 2 h inkubiert (NC ohne primären Antikörper), mit Peroxidase-konjugiertem Immunglobulin G (1:150, Abcam) 30 min inkubiert. Dann mit 50 µl DAB bei 25 °C 5 min entwickelt, mit Hämatoxylin gegengefärbt, mit 0,1 % Salzsäure differenziert, mit Alkohol dehydriert, Xylol-Klärung, neutrales Gummi-Versiegelung. Nach Trocknung wurden Zellen unter invertiertem Mikroskop fotografiert.

Zellgruppierung und Transfektion

Aneurysma-Vaskuläre Endothelzellen in logarithmischer Phase wurden in 5 Gruppen eingeteilt: Blank-Gruppe (keine Behandlung), sh-NC-Gruppe (transfiziert mit sh-MALAT1 NC-Plasmid), sh-MALAT1-Gruppe (transfiziert mit sh-MALAT1-Plasmid), Oe-NC-Gruppe (transfiziert mit Oe-MALAT1 NC-Plasmid), Oe-MALAT1-Gruppe (transfiziert mit Oe-MALAT1-Plasmid). Plasmide wurden von Genechem synthetisiert. Zelltransfektion erfolgte gemäß Anweisungen des Lipofectamine^TM 2000 Reagenz (11668-027, Invitrogen, Carlsbad, California, USA).

MTT-Assay

Vaskuläre Endothelzellen jeder Gruppe wurden in 96-Well-Platten mit 3 × 10⁴ Zellen/ml Dichte ausgesät und 48 h bei 37 °C, 5 % CO₂ kultiviert. Jede Gruppe hatte 5 parallele Wells, jedem Well wurden 20 µl frische MTT-Lösung (5 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) zugegeben. Nach 4-h Reaktion wurden Zellen mit 200 µl Dimethylsulfoxid gemischt. Nach vollständiger Auflösung wurde der optische Dichtewert jeder Gruppe bei 490 nm mit Mikroplattenreader (BioRad, Hercules, California, USA) gemessen.

Durchflusszytometrie

Zellzyklusverteilung wurde durch Propidiumiodid (PI) Färbung getestet. Vaskuläre Endothelzellen wurden abgelöst, zentrifugiert, in vorkühlten 75 % Ethanol resuspendiert und über Nacht bei −20 °C fixiert. Zellen wurden zentrifugiert, Überstand verworfen. Zellen in 450 µl PBS resuspendiert, 100 µl RNase A zugegeben, 400 µl PI bei 4 °C 30 min im Dunkeln gefärbt. Durchflusszytometer (FACSCalibur, Becton, Dickinson and Company, NJ, USA) wurde zur Zellzyklusanalyse genutzt.

Zellapoptose wurde durch Annexin V/PI Doppel-Färbung getestet. Abgelöste Endothelzellen wurden gesammelt, 3-mal mit PBS gewaschen. Zellen in 100 µl vorkühlten 1 × Binding-Puffer resuspendiert, mit 5 µl Annexin und 5 µl PI gemischt. Zellapoptose per Durchflusszytometer getestet. Mit Annexin V als x-Achse und PI als y-Achse: linker oberer Quadrant = mechanisch verletzte Zellen (Annexin V⁻/PI⁺), rechter oberer = späte apoptotische/nekrotische Zellen (Annexin V⁺/PI⁺), linker unterer = negative normale Zellen (Annexin V⁻/PI⁻), rechter unterer = frühe apoptotische Zellen (Annexin V⁺/PI⁻). Gesamtapoptotische Zellen (Annexin V⁺/PI⁻ und Annexin V⁺/PI⁺) wurden berechnet und als Prozentsatz ausgedrückt.

Reverse Transkription Quantitative PCR (RT-qPCR)

Gesamt-RNAs in Geweben und Zellen wurden mit Trizol (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China) extrahiert, Konzentration und Reinheit bestimmt. Reverse Transkription von RNA in cDNA erfolgte gemäß Reverse Transkriptionskit (K1621, Fermentas, Maryland, NY, USA). MALAT1, miR-143, VEGFA Primersequenzen (Tabelle 1) wurden von Genechem entworfen und synthetisiert. Zur Evaluierung der Expression von lncRNA, miRNA oder mRNA wurde RT-qPCR mit SYBR Green PCR Master Mix (Takara, Tokyo, Japan) und Roche Real-Time PCR System (Roche) durchgeführt. U6 diente als interner Parameter für miR-143, MALAT1 und VEGFA mit Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) als internen Parametern. Relative Transkriptionslevel der Zielgene wurden mit 2^−ΔΔCt Methode berechnet.

