Optische Mikroskopie

Optische Mikroskopie  

Die Mikroskopie untersucht die Vergrößerung des Bildes von Objekten, die zu klein sind, um mit dem bloßen Auge richtig gesehen zu werden. Die Mikroskopie erfüllt ihre Aufgabe, indem sie die von der zu beobachtenden Probe emittierte, absorbierte, transmittierte oder reflektierte Strahlung (Abb. 1) nutzt. Die Art der Strahlung gibt die Art der Mikroskopie an, z. B. optische Mikroskopie, Elektronenmikroskopie, Röntgenmikroskopie oder akustische Mikroskopie usw. Der sichtbare Teil des elektromagnetischen Spektrums ist die Art der Strahlung, die von der optischen Mikroskopie verwendet wird. Lichtmikroskopie ist die mikroskopische Untersuchung von Materialien durch das Lichtmikroskop.

Abb. 1 Elektromagnetische Wellen

In der Antike wurden grobe Lupen verwendet, aber die Entwicklung moderner Mikroskope begann im 17. Jahrhundert. Obwohl das erste zusammengesetzte Mikroskop 1595 von Hans und Zacharias Janssen gebaut wurde, gelang es Antoni van Leeuwenhoek (1632–1723), Linsen so gut herzustellen, dass sie in ihren sehr einfachen Mikroskopen die erstaunliche Vergrößerung von etwa 300x erreichten. Auf Anregung des Wissenschaftlers Robert Hook um 1670 baute der Instrumentenbauer Christopher Cock in London ein sehr erfolgreiches zusammengesetztes Mikroskop. Mit diesem Instrument konnte Hook die Zellen beobachten. Das Hooksche Mikroskop kann als Vater der modernen Instrumente angesehen werden.

Das optische Mikroskop, häufig als „Lichtmikroskop“ bezeichnet, ist eine Art Mikroskop, das sichtbares Licht (Abb. 1) und ein Linsensystem verwendet, um Bilder kleiner Proben zu vergrößern. Lichtmikroskope sind die ältesten und einfachsten Mikroskope. Es ist ein sehr wichtiges Instrument für die Untersuchung der Mikrostruktur, trotz der Entwicklung hochentwickelter elektronenmetallografischer Instrumente. Das ausgeklügelte „Rasterelektronenmikroskop“ (REM) und das „Transmissionselektronenmikroskop“ (TEM) sind ebenfalls unschätzbare Instrumente. Sie sind jedoch in Verbindung mit optischen Mikroskopen und nicht als Ersatz zu verwenden.

Alle Untersuchungen der Mikrostruktur beginnen mit der Verwendung des optischen Mikroskops, beginnend mit geringer Vergrößerung, z. B. 100-fach, gefolgt von zunehmend höheren Vergrößerungen, um die grundlegenden Eigenschaften der Mikrostruktur effizient zu beurteilen. Die meisten Mikrostrukturen können mit dem Lichtmikroskop beobachtet und anhand ihrer Eigenschaften identifiziert werden. Die Identifizierung fragwürdiger oder unbekannter Bestandteile kann durch die Beobachtung ihrer Härte relativ zur Matrix, ihrer natürlichen Farbe, ihrer Reaktion auf polarisiertes Licht und ihrer Reaktion auf die selektiven Ätzmittel unterstützt werden. Diese Beobachtungen werden mit den bekannten Details über die physikalische Metallurgie des untersuchten Materials verglichen. Wenn Zweifel bestehen bleiben oder die Struktur zu fein ist, um sie zu beobachten, müssen ausgefeiltere Techniken implementiert werden.

Das optische Mikroskop kann verwendet werden, um polierte oder geätzte metallographische Proben zu untersuchen. Bestimmte Bestandteile sind leichter als poliert zu erkennen, da sie nicht durch Ätzdetails verdeckt werden. Einschlüsse, Nitride, bestimmte Carbide und intermetallische Phasen können leicht ohne Ätzen beobachtet werden. Abgesehen von Einschlüssen können die anderen Phasen leichter untersucht werden, wenn beim abschließenden Polieren ein gewisses Relief eingebracht wird. Die Proben sind angemessen vorzubereiten, um eine korrekte Beobachtung und Interpretation der Mikrostruktur ohne Komplikationen durch Artefakte zu gewährleisten. Proben, die auf polarisiertes Licht ansprechen, wie Materialien mit nichtkubischen Kristallstrukturen, werden normalerweise ohne Ätzen untersucht. In den meisten Fällen muss jedoch geätzt werden, um die Mikrostruktur zu beobachten. Normalerweise wird zuerst ein Allzweck-Ätzmittel verwendet, um die Kornstruktur und die vorhandenen Phasen freizulegen, gefolgt von selektiven Ätzmitteln, die bestimmte interessierende Phasen angreifen oder färben. Selektive Ätzmittel werden häufig für die quantitative Metallographie verwendet, insbesondere wenn sie unter Verwendung einer automatisierten Vorrichtung durchgeführt werden. In jedem Fall muss sorgfältig geätzt werden, um die Mikrostruktur deutlich sichtbar zu machen.

Ein Mikroskop verwendet eine Objektivlinse mit sehr kurzer Brennweite, um ein stark vergrößertes Bild zu erzeugen. Dieses Bild wird dann mit einem kurzbrennweitigen Okular betrachtet, das als einfache Lupe verwendet wird. Das grundlegende Abbildungskonzept und die Strukturen der optischen Mikroskopie sind in Abb. 2 dargestellt. Das optische System eines Mikroskops umfasst hauptsächlich eine Objektivlinse und ein Okular. Der Zweck einer Objektivlinse besteht darin, ein Objekt zu vergrößern, damit es vom Benutzer klar beobachtet werden kann. Bei der Beobachtung wird die Probe in der Nähe der Fokusebene des Objektivs im Objektraum platziert und zunächst auf der Zwischenebene ein vergrößertes reelles Bild der Probe erzeugt. Die Zwischenebene befindet sich auf der Brennebene des Okulars, somit arbeitet das Okular als Lupe, um das auf die Zwischenbildebene projizierte Bild weiter zu vergrößern. Schließlich wird dem Betrachter ein vergrößertes, virtuelles, invertiertes Bild zur Verfügung gestellt.

Abb. 2 Optisches Prinzip der Mikroskopbildgebung

Die Fähigkeit eines optischen Mikroskops, trennbare Bilder verschiedener Punkte auf einem Objekt zu erzeugen, ist begrenzt. Das Auflösungsvermögen eines Objektivs ist ein quantitatives Maß für diese Fähigkeit. Punkte, die näher als die Auflösungsgrenze liegen, können nicht als separate Punkte unterschieden werden. Ernst Abbe legte 1873 erstmals den Wert des minimalen Abstands d zwischen zwei benachbarten Punkten fest, der es ermöglicht, sie als getrennt wahrzunehmen, durch die Gleichung „d =l/2n sin A“, wobei „l“ die Wellenlänge des Lichts „A“ ist. ist die Hälfte des Öffnungswinkels der Linse und 'n'  ist der Brechungsindex des Mediums zwischen dem Objekt und der Linse.

