Abscheidung von antikörpermodifizierten Upconversion-Nanopartikeln auf Glas durch ein lasergestütztes Verfahren zur Verbesserung der Leistung der Zellkultur

Einführung

Epithelzellen können an den inneren und äußeren Oberflächen des menschlichen Körpers gefunden werden, einschließlich der Haut, des Darms, der Atemwege und des Fortpflanzungstrakts. Epithelzellen bieten nicht nur eine Schutzhülle gegen Schmutz und Mikroben, sondern erfüllen auch wichtige Funktionen, z. B. Dehnung, Spuren etc. [1]. Daher wurden Epithelzellen in großem Umfang beim Tissue Engineering und der Geweberegeneration verwendet. Die Interaktion zwischen Epithelzellen und der Oberfläche von Substraten ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Funktion und Kommunikation der Zellen. Normalerweise wird eine Beschichtung auf Proteinbasis, z. B. Rattenschwanzkollagen, aufgetragen, damit die Epithelzellen für weitere Untersuchungen auf der Petrischale oder dem Glas wachsen können. Kürzlich demonstrieren auf einem Substrat beschichtete Nanomaterialien das Potenzial zur Kontrolle des Zellwachstums durch Nutzung der feinen Morphologien, speziellen Texturen/Muster der nanostrukturierten Beschichtung [2,3,4]. Darüber hinaus haben lumineszierende Nanomaterialien aufgrund ihrer hochstabilen Photolumineszenz-Eigenschaften erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen organischen Farbstoffen bei der Untersuchung der Interaktion von Zelle-Zelle und Zell-Oberfläche gezeigt. Interessant ist das Zusammenspiel von Zellen und einer mit proteinmodifizierten lumineszierenden Nanostrukturen beschichteten Oberfläche.

Das 1959 erstmals untersuchte Aufwärtskonversionsphänomen ist die sequentielle Absorption von zwei oder mehr Photonen, um ein Licht mit hoher Energie zu emittieren [5, 6]. Die Lanthanoid-dotierten Upconversion-Nanopartikel (UCNPs) bestehen aus drei verschiedenen Komponenten, darunter Aktivator, Sensibilisator und Wirtsmatrix. Die Lanthanoid-Ionen wie Er ³⁺ , Ho ³⁺ , und Tm ³⁺ könnten als Aktivatoren eine Rolle spielen, da sie einzigartige Energieniveaustrukturen besitzen [7,8,9,10,11]. Yb ³⁺ Ion ist der gebräuchlichste Sensibilisator, der verwendet werden kann, um die Energie von angeregtem Licht auf die Aktivatoren zu übertragen [12,13,14]. Als Kristallwirte werden normalerweise sowohl oxidische als auch fluoridhaltige Materialien verwendet [15,16,17]. Aufwärtskonversions-Nanopartikel, die unter Anregung des Nahinfrarotlichts (NIR) Licht aus dem sichtbaren Bereich in den nahen Infrarotbereich emittieren, können aufgrund des niedrigeren Streukoeffizienten von NIR-Licht, das als „therapeutisches Fenster“ bekannt ist, in der Tiefengewebe-Biobildgebung eingesetzt werden “ [18]. Kürzlich wurden verschiedene Oberflächenmodifikationen von UCNPs für die biologische Markierung/Sensorik entwickelt [19, 20]. Avidin wurde beispielsweise an Hexandisäure (HAD) konjugiert, die auf der Oberfläche von UCNPs modifiziert wurde, um die Interaktion mit Antikörpern zu demonstrieren [21]. ssDNA-modifizierte Core-Shell-UCNPs werden zum Nachweis spezifischer Oligonukleotide entwickelt [24].

Andererseits kontrolliert Immunglobulin G (IgG), ein Antikörper, der im Blut und in der extrazellulären Flüssigkeit vorkommt, die Infektion von Gewebe. Die Wechselwirkungen zwischen IgG und Nanopartikeln wurden untersucht, beispielsweise kann IgG als Templat zur Herstellung von Goldnanopartikeln verwendet werden und IgG modifizierte magnetische Nanopartikel zur Markierung von Bakterienzellen [22, 23]. Es wurden jedoch nur wenige Studien zur Modifikation von IgG auf UCNPs für Zellkulturen oder Gewebekulturen berichtet.