Western Blot Analyse

Gesamtprotein aus Geweben und Zellen wurde extrahiert. Proteinkonzentration wurde per Bicinchonsäure-Kit (Boster Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, Hubei, China) bestimmt. Protein wurde durch Elektrophorese mit 10 % Polyacrylamidgel (Boster Biological Technology) getrennt. Membran auf Polyvinylidenfluorid-Membran transferiert und 1 h mit 5 % BSA blockiert. Membran wurde mit Primärantikörpern gegen Ki-67 (1:1000), VEGFA (1:1000), vWF (1:1000), MMP-9 (1:1000, Abcam, Cambridge, UK), Cyclin D1 (1:1000), Bax (1:1000), Bcl-2 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA) und GAPDH (1:2000, Jackson Immuno Research, Grove, Pennsylvania, USA) sowie Sekundärantikörper (1:500, Jackson Immuno Research) mit Peroxidase markiert inkubiert. Membran wurde mit Odyssey Zwei-Farben-Infrarot-Fluoreszenz-Imaging-System detektiert, Grauwerte der Bänder mit Quantity One Bildanalysesoftware gemessen.

Dual-Luciferase-Reporter-Gen-Assay

Bindungsstellen von MALAT1 und miR-143 wurden durch Bioinformatik-Website (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) vorhergesagt und erklärt. Bindungsbeziehung zwischen MALAT1 und miR-143 wurde durch Luciferase-Reporter-Gen-Assay weiter verifiziert. Synthetisches MALAT1 3′untranslatiertes Region (3′UTR) Genfragment wurde in pmiR-Report Luciferase-Reporter-Vektoren (Thermo Fisher Scientific) eingeführt, um MALAT1 Wildtyp (MALAT1-WT) durch Endonuklease-Stellen BamH1 und EcoR1 zu generieren. Komplementäre Sequenzmutationsstelle der Sequenz wurde auf MALAT1-WT entworfen, und Zielfragment in pmiR-Report Vektoren eingefügt, um MALAT1 Mutanttyp (MALAT1-MUT) durch T4 DNA-Ligase nach Restriktionsendonuklease-Verdau zu produzieren. Korrekt sequenzierte MALAT1-WT und MALAT1-MUT wurden mit Mimik NC und miR-143 Mimik in vaskuläre Endothelzellen ko-transfiziert. Zellen wurden 48 h post-Transfektion geerntet und lysiert, Luciferase-Aktivität mit Luciferase-Detektionskit (BioVision, San Francisco, CA, USA) und Luminometer (Glomax20/20, Promega, Madison, Wisconsin, USA) getestet.

Zielbeziehung von miR-143 und VEGFA und Bindungsstelle von miR-143 und VEGFA 3′UTR wurden durch Bioinformatik-Website (https://www.targetscan.org/vert_72/) vorhergesagt. Sequenz des VEGFA 3′UTR Promotorbereichs mit miR-143-Bindungsstelle wurde kompiliert und in pmiR-Report Vektoren geklont, um VEGFA-WT zu generieren. Basierend auf diesem Reporter wurde Bindungsstelle von VEGFA-WT und miR-143 mutiert, um VEGFA-MUT zu bilden. VEGFA-WT oder VEGFA-MUT Reporter wurde mit Mimik NC oder miR-143 Mimik gemischt und 48 h in vaskuläre Endothelzellen ko-transfiziert. Danach wurden Zellen lysiert und Luciferase-Aktivität mit Luciferase-Detektionskit getestet.

