Laser-unterstützte MAPLE-Abscheidung von Antikörper-funktionalisierten Upconversion-Nanopartikeln verbessert Zellkulturleistung

Zusammenfassung

Ein hochleistungsfähiges Zellkultursubstrat beruht auf einer optimalen Oberfläche, die Zellfunktion und -kommunikation unterstützt. Jüngste Arbeiten zeigen, dass nanostrukturierte Beschichtungen Zelladhäsion verbessern können, doch konventionelle lösungsbasierte Methoden führen oft Verunreinigungen ein. Matrix-unterstützte gepulste Laserverdampfung (MAPLE) bietet einen sauberen, nicht-destruktiven Weg, Biopolymere auf verschiedene Substrate abzuscheiden. In dieser Studie synthetisierten wir NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺ Upconversion-Nanopartikel (UCNPs) und ihre Immunglobulin-G (IgG)-funktionalisierten Gegenstücke via One-Pot-Methode. Die UCNPs weisen einen durchschnittlichen Durchmesser von 50 ± 8 nm auf, und TEM-Bilder bestätigen die Anwesenheit von IgG auf ihren Oberflächen. Mit einem 532 nm Nd:YAG-Laser (10 Hz) deponierten wir UCNPs – mit und ohne IgG – auf Glasboden-Kulturschalen mittels MAPLE. Humane Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) wurden auf diesen Substraten ausgesät und mit gelatine-beschichteten Glas-Kontrollen verglichen. Zellviabilitätsassays zeigten keine Zytotoxizität, während morphologische Analysen verbesserte Adhäsion und Proliferation auf beiden UCNP-beschichteten Oberflächen zeigten. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass MAPLE-deponierte, antikörper-funktionalisierte UCNPs als biokompatible, hochleistungsfähige Beschichtungen für Zellkulturanwendungen dienen können.

Einleitung

Epithelzellen kleiden die inneren und äußeren Oberflächen des menschlichen Körpers aus und spielen eine doppelte Rolle als physische Barriere und aktiver Teilnehmer an physiologischen Prozessen wie Barrierefunktion, Signalgebung und Immunabwehr [1]. In der Gewebetechnik ist die Interaktion zwischen Zellen und Substratoberflächen ein kritischer Determinant für Zelladhäsion, Morphologie und Funktion. Traditionelle Proteinbeschichtungen – Kollagen, Gelatin, Fibronektin – werden seit langem eingesetzt, um Zellanhaftung auf Glas- oder Kunststoffoberflächen zu verbessern. Jüngste Fortschritte zeigen, dass nanostrukturierte Beschichtungen das Zellverhalten durch topografische Hinweise und Erhöhung der effektiven Oberfläche modulieren können, wodurch Adhäsion und Proliferation verbessert werden [2-4].

Upconversion-Nanopartikel (UCNPs), dotiert mit Lanthanoid-Ionen wie NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺, zeigen effiziente Nahinfrarot-(NIR)-Anregung und sichtbare oder NIR-Emission, was Vorteile für Tiefengewebe-Imaging und Biosensing aufgrund niedriger Phototoxizität und hoher Photostabilität bietet [5-9]. Oberflächenfunktionalisierung von UCNPs mit Biomolekülen – Avidin, DNA, Antikörper – ermöglichte gezieltes Imaging, Sensing und Zellmarkierung [19-21]. Allerdings wurde begrenzte Arbeit geleistet, um antikörper-funktionalisierte UCNPs als Oberflächenbeschichtungen für Zellkultur zu erforschen.

Konventionelle Abscheidetechniken (Sol-Gel, Spin-Coating, Dip-Coating) leiden unter unkontrollierter Dicke, Lösungsmittelrückständen und potenzieller Denaturierung von Biomolekülen. Matrix-unterstützte gepulste Laserverdampfung (MAPLE) umgeht diese Probleme, indem das Zielmaterial in einer gefrorenen Lösungsmittelmatrix eingeschlossen wird; Laserenergie wird von der Matrix absorbiert, was zu sanftem Transfer des Materials auf das Substrat ohne direkte Ablation des Biomoleküls führt [24,25]. MAPLE wurde in Drug Delivery, organischer Elektronik und biomedizinischen Beschichtungen angewendet [31-35], doch sein Einfluss auf Zellkultursubstrate bleibt untererforscht.

In dieser Arbeit berichten wir über die Synthese von NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺ UCNPs und ihren IgG-funktionalisierten Analoga, gefolgt von MAPLE-Abscheidung auf Glasboden-Kulturschalen. Wir bewerten dann die Biokompatibilität und den Einfluss auf das Verhalten humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs), was eine Grundlage für zukünftige Gewebetechnik-Anwendungen schafft.

Methoden/Experimentell

Materialien

Alle Reagenzien waren analytischer Grade: Gd(NO₃)₃·6H₂O (99,9 %), Yb(NO₃)₃·5H₂O (99,9 %), Er(NO₃)₃·5H₂O (99,9 %), NaF (≥ 99 %), verzweigtes Polyethylenimin (PEI, Mw ≈ 800), anti-humanes IgG (Fab-spezifisch, FITC-markiert), DAPI, Phalloidin-TRITC und Lösungsmittel (Ethylenglykol, Isopropanol). Die Materialien wurden von Sigma-Aldrich, Fisher Scientific und Caledon bezogen.

Synthese von UCNPs mit und ohne IgG im One-Pot-Prozess

UCNPs (NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺) wurden via modifizierter hydrothermaler Route synthetisiert. Kurz: 720 mg Gd(NO₃)₃·6H₂O, 170 mg Er(NO₃)₃·5H₂O, 160 mg Yb(NO₃)₃·5H₂O und 20 ml Ethylenglykol wurden in einem Dreihalskolben gemischt. 0,7 g PEI wurde zugesetzt, gefolgt von tropfenweiser Zugabe von 336 mg NaF gelöst in 10 ml Ethylenglykol. Das Gemisch wurde unter Stickstoff auf 200 °C erhitzt und 6 h refluxiert. Das Produkt wurde durch Zentrifugation gesammelt, mit Ethanol und Wasser gewaschen und bei 60 °C getrocknet.

Für IgG-Funktionalisierung wurden 15 mg UCNP-Pulver in 15 ml destilliertem Wasser dispersiert, dann 5 ml Borat-gepuffertes Salin (pH 8) und 20 µg IgG zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt, dann gewaschen und durch Zentrifugation pellettiert. Das Konjugat, UCNPs-IgG, wurde in wässrigem Puffer gelagert.

Abscheidung von UCNPs mit/ohne IgG durch MAPLE

MAPLE-Abscheidung wurde mit einem MAPLE 2000 System (PVD Products, Inc.) mit einem 532-nm Nd:YAG-Laser durchgeführt. Die Nanopartikellösung (1 Gew.-% in Isopropanol) wurde in einem flüssigstickstoffgekühlten Target-Halter gefroren. Laserparameter: 10 Hz, 200 µs Pulsbreite, 150 mJ cm⁻² Fluenz, 0,63 cm² Spotfläche. Glassubstrate, vorbeschichtet mit 2 Gew.-% Gelatin, wurden 4,5 cm vom Target positioniert und bei 25 °C unter 1 × 10⁻⁶ Torr gehalten. Target- und Substrathalter rotierten bei 10 rpm bzw. 25 rpm während einer 2-h-Abscheidung. Die resultierenden Filme wurden durch EDX, FTIR und Photolumineszenz (PL) Spektroskopie charakterisiert.

Materialcharakterisierung

Vor der Abscheidung wurden UCNPs und UCNPs-IgG durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, Philips CM-10, 80 kV) untersucht. Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) Spektren wurden an einem Bruker Vector 22 (600–4500 cm⁻¹, 4 cm⁻¹ Auflösung, 64 Scans) aufgezeichnet. PL-Spektren wurden mit einem QuantaMaster 40 Spektrofluorometer (Horiba) gemessen. Nach der Abscheidung wurden Filme durch EDX (Hitachi S-3400 N mit INCA PentaFET-x3) und Konfokalmikroskopie (Zeiss LSM 5 Duo) inspiziert. Zytotoxizität wurde via MTT-Assay an HUVECs, kultiviert für 24 h, bewertet.

Zellverhalten-Studie

HUVECs (ATCC) wurden mit ~1 × 10⁵ Zellen pro Schale auf Glassubstraten (Kontrolle Gelatin, UCNPs, UCNPs-IgG) ausgesät. Nach 24 h Inkubation bei 37 °C wurden Zellen mit 4 % Formalin fixiert, mit Phalloidin-TRITC (Aktin) und DAPI (Kerne) gefärbt und per Konfokalmikroskopie abgebildet. Zellfläche, Verbindungslänge, Zelllänge und Zellzahl wurden mit ImageJ quantifiziert.

Zytotoxizitäts-Assay

MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid) wurde nach 24 h dem Kultivierungsmedium zugesetzt, 3 h inkubiert und die Absorption bei 490 nm mit einem Bio-Tek EL340I Reader gemessen. Experimente wurden in Triplicate durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung von UCNPs und UCNPs-IgG vor MAPLE-Abscheidung

TEM-Bilder bestätigen die kubische Morphologie der UCNPs mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 50 ± 8 nm. Hochauflösendes TEM offenbart einen Gitterabstand von 0,312 nm, entsprechend der (111)-Ebene von kubischem NaGdF₄ (JCPDS 27-0697). Nach IgG-Konjugation erhöht sich die Partikelgröße auf 54 ± 8 nm, und die Antikörperschicht (~10 ± 5 nm) ist als peripherer Hof sichtbar (Abb. 3b).

Pulver-XRD zeigt charakteristische Peaks bei 32°, 37°, 54° und 65° (111, 200, 220, 311), die die kubische Phase bestätigen (Abb. 4).

FTIR-Spektren zeigen Amin-Peaks (1515 cm⁻¹, 1511 cm⁻¹) von PEI und IgG, –CH₂–/C-C-Streckungen (2987, 2900, 1400 cm⁻¹) und Carboxyl- und Amidbänder (1249, 1650 cm⁻¹), die IgG-Anbindung bestätigen (Abb. 5).

Charakterisierung von UCNPs nach MAPLE-Abscheidung

EDX-Mapping von Glassubstraten, beschichtet mit UCNPs und UCNPs-IgG, bestätigt das Vorhandensein von Gd, Er, Yb und F (Abb. 6a,b). PL-Messungen zeigen beibehaltene grüne (540 nm) und rote (650 nm) Emissionen unter 980 nm Anregung, mit nur geringen Intensitätsvariationen, die auf Oberflächendefekte oder Messfehler zurückzuführen sind.

FTIR der beschichteten Oberflächen bestätigt weiterhin den Erhalt funktioneller Gruppen: die –OH-Bande bei 3648 cm⁻¹ (IgG) erscheint nur in UCNPs-IgG (Abb. 7a), während die Aminbande bei 1575 cm⁻¹ in UCNPs evident ist (Abb. 7b). Das Fehlen dieser Bänder in blankem Glas (Abb. 7c) unterstreicht die erfolgreiche Abscheidung der Nanopartikelschichten.

Zellverhalten auf den verschiedenen Beschichtungen

Konfokalbilder nach 24 h Kultivierung zeigen vergleichbare Zellzahlen auf allen Oberflächen, aber UCNPs-IgG-Oberflächen weisen größere Zellausbreitung, längere zytoplasmatische Fortsätze und erhöhte interzelluläre Konnektivität auf (Abb. 8). Quantitative Analyse zeigt 11,2 % und 22,2 % Zunahme der Zellfläche für UCNPs und UCNPs-IgG relativ zu Gelatin-Kontrollen; Verbindungslängen steigen um 12,5 % und 17,5 %; Zelllängen wachsen um 8,2 % und 17,3 %; und Zellzahlen steigen um ~8 % auf nanopartikel-beschichteten Oberflächen (Abb. 9). Diese Metriken bestätigen, dass sowohl UCNPs als auch UCNPs-IgG die endotheliale Adhäsion und Ausbreitung verbessern, ohne Zytotoxizität zu induzieren.

Einfluss der Beschichtung auf Zellviabilität

MTT-Assays demonstrieren >99 % relative Viabilität auf blankem Glas, UCNPs und UCNPs-IgG, was den >85 % Benchmark für biokompatible Materialien übertrifft. Der leichte Anstieg der Viabilität (105 % für UCNPs, 104 % für UCNPs-IgG) deutet auf einen milden stimulierenden Effekt der Nanopartikelbeschichtungen hin, wahrscheinlich aufgrund erhöhter Oberflächenrauheit und Proteinadsorption.

Schlussfolgerungen

Wir haben demonstriert, dass NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺ UCNPs und ihre IgG-funktionalisierten Gegenstücke in einem One-Pot-Hydrothermalprozess synthetisiert und durch MAPLE auf Glasschalen abgesetzt werden können, ohne ihre strukturelle oder photolumineszente Integrität zu beeinträchtigen. TEM, FTIR, XRD und EDX bestätigen erfolgreiche Synthese, Konjugation und Abscheidung. Biokompatibilitätsassays zeigen keine Zytotoxizität, während Konfokalmikroskopie verbesserte Adhäsion, Ausbreitung und interzelluläre Vernetzung von HUVECs auf nanopartikel-beschichteten Oberflächen zeigt. Diese Ergebnisse positionieren MAPLE-deponierte, antikörper-funktionalisierte UCNPs als vielversprechende, kontaminationsarme Beschichtungen für fortgeschrittene Gewebetechnik- und regenerative Medizin-Plattformen.

Abkürzungen

DAPI:

4′,6-Diamidine-2′-phenylindol-dihydrochlorid

EG:

Ethylenglykol

HUVEC:

Humane Nabelschnur-Endothelzellen

IgG:

Immunglobulin G

MAPLE:

Matrix-unterstützte gepulste Laserverdampfung

PEI:

Polyethylenimin

Phalloidin-TRITC:

Phalloidin-Tetramethylrhodamin B isothiocyanat

UCNPs:

Upconversion-Nanopartikel