Mikroskopie-integrierte Spektroskopie: Präzise UV-Vis-NIR-Analyse von Mikroskalen-Proben

Ein hypheniertes Instrument ist eines, das die Fähigkeiten zwei verschiedener Technologien vereint, um eine neue analytische Technik mit neuartigen Fähigkeiten zu bilden. Das Mikroskop-Spektrophotometer ist ein solches hypheniertes Instrument; es ist ein Hybrid, der die Vergrößerungskraft eines optischen Mikroskops mit den analytischen Fähigkeiten eines UV-Vis-NIR-Bereichs-Spektrophotometers kombiniert. Als solche können Mikroskop-Spektrophotometer verwendet werden, um die molekularen Spektren mikroskopischer Probenbereiche vom tiefen Ultraviolett bis in den nahen Infrarotbereich zu messen. Sie können für viele verschiedene Arten der Spektroskopie konfiguriert werden und werden als solche verwendet, um Absorptions-, Reflexions- und sogar Emissionsspektren, wie Fluoreszenz und Photolumineszenz, von mikrongroßen Proben zu messen. Mit der Hinzufügung spezialisierter Algorithmen kann das Mikroskop-Spektrophotometer auch zur Messung der Dicke von Dünnschichten oder als Kolorimeter für mikroskopische Proben verwendet werden.

Es gibt viele Gründe, das Mikroskop-Spektrophotometer zu verwenden. Der offensichtlichste ist, dass Spektren von einem Probenbereich kleiner als ein Mikron erfasst werden können. Zusätzlich benötigen diese Instrumente nur kleine Mengen an Proben in fester oder flüssiger Form. Ein weiterer Vorteil ist, dass für viele Proben sehr wenig oder keine Vorbereitung erforderlich ist. Und Farbvergleiche durch Spektroskopie tendieren dazu, mit Spektrophotometern genauer zu sein, weil diese Instrumente einen breiteren Spektralbereich haben, Beleuchtungsvariationen korrigieren können und die Intensität jedes Wellenlängenbands des Lichts messen können.

Vor dem Aufkommen der Mikrospektroskopie war der einzige Weg, viele Arten mikroskopischer Proben zu analysieren, die Verwendung von mikrochemischen Tests und dann irgendeiner Art visueller Untersuchung. Leider neigen diese Methoden dazu, destruktiv zu sein, erfordern viele Proben und leiden unter den Ungenauigkeiten des menschlichen visuellen Systems. Das Mikroskop-Spektrophotometer vermeidet diese Probleme und kann „über den Bereich des menschlichen Auges hinaussehen“ und Variationen detektieren, die sonst nicht offensichtlich wären.

Mikroskop-Spektrophotometer Design

Das Mikroskop-Spektrophotometer integriert ein optisches oder Lichtmikroskop mit einem UV-Vis-NIR-Bereichs-Spektrophotometer (Abbildung 1). Das Mikroskop ist ein Gerät, das entwickelt wurde, um ein Bild kleiner Objekte zu vergrößern, um sie studieren zu können. Das Spektrophotometer ist ein Instrument, das die Intensität jeder Wellenlänge des Lichts vom Ultraviolett über das Sichtbare bis in den nahen Infrarotbereich misst. Mit einem ordnungsgemäß konfigurierten Mikroskop-Spektrophotometer ist man in der Lage, Absorptions-, Reflexions- und Emissionsspektren mit Probenahmebereichen im Submikronmaßstab zu erfassen.

Um einen so breiten Spektralbereich mit guter Bild- und Spektralqualität abzudecken, wird ein kundenspezifisch entworfenes Mikroskop gebaut und mit dem Spektrophotometer integriert. Standardoptische Mikroskope haben einen begrenzten Spektralbereich, der nur einen Teil des sichtbaren Bereichs abdeckt, wegen der für die Optik verwendeten Materialien sowie der Lichtquellen selbst. Das moderne Mikroskop-Spektrophotometer nutzt ein kundenspezifisch gebautes Mikroskop mit einem optischen Design und Lichtquellen, die für den tiefen UV- bis NIR-Bereich optimiert sind.

Das Spektrophotometer selbst muss auch für Mikrospektroskopie entworfen sein, um gute spektrale Ergebnisse zu erhalten. Das bedeutet, dass das Spektrophotometer hochsensitiv sein muss, während es noch eine akzeptable spektrale Auflösung beibehält. Stabilität ist auch ein Thema, da das Mikroskop-Spektrophotometer ein Einstrahl-Instrument ist und Referenzspektren vor der Messung der Probe erfasst werden müssen. Das Instrument muss auch einen hohen Dynamikbereich haben, da man häufig zwischen Transmissions- oder Reflexionsmikrospektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie wechselt, wenn man dieselbe Probe misst. Dies ermöglicht es, verschiedene Arten von Spektralinformationen von genau derselben Stelle auf der mikroskopischen Probe zu erhalten.