RNA-Pull-Down-Assay

Zur Verifizierung der Bindungsbeziehung zwischen miR-143 und MALAT1 wurde RNA-Pull-Down-Assay durchgeführt. Drei Biotin-markierte miRNA-Sequenzen Bio-miR-143-WT, Bio-miR-143-MUT und Bio-miR-NC wurden entworfen und GenePharma Company (Shanghai, China) anvertraut. Diese biotinylierten Oligonukleotide wurden 48 h in Zellen transfiziert. Dann wurden Zellen geerntet und 10 min mit spezifischem Zelllysepuffer (Ambion, Austin, Texas, USA) inkubiert. Anschließend wurde Lysat 3 h bei 4 °C mit M-280 Streptavidin-Perlen, vorbeschichtet mit RNase-freier und Hefe-tRNA (alle von Sigma), inkubiert, dann zweimal mit kaltem Lysepuffer, dreimal mit niedrigsalzigem Puffer und einmal mit hochsalziger Pufferlösung gewaschen. Antagonistischer miR-143-Probe als NC etabliert. Gesamt-RNA mit Trizol extrahiert, MALAT1-Anreicherungslevel per RT-qPCR getestet.

Statistische Analyse

Alle Daten wurden mit SPSS 21.0 Software (IBM Corp. Armonk, NY, USA) analysiert. Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung. Vergleiche zwischen zwei Gruppen durch unabhängigen Stichproben-t-Test, Vergleiche unter mehreren Gruppen durch einseitige Varianzanalyse (ANOVA), Paarvergleiche durch Tukeys multiple Vergleiche. Zusammenhang zwischen MALAT1-Expression und klinisch-pathologischen Merkmalen von IA durch Chi-Quadrat-Test. P < 0,05 indikativ für statistisch signifikanten Unterschied.

Ergebnisse

MALAT1 und VEGFA sind überexprimiert, miR-143 herunterreguliert in IA-Geweben

ET-1 und vWF Expression im Serum in IA-Gruppe und Kontrollgruppe wurden per ELISA detektiert; Ergebnisse zeigten erhöhte ET-1 und vWF Expression in IA-Gruppe vs. Kontrollgruppe (beide P < 0,05) (Abb. 1a, b).

Abbildung 1: MALAT1 und VEGFA überexprimiert, miR-143 herunterreguliert in IA-Geweben. a ET-1 Expression im Serum von IA-Patienten und temporaler Epilepsie-Patienten per ELISA. b vWF Expression im Serum von IA-Patienten und temporaler Epilepsie-Patienten per ELISA. c Pathologische Beobachtung von IA-Geweben und normalen Arteriengeweben per HE-Färbung. d Morphologische Beobachtung von IA-Geweben und normalen Arteriengeweben per Transmissionselektronenmikroskop. e MALAT1, miR-143, VEGFA mRNA Expression in IA-Geweben und normalen Arteriengeweben per RT-qPCR. f VEGFA, MMP-9, vWF Protein-Expression in IA-Geweben und normalen Arteriengeweben per Western Blot. Endothelzellen (ECs), interne elastische Lamina (IEL), glatte Muskelzellen (SMC). Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung; Gruppenvergleiche durch unabhängigen Stichproben-t-Test.

Pathologische Veränderungen von IA-Geweben wurden per HE-Färbung beobachtet. In normalen Arteriengeweben war keine offensichtliche Schädigung von Endothel, Endothelzellen und glatten Muskelzellen zu sehen; Zellen waren ordentlich angeordnet und hatten vollständige Struktur. IA-Gewebe zeigten geschädigte Endothelzellen, degenerierte glatte Muskelzellen, verdünnte Arterienwand, rupturierte elastische Fasern und infiltrierte Entzündungszellen (Abb. 1c).

Ultrastrukturelle Veränderungen von IA- und normalen Arteriengeweben wurden per Transmissionselektronenmikroskop beobachtet. In normalen Arteriengeweben waren Endothelzellen vollständig und Adventitia-Struktur intakt; keine gebrochene interne elastische Membran oder apoptotische glatte Muskelzellen. In IA-Geweben zeigte sich schwere Degeneration der Gefäßwand, hauptsächlich Verschwinden der meisten Endothelzellen, schwer gebrochene interne elastische Schicht, schwer geschädigte und degradierte glatte Muskelzellen und Unordnung der äußeren Membran des Blutgefäßes (Abb. 1d).