Konventionelle Methoden wie Sol-Gel-Methoden, Spincoating und Lösungsmittelverdampfung wurden angewendet, um biomolekülmodifizierte Nanopartikel auf einem Substrat für biomedizinische Assays abzuscheiden [27, 28]. Lösungsbeschichtungsverfahren zur Abscheidung von Proteinen oder proteinbasierten Nanostrukturen minimieren die Kontamination jedoch kaum. Die Laserabscheidung weist eine gut kontrollierte Dicke auf und vermeidet die Betriebskontamination, die bei chemischen Abscheidungen auftritt. Für die Entwicklung einer proteinbasierten Oberfläche für die Zellkultur wurden nur sehr wenige Laserabscheidungstechniken verwendet.

Im Gegensatz zu herkömmlichen physikalischen Abscheidungsverfahren trägt die matrixunterstützte gepulste Laserverdampfung (MAPLE) die Zielmaterialien nicht direkt ab; stattdessen wird die meiste Energie des Lasers vom gefrorenen Lösungsmittel (Matrix) absorbiert [24, 25]. In einem MAPLE-Prozess werden in einem leicht flüchtigen Lösungsmittel (Matrix) dispergierte Targetmaterialien in den mit flüssigem Stickstoff gekühlten Targethalter eingebracht [26,27,28,29,30]. Unter der Laserbestrahlung können die Targetmaterialien mit verdampfendem Lösungsmittel zum Substrat transportiert werden. Die APLE-Technik wurde in verschiedenen Bereichen angewendet, darunter Sensoren, organische elektronische Geräte, Arzneimittelabgabe, Beschichtung von Implantaten usw. [31,32,33,34,35]. Es wurden jedoch nur sehr wenige Arbeiten über die Wirkung des Substrats mit MAPLE-abgelagerten Biomolekül-/Protein-Nanopartikeln auf die Leistung von Zellkulturen berichtet.

In dieser Studie haben wir UCNPs (NaGdF₄ :Yb ³⁺ , Er ³⁺ ) und Immunglobulin G (IgG)-modifizierte UCNPs (UCNPs-IgG) durch hydrothermale Methode. Anschließend wurden UCNPs mit/ohne Modifikation von IgG direkt auf dem Glasboden einer Zellkulturschale unter Verwendung eines MAPLE-Prozesses mit 532 nm Nd:YAG-Laser abgeschieden. Die humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) wurden auf das mit UCNPs abgeschiedene Glas ausgesät, um die Zytotoxizität der Beschichtung von UCNPs und das Verhalten der Zellen auf der mit UCNPs behandelten Oberfläche zu untersuchen.

Methoden/Experimental

Materialien

Gadolinium(III)-nitrat-hexahydrat (Gd (NO₃ .) )₃ ·6H₂ O, Kristalle und Klumpen, 99,9 % Spurenmetallbasis), Ytterbium (III)-Nitrat-Pentahydrat (Yb (NO₃ )₃ ·5H₂ O, 99,9% Spurenmetallbasis), Erbium(III)nitrat-Pentahydrat (Er (NO₃ )₃ ·5H₂ O, 99,9% Spurenmetallbasis), Natriumfluorid (NaF, BioReagent, geeignet für Insektenzellkultur, ≥ 99%), verzweigtes Polyethylenimin (PEI, durchschnittliches Mw ~ 800 von LS, durchschnittliches Mn ~ 600 von GPC), anti-human IgG (Fab-spezifisch) – FITC-Antikörper aus Ziege (affinitätsisolierter Antikörper, gepufferte wässrige Lösung), 4′,6-Diamidin-2′-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI) und Phalloidin-Tetramethylrhodamin B-Isothiocyanat (Phalloidin-TRITC) wurden gekauft von Sigma-Aldrich. Ethylenglykol (EG) wurde von Fisher Chemical bezogen. Isopropanol (2-Propanol) wurde von Caledon Laboratory Chemicals bezogen.

