DNA-Synthese

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Hintergrund

Die Synthese von Desoxyribonukleinsäure (DNA) ist ein Prozess, bei dem Kopien von Nukleinsäuresträngen hergestellt werden. In der Natur findet die DNA-Synthese in Zellen nach einem Mechanismus statt, der als DNA-Replikation bekannt ist. Mit Hilfe von Gentechnik und Enzymchemie haben Wissenschaftler künstliche Methoden zur Synthese von DNA entwickelt. Die wichtigste davon ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). PCR wurde erstmals in den frühen 1980er Jahren entwickelt und hat sich zu einer Multi-Milliarden-Dollar-Industrie entwickelt, wobei das ursprüngliche Patent für 300 Millionen Dollar verkauft wurde.

Verlauf

Die DNA wurde 1951 von Francis Crick, James Watson und Maurice Wilkins entdeckt. Mithilfe von Röntgenkristallographiedaten von Rosalind Franklin stellten Watson und Crick fest, dass die Struktur der DNA die einer Doppelhelix ist. Für diese Arbeit erhielten Watson, Crick und Wilkins 1962 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin. Im Laufe der Jahre arbeiteten Wissenschaftler mit DNA, um den "Code des Lebens" herauszufinden. Sie fanden heraus, dass DNA als Befehlscode für Proteinsequenzen diente. Sie fanden auch heraus, dass jeder Organismus eine einzigartige DNA-Sequenz hat und diese für Screening-, Diagnose- und Identifizierungszwecke verwendet werden könnte. Eine Sache, die sich in diesen Studien als limitierend erwies, war die Menge an DNA, die aus einer einzigen Quelle verfügbar war.

Nachdem die Natur der DNA bestimmt war, konnten die Wissenschaftler die Zusammensetzung der zellulären Gene untersuchen. Ein Gen ist eine spezifische Sequenz von DNA-Basenpaaren, die den Code für die Konstruktion eines Proteins liefern. Diese Proteine ​​bestimmen die Eigenschaften eines Organismus, wie die Augenfarbe oder die Blutgruppe. Wenn ein bestimmtes Gen isoliert wurde, wurde es wünschenswert, Kopien dieses Moleküls zu synthetisieren. Einer der ersten Wege, auf denen eine große Menge einer bestimmten DNA synthetisiert wurde, war die Gentechnik.

Die Gentechnik beginnt mit der Kombination eines interessierenden Gens mit einem bakteriellen Plasmid. Ein Plasmid ist ein kleiner DNA-Abschnitt, der in vielen Bakterien vorkommt. Die resultierende Hybrid-DNA wird als rekombinante DNA bezeichnet. Dieses neue rekombinante DNA-Plasmid wird dann in Bakterienzellen injiziert. Die Zellen werden dann kloniert, indem man sie in einer Kultur wachsen und vermehren lässt. Wenn sich die Zellen vermehren, vermehren sich auch Kopien des eingefügten Gens. Wenn sich die Bakterien ausreichend vermehrt haben, können die mehrfachen Kopien des inserierten Gens isoliert werden. Diese Methode der DNA-Synthese kann in wenigen Wochen Milliarden Kopien eines Gens produzieren.

1983 wurde die für die Herstellung von DNA-Kopien erforderliche Zeit erheblich verkürzt, als Kary Mullis ein Verfahren zur Synthese von DNA entwickelte, das als Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bezeichnet wird. Dieses Verfahren ist viel schneller als bisherige bekannte Verfahren und produziert in nur wenigen Stunden Milliarden von Kopien eines DNA-Strangs. Es beginnt damit, dass ein kleiner Abschnitt doppelsträngiger DNA in eine Lösung gegeben wird, die DNA-Polymerase, Nukleotide und Primer enthält. Die Lösung wird erhitzt, um die DNA-Stränge zu trennen. Beim Abkühlen erstellt die Polymerase eine Kopie jedes Strangs. Der Vorgang wird alle fünf Minuten wiederholt, bis die gewünschte DNA-Menge produziert ist. 1993 brachte Mullis für seine Entwicklung der PCR den Nobelpreis für Chemie ein. Heute hat die PCR die Bereiche medizinische Diagnostik, Forensik und Mikrobiologie revolutioniert. Sie gilt als eine der wichtigsten Entwicklungen in der Genforschung.