Gegenwärtig wird die kleinste lineare Trennung von zwei Objektpunkten, für die sie durch ein Objektiv aufgelöst werden können, durch das Rayleigh-Kriterium festgelegt, das durch die Gleichung „d =1,22 (l/2NA)“ gegeben ist, wobei „l“ die Wellenlänge des Lichts ist, und „NA“ ist die numerische Apertur des Objektivs. Sowohl das Abbe-Kriterium als auch das Rayleigh-Kriterium sind sehr ähnlich, da die numerische Apertur durch NA =n sin A auf das Abbildungsmedium bezogen ist. Der Maximalwert von sinA ist 1 (A =90 Grad), daher die theoretische maximale numerische Apertur von an Objektiv in Luft (n =1) ist NA =1. Da eine hohe NA eine wesentliche Voraussetzung für eine hohe Auflösung ist, wurden Immersionsoptiken entwickelt. Durch Immersionsmedien mit unterschiedlichem Brechungsindex wie Wasser (n =1,33), Glyzerin (n =1,47) oder Öl (n =1,52) können Proben in sehr kurzer Entfernung vom Objektiv abgebildet werden.

Bei einem gut konstruierten Mikroskop wird die räumliche Auflösung hauptsächlich durch die Objektivlinse bestimmt. Ein Okular kann zwar auch das Bild vergrößern, aber das Auflösungsvermögen der Mikroskope nicht verbessern. Die räumliche Auflösung eines optischen Mikroskops wird durch die Rayleigh-Gleichung Ro =0. angegeben 62 l/n sin A, wobei „Ro“ der minimal auflösbare Abstand, „l“ die Wellenlänge des Lichts, „n“ der Brechungsindex des Mediums zwischen Linse und Objekt und „A“ Eins ist -halber Öffnungswinkel der Linse, und n sinA ist die numerische Apertur des Objektivs.

Basierend auf der obigen Gleichung und unter Berücksichtigung der praktischen Einschränkungen, nämlich (i) die Verwendung von sichtbarem Licht mit der Wellenlänge zwischen 390 nm (Nanometer) und 760 nm, (ii) die maximal erreichbare Apertur mit dem Halbwinkel von 70 Grad bis 75 Grad und (iii) die Anforderung, Immersionsverfahren mit Wasser oder Öl zur Erhöhung des Brechungsindex zu verwenden, darf die Auflösung eines herkömmlichen optischen Mikroskops 200 nm nicht überschreiten.

Das optische Mikroskop und der vereinfachte optische Wellenweg des Mikroskops sind in Abb. 3 dargestellt. Das moderne optische Mikroskop ist in der Lage, ein Objekt mit der 200-nm-Grenze der räumlichen Auflösung um das 1.500-fache zu vergrößern. Die Lichtmikroskope lassen sich anhand verschiedener Kriterien in viele verschiedene Typen einteilen. Basierend auf einem Beleuchtungsverfahren gibt es zum Beispiel Transmissions- und Reflexionsmikroskope. Bei einem Transmissionsmikroskop durchdringt das Licht transparente Objekte. In einem Reflexionsmikroskop beleuchtet die oben auf der Mikroskoplinse installierte Lichtquelle die nicht transparenten Objekte, und das reflektierte Licht wird von der Linse gesammelt. Die Mikroskope können auch anhand der Beobachtungsmethoden unterschieden werden, darunter Hellfeldmikroskope, Dunkelfeldmikroskope, Phasendifferenzmikroskope, Polarisationsmikroskope, Interferenzmikroskope und Fluoreszenzmikroskope.

Jedes Mikroskop kann entweder den Transmissions- oder den Reflexionsansatz verwenden. Die Hellfeldmikroskope sind die beliebtesten und am weitesten verbreiteten aller Mikroskope. Bei Verwendung dieses Mikroskoptyps variieren das Transmissions- (oder Absorptions-) Verhältnis und das Reflexionsverhältnis einiger beobachteter Objekte entsprechend der Änderung der Arbeitsumgebung. Die Amplitude dieser Objekte variiert mit der Änderung der Beleuchtungsintensität. Die farblosen transparenten Objekte sind nur sichtbar, wenn sich die Phase des beleuchteten Lichts ändert. Da die Hellfeldmikroskope die Lichtphase nicht ändern können, sind die farblosen transparenten Proben bei Verwendung dieses Mikroskoptyps unsichtbar.

Abb. 3 Optisches Mikroskop und sein Prinzip

Mikroskopkomponenten

Optische Mikroskope unterscheiden sich erheblich in Kosten und Leistungsfähigkeit. Reflektiertes Licht wird für die Untersuchung von Metallen verwendet. Mit Durchlichtmikroskopen werden Mineralien und Polymere untersucht, die auch im Auflicht untersucht werden können. Lichtmikroskope werden auch als „aufrecht“ oder „umgekehrt“ klassifiziert. Diese Begriffe beziehen sich auf die Orientierung der Polierebene der Probe während der Beobachtung. Da jede Konfiguration bestimmte Vor- und Nachteile hat, erfolgt die Auswahl nach persönlichen Vorlieben. Das einfachste optische Mikroskop ist das Tischmikroskop (normalerweise aufrecht). Einige Mikroskope können abhängig von der Steifigkeit des Ständers um fotografische Funktionen erweitert werden.

Es stehen verschiedene Arten von Mikroskopen zur Verfügung, die für die Beobachtung und Fotomikroskopie geeignet sind. Dies können eher einfache Einheiten oder vollwertige Forschungsmikroskope mit verschiedenen Beleuchtungsmodi, Lichtquellen, Aufsätzen mit Mikrohärte, Heiztischen usw. sein. Grundkomponenten des optischen Mikroskops sind unten angegeben und in Abb. 3 dargestellt.

Beleuchtung  System – Eine Vielzahl von Lichtquellen für die optische Mikroskopie stehen zur Verfügung. Die hauptsächlich bei Tischmikroskopen verwendete Niederspannungs-Wolfram-Glühlampe hat eine ausreichende Intensität für die Beobachtung, aber nicht für die Fotografie. Die Änderung des Stroms zur Glühbirne steuert die Lichtintensität. Kohlebogen-Beleuchtungssysteme, die früher bei Mikroskopen üblich waren, wurden durch Bogen- oder Fadenlichtquellen ersetzt. Die Xenon-Lichtbogen-Lichtquelle ist wegen ihrer hohen Intensität und ihrer Tageslicht-Farbeigenschaften weit verbreitet. Die Lichtintensität kann jedoch nur durch die Verwendung von Neutraldichtefiltern eingestellt werden. Wolfram-Halogen-Glühlampen werden wegen ihrer hohen Intensität und hohen Farbtemperatur ebenfalls weit verbreitet verwendet. Die Lichtintensität kann durch Variation des Stroms oder durch Verwendung von Neutraldichtefiltern gesteuert werden. Andere Lichtquellen wie Zirkoniumbogen-, Natriumbogen-, Quarzjod- oder Quecksilberdampflampen sind weniger gebräuchlich.

