Synthese von SPIO-Nanopartikeln und die nachfolgenden Anwendungen bei der Stammzellmarkierung bei der Parkinson-Krankheit

Einführung

Die Parkinson-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die durch den fortschreitenden Verlust von dopaminergen Neuronen im Mittelhirn gekennzeichnet ist. Die relativ fokale Beeinträchtigung macht es zu einem guten Kandidaten für zellbasierte Therapien. Mehrere Zelltypen, die von fetalem Mittelhirngewebe [1] bis hin zu induzierten Neuronen, die aus embryonalen Stammzellen (ESC) stammen, oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) [2] reichen, wurden mit der Behandlung von Parkinson in Verbindung gebracht; ethische Bedenken und das potenzielle Risiko einer Tumorgenität konnten bei der Anwendung jedoch nicht vermieden werden [3]. Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind multipotente Stammzellpopulationen, die in den letzten zehn Jahren als vielversprechendes therapeutisches Werkzeug für neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich Parkinson, beschrieben wurden [4, 5]. Im Vergleich zu anderen Zelltypen zeigen MSC eine gute Proliferation, eine weit verbreitete Verfügbarkeit im gesamten menschlichen Körper und eine immunrepressive Fähigkeit. Einige Studien haben gezeigt, dass die intrakranielle Transplantation von MSCs die Neuroprotektion, die neuronale Differenzierung und die Immunmodulation fördert [6,7,8]. In diesen Studien ist die Verfolgung der Lebensfähigkeit, Migration und Integration von transplantierten Zellen in vivo für ein grundlegendes Verständnis der Stammzellfunktion und die Bewertung der klinischen Wirksamkeit unerlässlich.

Um die therapeutische Wirkung der transplantierten Zellen besser analysieren zu können, wurden verschiedene Tracer entwickelt. Die Sicherheit und Wirksamkeit von Tracern sind die kritischsten Faktoren, die die Anwendung beeinflussen. Im Vergleich zur Markierung mit fluoreszierenden Proteinen [9] würde das Tracking mit superparamagnetischen Eisenoxid (SPIO)-Partikeln keine genetische Veränderung an den transplantierten Zellen mit sich bringen [10,11,12]. Mehrere Studien haben SPIO als wirksames Kontrastmittel verwendet, um die transplantierten Zellen zu visualisieren und zu verfolgen [6, 13, 14]. Es wurde jedoch berichtet, dass einige der im Handel erhältlichen SPIO die normalen Funktionen von MSC beeinträchtigen [15,16,17]; daher wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, um neuartige SPIOs zu entwickeln. In der vorliegenden Studie synthetisierten wir eine ultrakleine SPIO-Nanopartikel-(USPIO)-Beschichtung mit Polyacrylsäure (PAA) und eine anschließende Methoxypolyethylenglycolamin-(PEG)-Schicht. Das neuartige USPIO-PAA/PEG zeigt eine gute zelluläre Internalisierung und langfristige MRT-Tracking-Kapazität in vitro und in vivo. Darüber hinaus behielten die USPIO-PAA/PEG-markierten MSCs aus menschlichem Fettgewebe (HADSCs) die biologischen Eigenschaften bei, verbesserten die Verhaltensstörungen und erhöhten die TH-Immunreaktivität in der Substania nigra von PD-Tiermodellen.

Materialien und Methode

Materialien

Eisenacetylacetonat, TREG (Triethylenglycol), Diethylenglycol und PEG wurden von Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, China) bezogen. Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) wurde von Sigma-Aldrich Corporation (Shanghai, China) bezogen. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), Trypsin-EDTA (0,25%) und fötales Rinderserum (FBS) wurden von Thermo Fisher Scientific bezogen. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid und N-Hydroxysuccinimid wurden von Sigma-Aldrich (China) bezogen. N,N-Dimethylformamid, Ethylalkohol absolut und Ethylacetat wurden von Sinopharm Chemical Reagent Corporation bezogen. Reinstwasser wurde von Millipore Rein- und Reinstwasserreinigungssystemen hergestellt. Antihumanes CD90-FITC, Antihumanes CD45-PE, Antihumanes CD34-FITC und Antihumanes CD105-PE wurden von Biolegend bezogen.

Synthese von USPIO

Die USPIO wurde als frühere Forschung durch die Polyolmethode synthetisiert [18,19,20,21]. Die Versuchsschritte sind wie folgt:Eisenacetylacetonat 1 mmol und TREG 25 ml wurden in einem Dreihalskolben gemischt, der an Argon, kugelförmiges Kondensationsrohr und Thermometer angeschlossen war. Nach 15-minütiger Inkubation mit Argonfluss wurde die Mischung auf 120 °C (Heizrate beträgt 3 °C/min) erhitzt und 1 h gehalten, und dann wurde die Mischung mit derselben Heizrate weiter auf 250 °C erhitzt und gehalten 30 Minuten lang Die Reaktionsmischung wurde natürlich auf Raumtemperatur abgekühlt, mit 2 ml absolutem Ethylalkohol verdünnt, gefolgt von einer Fällung mit Ethylacetat. Das Sediment wurde durch Zentrifugation bei 8000 U/min für 20 Minuten gesammelt und dann in absolutem Ethylalkohol resuspendiert. Der USPIO wurde zur weiteren Verwendung in absolutem Ethylalkohol bei 4 °C gelagert.