Synthese von UCNPs mit und ohne IgG unter Verwendung eines Eintopfverfahrens

Die UCNPs (NaGdF₄ :Yb ³⁺ , Er ³⁺ ) wurden nach einer modifizierten Eintopfmethode synthetisiert [36]. Kurz gesagt, 720 mg Gd (NO₃ )₃ ·6H₂ O, 170 mg Er (NO₃ )₃ ·5H₂ O, 160 mg Yb (NO₃ )₃ ·5H₂ O, und 20 ml Ethylenglykol wurden in einen Dreihalskolben gegeben. Dann wurden 0,7 g PEI vorsichtig in den Kolben gegeben. Dann wurden 336 mg NaF, gelöst in 10 ml Ethylenglykol, tropfenweise in den Kolben gegeben. Die Mischung wurde auf 200°C erhitzt und unter Stickstoffschutz 6 h unter Rückfluss erhitzt. Die Reaktionsprodukte wurden durch Zentrifugation gesammelt und mehrmals mit Ethanol/destilliertem Wasser gewaschen. Das Produkt wurde bei 60 °C getrocknet.

IgG-Antikörper wurden auf der Oberfläche von UCNPs durch Amidbindungen modifiziert. Wie in 1 gezeigt, wurden 15 mg UCNPs-Pulver in 15 ml destilliertem Wasser gelöst. Anschließend wurden der Lösung 5 ml Borat-gepufferte Kochsalzlösung (BBS, pH =8) und 20 µg IgG zugesetzt. Die Lösung wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde gewaschen und durch Zentrifugation gesammelt.

Schema eines Eintopfverfahrens zur Herstellung von UCNPs und UCNPs-IgG

Ablagerung von UCNPs mit/ohne IgG durch MAPLE

Der Laserabscheidungsprozess wurde mit einer MAPLE 2000-Ausrüstung (Projekt 206, PVD Products, Inc., USA) durchgeführt, die mit einem 532-nm-Nd:YAG-Laser verbunden war. Der Abscheidungsprozess ist in Abb. 2 dargestellt. Zielnanopartikel wurden in Isopropanol mit einer Konzentration von 1 Gew.% gelöst. Die Mischung wurde in dem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Targethalter eingefroren. Bei diesem Verfahren wurden keine weiteren zusätzlichen Additive und Tenside verwendet.

Schema der Ablagerung von UCNPs und UCNPs-IgG unter Verwendung der MAPLE-Technik

Darüber hinaus wurde ein 532 nm Nd:YAG-Laser mit einer Laserfrequenz von 10 Hz und dem τ_fwhm ≅ 200 μs. Die Größe des Laserspotbereichs betrug 0,63 cm ² und die Laserfluenz betrug 150 mJ/cm ² . Die Glassubstrate wurden mit einer 2 Gew.-%igen Gelatinelösung behandelt, die auf dem Substrathalter fixiert wurde, und die Temperatur der Substrate betrug während des gesamten Experimentiervorgangs 25 °C. Der Laserabscheidungsprozess wurde unter 1 × 10 ^–6 . durchgeführt Torr. Wie in unseren vorherigen Studien [42, 43] wurde die Ablagerungszeit auf 2 h festgelegt. Der Abstand zwischen Substrat und Ziel betrug 4,5 cm (vertikale Konfiguration). Der Targethalter und der Substrathalter rotierten (Target:10 U/min, Substrat:25 U/min) während der Laserbestrahlungsperiode.