Kondensator – Eine von sphärischer Aberration und Koma freie einstellbare Linse wird vor der Lichtquelle platziert, um das Licht an der gewünschten Stelle im Strahlengang zu fokussieren. Vor dieser Linse ist eine Leuchtfeldblende angeordnet, um interne Blendung und Reflexionen innerhalb des Mikroskops zu minimieren. Die Leuchtfeldblende wird bis zum Rand des Sehfeldes abgeblendet. Eine zweite verstellbare Irisblende, die Aperturblende, wird im Strahlengang vor der Vertikalbeleuchtung platziert.

Das Öffnen oder Schließen dieser Blende verändert die Lichtmenge und den Winkel des Lichtkegels, der in die Objektivlinse eintritt. Die optimale Einstellung für diese Blende variiert mit jedem Objektiv und ist ein Kompromiss zwischen Bildkontrast, Schärfe und Schärfentiefe. Mit zunehmender Vergrößerung wird die Aperturblende abgeblendet. Das Öffnen dieser Blende erhöht die Bildschärfe, verringert jedoch den Kontrast. Das Schließen der Blende erhöht den Kontrast, beeinträchtigt aber die Bildschärfe. Die Aperturblende darf nicht zur Reduzierung der Lichtstärke verwendet werden. Es ist nur auf Kontrast und Schärfe einzustellen.

Lichtfilter – Diese werden verwendet, um das Licht für eine einfachere Beobachtung, für eine verbesserte Fotomikroskopie oder zur Änderung des Kontrasts zu modifizieren. Neutraldichtefilter werden verwendet, um die Lichtintensität gleichmäßig über das sichtbare Spektrum zu reduzieren. Es stehen verschiedene Graufilter von etwa 85 % bis 0,01 % Transmission zur Verfügung. Die Mehrheit der optischen Mikroskope hat eine Auswahl von mindestens zwei solcher Filter.

Selektive Filter gleichen die Farbtemperatur der Lichtquelle an die des Films an. Abhängig von der verwendeten Lichtquelle und dem Filmtyp ist dies häufig für die originalgetreue Wiedergabe von Farbbildern erforderlich. Ein grüner oder gelbgrüner Filter wird häufig in der Schwarzweißfotografie verwendet, um die Auswirkungen von Objektivfehlern auf die Bildqualität zu verringern. Die Mehrheit der Objektive, insbesondere die kostengünstigeren Achromaten, benötigen eine solche Filterung für gute Ergebnisse.

Polarisationsfilter werden verwendet, um linear polarisiertes Licht (ein Filter) oder gekreuzt polarisiertes Licht (zwei Filter rotiert, um Extinktion zu erzeugen) zur Untersuchung von nichtkubischen (kristallographischen) Materialien zu erzeugen. Materialien, die optisch anisotrop sind, wie Beryllium, Zirkonium, Alpha-Titan und Uran, können im gekreuzten polarisierten Zustand ohne Ätzen untersucht werden. Eine empfindliche Tönungsplatte kann auch mit kreuzpolarisiertem Licht verwendet werden, um die Farbgebung zu verbessern.

Das Objektiv – Es bildet das primäre Abbild der Mikrostruktur und ist die wichtigste Komponente des Lichtmikroskops. Das Objektiv sammelt so viel Licht wie möglich von der Probe und kombiniert dieses Licht, um das Bild zu erzeugen. Die NA des Objektivs ist ein Maß für die Lichtsammelfähigkeit der Linse. Die Lichtsammelfähigkeit nimmt mit dem Winkel „A“ zu. Die Einstellung der Aperturblende verändert die NA des Kondensors und damit die NA des Systems.

Objektivlinsen (Abb. 4) sind normalerweise auf einem Revolverkopf montiert, der vier bis sechs Objektive aufnehmen kann. Einige Mikroskope verwenden keine Revolverköpfe, und es kann jeweils nur ein Objektiv mit einem Bajonettverschluss auf der vertikalen Beleuchtung platziert werden. Die Vertikalbeleuchtung enthält einen Reflektor oder ein Prisma, das das Licht durch das Objektiv auf die Probenoberfläche lenkt. Es hält normalerweise auch die Apertur- und Leuchtfeldblenden und Filter. Die vertikale Beleuchtung liefert normalerweise nur eine oder zwei Beleuchtungsarten, wie etwa Hellfeld- und Dunkelfeldbeleuchtung oder Hellfeld- und Polarisationslichtbeleuchtung. Mittlerweile sind jedoch universelle vertikale Beleuchtungen erhältlich, die alle Beleuchtungsarten mit einer vertikalen Beleuchtung und einem Objektivsatz ermöglichen.

Die Tubuslänge ist die Länge des Körpertubus von der Augenlinie des Okulars bis zum Objektivgewinde. Diese Länge ist nicht genormt und kann variieren. Die meisten Objektive sind für die Verwendung mit einer bestimmten Tubuslänge ausgelegt, normalerweise 160 mm bis 250 mm, und können normalerweise nicht ausgetauscht werden.

Das am häufigsten verwendete Objektiv ist der Achromat, der für eine Farbe (normalerweise Gelb-Grün) sphärisch und für zwei Farben (normalerweise Rot und Grün) bezüglich des Farblängsfehlers korrigiert wird. Achromate sind daher für die Farbfotomikroskopie nicht geeignet. Die Verwendung eines Gelb-Grün-Filters und eines orthochromatischen Films führt zu optimalen Ergebnissen. Achromate bieten jedoch einen relativ großen Arbeitsabstand, dh den Abstand von der Frontlinse des Objektivs zur Probenoberfläche. Der Arbeitsabstand nimmt mit zunehmender Vergrößerung des Objektivs ab. Die meisten Hersteller fertigen Objektive mit langem Arbeitsabstand für spezielle Anwendungen, beispielsweise in der Heiztischmikroskopie. Achromate sind spannungsfrei, was für Untersuchungen mit polarisiertem Licht wichtig ist. Da sie weniger Linsen enthalten als andere höher korrigierte Linsen, werden interne Reflexionsverluste minimiert.

Halbapochromatische oder Fluorit-Objektive bieten einen höheren Korrekturgrad der sphärischen und chromatischen Aberration. Daher erzeugen sie qualitativ hochwertigere Bilder als Achromaten. Die apochromatischen Objektive haben den höchsten Korrektionsgrad, liefern die besten Ergebnisse und sind teurer. Plano-Objektive verfügen über eine umfassende Korrektur für die Ebenheit des Bildfelds, wodurch die Belastung der Augen verringert wird, und sind häufig bei modernen Mikroskopen zu finden.

Bei Parfokal-Linsensystemen ist jedes Objektiv auf dem Revolverrevolver nahezu fokussiert, wenn der Revolver gedreht wird, wodurch verhindert wird, dass die vordere Linse des Objektivs die Probe berührt, wenn die Linsen gewechselt werden. Viele Objektive sind auch federbelastet, was hilft, Schäden an der Linse zu vermeiden. Dies ist eher ein Problem bei stark vergrößernden Objektiven, da der Arbeitsabstand sehr klein sein kann.