Vorbereitung von PAA/PEG-beschichtetem USPIO

Die USPIO-PAA wurde nach einem früheren Bericht erworben [22]. Im Detail wurden 1,5 g Polyacrylsäure (PAA) in 24 ml Diethylenglykol gelöst. Nach einem 5-minütigen Argonfluss wurde die Mischung auf 110 °C erhitzt und gehalten, bis die Lösung klar war. Die im vorherigen Schritt hergestellte Ethanol-Dispergierlösung, die 28 mg USPIO enthielt, wurde nach dem Ultraschall-Dispergieren zu der obigen geklärten Lösung gegeben. Die Lösung wurde schließlich mit einer Geschwindigkeit von 3 °C/min auf 210 °C erhitzt. Die Reaktion wurde nach 2 h Rückfluss gestoppt und natürlich auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach dem Abkühlen wurde der Reaktionslösung Ethylacetat zugesetzt, um die USPIO-NPs auszufällen, und dann 20 min bei 8000 U/min zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Der Niederschlag wurde dann in Ethanol dispergiert, gefolgt von einer Fällung mit Ethylacetat. Nach dreimaligem Waschen wurde das USPIO-PAA zur weiteren Verwendung in Reinstwasser dispergiert. Um die Biokompatibilität zu verbessern, haben wir PEG außerdem durch EDC- und NHS-vermittelte Amidierung mit der Oberfläche von Nanopartikeln verknüpft [23]. 0,45 g PEG wurden in 5 ml Reinstwasser gelöst und zu der 15 ml USPIO-PAA-Dispersion (enthält 35 mg Fe), ergänzt mit 20 mg EDC und 12 mg NHS, zugegeben. Die Mischung wurde 2 h bei Raumtemperatur mechanisch gerührt und dann wurden 10 ml DMF-Lösungsmittel zugegeben, wobei Wasser bei 40 °C in der Rotationsverdampfungsapparatur entfernt wurde. Schließlich wurden der Mischung 40 mg DEC und 24 mg NHS zugesetzt und 48 h bei Raumtemperatur gemischt. Die Reaktionslösung wurde für 72 h in einen Dialysebeutel in Reinstwasser überführt, wobei alle 12 h Reinstwasser ausgetauscht wurde. Die Mischung wurde weiter in ein Ultrafiltrationsröhrchen überführt, um Moleküle mit einem Mr >  30 kD durch Zentrifugation bei 4000 U/min für 10 Minuten zu sammeln. Das Endprodukt wurde in Reinstwasser gelöst und bei 4 °C gelagert. In einigen Fällen wurde SPIO-PAA/PEG, das sich in Wasser auflöste, durch Zentrifugation mit einem Ultrafiltrationszentrifugenröhrchen (> 30 KD Porengröße, Millipore) gesammelt und die Pellets wurden für weitere Experimente in einem Vakuumofen getrocknet.

Charakterisierung von NPs

Die Partikelgröße, Größenverteilung und Morphologie der Proben wurden durch TEM analysiert. Die Beschichtungsschicht wurde durch Negativfärbung gemessen. Nach der Ultraschalldispergierung wurden USPIO-PAA und USPIO-PAA/PEG in wässriger Lösung zu dem Kupfernetzwerk der 300-mesh-Kohlenstoff-Trägermembran gegeben, natürlich getrocknet und dann in ein Projektionselektronenmikroskop (Tecnai G2F20 s-twin, FEI) gegeben. zur Beobachtung.

Die Infrarotspektroskopie-Analyse wird auf einem FTIR-Spektrometer der Cary 600-Serie von Agilent Technologies durchgeführt, bei dem das getrocknete Probenpulver zur Detektion direkt in den Probentank gegeben wird.

Der Fe-Gehalt in der USPIO-PAA/PEG-Dispersion wurde durch Flammenatomabsorptionsspektrometrie (FAAS) bestimmt, deren Modell PerkinElmer Analyst 700 ist. Zuerst wurden 1, 2, 3, 4 und 5 μg/ml Eisenstandardlösung konfiguriert, um die Standardkurve, dann wurden 100 μL USPIO-PAA- oder USPIO-PAA/PEG-Dispersionslösung mit Salpetersäure gelöst und der Eisengehalt in einem 50-ml-Messkolben bestimmt.