Materialcharakterisierung

UCNPs und UCNPs-IgG vor der MAPLE-Abscheidung wurden durch Transmissionselektronenmikroskop (TEM, Philips CM-10, Betrieb bei 80 kV) charakterisiert. Fourier-Transform-Infrarotspektren (FTIR) der UCNPs und UCNPs-IgG wurden mit einem Bruker Vector 22 FTIR-Spektrometer (Scanbereich 600 cm ⁻¹ ~4500 cm ⁻¹ , Auflösung 4 cm ⁻¹ , 64 Scans). Die Photolumineszenzeigenschaften von UCNPs wurden unter Verwendung des QuantaMaster™ 40 Spektrofluorometers (Horiba Canada – Photon Technology International Inc.) untersucht. Das Wachstum von humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) auf der Glasoberfläche mit/ohne Ablagerungen von Nanopartikeln wurde mit einem konfokalen Mikroskop (Zeiss LSM 5 Duo Vario Mikroskop) untersucht. Zur Durchführung der energiedispersiven Röntgenspektroskopie (EDX) wurde ein Hitachi S-3400 N Rasterelektronenmikroskop mit einem INCA PentaFET-x3 EDX-System (Oxford Instruments) verwendet.

Studie zum Zellverhalten

Humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs, American Type Culture Collection) wurden verwendet, um die Biokompatibilität von UCNPs mit/ohne IgG-Modifikation nach der Laserabscheidungsbehandlung zu untersuchen. HUVECs wurden auf die mit UCNPs und UCNPs-IgG abgeschiedene Glasoberfläche geimpft. Das mit 2 Gew.-% Gelatinelösung (ohne UCNPs) behandelte Glassubstrat wird als Kontrolle nach der MAPLE-Abscheidungsbehandlung verwendet. Die hinterlegten Proben wurden in MCDB-Medium (10% fötales Rinderserum, 1% Penicillin und Amphotericin B) zur Aussaat von HUVECs getränkt. Die HUVECs wurden 24 h bei 37 °C kultiviert. HUVECs wurden mit 4% Formalin für 2 h auf der Substratoberfläche fixiert, um die konfokale Bildgebung zu erhalten (Zeiss LSM 510 Duo). Die Zellen wurden mit Phalloidin-TRITC und DAPI gefärbt. Die Proben wurden mit PBS (pH 7,4) gewaschen und mit dem Anti-Fade-Mittel behandelt.

Studie zur Zytotoxizität

Die HUVECs wurden in MCDB-Medium (10% fötales Rinderserum, 1% Penicillin und Amphotericin B) auf der Oberfläche der hinterlegten Proben kultiviert. Nach dem Überführen in Kulturschalen wurden die Zellen für 24 h kultiviert (37 °C, 5 % CO₂ ) auf der Oberfläche der Proben. Ungefähr 100.000 Zellen wurden auf die Oberfläche jeder Probe ausgesät (mit/ohne Ablagerung von UNCPs). Alle Proben einschließlich der Kontrolle, der Glassubstrate mit der Abscheidung von UCNPs und UCNPs-IgG wurden dreifach gemessen. Dann wurde das MTT-Agens (3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) zu den Zellmedien gegeben und die Zellen wurden 3 h inkubiert. Das Zellmedium wurde entfernt und die Vertiefungen wurden zweimal mit PBS gespült. Dann wurde DMSO in jede Vertiefung gegeben, um das Formazan aufzulösen. Die Flüssigkeit wurde auf die 96-Well-Platten übertragen und mit dem biokinetischen Reader bei 490 nm (Bio-Tek Instruments EL340I Microplate Reader) analysiert.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung von UCNPs/UCNPs-IgG vor der MAPLE-Ablagerung