Hintergrund

Der Schlüssel zum Verständnis der DNA-Synthese ist das Verständnis ihrer Struktur. DNA ist ein langkettiges Polymer, das aus chemischen Einheiten besteht, die als Nukleotide bezeichnet werden. DNA, auch als genetisches Material bekannt, ist das Molekül, das Informationen trägt, die die Proteinsynthese in den meisten lebenden Organismen bestimmen. Typischerweise existiert DNA als zwei Ketten chemisch verbundener Nukleotide. Diese Verbindungen folgen bestimmten Mustern, die von den Basenpaarungsregeln diktiert werden. Jedes Nukleotid besteht aus einem Desoxyribose-Zuckermolekül, einer Phosphatgruppe und einer von vier stickstoffhaltigen Basen. Zu den Basen zählen die Pyrimidine Thymin (T) und Cytosin (C) sowie die Purine Adenin (A) und Guanin (G). In der DNA verbindet sich Adenin im Allgemeinen mit Thymin und Guanin mit Cytosin. Das Molekül ist in einer als Doppelhelix bezeichneten Struktur angeordnet, die man sich vorstellen kann, wenn man sich eine verdrehte Leiter oder Wendeltreppe vorstellt. Die Sockel bilden die Sprossen der Leiter, während die Zucker- und Phosphatanteile die Leiterseiten bilden. Die Reihenfolge, in der die Nukleotide verknüpft sind, die sogenannte Sequenz, wird durch einen Prozess bestimmt, der als DNA-Sequenzierung bekannt ist.

In einer eukaryontischen Zelle erfolgt die DNA-Synthese kurz vor der Zellteilung durch einen als Replikation bezeichneten Prozess. Wenn die Replikation beginnt, werden die beiden DNA-Stränge durch eine Vielzahl von Enzymen getrennt. So geöffnet, dient jeder Strang als Vorlage für die Herstellung neuer Stränge. Dieser ganze Prozess wird durch ein Enzym namens DNA-Polymerase katalysiert. Dieses Molekül bringt korrespondierende oder komplementäre Nukleotide mit jedem der DNA-Stränge in Einklang. Die Nukleotide werden dann chemisch verknüpft, um neue DNA-Stränge zu bilden, die exakte Kopien des ursprünglichen Strangs sind. Diese Kopien, die als Tochterstränge bezeichnet werden, enthalten die Hälfte des Mutter-DNA-Moleküls und die Hälfte eines ganz neuen Moleküls. Die Replikation nach diesem Verfahren ist als semikonservative Replikation bekannt. Der Replikationsprozess ist wichtig, da er den Zellen eine Methode bietet, ein exaktes Duplikat ihres genetischen Materials von einer Zellgeneration auf die nächste zu übertragen.

Rohstoffe

Die primären Rohstoffe, die für die DNA-Synthese verwendet werden, umfassen DNA-Ausgangsmaterialien, taq-DNA-Polymerase, Primer, Nukleotide und die Pufferlösung. Jeder von ihnen spielt eine wichtige Rolle bei der Produktion von Millionen von DNA-Molekülen.

Die kontrollierte DNA-Synthese beginnt mit der Identifizierung eines kleinen DNA-Segments, das kopiert werden soll. Dies ist typischerweise eine spezifische DNA-Sequenz, die den Code für ein gewünschtes Protein enthält. Dieses als Template-DNA bezeichnete Material wird in Konzentrationen von etwa 0,1-1 Mikrogramm benötigt. Es muss hoch gereinigt werden, da selbst Spurenmengen der bei der DNA-Reinigung verwendeten Verbindungen den PCR-Prozess hemmen können. Eine Methode zur Reinigung eines DNA-Strangs besteht darin, ihn mit 70 % Ethanol zu behandeln.