Die Magnetresonanztomographie der Nanopartikel wurde auf klinischen Scannern mit einem Magnetfeld von 3 T in der Bildgebungsabteilung des ersten angegliederten Krankenhauses der Universität Soochow durchgeführt. Die Nanopartikel wurden entsprechend der entsprechenden Konzentration in 1 % Agarosegel-Lösung dispergiert. Nachdem sich die Lösung verfestigt hatte, wurde die transversale Relaxationszeit der Proben durch eine Multi-Echo-Sequenz gemessen. Exportieren der Aufnahme von MRT im DICOM-Format und anschließendes Öffnen mit dem RadiAnt DICOM Viewer, Lesen des Grauwerts, durch Importieren der Grauwerte verschiedener Echozeiten in Origin zur Anpassung wurden die transversalen Relaxationszeitwerte von USPIO-Dispersionen mit unterschiedlichen Konzentrationen erhalten; schließlich wurde die transversale Relaxationsrate r2 von USPIO-PAA- und USPIO-PAA/PEG-Proben durch lineare Anpassung mit der transversalen Relaxationsrate von 1/T2 und der Fe-Konzentration der Proben erhalten. Die magnetischen Hystereseschleifen von USPIO-PAA und USPIO-PAA/PEG wurden mit dem Quantum Design DynaCool-9-Gerät an der Suzhou University of Science and Technology gemäß den zuvor beschriebenen Methoden erfasst [24].

Isolierung und Identifizierung von HADSCs

Alle Studien wurden in Übereinstimmung mit den „Ethical Guiding Principles on Human Embryonic Stem Cell Research“ (des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie und des Gesundheitsministeriums, Volksrepublik China, 2003) und der Helsinki-Deklaration durchgeführt. Fettproben wurden mit Einverständnis und ethischer Genehmigung vom ersten angeschlossenen Krankenhaus der Universität Soochow entnommen. Das Fettgewebe wurde gewaschen und nach Entfernung der Blutgefäße und des Bindegewebes unter einem anatomischen Mikroskop in kleine Stücke geschnitten. Die Blöcke wurden mit Typ-I-Kollagenase (0,3 pzu/ml) bei 37 °C für 30 Minuten verdaut, gefolgt von einer Zentrifugation bei 500g . für 10 min. Das Zellpellet wurde in DMEM + 10% FBS suspendiert und mit einer Dichte von 8 × 10 ⁴ . ausgesät /cm ² . Nach 48 h wurde das alte Medium mit schwimmenden Zellen verworfen und durch frisches Medium ersetzt.

HADSCs wurden durch Durchflusszytometrie auf Oberflächenmarker charakterisiert, die spezifisch mesenchymale (CD90 und CD105) und hämatopoetische (CD34 und CD45) Stammzellen markieren. Insgesamt wurden 1  × 105 Zellen geerntet und mit entweder PE, FITC, APC/cy7 oder PerCP-konjugierten Antikörpern gegen CD34, CD45, CD90 und CD105 antihumane monoklonale Mausantikörper und geeigneten Isotypkontrollen inkubiert. Gefärbte Zellen wurden unter Verwendung eines Durchflusszytometers (LSRFortessa, BD, USA) analysiert und die Daten wurden unter Verwendung der FlowJo-Software analysiert. Für die Oberflächenmarker von HADSCs wurden vier Phänotypen von CD90+, CD105+, CD34– und CD45– ausgewählt. Die Expressionsniveaus von Zelloberflächenmarkern wurden durch Durchflusszytometrie (BD LSRFortessa) identifiziert.

Die adipogene und osteogene Differenzierung von HADSCs wurde durch Oil Red O bzw. Alizarin Red Färbung bewertet. HADSCs wurden entweder mit MesenCultTM Adipogenic Differentiation Medium (Stammzell Tech., 05412) oder OriCellTM Osteogenic Differentiation Kit (Cyagen, HUXMA-90021) kultiviert. Zur adipogenen Differenzierung von HADSCs wurden die Zellen am Tag 14 durch qualitative Oil Red O-Färbung auf lipidgefüllte reife Adipozyten (VivaCell Biosciences, C37A00150) bewertet. Für die osteogene Differenzierung von HADSCs wurden die Zellen am Tag 21 durch Alizarin-Rot-Färbung auf Kalziumknötchen in reifen Osteozyten (VivaCell Biosciences, C37C00150) untersucht. Die Bilder wurden mit einem inversen Nexcope-Mikroskop aufgenommen.

In-vitro-zelluläre Aufnahme von USPIO-PAA/PEG und Bewertung der Biokompatibilität

HADSCs wurden in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 1 × 10 ⁶ . ausplattiert pro gut. Die Zellen wurden mit dem Medium, das USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/ml und 0,1 μg/ml) enthielt, 2 Stunden lang inkubiert und mit Preußischblau (PB)-Färbung zur intrazellulären Fe-Identifizierung gefärbt.

Die Biokompatibilität von USPIO-PAA/PEG wurde durch MTT-Kolorimetrie und 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin (EdU) Inkorporationsassay (EdU Proliferation Kit, Thermo) bestimmt. Für MTT wurden HADSCs in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 5 × 10 ³ . ausplattiert pro Well und inkubiert mit unterschiedlichen Konzentrationen (0, 10, 20, 40, 80, 160 Fe μg/mL) von USPIO-PAA/PEG 24 h, 48 h oder 72 h. 20 μl MTT-Lösung (5 mg/ml) wurden 4 h lang in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von 150 μl Dimethylsulfoxid, um die Kristalle aufzulösen. Der Absorptionswert jedes Lochs wurde bei OD 570 nm unter Verwendung eines enzymmarkierten Instruments (BioTek Synergy HT) gemessen. Für den EdU-Assay wurden HADSCs mit SPIO-PAA/PEG bei 160 Fe μg/ml für 72 h inkubiert, gefolgt von der Inkubation mit 10 μM EdU für 24 h. Die Zellen wurden gesammelt, mit 4% Paraformaldehyd fixiert und mit 2 mg/ml Glycin neutralisiert. Nachdem die Permealisierungszellen mit der Farbstofflösung (Azid 647) inkubiert worden waren, wurden die EdU-Einbauraten durch Durchflusszytometrie bewertet.