IgG-Antikörper wurden über Amidbindungen an Amin-modifizierte UCNPs konjugiert. Die UCNPs mit/ohne IgG wurden durch TEM charakterisiert. Abbildung 3a ist die TEM-Aufnahme von kubischen UCNPs. Die durchschnittliche Größe der UCNPs wird auf 50 ± 8 nm geschätzt. Der kleine Einschub von Fig. 3a ist die mikroskopische Aufnahme eines hochauflösenden TEM (HRTEM). UCNPs haben hochkristalline Strukturen. Der gemessene interplanare Abstand zwischen zwei benachbarten Gitterebenen betrug 0,312 nm, was einer (1 1 1)-Ebene der kubischen Phase NaGdF₄ . entspricht (JCPDS 27-0697). Abbildung 3b ist die TEM-Aufnahme von UCNPs, die mit IgG (UCNPs-IgG) konjugiert sind. Die mit Antikörpern modifizierten UCNPs behielten die kubische Form bei und die durchschnittliche Partikelgröße beträgt etwa 54 ± 8 nm. Die an UCNPs biokonjugierten IgG-Antikörper können direkt durch TEM beobachtet werden, wie in Fig. 3b gezeigt, mit einem roten Kreis markiert. Die Größe der IgG-Antikörper beträgt etwa 10±5 nm, was den theoretischen Berechnungen und experimentellen Messungen ähnelt [44, 45].

TEM-Aufnahmen von a UCNPs und b UCNPs-IgG vor der MAPLE-Ablagerung

Die Kristallstruktur von UCNPs (NaGdF₄ :Yb ³⁺ , Er ³⁺ ( 220) und (311) Kristallebenen, die mit dem Standard-XRD-Muster von NaGdF₄ . in kubischer Phase identisch sind (JCPDS 27-0697) und Referenzen [36, 37]. Sowohl HRTEM- als auch XRD-Messungen bestätigen die Kristallstruktur der UCNPs.

XRD-Profil von NaGdF₄ :Er ³⁺ , Yb ³⁺ Upconversion-Nanopartikel

Um die Biokonjugation von IgG an UCNPs weiter zu untersuchen, wurde Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) eingesetzt. Wie in Abb. 5 gezeigt, werden die Biegeschwingungsbanden der Amingruppen bei 1515 cm ⁻¹ . beobachtet und 1511 cm ⁻¹ in den Spektren von UCNPs und UCNPs-IgG, da sowohl die PEI- als auch die IgG-Antikörper Aminogruppen besitzen. Die Peaks bei 2987 cm ⁻¹ , 2900 cm ⁻¹ , und 1400 cm ⁻¹ kann auf die Streckschwingungen von -CH₂ . zurückgeführt werden - bzw. C-C-Bindungen. Die Streckschwingungsbande der Hydroxylgruppe (-OH) wird bei 3673 cm ⁻¹ . beobachtet im Spektrum von UCNPs-IgG aufgrund der Carboxylgruppe von IgG. Der Peak bei 1249 cm ⁻¹ und 1650 cm ⁻¹ werden den Streckschwingungsbanden der Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindung bzw. der Amidbindung im Spektrum der IgG-modifizierten UCNPs zugeschrieben. Diese Peaks zeigen das Vorhandensein der IgG-Antikörper auf der Oberfläche des UCNPs-IgG.

FTIR-Spektren von UCNPs-IgG bzw. UCNPs, hergestellt durch Eintopfverfahren

Charakterisierung von UCNPs mit/ohne IgG nach MAPLE-Ablagerung

UCNPs und UCNPs-IgG wurden im MAPLE-Verfahren auf Zellkulturschalen mit Glasboden aufgebracht. Die Oberflächen von Glas vor und nach der Abscheidung von UCNPs bzw. UCNPs-IgG wurden durch die energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) charakterisiert. Abbildung 6 zeigt das Vorhandensein der Elemente Gadolinium (Gd), Erbium (Er), Ytterbium (Yb) und Fluor (F) in mit UCNPs (Abb. 6a) und UCNPs-IgG (Abb. 6b) beschichteten Glasproben. bzw. Außerdem wurde die Photolumineszenz von UCNPs und UCNPs-IgG nach der MAPLE-Abscheidung mit längerer Bestrahlungszeit gemessen. Sowohl grüne (540 nm) als auch rote (650 nm) Emissionen können bei einer Anregung von 980 nm beobachtet werden, wie in Zusatzdatei 1:Abbildung S1 in der Begleitdatei gezeigt. Es ist anzumerken, dass die Intensität der Emission zwischen den Proben von UCNPs mit und ohne IgG leicht unterschiedlich ist, was durch die Oberflächendefekte oder den Messfehler verursacht werden könnte. Weitere Studien werden durchgeführt. Folglich kann die MAPLE-Ablagerung die Struktur und Eigenschaften von UCNPs mit/ohne IgG aufrechterhalten.