Während der Vorgang der DNA-Replikation vor 1980 bekannt war, war eine PCR nicht möglich, da keine hitzestabilen DNA-Polymerasen bekannt waren. DNA-Polymerase ist das Enzym, das die Reaktionen katalysiert, die an der DNA-Synthese beteiligt sind. In den frühen 1980er Jahren fanden Wissenschaftler Bakterien, die in der Nähe natürlicher Dampföffnungen lebten. Es stellte sich heraus, dass diese Organismen, die Thermus aquaticus genannt werden, hatte eine DNA-Polymerase, die bei extremer Hitze stabil und funktionsfähig war. Diese taq DNA-Polymerase wurde zum Grundstein für moderne DNA-Synthesetechniken. Während eines typischen PCR-Prozesses werden 2-3 Mikrogramm taq DNA-Polymerase wird benötigt. Wird jedoch zu viel verwendet, können unerwünschte, unspezifische DNA-Sequenzen entstehen.

Die Polymerase baut die DNA-Stränge auf, indem sie entsprechende Nukleotide an jedem DNA-Strang kombiniert. Chemisch gesehen bestehen Nukleotide aus drei Arten von Molekülgruppen, einschließlich einer Zuckerstruktur, einer Phosphatgruppe und einer zyklischen Base. Der Zuckeranteil liefert die Primärstruktur für alle Nukleotide. Im Allgemeinen bestehen die Zucker aus fünf Kohlenstoffatomen mit einer Reihe von daran gebundenen Hydroxy-(-OH)-Gruppen. Für DNA ist der Zucker 2-Desoxy-D-Ribose. Der bestimmende Teil eines Nukleotids ist die heterozyklische Base, die kovalent an den Zucker gebunden ist. Diese Basen sind entweder Pyrimidin- oder Puringruppen und bilden die Grundlage für den Nukleinsäurecode. Es werden zwei Arten von Purinbasen gefunden, darunter Adenin und Guanin. In der DNA sind zwei Arten von Pyrimidinbasen vorhanden, Thymin und Cytosin. Eine Phosphatgruppe bildet den letzten Teil eines Nukleotids. Diese Gruppe leitet sich von Phosphorsäure ab und ist kovalent an die Zuckerstruktur am fünften Kohlenstoffatom gebunden.

Die erste Phase der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beinhaltet die Denaturierung von DNA. Dieses "Öffnen" des DNA-Moleküls liefert die Matrize für das nächste DNA-Molekül, aus dem hergestellt werden soll. Wenn die DNA in separate Stränge gespalten ist, wird die Temperatur gesenkt – der Primer-Annealing-Schritt. In der nächsten Phase interagiert die DNA-Polymerase mit den Strängen und fügt über die gesamte Länge komplementäre Nukleotide hinzu. Die in dieser Phase benötigte Zeit beträgt etwa eine Minute pro 1.000 Basenpaare.

Um die DNA-Synthese zu initiieren, müssen kurze Primer-Abschnitte der DNA verwendet werden. Diese Primerabschnitte, Oligofragmente genannt, sind etwa 18-25 Nukleotide lang und entsprechen einem Abschnitt auf der Matrizen-DNA. Sie haben typischerweise eine C- und G-Nukleotidkonzentration von etwa 60 % bei gleichmäßiger Verteilung. Dies bietet die maximale Effizienz im Syntheseprozess.

Die Pufferlösung stellt das Medium bereit, in dem die DNA-Synthese erfolgen kann. Dies ist eine wässrige Lösung, die MgCl2, HCl, EDTA und KCl enthält. Die MgCl2-Konzentration ist wichtig, da die Mg2+-Ionen mit der DNA und den Primern interagieren und entscheidende Komplexe für die DNA-Synthese bilden. Die empfohlene Konzentration beträgt ein bis vier Mikromol. Der pH-Wert dieses Systems ist kritisch, daher kann es auch mit Ammoniumsulfat gepuffert werden. Um die Reaktion anzuregen, werden verschiedene Energiemoleküle wie ATP, GTP und NTP hinzugefügt. Diese Verbindungen sind dieselben, die lebende Organismen verwenden, um Stoffwechselreaktionen anzutreiben.