Bestimmte Objektive sind für die Verwendung mit Öl zwischen der Probe und der Frontlinse des Objektivs ausgelegt. Ölimmersionsobjektive werden jedoch selten verwendet, da Probe und Objektiv nach Gebrauch gereinigt werden müssen. Sie liefern jedoch höhere Auflösungen, als sie erreicht werden können, wenn sich Luft zwischen Linse und Probe befindet. Im letzteren Fall liegt die maximal mögliche NA bei 0,95, während die Ölimmersionsobjektive eine NA von 1,3 bis 1,45 NA, erzeugen je nach Objektiv und verwendetem Öl. Vergrößerungen von 25x bis 160× sind verfügbar. Die Verwendung von Öl schärft auch das Bild, was bei der Untersuchung von Proben mit geringem Reflexionsvermögen wie Kohle oder Keramik wertvoll ist.

Abb. 4 Objektiv- und Okulartypen

Okular – Sie wird auch Okularlinse genannt. Das Okular (Abb. 4) vergrößert das vom Objektiv erzeugte Primärbild. Das Auge kann dann das volle Auflösungsvermögen des Objektivs nutzen. Das Mikroskop erzeugt ein virtuelles Bild der Probe am Punkt der deutlichsten Sicht, normalerweise 250 mm vom Auge entfernt. Das Okular vergrößert dieses Bild, wodurch nützliche Vergrößerungen erzielt werden können. Das Standard-Okular hat ein Gesichtsfeld von 24 mm Durchmesser, während die Weitfeld-Okulare für Plano-Objektive ein Gesichtsfeld von 30 mm Durchmesser haben, was den nutzbaren Bereich des Primärbildes vergrößert.

Das einfachste Okular ist das Huygensche Okular, dessen Design von C. Huygens erfunden wurde. Es besteht aus zwei plankonvexen Linsen, deren konvexe Oberflächen der Objektivlinse zugewandt sind. Es ist zufriedenstellend für die Verwendung mit Achromat-Objektiven mit niedriger und mittlerer Vergrößerung. Ausgleichsokulare werden bei Achromaten mit hoher NA und den höher korrigierten Objektiven verwendet. Da mit diesen Okularen einige Linsenkorrekturen durchgeführt werden, ist das Okular auf den verwendeten Objektivtyp abzustimmen.

Der Augenabstand ist der Abstand zwischen der Augenlinse des Okulars und dem Auge. Bei den meisten Okularen beträgt der Augenabstand 10 mm oder weniger, was unzureichend ist, wenn die Person, die das Mikroskop verwendet, eine Brille trägt. Einfache Sehprobleme, wie Kurzsichtigkeit, können mit der Feineinstellung des Fokus ausgeglichen werden. Sehprobleme wie Hornhautverkrümmung können nicht mikroskopisch korrigiert werden und es muss eine Brille getragen werden. Für den für Brillen notwendigen Augenabstand von ca. 20 mm sind High-Eye-Point-Okulare erhältlich.

Okulare sind normalerweise mit verschiedenen Fadenkreuzen oder Strichplatten zum Lokalisieren, Messen, Zählen oder Vergleichen von Mikrostrukturen ausgestattet. Das Okular vergrößert das Fadenkreuz- oder Strichplattenbild und das Primärbild. Beide Bilder sollen gleichzeitig scharf sein. Es werden auch spezielle Okulare hergestellt, um genauere Messungen zu ermöglichen, als dies mit einer Strichplatte möglich ist. Beispiele sind das Filar-Mikrometer-Okular oder das Schrauben-Mikrometer-Okular. Solche Geräte können automatisiert werden, um eine direkte digitale Anzeige der Messung zu erzeugen, die auf etwa 1 Mikrometer genau ist.

Normalerweise wird ein Okular mit 10-facher Vergrößerung verwendet. Um jedoch Standardvergrößerungen zu erhalten, benötigen einige Systeme andere Vergrößerungen, z. B. 6,3-fach. In bestimmten Situationen sind auch Okulare mit höherer Vergrößerung wie 1×, 15×, 20× oder 25× nützlich. Die Gesamtvergrößerung ergibt sich aus der Multiplikation der Objektivvergrößerung Mo mit der Okularvergrößerung Me (Abb. 2). Wird zusätzlich ein Zoomsystem oder Balg verwendet, ist die Vergrößerung entsprechend zu verändern.

Bühne – Zum Fokussieren und Bewegen der Probe ist ein Kreuztisch vorgesehen, der auf dem Tisch platziert und mit Klammern befestigt wird. Der Objekttisch eines inversen Mikroskops hat austauschbare Mitteltischplatten mit Löchern unterschiedlicher Größe. Die polierte Oberfläche wird zur Betrachtung gegen das Loch gelegt. Allerdings ist nicht die gesamte Fläche einsehbar und bei hohen Vergrößerungen ist es aufgrund des eingeschränkten Arbeitsabstandes nicht möglich, das Objektiv in der Nähe des Lochrandes zu fokussieren. Im Falle eines aufrechten Mikroskops wird die Probe auf einem Objektträger auf dem Objekttisch platziert. Da die polierte Oberfläche senkrecht zum Lichtstrahl stehen soll, wird Ton zwischen Probenboden und Objektträger gegeben. Ein Stück Linsengewebe wird über die polierte Oberfläche gelegt, und die Probe wird mit einer Nivellierpresse in den Ton gepresst. Gewebestücke können jedoch an der Probenoberfläche haften bleiben. Eine Alternative, die besonders bei montierten Proben nützlich ist, besteht darin, einen Ring anstelle von Gewebe zu verwenden, um die Probe abzuflachen. Aluminium- oder Edelstahlringformen in der gleichen Größe wie die Halterungen (in einem Schraubstock leicht abgeflacht) sitzen eher auf der Halterung als auf der Probe.

Das aufrechte Mikroskop ermöglicht die Betrachtung der gesamten Oberfläche mit jedem Objektiv, und der Bediener kann sehen, welcher Abschnitt der Probe betrachtet wird. Dies ist eine nützliche Funktion bei der Untersuchung bestimmter Bereiche auf beschichteten Proben, Schweißnähten und anderen Proben, bei denen bestimmte Bereiche untersucht werden sollen. Bei montierten Proben kann ein Tischhalter mit automatischer Nivellierung für Halterungen das Nivellieren von Proben auf Ton eliminieren.

Der Tisch muss starr sein, um Vibrationen zu eliminieren. Die von x- und y-Mikrometern gesteuerte Tischbewegung muss glatt und präzise sein, und daher wird normalerweise ein Zahnstangengetriebe verwendet. Viele Tische haben Skalen zum Messen der Abstände in x- und y-Richtung. Die Fokussiersteuerungen enthalten häufig Lineaturen zum Schätzen der vertikalen Bewegung. Einige Einheiten haben motorisierte Bühnen und Fokussteuerungen.

Eine kreisförmige drehbare Tischplatte kann die Untersuchung mit polarisiertem Licht erleichtern. Solche Stufen, die für mineralogische oder petrographische Studien üblich sind, sind abgestuft, um die Messung des Rotationswinkels zu ermöglichen. Ein geradliniger Tisch wird normalerweise oben auf dem kreisförmigen Tisch platziert.