EDX-Spektren von a Proben nach MAPLE-Behandlung und b Proben ohne MAPLE-Behandlung (bloßes Glas)

FTIR wurde verwendet, um UCNPS- und UCNPs-IgG-Beschichtungen, die durch die MAPLE-Technik hergestellt wurden, im Vergleich mit der blanken Glasprobe zu untersuchen. Die FTIR-Spektren der Proben, die mit UCNPs, UCNPs-IgG durch die MAPLE-Abscheidung abgeschieden wurden, und der Blindprobe (nacktes Glassubstrat) sind in Abb. 7 dargestellt. Die Streckschwingungsbanden von –OH-Gruppen bei 3648 cm ⁻¹ wird der Carboxylgruppe von IgG zugeschrieben, die nur in Spektrum-1 beobachtet wird, d. h. UCNPs-IgG-Beschichtung. Dieses Ergebnis weist auf die Existenz des UCNP-IgG auf der Substratoberfläche hin. In Spektrum-2 (UCNPs-Beschichtung) das Biegeschwingungsband bei 1575 cm ⁻¹ wird der auf den UCNPs modifizierten Amingruppe zugeschrieben, während die Biegeschwingungsbande der Amingruppe in Spektrum-1 (UCNPs-IgG) aufgrund der erfolgreichen Biokonjugation kaum beobachtet wird. Folglich ist die MAPLE-Technik in der Lage, die Eigenschaften und Mikrostrukturen von mit Antikörpern modifizierten UCNPs zu erhalten.

FTIR-Spektren von blankem Glas und mit UCNPs-IgG bzw. UCNPs beschichtetem Glas

Im Vergleich zum Spektrum des blanken Glases (Spektrum-3) betragen die Streckschwingungsbanden der Methylengruppen etwa 2985 cm ⁻¹ und 2900 cm ⁻¹ sowohl in Spektrum-1 als auch in Spektrum-2 aufgrund der kohlenstoffbasierten funktionellen Gruppen auf der Oberfläche von UCNPs. Es ist anzumerken, dass die Peaks der Beschichtungen in Fig. 7 deutlich schwächer sind als die Peaks in Fig. 5, die durch die geringen Mengen an auf der Substratoberfläche abgeschiedenen Nanopartikeln und die Änderungen der Spektren bei 1250 cm ^{-1 . verursacht werden} in Fig. 7 im Vergleich zu Fig. 5 stammt von der Wirkung des Glassubstrats.

Zellverhalten bei den verschiedenen Beschichtungen

Herkömmliche Methoden für HUVEC-Zellen erfordern das Auftragen einer Proteinschicht, die als unsere Kontrolle bei der Untersuchung der Zellkulturleistung verwendet wird. Daher sind drei verschiedene Beschichtungen in dieser Studie (1) Kontrolle (mit Gelatine beschichtetes Glas), (2) mit UCNPs beschichtetes Glas und (3) mit UCNPs-IgG beschichtetes Glas. Abbildung 8 zeigt die konfokalen Mikroskopaufnahmen von Zellen, die auf verschiedenen Oberflächen für 24 Stunden kultiviert wurden. Die Menge an HUVECs, die auf der mit UCNPs bzw. UCNPs-IgG beschichteten Oberfläche wachsen, ist ähnlich wie bei der Kontrolle. Das Verhalten von HUVEC-Zellen, die auf den mit UCNPs-IgG modifizierten Oberflächen wachsen, wird jedoch in der ersten 24-Stunden-Kulturperiode dramatisch verbessert. Das Zellwachstumsverhalten innerhalb der Kulturperiode umfasste die Fläche der Zellen, die Länge der Verbindungen, die Länge der Zellen und die Gesamtzellzahl auf der Probenoberfläche wurden untersucht und analysiert.