Andere Materialien, die in dem Verfahren verwendet werden können, umfassen Mineralöl oder Paraffinwachs. Nachdem die DNA-Synthese abgeschlossen ist, wird die DNA typischerweise isoliert und gereinigt. Einige gebräuchliche Reagenzien, die in diesem Verfahren verwendet werden, umfassen Phenol, EDTA und Proteinase K.

Der Herstellungsprozess

Die DNA-Synthese wird typischerweise in kleinem Maßstab in Laboratorien durchgeführt. Es umfasst drei verschiedene Prozesse, einschließlich der Probenvorbereitung, des DNA-Synthese-Reaktionszyklus und der DNA-Isolierung. Diese Herstellungsschritte werden typischerweise in getrennten Bereichen durchgeführt, um eine Kontamination zu vermeiden. Nach diesen Verfahren sind Wissenschaftler in der Lage, einige wenige DNA-Stränge in Millionen und Abermillionen exakter Kopien umzuwandeln.

Vorbereitung der Proben

• 1 Um mit der DNA-Synthese zu beginnen, werden die verschiedenen Lösungen hergestellt. Dies erfolgt typischerweise in einem Laminar-Flow-Kabinett, das mit einer UV-Lampe ausgestattet ist, um eine Kontamination zu minimieren. Wissenschaftler verwenden aus ähnlichen Gründen bei jedem Produktionsschritt frische Handschuhe. Typischerweise werden alle Ausgangslösungen außer den Primern, Polymerasen und den dNTPs in einen Autoklaven gegeben, um alle kontaminierenden Organismen abzutöten. Es werden zwei getrennte Lösungen hergestellt. Einer enthält den Puffer, Primer und die Polymerase. Der andere enthält das MgCl2 und die Template-DNA. Diese Lösungen werden alle in kleine Röhrchen gegeben, um die Reaktion zu starten.

Kary Banks Muilis.

Kary Banks Muilis wurde 1944 in Lenoir, North Carolina, geboren. Nach seinem Abschluss an der Georgia Tech im Jahr 1966 mit einem B.S. in Chemie begann Muilis das Doktorandenprogramm für Biochemie an der University of California, Berkeley. Seinen Ph.D. 1973 nahm er einen Lehrauftrag an der Medical School der University of Kansas in Kansas City an. 1977 nahm er ein Postdoc-Stipendium an der University of California in San Francisco an.

Muilis nahm 1979 eine Stelle als Forscher bei einer wachsenden Biotech-Firma – Cetus Corporation in Emeryville, Kalifornien – an, die Chemikalien synthetisierte, die von anderen Wissenschaftlern beim genetischen Klonen verwendet wurden. Dort entwarf er die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), eine schnelle und effektive Technik zur Reproduktion bestimmter Gene oder DNA-Fragmente (Desoxyribonukleinsäure), die in wenigen Stunden Milliarden von Kopien erstellen kann. Der effektivste Weg, DNA zu reproduzieren, war das Klonen, aber es war problematisch. Es dauerte eine Weile, um Mullis' Kollegen von der Bedeutung dieser Entdeckung zu überzeugen, aber bald wurde die PCR zum Schwerpunkt intensiver Forschung. Wissenschaftler von Cetus entwickelten eine kommerzielle Version des Verfahrens und eine Maschine namens Thermal Cycler (mit der Zugabe der chemischen Bausteine ​​der DNA [Nukleotide] und eines biochemischen Katalysators [Polymerase] würde die Maschine den Prozess automatisch an einem Zielstück durchführen der DNA).

Cetus sprach Muilis 10.000 US-Dollar für die Entwicklung des PCR-Patents zu und verkaufte es dann für 300 Millionen US-Dollar. 1986 verließ Muilis Cetus, wurde privater biochemischer Forschungsberater und erhielt 1993 den Nobelpreis.