6-OHDA-induziertes PD-Modell

15–20 männliche Wistar-Ratten (SPF-Klasse, Gewicht 220 ± 20 g) wurden für die In-vivo-Nachverfolgung von USPIO-PAA/PEG-markierten HADSCs bei Parkinson-Tieren verwendet. Alle Verfahren wurden gemäß den Regularien in China (Regulations for the Administration of Affairs bezüglich Versuchstiere, 2017) durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Chinese Academy of Sciences genehmigt. Während der gesamten Zeit wurden die Tiere unter kontrollierter Beleuchtung (12/12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus, „an“ um 7 Uhr morgens) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Das PD-Modell wurde durch 2-Punkt-Injektion von 6-Hydroxydopamin (6-OHDA, Sigma, St. Louis, MO, USA) in das einseitige Striatum von Ratten hergestellt. Wie zuvor beschrieben [25, 26] wurde Ratten stereotaktisch 3 μl 6-OHDA-Lösung (5 μg/μl) an 2 Koordinaten (AP:1,2 mm, ML:2,2 mm, DV:− 4,0 bis 6,0 mm) injiziert; und AP:− 1,0 mm, ML:4,4 mm, DV:− 4,5 bis 6,5 mm). Apomorphin-induzierte Rotationstests (0,5 mg/kg, subkutan) wurden verwendet, um die Gültigkeit von PD-Modellen zu testen. Den Ratten wurde 1, 2 und 3 Wochen nach der 6-OHDA-Behandlung Apomorphin (0,5 mg/kg) subkutan injiziert, und die Rotationsbewertungen wurden 30 Minuten lang auf offenem Feld bewertet. Das PD-Modell hat mehr als 7 Umdrehungen pro Minute durch Apomorphin und wurde als erfolgreich angesehen.

Zelltransplantation und In-vivo-MRT-Bildgebung

HADCs wurden mit USPIO-PAA/PEG (Eisenkonzentration 10 μg/ml) 2 h lang inkubiert, als sie eine Konfluenz von 80 % erreichten. 3 Wochen nach der Vorbereitung des PD-Modells, 3 × 10 ⁶ von USPIO-PAA/PEG-markierten HADCs oder Kochsalzlösung wurden in das linke Striatum von PD-Rattenmodellen an der folgenden Koordinate injiziert (AP:1,2 mm, ML:2,2 mm, DV:– 4,0 bis 6,0 mm). Den Tieren, die eine Transplantation erhielten, wurde Buprenorphin (0,5 mg/kg) unmittelbar nach der Operation und für 2 Tage danach verabreicht. Diese Tiere wurden 1, 2 oder 3 Wochen nach der Transplantationsoperation den Apomorphin-induzierten Rotationstests unterzogen.

Für die In-vivo-MRT wurden Tiere am 3., 9., 15. und 21. Tag nach der Injektion von Kochsalzlösung oder HADSCs mit einem Kleintier-Bildgebungssystem (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) in einem In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS) abgebildet.

Histologische Analyse

Die Gehirne der verbleibenden Rattenmodelle wurden entnommen und 3 Wochen nach der Stammzelltransplantation (n = 5 pro Gruppe). Die Schnitte wurden mit Anti-Tyrosin-Hydroxylase (TH, abcam, England) inkubiert und mit Alexa-594-konjugiertem Esel-Anti-Kaninchen-Antikörper (Abcam) sichtbar gemacht. DAPI wurde zur Gegenfärbung mit Kernen verwendet. Die Bilder wurden mit dem konfokalen Mikroskop Leica TCS SP5 aufgenommen.

Statistische Analyse

Numerische Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Die Daten wurden zweiseitigen Student-t-Tests oder einer Einweg-ANOVA unter Verwendung von GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) unterzogen, um den Unterschied zu bewerten. * zeigt p . an < 0,05 und NS zeigen keinen signifikanten Unterschied an.

Ergebnisse

Synthese und Charakterisierung von Nanopartikeln

Das experimentelle Design ist in Abb. 1 dargestellt. Die hydrophoben USPIO-NPs wurden unter Verwendung der thermischen Zersetzungsmethode hergestellt. Wie in Abb. 2a–c gezeigt, betrug der Durchmesser der ursprünglichen USPIO-NPs 4,07 ± 0,57 nm; durch die Beschichtung mit PAA erhöhte sich der Durchmesser der USPIO-PAA-NPs auf 6,34 ± 0,54 nm; eine weitere Modifikation der NPs mit PEG lässt den Durchmesser von USPIO-PAA/PEG-NPs 10,07 ± 0,55 nm erreichen. Alle drei Nanopartikel waren kugelförmig und gleichmäßig verteilt. Die statistische Analyse zeigte einen signifikanten Unterschied (F = 10, **p < 0.01, ##p < 0.01) unter den Durchmessern der NPs USPIO, USPIO-PAA und USPIO-PAA/PEG, was auf eine erfolgreiche Modifikation mit PAA und PEG hinweist (Abb. 2d).