Konfokale mikroskopische Aufnahmen von HUVECs auf der Oberfläche von a Kontrolle, b UCNPs und c IgG-modifizierte UCNPs

Abbildung 9 zeigt die statistische Analyse des Zellverhaltens nach 24-stündiger Kultivierung auf den drei verschiedenen Oberflächen. Die Fläche der Zellen (Abb. 9a), die Länge der Verbindungen (Abb. 9b), die Länge der Zellen (Abb. 9c) und die Anzahl der Zellen (Abb. 9d) wurden mit der ImageJ-Software untersucht. Die Länge der Zellen wird als der größte Längenwert dieser Zelle definiert. Die Länge der Verbindung ist definiert als der Abstand zwischen dem Rand der Zellspitzen und den Zellkernen. Im Vergleich zu Zellen, die auf Kontrollproben wachsen, nimmt die Zellfläche von HUVEC-Zellen auf der mit UCNPs und UCNPs-IgG modifizierten Oberfläche um 11,2 % bzw. 22,2 % zu; die Länge der Verbindungen von HUVEC-Zellen auf der mit UCNPs und UCNPs-IgG modifizierten Oberfläche nimmt um 12,5 % und 17,5 % zu; und die Länge von HUVEC-Zellen auf der mit UCNPs und UCNPs-IgG modifizierten Oberfläche nimmt um 8,2 % und 17,3 % zu. Darüber hinaus zeigen die analysierten Ergebnisse der Zellzahl, dass die Menge der Zellen auf der Oberfläche der UCNP-basierten Probe etwa 8% höher ist als die der Kontrolle. Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl UCNPs-Proben als auch UCNPs-IgG-Proben mit den HUVECs-Zellen biokompatibel sind, was mit den vorherigen Arbeiten übereinstimmt [38]. Das Wachstum von HUVEC-Zellen, die auf der mit UCNPs und UCNPs-IgG abgelagerten Oberfläche kultiviert wurden, wurde in Bezug auf Zellfläche, Zelllänge und Verbindungslänge gefördert. Frühere Studien weisen darauf hin, dass Nanostrukturen die endotheliale Aktivierung von HUVEC-Zellen auslösen könnten [2,3,4, 39]. Es wurde berichtet, dass eine Freisetzung von Entzündungsmediatoren und eine Hochregulierung von Adhäsionsmolekülen von HUVECs beobachtet werden würde, wenn sie einer Vielzahl von Nanopartikeln ausgesetzt werden [40]. Entzündungsmediatoren könnten basierend auf den bisherigen Studien die Angiogenese- und Pro-Angiogenese-Wirkung fördern [2, 41]. Darüber hinaus weisen neuere Arbeiten darauf hin, dass IgG die Angiogenese-ähnliche Transformation von HUVECs fördern könnte [3].

HUVECs, die auf verschiedenen Beschichtungen kultiviert wurden, einschließlich Kontrolle, UCNPs, UCNPs-IgG:a Zellenbereich, b Zellenverbindungslänge, c Zellenlänge und d Zellenanzahl