RT-qPCR zur Bestimmung von MALAT1, miR-143, VEGFA mRNA-Expression, Western Blot für VEGFA, MMP-9, vWF Protein-Expression in IA-Geweben und normalen Arteriengeweben. Im Gegensatz zu normalen Arteriengeweben waren MALAT1, VEGFA, MMP-9, vWF Expression erhöht und miR-143 Expression erniedrigt in IA-Geweben (alle P < 0,05) (Abb. 1e, f).

Hunt-Hess-Grad, Grad der Endothelschädigung und Rauchgeschichte korrelieren mit MALAT1-Expression in IA-Geweben

Basierend auf medianer MALAT1-Expression wurden Patienten in Niedrig- und Hochexpressionsgruppe eingeteilt. Zusammenhang zwischen MALAT1-Expression und klinisch-pathologischen Merkmalen von IA-Patienten wurde analysiert. Ergebnisse legten nahe, dass Hunt-Hess-Grad, Grad der Endothelschädigung und Rauchgeschichte mit MALAT1-Expression assoziiert waren (alle P < 0,05), während Alter, Geschlecht und Operationsmodus nicht mit MALAT1-Expression zusammenhingen (alle P > 0,05) (Tabelle 2).

Downreguliertes MALAT1 unterdrückt Blutdruck, Expression von ET-1, vWF, MMP-9 und apoptotischen Index vaskulärer Endothelzellen von IA-Ratten

Wie in Tabelle 3 gezeigt, senkte MALAT1-Knockdown, während MALAT1-Wiederherstellung den Blutdruck in Woche 4 und 12 erhöhte.

Abbildung 2: Downreguliertes MALAT1 unterdrückt Blutdruck, Expression von ET-1, vWF, MMP-9 und apoptotischen Index vaskulärer Endothelzellen von IA-Ratten. a ET-1 Expression im Serum von Ratten per ELISA. b vWF Expression im Serum von Ratten per ELISA. c Pathologische Veränderungen von IA-Geweben in Ratten per HE-Färbung. d Ultrastruktur von IA-Geweben in Ratten per Transmissionselektronenmikroskop. e Apoptose vaskulärer Endothelzellen per TUNEL-Färbung. f Vaskulärer Endothelzell-apoptotischer Index von Ratten. g MALAT1, miR-143, VEGFA mRNA-Expression in IA-Geweben von Ratten per RT-qPCR. h VEGFA, MMP-9, vWF Protein-Expression in IA-Geweben von Ratten per Western Blot. * P < 0,05 vs. sh-NC-Gruppe, # P < 0,05 vs. Oe-NC-Gruppe. Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung, Vergleiche unter mehreren Gruppen durch einseitige ANOVA gefolgt von Tukeys multiplen Vergleichen.

Pathologische Veränderungen von IA-Geweben jeder Gruppe wurden per HE-Färbung untersucht. Blank-Gruppe, sh-NC-Gruppe und Oe-NC-Gruppe zeigten geschädigte Intima, exfoliierte Endothelzellen, degenerierte glatte Muskelzellen, reduzierte Zellen und Schichten, verdünnte Arterienwand. In sh-MALAT1-Gruppe waren Intima, Endothelzellen, glatte Muskelzellschicht und äußere Membranschicht der intrakraniellen Arterie leicht geschädigt, aber ordentlich angeordnet. Oe-MALAT1-Gruppe zeigte verschwundene Intimaschicht, exfoliierte Endothelzellen, gebrochene elastische Fasern, infiltrierte Entzündungszellen (Abb. 2c).

IA-Gewebe der Ratten jeder Gruppe wurden per Transmissionselektronenmikroskop beobachtet. In Blank-, sh-NC- und Oe-NC-Gruppe zeigten sich denaturierte Endothelzellen, disintegrierter subendothelialer Layer, verschwundene interne elastische Schicht, verminderte glatte Muskelzellen. sh-MALAT1-Gruppe zeigte flache Endothelzellen, ovale Kerne, erhöhte Kollagenfasern, aber keine elastische Schicht. Oe-MALAT1-Gruppe war durch verschwundene Endothelzellen und getrennte elastische Schicht von der Muskelschicht gekennzeichnet, die in das Lumen disintegrierte (Abb. 2d).

Apoptotischer Index vaskulärer Endothelzellen bei IA-Ratten wurde per TUNEL-Färbung getestet. Silencing von MALAT1 reduzierte apoptotischen Index, während überexprimiertes MALAT1 gegenteiligen Effekt zeigte (Abb. 2e, f).