Schematische Darstellung des Versuchsdesigns

Charakterisierung von Nanopartikeln. a–c Repräsentative TEM-Bilder von USPIO-NPs (a ), USPIO-PAA-NPs (b ) und USPIO-PAA/PEG-NPs (c ). d Die statistische Analyse zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen der Partikelgröße von USPIO, USPIO-PAA und USPIO-PAA/PEG (n = 20 pro Gruppe). e Fourier-Transformations-Infrarot von Nanopartikeln von USPIO-, USPIO-PAA- und USPIO-PAA/PEG-NPs. Die Pfeile geben den spezifischen Absorptionspeak bei 1728 cm ⁻¹ . an aufgrund der PAA-Modifikation, 1595 cm ⁻¹ und 3440 cm ⁻¹ aufgrund der PEG-Modifikation. Numerische Daten werden als Mittelwert ± SD, **p . dargestellt < 0,01 im Vergleich zu den USPIO-NPs, ##p < 0,01 gegenüber den USPIO-PAA/PEG-NPs. Der Balken steht für 20 nm

Bei Verwendung der Infrarotabsorptionsmethode haben wir festgestellt, dass USPIO-PAA einen offensichtlichen Carbonylabsorptionspeak bei 1728 cm ⁻¹ . aufweist aufgrund des Carbonyl-Streckschwingungspeaks im PAA-Molekül; USPIO-PAA/PEG hat eine Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung in der Ebene der Biegeschwingungsspitze bei 1595 cm ⁻¹ und ein Streckschwingungspeak der Hydroxylgruppe bei 3440 cm ^–1 (Abb. 2e). Alle diese Daten bestätigten weiter, dass PAA- oder PEG-Moleküle erfolgreich an der Oberfläche von NPs modifiziert wurden.

USPIO-PAA/PEG zeigte gute magnetische In-vitro-Reaktion und Biokompatibilität mit HADSC

Die In-vitro-Bildgebungsfähigkeit von USPIO-PAA und USPIO-PAA/PEG wurde anhand der Graustufenwerte von MRT-Bildern bei unterschiedlichen Konzentrationen (äquivalent zu Fe-Konzentrationen) bewertet. Nach der Anpassung wurden die Werte der transversalen Relaxationszeit der Dispersionen bei verschiedenen Konzentrationen erhalten. Durch Einstellen der transversalen Relaxationsrate von 1/T2 als vertikale Koordinate und der Fe-Konzentration als horizontale Koordinate wurde die transversale Relaxationsrate von USPIO-PAA zu 107,94 s ⁻¹ . berechnet mm ⁻¹ (Abb. 3a) und 84,65 s ⁻¹ mm ⁻¹ für USPIO-PAA/PEG (Abb. 3b). Beide Partikel zeigten gute MRT-Abbildungseigenschaften. Die magnetischen Hystereseschleifen von SPIO-PAA und SPIO-PAA/PEG zeigten, dass der Sättigungsmagnetisierungswert von SPIO-PAA 57 emu/g über 10.000 Oe beträgt (Abb. 3c) und der von SPIO-PAA/PEG 40 . beträgt emu/g über 10.000 Oe (Abb. 3d). Koerzitivkraft und Remanenz lagen nahe null (Abb. 3c, d), was weiter darauf hindeutet, dass sowohl SPIO-PAA als auch SPIO-PAA/PEG Superparamagnetismus waren.

In-vitro-Magnetantwort der synthetisierten USPIO-PAA- und USPIO-PAA/PEG-NPs. a , b MRT und transversale Relaxationsrate von USPIO-PAA-NPs (a ) und USPIO-PAA/PEG-NPs (b ). r ₂ stellt die Entspannungsrate dar. Die Relaxationsraten der USPIO-PAA- und USPIO-PAA/PEG-NPs betrugen 107,94 s ⁻¹ mM ⁻¹ und 84,65 s ⁻¹ mM ⁻¹ . c , d magnetische Hystereseschleifen von USPIO-PAA-NPs (c ) und USPIO-PAA/PEG-NPs (d ). Die magnetische Hysterese wurde bei 295 k (21,85 °C) mit der maximalen Magnetfeldstärke von 50.000 Oe (5 Telsa) gemessen. Die Sättigungsmagnetisierungswerte lagen nahe 57 emu/g für SPIO-PAA und 40 emu/g für SPIO-PAA/PEG. Die Magnetisierungshysterese war in beiden Kurven nahe Null