Auswirkung der Beschichtung von UCNPs mit/ohne IgG auf die Zellviabilität

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde untersucht, indem HUVEC-Zellen verwendet wurden, die auf den verschiedenen Oberflächen kultiviert wurden. Abbildung 10 zeigt die relative Lebensfähigkeit der Zellen auf verschiedenen Oberflächen:Kontrolle (mit Gelatine beschichtetes Glas), blankes Glas, auf Glassubstraten abgeschiedene UCNPs und auf Glassubstraten abgeschiedene UCNPs-IgG. Die relative Zelllebensfähigkeit des blanken Glases, des mit UCNPs beschichteten Glases und des mit UCNPs-IgG beschichteten Glases betrug 99,6 %, 105,44 % bzw. 103,96 %. Einige Studien zeigen, dass PEI mit hoher Konzentration toxische Wirkungen haben kann, insbesondere wenn es in hoher Konzentration angewendet wird, aber die Verwendung von PEI als Ligand ist akzeptabel und zeigt eine vernachlässigbare Zytotoxizität [44,45,46,47]. Aufgrund des Mechanismus von MAPLE liegt die Menge der UCNPs/UCNPs-IgG auf der Substratoberfläche deutlich unter dem Schwellenwert (1 mg/ml). Offensichtlich hat die Ablagerung von UCNPs und UCNPs-IgG auf dem Glas durch MAPLE keine toxischen Wirkungen auf die HUVEC-Zellen. Es wird darauf hingewiesen, dass biokompatible Materialien normalerweise eine relative Zelllebensfähigkeit (> 85 %) von Zellen aufweisen können. [8]

Zelllebensfähigkeit von HUVEC-Zellen, die auf blankem Glas wachsen, Beschichtungen mit UCNPs bzw. UCNPs-IgG und mit Gelatine beschichtetes Glas als Kontrolle

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend wurden die UCNPs und UCNPs-IgG erfolgreich nach der Eintopfmethode synthetisiert und mit der MAPLE-Technik auf Kulturschalen mit Glasboden aufgebracht. Die Ergebnisse von TEM und FTIR zeigen die erfolgreiche Biokonjugation von IgG auf der Oberfläche von UCNPs. Die durchschnittliche Partikelgröße der UCNPs beträgt 50 ± 8 nm. Die mit Antikörpern modifizierten UCNPs behielten die kubische Form bei und die durchschnittliche Partikelgröße beträgt etwa 54 ± 8 nm. Die Biokonjugation von IgG auf UCNPs kann direkt durch TEM beobachtet werden, das eine durchschnittliche Größe von 10 ± 5 nm hat. Die FTIR-Spektren bestätigten auch das Vorhandensein der Carboxylgruppe/Peptid-Bindung des auf der Oberfläche von UCNPs modifizierten Antikörpers. Der MAPLE-Abscheidungsprozess wurde verwendet, um UCNPs und UCNPs-IgG auf einem Glassubstrat abzuscheiden. Die Ergebnisse von EDX-, FTIR- und PL-Messungen zeigen die Beibehaltung der Strukturen und Eigenschaften von UCNPs und UCNPS nach der MAPLE-Ablagerung. Unsere Studie zeigt, dass der MAPLE-Prozess die Beibehaltung der Eigenschaften und Strukturen von UCNP mit/ohne Modifikation von Antikörpern erreichen kann. Darüber hinaus wurde die Leistung der Zellkultur statistisch untersucht, indem die HUVEC-Zelllinie auf den verschiedenen Oberflächen kultiviert wurde, die mit UCNPs bzw. UCNPs-IgG behandelt wurden, die durch das MAPLE-Verfahren hergestellt wurden. Zellfläche, Zelllänge und Verbindungslänge sind sehr wichtig, um eine ideale Konfluenz und die Bildung von Mikrogefäßstrukturen zu unterstützen. Die mit UCNPs und UCNPs-IgG-Proben nach der MAPLE-Technik behandelten Glasoberflächen zeigen keine toxische Wirkung auf die HUVEC-Zelllinie. Es wird erwartet, dass die MAPLE-Ablagerung von UCNPs und UCNPs-IgG bei der Herstellung der neuen biologischen Geräte für Tissue Engineering und Geweberegeneration angewendet werden könnte.

Abkürzungen

DAPI:

4′,6-Diamidin-2′-phenylindol-dihydrochlorid

ZB:

Ethylenglykol

HUVEC:

Endothelzellen der menschlichen Nabelvene

IgG:

Immunglobulin G

MAPLE:

Matrixunterstützte gepulste Laserverdampfung

PEI:

Polyethylenimin

Phalloidin-TRITC:

Phalloidin-Tetramethylrhodamin B-Isothiocyanat

UCNPs:

Upconversion-Nanopartikel