Die Integration des Spektrophotometers mit dem Mikroskop ist kritisch wichtig. Während Mikroskop und Spektrophotometer beide für Mikrospektroskopie optimiert sein müssen, ist der Schlüssel zum Betrieb eines Mikroskop-Spektrophotometers die Hardware, die es ihnen ermöglicht, zusammenzuarbeiten. Dieses Interface hat mehrere grundlegende Anforderungen. Am wichtigsten ist, dass es die vom Mikroskop von der Probe gesammelte elektromagnetische Energie in das Spektrophotometer kanalisieren muss. Allerdings muss der Benutzer in der Lage sein, den Probenmessbereich zu visualisieren, aber auch die umgebende Probe zu sehen. Dies wird erreicht, indem die Eintrittsöffnung des Spektrophotometers in der gleichen Brennebene wie das Probenbild liegt. Die Probe kann dann mit dem Mikroskoptisch bewegt werden, wie man es normalerweise mit einem Mikroskop tun würde, bis das Bild der Eintrittsöffnung über dem zu messenden Bereich liegt. In Abbildung 2 ist das schwarze Quadrat in der Mitte des Bildes die Eintrittsöffnung des Spektrophotometers. All dies geschieht in Echtzeit, sodass die Spektroskopie von Mikroskopproben schnell und einfach ist.

Wie in Abbildung 3 gezeigt, fokussiert die Mikroskopoptik Licht auf die Probe. Die elektromagnetische Energie wird dann vom Mikroskopobjektiv von der Probe gesammelt. Das Licht vom Objektiv wird auf die gespiegelte Eintrittsöffnung des Spektrophotometers fokussiert. Der Großteil des Lichts wird von der Eintrittsöffnungsoberfläche auf die Kamera reflektiert. Die Spektrophotometeröffnung wird auch von der Kamera abgebildet, sodass sie als schwarzes Quadrat auf der Probe erscheint (Abbildung 2). Dies ermöglicht eine einfache und schnelle Ausrichtung des Mikroskop-Spektrophotometers. Das Licht, das durch die Eintrittsöffnung geht, gelangt dann in das Spektrophotometer, wo ein Spektrum gemessen wird.

Das Mikroskop kann mit verschiedenen Beleuchtungsschemata konfiguriert werden, abhängig von der Art des durchzuführenden Experiments. Einfallende Beleuchtung mit Weißlicht ermöglicht Reflexionsmikrospektroskopie vom tiefen UV bis zum nahen IR. Einfallende Beleuchtung kann auch für Fluoreszenz- oder Photolumineszenzmikrospektroskopie verwendet werden. Zusätzlich ist Transmissionsmikrospektroskopie mit Weißlicht möglich, das durch den Mikroskopkondensator auf die Probe fokussiert wird.

Anwendungen der Mikrospektroskopie

Die ersten Mikroskop-Spektrophotometer wurden in den 1940er Jahren entwickelt und seitdem wurden eine Vielzahl verschiedener Anwendungen entwickelt. Mit der Fähigkeit, Spektren mikroskopischer Probenbereiche zu erfassen, werden Mikroskop-Spektrophotometer überall eingesetzt, von Universitätslaboren bis zu Produktionslinien für Qualitätskontrolle und Fehlersuche.

Forensische Wissenschaft

Die Analyse forensischer Beweise war seit den frühen 1980er Jahren eine der wichtigsten Anwendungen für Mikroskop-Spektrophotometer. Der größte Aufwand lag in der Analyse von Spuren, speziell Textilfasern und Farbsplittern^{1, 2}. Wie ihre Namen andeuten, sind diese Probenarten meist mikroskopisch und, da es sich um Beweise handelt, sollten sie durch Tests nicht beschädigt oder zerstört werden. Bei Fasern werden Mikroskop-Spektrophotometer verwendet, um die UV-Vis-NIR-Absorptions- und Fluoreszenzspektren einzelner Fasern zu messen. Farbsplitter werden meist quergeschnitten und dann das Absorptionsspektrum jeder Schicht gemessen, damit bekannte und befragte Proben mit hoher Diskriminierung verglichen werden können.

Flachbildschirme

Moderne Flachbildschirme bestehen aus Millionen mehrfarbiger Pixel. Mit dem technologischen Fortschritt werden die Pixel immer kleiner und dichter auf immer größeren Flächen gepackt. Die modernsten Displays nutzen verschiedene Technologien wie Quantenpunkte und organische Leuchtdioden, um Pixel verschiedener Farben auf mikroskopischer Skala zu erzeugen. Das Mikroskop-Spektrophotometer wird verwendet, um diese Materialien als brauchbare Lichtquellen zu entwickeln und letztendlich als Displays^3,4. Das Mikroskop-Spektrophotometer wird auch im Produktionsprozess verwendet, um sicherzustellen, dass sowohl die Farbe als auch die Intensität der Pixel über den gesamten Bildschirm konsistent sind, wodurch helle und gleichmäßig beleuchtete Bilder über den gesamten Display sichergestellt werden.