RT-qPCR Detektion von MALAT1, miR-143, VEGFA mRNA-Expression, Western Blot von VEGFA, MMP-9, vWF Protein-Expression in IA-Geweben zeigte, dass MALAT1-Eliminierung MALAT1, VEGFA, MMP-9, vWF Expression senkte und miR-143 Expression erhöhte. Im Gegenteil erzwang MALAT1-Elevation gegenteilige Effekte auf diese Genexpressionen (Abb. 2g, h).

Niedrige MALAT1-Expression fördert Lebensfähigkeit und hemmt Apoptose vaskulärer Endothelzellen in IA

Immunhistochemische Färbung detektierte Expression des endothelspezifischen Markers vWF. Zytoplasma von IA-Vaskulären Endothelzellen war mit feinen braunen Partikeln bedeckt (positiv), während Zytoplasma in NC-Gruppe keine braunen Partikel zeigte. Ergebnisse bestätigten, dass kultivierte Zellen Endothelzellen waren (Abb. 3a, b).

Abbildung 3: Niedrige MALAT1-Expression fördert Lebensfähigkeit und hemmt Apoptose vaskulärer Endothelzellen in IA. a vWF-immunhistochemische Färbung in IA-Vaskulären Endothelzellen: feine gelbe Partikel. b vWF-immunhistochemische Färbung in IA-Vaskulären Endothelzellen: keine braunen Partikel in NC-Gruppe. c Vaskuläre Endothelzell-Lebensfähigkeit jeder Gruppe per MTT-Assay. d Protein-Expression von Cyclin D1 und Ki-67 in jeder Gruppe per Western Blot. e Zellzyklusveränderungen in jeder Gruppe per PI-Färbung. f Zellapoptose-Rate in jeder Gruppe per Annexin V/PI Doppel-Färbung. g Bax und Bcl-2 Protein-Expression in jeder Gruppe per Western Blot. * P < 0,05 vs. sh-NC-Gruppe, # P < 0,05 vs. Oe-NC-Gruppe. Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung, Vergleiche unter mehreren Gruppen durch einseitige ANOVA gefolgt von Tukeys multiplen Vergleichen.

MTT-Assay, Durchflusszytometrie und Western Blot wurden zur Testung vaskulärer Endothelzell-Lebensfähigkeit und Apoptose genutzt. MALAT1-Verminderung förderte vaskuläre Endothelzell-Lebensfähigkeit (erhöhte Cyclin D1 und Ki-67 Expression) und unterdrückte Apoptose (verminderte G0/G1-Phasen-Zellen, erhöhte S- und G2/M-Phasen-Zellen, reduzierte Bax, erhöhte Bcl-2 Expression). MALAT1-Hochregulation wirkte gegenteilig auf Zelllebensfähigkeit und Apoptose (Abb. 3c–g).

miR-143 bindet an MALAT1 und VEGFA ist Zielgen von miR-143

MALAT1, miR-143, VEGFA Expression in vaskulären Endothelzellen jeder Gruppe wurden per RT-qPCR und Western Blot verifiziert. Ergebnisse zeigten, dass MALAT1-Knockdown MALAT1 und VEGFA Expression senkte und miR-143 Expression erhöhte. Im Gegenteil führte MALAT1-Hochregulation zu Erhöhung von MALAT1 und VEGFA Expression und Reduktion von miR-143 Expression (Abb. 4a, b).

Abbildung 4: miR-143 bindet an MALAT1 und VEGFA ist Zielgen von miR-143. a MALAT1, miR-143, VEGFA mRNA-Expression in vaskulären Endothelzellen von Aneurysma in jeder Gruppe. b VEGFA Protein-Expression in vaskulären Endothelzellen von Aneurysma in jeder Gruppe. c Bindungsstellen von MALAT1 und miR-143 vorhergesagt durch Bioinformatik-Website. d Regulatorische Beziehung MALAT1 und miR-143 validiert durch Dual-Luciferase-Reporter-Gen-Assay. e Bindungsbeziehung MALAT1 und miR-143 verifiziert durch RNA-Pull-Down-Assay. f Bindungsstellen miR-143 und VEGFA vorhergesagt durch Bioinformatik-Website. g Regulatorische Beziehung miR-143 und VEGFA validiert durch Dual-Luciferase-Reporter-Gen-Assay. * P < 0,05 vs. sh-NC-Gruppe, # P < 0,05 vs. Oe-NC-Gruppe. Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung, Vergleiche zwischen zwei Gruppen durch unabhängigen Stichproben-t-Test, Vergleiche unter mehreren Gruppen durch einseitige ANOVA gefolgt von Tukeys multiplen Vergleichen.