Durch Inkubation der USPIO-PAA/PEG-NPs mit HADSCs für unterschiedliche Zeiträume haben wir festgestellt, dass USPIO-PAA/PEG-NPs keine signifikanten Auswirkungen auf das Überleben von Zellen haben (p> 0,05). Die Zelllebensfähigkeit von HADSCs bleibt über 96 %, wenn die äquivalente Fe-Konzentration zwischen 0 und 160 μg/ml liegt. Darüber hinaus induziert die Verlängerung der Inkubationszeit (von 24 auf 72 h) bei jeder Fe-Konzentration keinen signifikanten Zellverlust (Abb. 4a). Eine ähnliche Beobachtung wurde erhalten, als USPIO-PAA/PEG-NPs mit iPSCs in unterschiedlichen Konzentrationen inkubiert wurden (Abb. 4b). Obwohl HADSCs 72 h lang mit 160 μg Fe/mL USPIO-PAA/PEG behandelt wurden, wurde die Proliferationsfähigkeit, wie durch die EdU-Inkorporationsraten angezeigt, durch das Vorhandensein von USPIO-PAA/PEG nicht beeinträchtigt (Abb. 4c). Alle diese Daten zeigten die Biosicherheit der synthetisierten USPIO-PAA/PEG-NPs.

Die synthetisierten USPIO-PAA/PEG-NPs zeigen eine gute Biokompatibilität und Markierungsfähigkeit. a , b HADSCs oder iPSCs wurden mit USPIO-PAA/PEG-NPs in unterschiedlichen Konzentrationen (entsprechend den Fe-Konzentrationen bei 0, 10, 20, 40, 80 und 160 μg Fe/ml) für 24, 48 und 72 h inkubiert, und die Zelllebensfähigkeit wurde mit der MTT-Methode bestimmt und in a gezeigt , b , bzw. Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den Lebensfähigkeiten bei verschiedenen NP-Konzentrationen (n = 5) oder Inkubationszeit (n = 5). c Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass die EdU-Einbauraten in den HADSCs ähnlich waren, die in An- oder Abwesenheit von USPIO-PAA/PEG (160 μg Fe/ml für 72 h) inkubiert wurden. HADSCs, die nicht mit EdU behandelt wurden, dienten als Negativkontrolle. d USPIO-PAA/PEG bei 10 μg Fe/ml und Inkubationszeit für 2 h führte zu einer Markierungseffizienz von HADSCs von fast 100 %, wie durch Preußischblau-Färbung bewertet. Beachten Sie, dass USPIO-PAA/PEG bei 0,1 μg Fe/ml (2 h Inkubationszeit) eine leichte, aber gleichmäßige PB-Färbung in den HADSCs erzeugte. Numerische Daten werden als Mittelwert  ± SD dargestellt. Der Balken steht für 20 μm

Um zu ermitteln, ob Zellen effektiv durch USPIO-PAA/PEG-NPs markiert werden könnten, haben wir die HADSCs mit USPIO-PAA/PEG-NPs bei einem äquivalenten Fe von 10 μg/ml oder 0,1 μg/ml 2 h lang inkubiert. Wie in Abb. 4d gezeigt, wurde in fast 100 % der HADSCs in Gegenwart von USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/ml) eine große Anzahl blau gefärbter NPs beobachtet. Obwohl die Dosis von USPIO-PAA/PEG auf 0,1 μg Fe/ml reduziert wurde, beobachteten wir in fast allen HADSC immer noch eine ziemlich gleichmäßige und dispergierte PB-Färbung. Im Vergleich zu einigen der anderen berichteten SPIOs [14, 27, 28] zeigte USPIO-PAA/PEG eine hohe Zellaufnahmeeffizienz.

Langzeit-Tracking von USPIO-PAA/PEG-NPs-markierten HADSCs in PD-Rattenmodellen

Mit USPIO-PAA/PEG-NPs markierte HADSCs wurden durch stereotaktische Injektion in das linke Striatum des PD-Rattenmodells transplantiert. Wie in Abb. 5 gezeigt, beobachteten wir 3 Tage nach der HADSC-Transplantation ein klares MRT-Signal im linken Striatum, was auf eine ordnungsgemäße In-vivo-Nachverfolgung der transplantierten Zellen hinweist. Eine dynamische Beobachtung an D3, D9, D15 und D21 nach der Transplantation zeigte, dass die transplantierten Zellen mit NP-Markierung bis zu 3 Wochen eindeutig verfolgt werden konnten und die MRT-Signale während des Prozesses keine offensichtliche Verringerung zeigten. Diese Ergebnisse zeigen, dass die synthetisierten Nanopartikel ein gutes Potenzial für die In-vivo-Nachverfolgung der transplantierten Zellen haben.