DNA-Synthesezyklus

• 2 Nachdem die Reaktionslösungen vorbereitet wurden, wird der PCR-Zyklus gestartet. Die erste Phase beinhaltet die Denaturierung der DNA. Einer der wichtigsten ersten Schritte ist die vollständige Denaturierung des DNA-Templates. Denaturieren der DNA bedeutet im Wesentlichen das Aufbrechen des doppelgebundenen Strangs. Dieses "Öffnen" des DNA-Moleküls liefert die Matrize für das nächste DNA-Molekül, aus dem hergestellt werden soll. Eine unvollständige Denaturierung führt zu einer ineffizienten Kopie im ersten Zyklus, die sich negativ auf jeden nachfolgenden Zyklus auswirkt. Die anfängliche Denaturierung erfolgt durch Erhitzen der DNA-Matrizenlösung auf 203 °F (95 °C) über ein bis drei Minuten. Die Gesamtzeit hängt von der Vorlagenzusammensetzung ab. In Wiederholungszyklen dauert der Denaturierungsschritt etwa zwei Minuten und beinhaltet das Erhitzen der Lösung auf 201 PF (94 °C). Der Lösung können zusätzliche Materialien zugesetzt werden, um die DNA-Denaturierung zu erleichtern, wie beispielsweise Glycerin, DMSO oder Formamid.
• 3 Wenn die DNA in separate Stränge gespalten ist, wird die Temperatur auf 122-149°F (50-65°C) gesenkt. Dies ist als Primer-Annealing-Schritt bekannt und dauert etwa zwei Minuten. An diesem Punkt passen der linke und der rechte Primer zusammen und verbinden sich chemisch mit ihren komplementären Basen auf der Matrizen-DNA.
• 4 Die nächste Phase beinhaltet den Erweiterungsschritt. In diesem Teil der Reaktion wird der größte Teil des DNA-Strangs kopiert. Die Temperatur des Systems wird auf etwa 162 °F (72 °C) erhitzt und dort je nach Länge der zu kopierenden DNA gehalten. In diesem Stadium interagiert die DNA-Polymerase mit den Strängen und fügt über die gesamte Länge komplementäre Nukleotide hinzu. Die in dieser Phase benötigte Zeit beträgt etwa eine Minute pro 1.000 Basenpaare.
• 5 Nach diesem ersten Zyklus wird der DNA-Synthesezyklus wiederholt. Die Anzahl der Zyklen hängt von der Menge der anfänglichen DNA und der gewünschten DNA-Menge ab. Wenn weniger als 10 Kopien der Matrizen-DNA verfügbar sind, sind 40 Zyklen erforderlich. Mit mehr anfänglicher DNA sind 25-30 Zyklen ausreichend.
• 6 Während des letzten Zyklus wird die Probe etwa 15 Minuten lang bei 162 °F (72 °C) gehalten. Dies ermöglicht das Auffüllen (mit Nukleotiden) aller hervorstehenden Enden eines neuen DNA-Strangs. In diesem Stadium fügt die Polymerase zusätzliche A-Nukleotide an einem Ende der DNA-Stränge hinzu.

DNA-Isolierung

• 7 Wenn die Reaktionen abgeschlossen sind, wird die DNA aus den PCR-Reaktionsmaterialien wie der DNA-Polymerase, MgCl2 und den Primern isoliert. Dies geschieht durch Zugabe von Verbindungen wie Phenol, EDTA und Proteinase K. Hilfreich ist hierbei auch die Zentrifugation.

Die Zukunft

Während Wissenschaftler die PCR regelmäßig für die DNA-Synthese verwenden, ist noch vieles über die DNA-Replikation unbekannt. Zukünftig soll die Forschung einige wichtige Schritte des Prozesses im Detail aufklären, wie zum Beispiel die beteiligten Komponenten und Zwischenprodukte. Darüber hinaus können verbesserte Polymerasen entwickelt werden, die es ermöglichen, aus kleineren Ausgangsproben mehr DNA zu erzeugen. Es besteht die Hoffnung, dass die DNA-Synthese eines Tages dazu beitragen wird, einige der Schlüsselaspekte lebender Organismen zu erschließen und zur Entwicklung von Medikamenten zu führen, die verschiedene Krebsarten, virale und bakterielle Infektionen heilen.