Spezifische Bindungsregion zwischen MALAT1 und miR-143 wurde durch Online-Analyse-Software vorhergesagt (Abb. 4c). Dual-Luciferase-Reporter-Gen-Assay zeigte, dass Luciferase-Aktivität in MALAT1-WT + miR-143 Mimik Gruppe vs. MALAT1-WT + Mimik-NC Gruppe beeinträchtigt war (P < 0,05). In MALAT1-MUT + miR-143 Mimik Gruppe gab es keinen signifikanten Unterschied in Luciferase-Aktivität relativ zu MALAT1-MUT + Mimik-NC Gruppe (P > 0,05), was spezifische Bindung von miR-143 an MALAT1 anzeigt (Abb. 4d). RNA-Pull-Down-Assay zeigte, dass Anreicherungslevel von MALAT1 in Bio-miR-143-WT Gruppe erhöht war vs. Bio-miR-NC Gruppe (P < 0,05), aber kein signifikanter Unterschied in MALAT1-Anreicherung in Bio-miR-143-MUT Gruppe (P > 0,05) (Abb. 4e).

Bioinformatik-Software sagte gezielte Beziehung zwischen miR-143 und VEGFA voraus (Abb. 4f). Luciferase-Aktivitätsergebnisse zeigten, dass relative Luciferase-Aktivität nach Ko-Transfektion von VEGFA-WT und miR-143 Mimik in vaskuläre Endothelzellen unterdrückt war (P < 0,05). Ko-Transfektion von VEGFA-MUT und miR-143-Mimik beeinflusste relative Luciferase-Aktivität nicht (P > 0,05) (Abb. 4g). Dies indizierte, dass VEGFA direktes Zielgen von miR-143 ist.

Diskussion

IA ist eine schwere intrakranielle Erkrankung, die hauptsächlich zu Subarachnoidalblutung führt [18]. Eine frühere Studie demonstrierte Involvierung von lncRNA-bezogenen competing endogenous RNA Netzwerken in IA [19]. Eine jüngere Studie lieferte Beweis, dass funktioneller Polymorphismus im miR-143/145 Genpromotor mit IA-Risiko assoziiert ist [20]. In einer Studie von Xu et al. wurde gezeigt, dass Überexpression angiogener Faktoren wie VEGFA mit IA-Bildung und Ruptur zusammenhängen könnte [21]. Um den molekularen Mechanismus von MALAT1 in IA zu erklären, wurden eine Reihe von Assays durchgeführt, und Ergebnisse ergaben, dass IA, induziert durch vaskuläre endotheliale Verletzung, durch MALAT1/miR-143/VEGFA Signalachse reguliert wird.

Erstens lieferte unsere Studie substanzielle Evidenz, dass MALAT1 und VEGFA in IA-Geweben hochreguliert und miR-143 herunterreguliert sind. Eine jüngste Studie präsentierte, dass MALAT1 eines der am stärksten hochregulierten lncRNAs im Prozess zerebraler Ischämie ist [22]. Eine andere Studie zeigte, dass MALAT1 in Ovarialkrebszellen hochreguliert ist und an Apoptose, Migration, Proliferation partizipiert [23]. Eine Studie zum Expressionsprofil unrupturierter und rupturierter IA demonstrierte, dass Expression angiogener Faktoren wie VEGFA in rupturierten Aneurysmen hochreguliert ist [21]. Zudem präsentierte eine klinische Studie, dass miR-143/145 Cluster von IA-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden herunterreguliert ist [11]. Außerdem wurde zuvor diskutiert, dass miR-143/145 an verschiedenen biologischen Prozessen im Zusammenhang mit Aneurysmabildung teilnimmt und in IA-Patienten herunterreguliert ist [20]. All diese Findings stimmen mehr oder weniger mit früheren Forschungsergebnissen überein.