Energie

Kohle und petroleumhaltiges Muttergestein enthalten Vitrinit und andere Makrale. Mikroskop-Spektrophotometer werden verwendet, um die thermische Reife⁵ und damit den Energiegehalt von Kohle, Koks und petroleumhaltigem Muttergestein zu bestimmen. Dies geschieht durch Messung der absoluten Reflektivität von Vitrinit auf einer polierten Probe. Abhängig von der Reflektivität kann die thermische Reife der Probe bestimmt werden.

Nanotechnologie

Das Mikroskop-Spektrophotometer fördert auch Nanotechnologie und Materialwissenschaften basierend auf ihrer Fähigkeit, Transmissions-, Reflexions- und Emissionsspektren mikroskopischer Probenbereiche zu messen. Ein schnell wachsender Anwendungsbereich ist die Entwicklung und Nutzung von Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)^6,7,8.

Oberflächenplasmonen werden durch Bestrahlen einer planaren metallischen Oberfläche oder nanoskaliger metallischer Partikel mit Licht angeregt (Abbildung 4). Änderungen in den optischen Eigenschaften dieser Materialien treten auf, wenn diese Nanopartikel oder Oberflächen mit anderen Materialien interagieren. Als solche wird viel Arbeit geleistet, um neue Materialien zu entwickeln, die eine Form der Plasmonenresonanz aufweisen, aber auch Geräte zu bauen, die diese Phänomene aufweisen. Letztere umfassen Biosensoren und Mikrofluidik-Gerätesensoren verschiedener Arten. Das Mikroskop-Spektrophotometer misst, wie sich die Spektren der SPR-Materialien unter verschiedenen Bedingungen ändern, was dem Forscher die Fähigkeit gibt, ein neues Material zu charakterisieren und es dann für spezifische optische Effekte „abzustimmen“.

Fazit

Das Mikroskop-Spektrophotometer ist eine hyphenierte Technik, die das optische Mikroskop mit einem Spektrophotometer kombiniert, sodass man Spektren mikroskopischer Probenbereiche erfassen kann. Solche Instrumente sind fähig zu Absorptions- und Reflexionsspektren vom tiefen UV über das Sichtbare bis in den nahen Infrarotbereich. Das Mikroskop-Spektrophotometer kann auch Fluoreszenz und andere Arten von Emissionsspektren messen. Diese Geräte haben Anwendungen in vielen Bereichen gefunden, einschließlich forensischer Wissenschaft, Halbleiter- und optischer Schichtdickenmessung, Biotechnologie und dem Neuesten in der Materialwissenschaft.

Referenzen

1. S. Walbridge-Jones, Microspectrophotometry for textile fiber color measurement, Identification of Textile Fibers, Woodhead Publishing, 2009, Pages 165-180,
2. Standard Guide for Microspectrophotometry in Forensic Paint Analysis, American Society of Testing and Materials.
3. Buchnev, O., Podoliak, N., & Fedotov, V. A. (2018). Liquid crystal-filled meta-pixel with switchable asymmetric reflectance and transmittance. J. Molecular Liquids, 267, 411-414.
4. Rezaei, S. D., Hong Ng , R. J., Dong, Z., Ho, J., Koay, E. H., Ramakrishna, S., & Yang, J. K. (2019). Wide-gamut plasmonic color palettes with constant subwavelength resolution. ACS nano, 13 (3), 3580-3588.
5. „Methods for the petrographic analysis of coals – Part 5: Method of determining microscopically the reflectance of vitrinite“, ISO 7404-5, International Organization for Standardization, 2009.
6. Ng, R.J.H., Krishnan, R.V., Dong, Z., Ho, J., Liu, H., Ruan, Q., Pey, K.L. and Yang, J.K (2019). Micro-tags for art: covert visible and infrared images using gap plasmons in native aluminum oxide. Optical Materials Express, 9 (2), 788-801.
7. Alali, M., Yu, Y., Xu, K., Ng, R.J., Dong, Z., Wang, L., Dinachali, S.S., Hong, M. and Yang, J.K. (2016). Stacking of colors in exfoliable plasmonic superlattices. Nanoscale, 8 (42), 18228-18234.
8. Jiang, M., Siew, S.Y., Chan, J.Y., Deng, J., Wu, Q.Y.S., Jin, L., Yang, J.K., Teng, J., Danner, A. and Qiu, C.W., (2020). Patterned resist on flat silver achieving saturated plasmonic colors with sub-20-nm spectral linewidth. Materials Today, 35, 99-105.

Dieser Artikel wurde von Dr. Paul Martin, President, CRAIC Technologies (San Dimas, CA) verfasst. Für weitere Informationen kontaktieren Sie Dr. Martin unter This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it., oder besuchen Sie hier .