Aufstehen – Tischmikroskope benötigen ein starres Stativ, insbesondere wenn auf dem Gerät Fotomikroskopie durchgeführt wird. Die verschiedenen Teile des Mikroskops werden im zusammengebauten Zustand am Ständer befestigt. In einigen Fällen wird das Tischmikroskop auf einem separaten Stativ platziert, das auch das fotografische System trägt.

Linsenfehler

Viele Linsenfehler resultieren aus den Gesetzen der Reflexion und Brechung. Der Brechungsindex einer Linse variiert mit der Wellenlänge des Lichts, und die Brennweite der Linse variiert mit dem Brechungsindex. Daher ändert sich die Brennweite für verschiedene Lichtfarben. Ein separates Bild für jede vorhandene Wellenlänge wird in unterschiedlichen Abständen von der Linse fokussiert. Dies ist die chromatische Längsaberration (Abb. 5). Darüber hinaus variiert die Vergrößerung mit der Brennweite, wodurch sich die Größe des Bildes ändert. Dies ist die laterale chromatische Aberration (Abb. 5). Diese Unterschiede sollen eliminiert werden, um Farbfotografien zu erzeugen. Da Achromaten für diese Probleme nur begrenzte Korrekturen haben, müssen sie mit Gelb-Grün-Lichtfilterung verwendet werden, um scharfe Bilder zu erhalten. Sphärische Aberration (Abb. 5) tritt auf, wenn Licht von einem Punktobjekt auf der optischen Achse in der Mitte oder an der Peripherie der Linse stärker gebrochen wird, wodurch eine Reihe von Fokuspositionen erzeugt wird, in denen das Punktbild als Kreis mit endlicher Fläche erscheint . Dies kann minimiert werden, indem eine Blende verwendet wird, die die Verwendung des Objektivs auf den zentralen Abschnitt beschränkt. Das Linsendesign kann auch einen Teil dieses Problems beheben.

Da die optimal fokussierte Bildfläche gekrümmt ist, werden Ausgleichsokulare mit gleicher, aber entgegengesetzter Krümmung verwendet, um ein ebenes Bild zu erzeugen. Andere Probleme wie Koma und Astigmatismus können die Bildqualität beeinträchtigen, wenn sie nicht korrigiert werden.

Abb. 5 Linsenfehler

Auflösung

Um mikrostrukturelle Details zu sehen, muss das optische System eine angemessene Auflösung oder Auflösungsleistung und einen angemessenen Bildkontrast erzeugen. Wenn die Auflösung akzeptabel ist, aber der Kontrast fehlt, können keine Details beobachtet werden. Im Allgemeinen ist die Fähigkeit, zwei durch einen Abstand „d“ getrennte Punkte oder Linien aufzulösen, eine Funktion der Wellenlänge „l“ des einfallenden Lichts und der numerischen Apertur NA, des Ziels. Dies folgt der Gleichung „d =k.l / NA“, wobei k 0,5 oder 0,61 ist. Abb. 6 zeigt diese Beziehung für k =0,61 und vier Lichtwellenlängen. Andere Formeln wurden ebenfalls berichtet. Andere Faktoren, die das Auflösungsvermögen beeinflussen, wie zB der Korrektionsgrad der Objektive und die Sehschärfe der Person, die durch das Mikroskop schaut, sind in der Gleichung nicht enthalten. Es basiert auf der Arbeit von Abbe unter Bedingungen, die in der Metallographie nicht vorhanden sind, wie z. B. selbstleuchtende Punkte, perfekter Schwarz-Weiß-Kontrast, Durchlichtprüfung, eine ideale Punktlichtquelle und das Fehlen von Linsenfehlern.

Unter Verwendung der Gleichung im vorherigen Absatz beträgt die Auflösungsgrenze für ein Objektiv mit einer NA von 1,4 etwa 0,2 Mikrometer. Um Linien oder Punkte mit einem Abstand von 0,2 Mikrometern zu sehen, ist die erforderliche Vergrößerung zu bestimmen, indem das Auflösungsvermögen des Objektivs durch das Auflösungsvermögen des menschlichen Auges dividiert wird, das unter Beobachtungsbedingungen schwer zu bestimmen ist. Abbe verwendete einen Wert von 0,3 mm bei einem Abstand von 250 mm, was dem Augenabstand für optimales Sehen entspricht. Für Licht mit einer mittleren Wellenlänge von 0,55 Mikrometern beträgt die erforderliche Vergrößerung das 1.100-fache der NA des Objektivs. Dies ist der Ursprung der 1.000-NA-Regel für die maximal nutzbare Vergrößerung. Jede Vergrößerung über 1.000 NA wird als „leer“ oder nutzlos bezeichnet.

Die strikte Einhaltung der 1.000-NA-Regel ist angesichts der Bedingungen, unter denen sie entwickelt wurde, die sich sicherlich von denen der Metallographie unterscheiden, in Frage zu stellen. Gemäß der Abbe-Analyse ist für eine Person, die ein optisches Mikroskop mit optimaler 20/20-Sicht und für optimale Kontrastbedingungen und eine mittlere Lichtwellenlänge von 550 nm verwendet, die niedrigste Vergrößerung, die die NA des Objektivs voll ausnutzt, das 550-fache der NA . Dies legt eine nützliche Mindestvergrößerung fest, die mit einem gegebenen Objektiv verwendet werden kann. Es wurde vorgeschlagen, dass die Obergrenze der nützlichen Vergrößerung für die durchschnittliche Person, die ein optisches Mikroskop verwendet, bei 2.200 NA, liegt nicht 1.000 NA.

Abb. 6 Zusammenhang zwischen Auflösung und Schärfentiefe mit numerischer Apertur

Schärfentiefe

Schärfentiefe ist die Entfernung entlang der optischen Achse, über die Bilddetails mit akzeptabler Klarheit beobachtet werden können. Diejenigen Faktoren, die die Auflösung beeinflussen, wirken sich auch auf die Schärfentiefe aus, jedoch in die entgegengesetzte Richtung. Es ist also ein Kompromiss zwischen diesen beiden Parametern zu finden, die mit zunehmender Vergrößerung schwieriger werden. Dies ist einer der Gründe, warum Lichtätzen für Untersuchungen mit hoher Vergrößerung bevorzugt wird.

Untersuchungsmodi

Um das Auflösungsvermögen des gewählten Objektivs zu erreichen, muss der Bildkontrast ausreichend sein. Der Bildkontrast hängt von der Probenvorbereitung und der Optik ab. Unterschiede im Lichtreflexionsvermögen von der Probenoberfläche erzeugen Amplitudenmerkmale, die für das Auge nach Vergrößerung sichtbar sind. Phasenunterschiede, die durch Lichtreflexion entstehen, sollen durch Phasenkontrast- oder Interferenzkontrast-Vorsätze am Mikroskop sichtbar gemacht werden.

Hellfeldbeleuchtung – Vertikale Hellfeldbeleuchtung, die am weitesten verbreitete Beobachtungsmethode, macht die überwiegende Mehrheit der aufgenommenen Mikroaufnahmen aus. Im Betrieb passiert Licht das Objektiv und trifft senkrecht auf die Probenoberfläche. Oberflächenmerkmale senkrecht zum einfallenden Licht reflektieren Licht zurück durch das Objektiv zu den Okularen, wo die Oberflächenmerkmale hell erscheinen. Schräg zum Lichtstrahl liegende Flächen reflektieren weniger Licht zum Objektiv und erscheinen je nach Winkel dunkler.