Zusätzlich zu obigen Befunden untersuchte diese Studie die funktionelle Rolle von MALAT1 in IA durch Gain-of-Function und Loss-of-Function Assays. Zusammenfassend reduzierte Downregulation von MALAT1 Blutdruck, Serumspiegel von ET-1, vWF und MMP-9 Expression in IA-Geweben. Es wurde zuvor suggeriert, dass Downregulation von MALAT1 die Hochregulierung des glukose-induzierten ET-1 Transkriptionsprodukts hemmt [24]. Auch wird berichtet, dass ektopische MALAT1-Expression Induktor der vWF-Generierung ist [25]. Eine andere Studie verifizierte, dass Depletion von MALAT1 in Knochenmark-Makrophagen MMP-9 Expression inhibiert [26].

Zellversuche wurden zur weiteren Bestätigung der Funktionen von MALAT1 in IA durchgeführt. Ergebnisse legten nahe, dass MALAT1-Knockdown vaskuläre Endothelzell-Lebensfähigkeit förderte und Apoptose in IA unterdrückte. Ähnlich wurde dokumentiert, dass Störung von MALAT1 aortale Wandarchitektur verbessert und Aneurysmawachstum verzögert [8]. Ergänzend zu unseren Studienergebnissen gibt es Forschung, die zeigt, dass geringe MALAT1-Expression Apoptose induziert und Proliferation von akuten myeloischen Leukämiezellen hemmt [27]. Eine andere Studie demonstrierte inhibierende Effekte von MALAT1-Knockdown auf Proliferation humaner Osteoarthritis-Knorpelzellen [28]. Frühere Forschung bestätigt allgemein, dass Downregulation von MALAT1 Apoptose induzieren und Proliferation von Gliomzellen abschwächen kann [29]. Zudem fördert niedrige MALAT1-Expression durch RNA-Interferenz Apoptose und unterdrückt Proliferation von Multiplen Myelomzellen [30]. Kollektiv haben diese Studien den molekularen Mechanismus von MALAT1 in IA teilweise erklärt.

Zusätzlich belegte diese Studie, dass miR-143 an MALAT1 bindet und VEGFA Zielgen von miR-143 ist. Ähnlich behauptet ein Paper, dass MALAT1 direkt an miR-143 bindet und dessen Expression unterdrückt [10]. Zhu et al. fanden, dass MALAT1 seine Rollen über Interaktion mit miR-143 in Zervixkarzinomzellen ausübt [31]. Weiter bestätigt, dass MALAT1 indirekt VEGFA über miR-200b-3p moduliert [32]. Eine andere Studie schlug vor, dass miR-143-3p ZFPM2-Effekt auf Proteintargets im Blut, einschließlich VEGFA, vermittelt [33]. Dennoch wurden Interaktionen zwischen MALAT1, miR-143 und VEGFA in IA nicht diskutiert und benötigen weitere Studien.

Schlussfolgerung

Aus diesen Ergebnissen ist klar, dass MALAT1-Knockdown Apoptose unterdrückt und Lebensfähigkeit vaskulärer Endothelzellen in IA fördert, indem es miR-143/VEGFA-Achse moduliert. Co-Expressionsnetzwerk suggeriert Verbindung zwischen MALAT1 und miR-143 mit Involvierung von VEGFA. Die Befunde dieser Studie decken teilweise die Pathogenese von IA-Initiation und Progression auf, und die untersuchten Targets könnten ein bemerkenswert potenzieller Einstiegspunkt sein, um Pathologie von IA aus einer anderen Perspektive zu enthüllen. Begrenzt sind weitere groß angelegte Studien erforderlich, um Mechanismen der MALAT1/miR-143/VEGFA-Achse in IA umfassend zu illustrieren.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Nicht zutreffend.

Abkürzungen

TMDs:

Transition metal dichalcogenides

2D:

Zweidimensional

MR:

Magnetowiderstand

BLG:

Bilayer Graphen

SL-MoSe₂:

Einlagiges MoSe₂

CNP:

Ladungsneutralitätspunkt

AFM:

Rasterkraftmikroskopie