Repräsentative MRT-Bilder des Gehirns nach 3 Tagen, 9 Tagen, 15 Tagen und 21 Tagen, gefolgt von einer Transplantation mit USPIO-PAA/PEG-Markierungs-HADSCs oder Kochsalzlösung. Die MRT-Bilder der entsprechenden Kontrollen, d. h. normale Ratten oder PD-Rattenmodelle, denen Kochsalzlösung injiziert wurde, wurden in der 1. bzw. 2. Reihe gezeigt. Beachten Sie, dass im Vergleich zu den negativen Signalen in der Kontrolle die mit USPIO-PAA/PEG-markierten HADSCs transplantierten Rattenhirne bis zu 21 Tage konstante und klare MRT-Signale zeigten. Der Balken steht für 5 mm

USPIO-PAA/PEG NPs-markierte HADSCs zeigten therapeutische Wirkungen im PD-Modell

Um zu bewerten, ob NPs-markierte HADSCs therapeutische Wirkungen zeigten, führten wir zunächst eine phänotypische Charakterisierung der isolierten HADSCs durch. Wie in Abb. 6a gezeigt, waren die kultivierten HADSCs spindelförmige Zellen. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass die HADSCs stark exprimierte Marker für mesenchymale Zellen wie CD90 (> 99%) und CD105 (> 99%) waren, während nur wenige von ihnen hämatopoetische Marker wie CD34 und CD45 exprimierten (Abb. 6b–g .). ). Die HADSCs konnten unter bestimmten Bedingungen entweder zu adipogenen oder osteogenen Linien differenzieren, und die Differenzierungskapazität wurde durch Oil Red O bzw. Alizarin Red Färbung gezeigt (Abb. 5h). Beachten Sie die Lipidtröpfchen oder verkalkten Knötchen in den differenzierten HADSCs, während in den Kontroll-HEK293-Zellen keine solche Struktur vorliegt (Abb. 6h). All dies weist darauf hin, dass HADSCs die Kriterien von mesenchymalen Zellen erfüllen.

HADSC-Charakterisierung. a Ein repräsentatives Bild unter dem Begriff Kontrastmikroskop zeigt, dass HADSCs einen typischen spindelähnlichen Phänotyp aufweisen. b–g HADSCs wurden mit Antikörpern, die mit verschiedenen Farbstoffen gegen CD45-, CD105-, CD34- und CD90-Marker konjugierten, inkubiert und einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen. Die Streudiagramme sind in b, c dargestellt , und die Histogramme werden in d–g . angezeigt . Beachten Sie, dass die meisten Zellen CD90 und CD105 exprimierten, aber nicht CD34 und CD45. h Die adipogene Differenzierung und die osteogene Differenzierung von HADSCs gegenüber HEK293-Zellen werden durch Oil Red O bzw. Alizarin Red Färbung bewertet. Der Balken steht für 20 μm

Die Apomorphin-induzierten Rotationen betrugen 17,1 ± ± 1,79, 28,7 ± ± 1,77 und 31,86 ± ± 1,72 pro Minute in der 1., 2. und 3. Woche nach der 6-OHDA-Injektion, was die erfolgreiche Etablierung des Ratten-PD-Modells bestätigt. Wie in Abb. 7 gezeigt, reduzierten sich die Rotationszahlen der PD-Rattenmodelle in der 1., 2. und 3. Woche auf 32,59 ± ± 1,12, 31,85 ± ± 1,98 und 31,54 ± ± 1,73, gefolgt von der Transplantation NPs-markierter HADSCs in das Striatum der Läsionsseite. Die statistische Analyse ergab einen signifikanten Unterschied zwischen der Kochsalzlösungs- und der HADSC-verabreichten Gruppe ab der 2. Woche nach der Transplantationsoperation (p < 0.01 in der 2. Woche, p <  0,01 in der 3. Woche; n = 5 in jeder Gruppe), was darauf hinweist, dass die NPs-markierten HADSCs die Verhaltensbeeinträchtigungen in den PD-Modellen verbessern.

PD-Rattenmodellen wurden entweder Kochsalzlösung oder USPIO-PAA/PEG-markierte HADSCs in das mit 6-OHDA beeinträchtigte ipsilaterale Striatum verabreicht, und die Rotationszahlen pro Minute wurden bewertet und verglichen. Es gibt eine signifikante Verringerung der Rotationszahlen in der 2., 3. Woche, nachdem die PD-Ratten HADSCs erhielten, im Vergleich zu den entsprechenden PD-Ratten, die Kochsalzlösung erhielten. ns zeigt eine unbedeutende Änderung an und ** bedeutet p < 0,01. n = 5 für jede Gruppe

PD ist durch den Verlust von Neuronen gekennzeichnet, die Tyrosinhydroxylase (TH) in der Substantia nigra exprimieren. Durch die Verwendung der Immunfärbung gegen TH fanden wir, dass 6-OHDA die TH-exprimierenden Neuronen in der Substantia nigra reduziert, und die Transplantation mit HADSCs in das Striatum von PD-Rattenmodellen könnte eine solche Reduktion lindern (Abb. 8). Combined with the observation that cell transplantation alleviates the behavioral impairments of PD rats, we concluded that USPIO-PAA/PEG NPs-labeled HADSCs exert therapeutic effects in PD rat models.