Schrägbeleuchtung – Bei einigen Mikroskopen ist es möglich, die Kondensorbaugruppe oder den Spiegel zu dezentrieren, sodass das durch das Objektiv fallende Licht in einem nicht senkrechten Winkel auf die Probenoberfläche trifft. Rauheit auf der Probenoberfläche wirft Schatten und erzeugt ein dreidimensionales Erscheinungsbild. Dies ermöglicht die Bestimmung von Merkmalen, die erhaben oder vertieft sind. Es kann jedoch nur eine sehr geringe Schiefe eingeführt werden, da diese Technik dazu führt, dass die Beleuchtung ungleichmäßig wird und die Auflösung verringert wird.

Bei Dunkelfeldbeleuchtung – Bei der Dunkelfeldbeleuchtung wird das von schräg ausgerichteten Merkmalen reflektierte Licht gesammelt, und die von Merkmalen senkrecht zum einfallenden Strahl reflektierten Strahlen werden blockiert. Daher ist der Kontrast im Wesentlichen umgekehrt zu dem der Hellfeldbeleuchtung; das heißt, Merkmale, die bei Hellfeldbeleuchtung hell sind, erscheinen dunkel, und Merkmale, die normalerweise dunkel sind, erscheinen hell. Dadurch entsteht ein sehr starker Bildkontrast, wobei die schrägen Merkmale leuchtend erscheinen. Unter solchen Bedingungen ist es häufig möglich, Merkmale zu erkennen, die bei Hellfeldbeleuchtung nicht sichtbar sind. Diese Methode ist besonders nützlich für die Untersuchung von Kornstrukturen. Die geringe Lichtintensität erschwert jedoch die Fotomikroskopie, ein Problem, das durch die Verwendung automatischer Belichtungssteuerungsgeräte verringert wird.

Polarisiertes Licht – Polarisiertes Licht, wie es in der Metallographie verwendet wird, war normalerweise auf die Beobachtung bestimmter optisch anisotroper Metalle wie Beryllium, Alpha-Titan, Zirkonium und Uran beschränkt, die schwer zu ätzen sind, aber gut auf polarisiertes Licht ansprechen, wenn sie richtig poliert sind. Before development of the electron micro-probe analyzer (EMPA) and energy dispersive spectroscopy (EDS), polarized light examination was an integral part of the method for identifying inclusions. Since the development of these instruments, polarized light has been used less frequently for this purpose, since identification with the EMPA or EDS techniques is more definitive. Most metallurgical microscopes now use synthetic Polaroid filters. The ‘polarizer’ is placed in the light path before the objective, and the ‘analyzer’ is placed in the light path after the objective, normally just below the eyepiece.

Light consists of transverse waves vibrating in all directions at right angles to the direction of propagation. These vibrations occur symmetrically around the direction of propagation and are unpolarized. When light passes through a polarizing filter, the vibrations occur in only one plane in the direction of propagation, and the light is termed plane polarized. This plane changes as the filter is rotated. When the analyzer filter is placed in the light path, plane polarized light passes through it if the plane of vibration of the light is parallel to the plane of vibration of the analyzer. If the plane of vibration of the analyzer is perpendicular to that of the light the light does not pass through, and extinction results. When plane-polarized light is reflected from the surface of an isotropic metal (any metal with a cubic crystallographic structure, such as iron), then passes through the analyzer in the crossed position (plane of vibration perpendicular to that of the plane-polarized light), the image is extinguished, or dark. However, in practice, since the metallurgical microscope does not produce perfectly plane-polarized light, complete extinction does not occur. This is not a serious problem, since polarized light is used only in a qualitative manner in metallography. Strain-free objectives, normally achromats, are to be used. Fluorite or apochromatic objectives are unsuitable. A strong white-light source is needed to produce accurate colour effects.

If an optically anisotropic, polished metal is placed under the light beam with the polarizer and analyzer crossed, the microstructure is revealed. The quality of sample preparation is very important, and the surface is to be perpendicular to the light path. Rotation of the sample under the beam changes light intensity and colour. Since it is difficult to set the polarizer and analyzer in the crossed position accurately when an anisotropic sample is in place unless the crossed positions are marked on the polarizer and the analyzer, it is best to find this position first using an isotropic sample.

When plane-polarized light strikes an anisotropic metal surface, reflection occurs as two plane-polarized components at right angles to each other. The directions vary with crystal structure. The strength of these two perpendicular reflections can change, and a phase difference exists between them. These differences vary with each metal and depend on the crystal orientation. No reflection is obtained when the basal plane of hexagonal or tetragonal crystals is perpendicular to the light beam. Maximum reflectance occurs when the principal symmetry axis of the crystal is perpendicular to the light beam. The resultant image is predominantly influenced by these orientation effects with phase differences are of little significance.

When the analyzer is crossed with respect to the polarizer, rotation of plane-polarized light from the anisotropic surface allows the light to pass through the analyzer, producing an image in which each grain has a different light intensity and colour, depending on its crystal orientation relative to the light beam. As the stage is rotated, each grain changes four times in intensity from light to dark during a 360 degree rotation. If the phase difference is appreciable, the light is elliptically polarized, the difference in intensity in each grain with rotation is less, and extinction is not observed. Colour images are obtained when the reflected plane-polarized light varies with wavelength. When little colour is present, a sensitive tint plate inserted between the polarizer and the objective enhance colouration.

Isotropic metals can be examined using crossed-polarized light if the surface can be rendered optically active by etching, staining, or anodizing. Procedures have been developed for several metals, however, all etched surfaces do not respond to polarized light. Normally, the etch s to produce etch pits or facets in each grain to cause double reflection at these features. Grains with different crystal orientations produce differently oriented pits or facets, yielding different degrees of elliptical polarization and hence varying light intensity. Anodizing produces a thick oxide film on the sample surface and irregularities in the film lead to double reflection.

Although the polarization response of anodized samples has been attributed to optical anisotropy of the film, experimentation has shown that the effect is due to film surface irregularities. Tint etchants produce surface films which result in interference colours which can be enhanced using polarized light. In general, best results are achieved when the analyzer is shifted slightly from the crossed position. In addition to its use in examining inclusions, anisotropic metals (antimony, beryllium, bismuth, cadmium, cobalt, magnesium, scandium, tellurium, tin, titanium, uranium, zinc, and zirconium, for example), and etched / anodized/ tint-etched cubic metals, polarized light is useful for examination of coated or deformed metals. Phase identification can also be aided in some cases. The internal structure of graphite nodules in cast iron is vividly revealed using polarized light. Martensitic structures are frequently better revealed using polarized light, which illustrate lath martensite in a high-strength iron-base alloy.

Phase contrast illumination – It permits examination of subtle phase variations in microstructures with little or no amplitude contrast from differences in the optical path at the surface (reflected light) or from differences in the optical path through the sample (transmitted light). Differences of height as small as 0.005 micrometers can be detected. Application of phase-contrast illumination in metallography has been limited. The technique needs a separate set of objectives and a special vertical illuminator.

Interference-contrast illumination – Differential interference-contrast illumination produces images with emphasized topographic detail similar to those observed using oblique illumination. Detail which is invisible or faintly visible using bright-field illumination can be revealed vividly with interference-contrast illumination. Examples of the topographic detail which can be revealed using differential interference-contrast illumination are the relative hardness of the constituents or the nature of the etching process, that is, which areas or constituents are attacked by the etchant. In some cases, other aspects of the structure can be revealed which are invisible or faintly visible in bright-field illumination.

Interference techniques – Several interference techniques are used to measure height differences on samples. Interference fringes on a perfectly flat surface appear as straight, parallel lines of equal width and spacing. Height variations cause these fringes to appear curved or jagged, depending on the unit used. The interference microscope divides the light from a single point source into two or more waves which are superimposed after traveling different paths. This produces interference. Two-beam and multiple-beam instruments are the two basic types of interferometers used. The measurements are based on the wavelength of the light used. Two-beam interferometers can measure height differences as small as ‘l’/20; multiple-beam interferometers, as small as ‘l’/200.

The Linnik-type interferometer is a two-beam reflecting microscope which uses non-polarized light. A beam-splitting prism produces two light beams from a monochromatic light source. One beam travels through the test piece objective to the test piece surface and is reflected back through the objective to the eyepiece. The other beam travels through the reference objective, strikes an optically flat reference mirror, and returns to the beam splitter, then to the eyepiece. If the path difference between the two beams is not equal or not a multiple of ‘l’/2, interference occurs and contour lines are formed which indicate locations of equal elevation. The height difference between adjacent fringes is ‘l’/2.

The Tolansky multiple-beam interferometer produces interference between many light beams by placing a reference mirror which is partially transmitting and partially reflecting very near the sample surface but slightly out of parallel. The reference mirror has a known reflectivity selected to approximate that of the surface. Light passes through the reference mirror and strikes the sample surface, is reflected by the sample surface, and interferes with the rays reflected between the reference mirror and the sample. The fringes produced by the multiple-beam interferometer are sharper than those from the two-beam interferometer, which accounts for the greater accuracy. The distance between the fringes is also ’l’/2. Elevations produce displacements of the fringes from parallel alignment. The displacement is compared to the distance between the fringes to obtain height measurements.

Light-section microscopy – The light-section microscope, also used to measure surface topography, complements interference techniques. Roughness differences from 1 micrometer to 400 micrometers can be measured, which is useful in examining machined surfaces and for measurement of surface layers or films. In operation, a slit is placed near the field iris in the illumination system and is imaged by an objective as a light line on the surface to be measured. Oblique illumination is used with a dark background. The light band is observed using a second objective which is identical to the first. The objectives are 45 degrees to the sample surface and 90 degrees to each other. A reticle in the eyepiece is used for measurements, or they are made on photographs. Vertical resolution is not as good as with interferometers, but lateral resolution is better.

Auxiliary techniques

Several special devices can be used with the optical microscope to get additional information. These techniques are described below.

Micro-hardness testing – Micro-indentation hardness data can be obtained by adding indenter attachments to the microscope. Single-purpose units also are made by many manufacturers of hardness test equipment. Loads are normally made from 1 g (gram) to 1,000 g, although some manufacturers have units for low loads (0.05 g to 200 g). Knoop or Vickers indenters can be used.

Hot-stage microscopy – Hot-stage microscope cells are available from several manufacturers. Single-purpose units can also be used. Cold-cell attachments have also been produced, but have rather limited use in metallography. The hot-stage microscope has been used to study phase transformations on heating or cooling or at constant temperature. Examination of reactions in the hot-stage microscope cell needs use of long-working-distance objectives, since the sample is held within the cell. Moreover, since the cell window is quartz, the objectives is to be quartz-corrected, especially those with magnifications of 20× or more.

Techniques other than chemical etching are to be used to view phase changes. Grain boundaries are to be thermally etched if the sample is held at a constant temperature in the vacuum. Grain-boundary grooving is easily observed using bright field illumination. Phase transformations are visible by the relief produced at the surface. Hence, shear reactions, such as those produced by martensite or bainite formation, are most easily observed. Other phase transformations are more difficult or impossible to observe. Transformations can be photographed in situ, for which motion picture cameras are normally used.

Special stages – These are available in a variety of configurations. Auto leveling stages for mounted samples are a typical example. Universal tilting stages have also been made for rapid manipulation of rough, irregular samples. Special stages have also been designed for handling small objects. A number of stages have been made for performing in situ experiments. Basic studies of solidification have been performed by in situ observation of the freezing of low-melting-point organic materials, such as camphene, which solidify like metals. Observation of the recrystallization of low-melting-point metals and alloys has been similarly observed. Special stages have been used to observe the progress of electrolytic polishing and etching. Cells have also been used for in situ examination of corrosion processes. Stages have been designed to observe a variety of processes involving static or dynamic stress, and devices have also been designed to permit physical extraction of inclusions.

Hot-cell microscopy – Metallographic preparation of radioactive materials needs remote-control preparation using specially designed hot cells. Special microscopes have been designed for use with the hot cell.

Field microscopy – When the microstructure of a component or large object which cannot be cut and moved to the laboratory is to be examined, portable laboratory equipment, made by several manufacturers, can be used to polish a section in situ. A portable microscope can be sometimes used to examine and photograph the microstructure. If this cannot be done, replicas can be made and examined using an optical microscope or an electron microscope.

Comparison microscopes – The need occasionally arises to compare two microstructures. Normally, this is carried out by placing micrographs from each sample side-by-side, but it can also be performed using special microscopes. A bridge comparator is used to combine images from two bench microscopes for simultaneous viewing.

Television monitors – Projection microscopes can be used for group viewing, but it is more common to display the microstructure on a black-and-white or colour monitor. A number of high-resolution closed-circuit systems are available.

Clean-room microscopy – The study of small particles is influenced by dust contamination during viewing. Hence, such work is to be performed in a clean box, clean bench, or clean room which is specially made to provide a dust free environment.

Image analyzers – The increased use of quantitative metallography, particularly for characterization of inclusions, has promoted development of automated image analysis systems based on television principles. Phases or constituents of interest are detected primarily by differences in light reflectivity which produce gray-level differences on the monitor. Majority of the stereological measurements can be made using these systems. Considerable automation has been achieved using automated stages and powerful minicomputers. Although these devices can be quite expensive, they have stimulated interest in stereology and its application to structure-property correlations.

Features are detected on as-polished or etched samples, depending on the nature of the feature of interest. If etching is needed, selective techniques are normally used. Field and feature-specific measurements are utilized. Field measurements measure all the detected features simultaneously, as in volume fraction measurements. In feature-specific measurements, each separate particle is measured sequentially. This procedure is normally used for shape and size measurements.

Some structures do not lend themselves to accurate measurements using such systems. For example, quantification of fracture surface detail cannot be performed using an automatic image analyzer, since the device cannot separate fracture features by gray level. Many transmission electron micrograph structures also cannot be analyzed using these devices. For such structures, semi-automatic tracing devices can be used with the operator performing detection with a light pen or stylus. These lower-cost systems can be used for nearly any stereological measurement. Because of the greater time needed for detection, they are less suitable for measurement problems which need sampling of many fields.

Photo-microscopy

Prior to the development of photographic attachments, microstructures were to be sketched. Although the need for such documentation is no more there, sketching remains useful as a teaching method. Photo-microscopy is important in metallography, since the photo-micrograph can faithfully reproduce the detail observed for others to view. With the equipment presently available, high-quality micrographs are easily produced. However, this needs careful attention to sample preparation, etching, and use of the microscope. Reproduction of false microstructures is all too common and has caused inaccurate interpretations, rejection of good materials, and faulty conclusions in failure analyses.

Historically, darkroom photographic procedures have been most prevalent. Since the introduction of instant photographic processes such as Polaroid, however, many photo-micrographs have been made using these materials, taking advantage of their speed and efficiency. However, image reproduction is sacrificed, and the process is to be repeated for each extra copy. Use of an automatic exposure device is necessary with instant process film to minimize waste. Traditional darkroom photographic methods need more effort, but yield better micrographs. Considerable automation in wet darkroom processes is possible, but frequent use of photo-microscopy is needed to justify the cost of such equipment.

Obtaining good micrographs needs adequate image contrast and resolution, uniform focus over the entire field, uniform lighting, and adequate depth of field. The light source is to be properly aligned, and the system is to be free of vibration. The yellow-green filter is to be employed to correct lens defects. The optics is to be clean, and the field and aperture diaphragms are to be adjusted correctly. The microscope is focused in a variety of ways, depending on the model. Several film formats can be used, such as plates, sheet film of different size, or 35-mm roll film. The magnification at the film plane is to be known. This is a simple procedure if the only variables are the objective and eyepiece magnification, but is more difficult when using a zoom system or bellows. A stage micrometer can be utilized to determine the true magnification.

A range of black-and-white and colour films is available for darkroom or instant techniques. The manufacturers of these films document film characteristics. Black-and-white films are normally used due to their lower cost. They show better contrast control, are easier to process, and are normally quicker to use than colour films. Colour film has some important uses for which its cost is justified. In traditional black-and-white photography, a negative image is produced first and is used to produce a positive image of the microstructure on suitable paper. The micrograph lasts for many years without any apparent change. Selection of the negative film is based on the format available, colour sensitivity, contrast, resolving power, speed, graininess, and exposure and development latitudes.

Some black-and-white films are not sensitive to the entire visible spectrum. Orthochromatic films are sensitive to all colours except orange and red. Panchromatic films are sensitive to all colours, although they emphasize blue and de-emphasize yellow. A yellow filter can be used to reduce this colour bias.

Orthochromatic films can be developed under dark red light, but panchromatic films need total darkness. Orthochromatic films are very good for photo-microscopy, particularly when a yellow-green filter is inserted to correct lens defects.

Film speed is a critical variable only when illumination is low, as in polarized light, interference-contrast, or dark-field illumination. Orthochromatic film has a medium contrast which is adequate for most structures. Contrast can be enhanced with a high-contrast film. The resolving power of a film defines its ability to record fine details in the image. Hence, a high-resolving-power film is desirable. Graininess depends on the size of the silver grains in the emulsion, the developer used, and the development time and temperature. High-speed films are grainier than low-speed films, making them less suitable for enlarging. Contact printing is preferred. It needs a large film size, but saves enlargement time. It produces better images and eliminates re-determining the magnification of the print. A fine-grain film provides the best resolution.

When a negative is exposed, there is an allowable range of exposures which produces a useful, printable negative. Wide exposure latitude is quite valuable. Each film includes information on its characteristic relationship between exposure time and density. The exposure selected is to be on the linear portion of the density-time curve. A good, dense negative allows suppression of some of the fine image defects during printing. An underexposed negative greatly restricts printing and normally results in a poor print. Development of negatives is rather simple and involves use of a developing solution, a stop bath, a fixing solution, as well as washing and drying.

The correct exposure is most easily determined using a built-in exposure meter. If this is not available, a test exposure series can be made. This is accomplished by pulling out the film slide completely and exposing the entire film for a time judged to be considerably shorter than that needed. The slide is then inserted so that it covers around 10 mm to 20 mm of the film, and the exposure is repeated. This is repeated incrementally until the slide is fully inserted, covering the film. After development, the correct time can be assessed based on the density of the negative in each band.

Alternatively, the step exposure can be performed using an instant film of the same speed, saving the darkroom time. Majority of the black-and-white films are contact printed. The negative is placed emulsion side up on the contact printer, and a suitable paper is placed emulsion side down over the negative. The printer is closed, and light is passed through the film onto the paper. The print is developed, stopped, fixed, washed, and dried. Print contrast is controlled by the type of paper and development time. Print contrast types vary from extra-soft (flat) to extra-contrast (grades 1 to 5). Number 3 paper is used most frequently. Number 4 paper is used to increase contrast, and No. 2 paper to reduce contrast.

Instant process films eliminate the darkroom work, thus hastening the process. Polaroid prints use the diffusion-transfer reversal process. Development begins when the film is removed from the camera after the exposure. The action of pulling the film out of the camera crushes a pod containing the viscous, caustic developer and spreads it over the film. Black-and-white films develop rapidly while the colour prints need slightly more time. Some of the Polaroid films have very high speeds, an advantage in dim lighting. Some prints are to be coated with a neutralizing stabilizer / protective varnish to prevent staining and fading. Also available are instant films which produce a negative and a positive print. This negative is to be cleared, but a darkroom is not required. Polaroid films used in microscopy are all panchromatic. They are available as roll film, film packs, or sheets. Exposure times are to be more accurately controlled to get good prints than with traditional wet-process films.

Macro-photography

Examination and photography are frequently needed for such objects as macro-etched disks and broken parts. Examination can be performed visually or with the aid of a simple hand lens or stereo-microscope. Macro-photography can be performed using majority of the cameras, perhaps aided by the use of close-up lens attachments, a bellows, or a macro-lens. Many stereomicroscopes can be equipped with cameras for photography while some takes stereo-pairs. A few manufacturers offer camera stands for macro-photography. Some metallographs also have low-magnification objectives which can perform certain types of macro-photography.

Macro-photography utilizes magnifications from less than 1× to 50×. Most laboratories, especially those engaged in failure analyses, have various cameras, light sources, and stereo-viewers to cover the wide range of objects photographed. Correct lighting is necessary to emphasize details and provide even illumination without glare or reflection. Adjustment of lighting needs some experimentation and experience. Available lighting includes flood lamps, rings, coaxial, or fiber optics. A light box is useful for eliminating shadows, but considerable creativity is needed to achieve good results.

Depth of field and resolution are important variables. Many of the objects to be photographed are three-dimensional, which needs a certain depth of field and proper lighting to reveal shape and texture. Depth of field varies with the aperture diaphragm lens setting, the magnification, and the focal length of the lens. Stopping down the aperture improves depth of field, but decreases image brightness and clarity. Depth of field also increases as magnification decreases and focal length increases. For magnifications below 5×, focal lengths of 100 mm or more are preferred. Shorter-focal-length lenses are used for higher magnifications.