Immunostaining against TH in the substantia nigra of the rats receiving saline (a , d , g ), PD rats receiving saline (b , e , h ) or PD rats receiving USPIO-PAA/PEG NPs-labeled HADSCs (c , f , ich ). The area in the dashed frame indicates the compact area of substantia nigra (SNc) and the ventral tegmental area (VTA). Images in the boxes of d , e , f are enlarged and shown in g , h , ich , bzw. There are less TH-expressing cells in the SNc and VTA regions in the rats receiving 6-OHDA injection, as compared to the controls receiving saline. Following by HADSC transplantation, more of TH-expressing cells in the SNc of PD rats could be observed. The bar represents 100 μm

Diskussion

Cell therapy is a promising strategy for the treatment of neurodegenerative diseases and has been in the front edge of preclinical research over the last 20 years [29, 30]. Tracing the transplanted cells is an indispensable part for the clarification of underlying mechanisms as well as the evaluation of clinical effects; however, it is challenging and to some extent, hampered the application of cell therapy [31, 32]. Computed tomography (CT), near-infrared fluorescence imaging (NIFI) and MRI are the most commonly used methods for the in vivo tracking of transplanted cells [31, 32]. Compared to the rather high radiation of CT and low sensitivity of NIFI, MRI shows good imaging of deep tissue, high contrast and low ionizing radiation, making it a good candidate for the in vivo tracing [33,34,35,36]. The development of proper tracers for MRI therefore becomes an indispensable part of promoting the application of cell therapy.

SPIO is a simple and reliable labeling strategy for MRI visualization. To achieve long-term in vivo tracing of the transplanted cells, the SPIO particles is required to have a uniform and ultrasmall size, since large particles may lead to uneven distribution of the tracers and interfere with the normal blood circulation [33]. Moreover, the internalization efficiency and biocompatibility of nanoparticles are another important index to evaluate the tracers. Nanoparticles usually enter cells through liquid phase endocytosis [37], receptor-mediated endocytosis [38] and phagocytosis [39]. To achieve a better cellular uptake, the SPIO particles are usually modified with intermediate ligands [18, 40, 41].

Besides cell tracking, SPIO has also been applied for drug delivery [42]. The tissue distribution and pharmacokinetic clearance are important index for both applications. Compared to the NPs-PAA, NPs-PAA/PEG showed longer retention time in blood and slower urinary clearance [43]. NPs densely coated with PEG provide much more uniform distribution over mucosal epithelial surfaces, including the gastrointestinal tract [44], respiratory system [45, 46] and brain tumor [42], etc. Moreover, PEG coating reduces the attachment of proteins and formation of corona, which in turn might promote uniform distribution of the NPs at the cost of reduced uptake [47]. As a potential good diagnostic and therapeutic tool, the labeling capacity of SPIO-PAA/PEG to MSCs and its further application in brain disorders such as PD have not been well studied, and the present study was designed to answer this question. In the present study, we synthesized a novel ultrasmall USPIO-PAA/PEG nanoparticles, modifying the SPIO cores with PAA and PEG ligands, respectively. The USPIO-PAA/PEG NPs have uniform ultrasmall diameter (10.07 ± 0.55 nm), good dispersion in aqueous solution, biocompatibility with various cell types as well as good magnetic response effect in vitro and in vivo. Importantly, the signals of labeled HADSCs could be clearly detected under MRI after brain transplantation for up to three weeks, indicating the good potential for clinical application.

PD is characterized by a progressively loss of dopaminergic neurons in the substania nigra, and by the deficiency of dopaminergic levels in the dopaminergic networks [1]; the most affected one is the nigrostriatal pathway including the striatum. In the present study, we transplanted USPIO-PAA/PEG-labeled HADSCs into the striatum of PD rat models, and found that such transplantation improved the behavioral impairments; moreover, it attenuated the loss of dopaminergic neurons in the substania nigra to some extent. Similarly, Ardeshir et al. reported that transplanting the MSCs derived from rat adipose tissues attenuated apomorphine-induced rotations in PD models [48]. Different from transplanting fetal midbrain tissues [49] or dopaminergic neural progenitors [50], HADSCs exert its therapeutic effects mainly through the paracrine effects [51, 52], rather than substituting for the impaired tissues. Studies have shown that MSCs act as promoters of immunomodulation, neuroprotection and neuronal differentiation, and these effects are essentially mediated by the secretome released by MSCs [6, 7, 51]. Our result is consistent with these observations; moreover, it indicates that the novel USPIO-PAA/PEG tracers did not interfere with the neuroprotection effects of HADSCs.

Schlussfolgerungen

We have developed a novel USPIO-PAA/PEG tracers showing high cell uptake efficiency, excellent biocompatibility and long-term MRI tracing capacities. The HADSCs labeled with USPIO-PAA/PEG could be traced with MRI for 3 weeks after cell transplantation. Moreover, the labeled HADSCs significantly attenuated the behavioral impairments of PD models, and increase the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra. The development of USPIO-PAA/PEG tracer may provide a promising tool in stem cell research and application.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels unterstützen, sind im Artikel enthalten.

Abkürzungen

SPIO:

Small superparamagnetic iron oxide

USPIO:

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide

PAA:

Polyacrylsäure

PEG:

Methoxypolyethylene glycol amine

HADSCs:

Human adipose-derived stem cells

USPIO-PAA/PEG:

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles coating with the polyacrylic acid and methoxypolyethylene glycol amine

6-OHDA:

6-Hydroxydopamine

CT:

Computertomographie

NIFI:

Near infrared fluorescence imaging

MRT:

Magnetresonanztomographie

TH:

Tyrosine hydroxylase

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop