Ultrasmall superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel für Stammzell-Tracking in der Parkinson-Therapie

Zusammenfassung

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist durch den fortschreitenden Verlust dopaminerger Neuronen im Mittelhirn gekennzeichnet, und die Stammzelltransplantation bietet eine vielversprechende Strategie für die Behandlung. In diesen Studien ist das Tracking der biologischen Verhaltensweisen der transplantierten Zellen in vivo essenziell für ein grundlegendes Verständnis der Stammzellfunktion und die Bewertung der klinischen Wirksamkeit. In der vorliegenden Studie entwickelten wir neuartige ultrasmall superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (USPIO), beschichtet mit Polyacrylsäure (PAA) und Methoxypolyethylenglykolamin (PEG) durch thermische Zersetzung und eine zweistufige Modifikation. Die USPIO-PAA/PEG-NPs weisen einen einheitlichen Durchmesser von 10,07 ± 0,55 nm und einen geeigneten Absorptionspeak der entsprechenden Liganden auf, wie durch TEM und FTIR gezeigt. Der MTT-Test zeigte, dass das Überleben von Zellen, die mit USPIO-PAA/PEG-NPs inkubiert wurden, über 96 % betrug. Die synthetisierten USPIO-PAA/PEG wiesen eine gute Relaxationsrate von 84,65 s⁻¹ mM⁻¹ auf, was darauf hindeutet, dass sie effizient aufgenommen und per MRT nachverfolgt werden können. Darüber hinaus wurden primäre humane adipöse Stammzellen (HADSCs) charakterisiert, mit USPIO-PAA/PEG markiert und in den Striatum von 6-Hydroxydopamin (6-OHDA)-induzierten PD-Rattenmodellen transplantiert. Die markierten Zellen konnten per MRT bis zu 3 Wochen nach der Transplantationsoperation nachverfolgt werden; zudem schwächte die Transplantation mit den markierten HADSCs die Apomorphin-induzierten Rotationen in PD-Modellen signifikant ab und erhöhte die Anzahl der dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra. Insgesamt bietet die Entwicklung von USPIO-PAA/PEG-NPs ein vielversprechendes Werkzeug für die in-vivo-Nachverfolgungstechnik der Zelltherapie und identifiziert eine neuartige Strategie, Stammzellen mit therapeutischem Potenzial bei PD zu tracken.

Einleitung

Die Parkinson-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die durch den fortschreitenden Verlust dopaminerger Neuronen im Mittelhirn gekennzeichnet ist. Die relativ fokale Beeinträchtigung macht sie zu einem guten Kandidaten für zellbasierte Therapien. Verschiedene Zelltypen, von fötalem Mittelhirngewebe [1] bis zu induzierten Neuronen, die aus embryonalen Stammzellen (ESC) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitet sind [2], wurden in der Behandlung von PD in Betracht gezogen; jedoch konnten ethische Bedenken und das potenzielle Risiko der Tumorigenität während der Anwendung nicht vermieden werden [3]. Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind eine multipotente Stammzellpopulation, die in den letzten zehn Jahren als vielversprechendes therapeutisches Werkzeug für neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich PD, berichtet wurde [4, 5]. Im Vergleich zu anderen Zelltypen zeigen MSCs gute Proliferation, weit verbreitete Verfügbarkeit im menschlichen Körper und immunsuppressive Fähigkeit. Einige Studien haben gezeigt, dass die intrakranielle Transplantation von MSCs Neuroprotektion, neuronale Differenzierung und Immunmodulation fördert [6,7,8]. In diesen Studien ist das Tracking der Vitalität, Migration und Integration der transplantierten Zellen in vivo essenziell für ein grundlegendes Verständnis der Stammzellfunktion und die Bewertung der klinischen Wirksamkeit.

Um die therapeutischen Effekte der transplantierten Zellen besser zu analysieren, wurden verschiedene Tracer entwickelt. Die Sicherheit und Wirksamkeit der Tracer sind die kritischsten Faktoren, die die Anwendung beeinflussen. Im Vergleich zur Markierung mit fluoreszierenden Proteinen [9] würde das Tracking mittels superparamagnetischer Eisenoxid (SPIO) Partikel keine genetische Modifikation der transplantierten Zellen mit sich bringen [10,11,12]. Mehrere Studien haben SPIO als effektives Kontrastmittel zur Visualisierung und Nachverfolgung transplantierter Zellen verwendet [6, 13, 14]. Allerdings wurde berichtet, dass einige kommerziell verfügbare SPIO die normalen Funktionen von MSCs beeinträchtigen [15,16,17]; daher wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, neuartige SPIOs zu entwickeln. In der vorliegenden Studie synthetisierten wir ultrasmall SPIO-Nanopartikel (USPIO), beschichtet mit Polyacrylsäure (PAA) und einer anschließenden Methoxypolyethylenglykolamin (PEG) Schicht. Die neuartigen USPIO-PAA/PEG zeigen gute zelluläre Internalisierung und langfristige MRT-Nachverfolgungskapazität in vitro und in vivo. Zudem behielten die USPIO-PAA/PEG-markierten MSCs, die aus menschlichem Fettgewebe stammen (HADSCs), ihre biologischen Merkmale bei, verbesserten die Verhaltensbeeinträchtigungen und erhöhten die TH-Immunreaktivität in der Substantia nigra von PD-Tiermodellen.

Materialien und Methoden

Materialien

Eisenacetylacetonat, TREG (Triethylenglykol), Diethylenglykol und PEG wurden von Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, China) bezogen. Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) wurde von Sigma-Aldrich Corporation (Shanghai, China) gekauft. Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), Trypsin-EDTA (0,25 %) und fötales Rindserum (FBS) wurden von Thermo Fisher Scientific bezogen. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid und N-Hydroxysuccinimid wurden von Sigma-Aldrich (China) gekauft. N,N-Dimethylformamid, absoluter Ethylalkohol und Ethylacetat wurden von Sinopharm Chemical Reagent Corporation bezogen. Ultrapures Wasser wurde von Millipore-Rein- und Ultrapure-Wasseraufbereitungssystemen produziert. Anti-human CD90-FITC, Anti-human CD45-PE, Anti-human CD34-FITC und Anti-human CD105-PE wurden von Biolegend gekauft.

Synthese von USPIO

Die USPIO wurden nach einer früheren Forschungsmethode [18,19,20,21] durch das Polyol-Verfahren synthetisiert. Die Versuchsschritte sind wie folgt: 1 mmol Eisenacetylacetonat und 25 ml TREG wurden in einem Dreihalskolben gemischt, der mit Argon, einem kugelförmigen Rückflusskühler und einem Thermometer verbunden war. Nach 15 min Argonfluss wurde das Gemisch auf 120 °C erhitzt (Heizrate 3 °C/min) und 1 h gehalten, dann wurde das Gemisch bei derselben Heizrate weiter auf 250 °C erhitzt und 30 min gehalten. Die Reaktionsmischung wurde natürlich auf Raumtemperatur abgekühlt, mit 2 ml absolutem Ethanol verdünnt, gefolgt von Fällung mit Ethylacetat. Der Sediment wurde durch Zentrifugation bei 8000 rpm für 20 min gesammelt und dann in absolutem Ethanol wieder suspendiert. Die USPIO wurden in absolutem Ethanol bei 4 °C zur weiteren Verwendung gelagert.

Herstellung von PAA/PEG-beschichteten USPIO

Die USPIO-PAA wurden gemäß einem früheren Bericht [22] erhalten. Im Detail wurden 1,5 g Polyacrylsäure (PAA) in 24 ml Diethylenglykol gelöst. Nach 5-minütigem Argonfluss wurde das Gemisch auf 110 °C erhitzt und so lange gehalten, bis die Lösung klar wurde. Die Ethanoldispersionslösung mit 28 mg USPIO aus dem vorherigen Schritt wurde nach ultraschallgestützter Dispersion der oben geklärten Lösung zugegeben. Die Lösung wurde schließlich mit einer Rate von 3 °C/min auf 210 °C erhitzt. Die Reaktion wurde nach 2 h Reflux gestoppt und natürlich auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach dem Abkühlen wurde Ethylacetat zur Reaktionslösung gegeben, um die USPIO-NPs auszufällen, und dann bei 8000 rpm für 20 min zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Der Niederschlag wurde dann in Ethanol dispersiert, gefolgt von Fällung mit Ethylacetat. Nach dreimaligen Waschverfahren wurde die USPIO-PAA in ultrapurem Wasser für die weitere Verwendung dispersiert. Um die Biokompatibilität zu verbessern, verknüpften wir PEG weiterhin an die Oberfläche der Nanopartikel durch EDC- und NHS-vermittelte Amidierung [23]. 0,45 g PEG wurden in 5 ml ultrapurem Wasser gelöst und zu 15 ml USPIO-PAA-Dispersion (enthält 35 mg Fe) ergänzt mit 20 mg EDC und 12 mg NHS gegeben. Das Gemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur mechanisch gerührt, dann wurden 10 ml DMF-Lösungsmittel hinzugefügt, Wasser bei 40 °C im Rotationsverdampfer entfernt. Schließlich wurden 40 mg DEC und 24 mg NHS zum Gemisch gegeben, 48 h bei Raumtemperatur gemischt. Die Reaktionslösung wurde für 72 h in einen Dialysebeutel in ultrapurem Wasser übertragen, wobei das ultrapure Wasser alle 12 h ersetzt wurde. Das Gemisch wurde weiter in ein Ultrafiltrationsröhrchen übertragen, um Moleküle mit einem Mr > 30 kD durch Zentrifugation bei 4000 rpm für 10 min zu sammeln. Das Endprodukt wurde in ultrapurem Wasser gelöst und bei 4 °C gelagert. In einigen Fällen wurde SPIO-PAA/PEG, in Wasser gelöst, durch Zentrifugation mit einem Ultrafiltrationszentrifugenröhrchen (> 30 KD Porengröße, Millipore) gesammelt, und die Pellets wurden im Vakuumofen für weitere Experimente getrocknet.

Charakterisierung der NPs

Die Partikelgröße, Größenverteilung und Morphologie der Proben wurden mittels TEM analysiert. Die Beschichtungsschicht wurde durch Negativeinfärbung gemessen. Nach ultraschallgestützter Dispersion wurden die USPIO-PAA und USPIO-PAA/PEG in wässriger Lösung auf das Kupfernetz der 300-Mesh-Kohlenstoffträgermembran gegeben, natürlich getrocknet und dann in ein Transmissionselektronenmikroskop (Tecnai G2F20 s-twin, FEI) zur Beobachtung gegeben.

Die Infrarotspektroskopie-Analyse wurde an einem Agilent Technologies Cary 600 Series FTIR-Spektrometer durchgeführt, wobei das getrocknete Probenpulver direkt in den Probentank zur Detektion gegeben wurde.

Der Fe-Gehalt in der USPIO-PAA/PEG-Dispersion wurde durch Flammenatomabsorptionsspektrometrie (FAAS) bestimmt, deren Modell PerkinElmer Analyst 700 ist. Zunächst wurden 1, 2, 3, 4 und 5 μg/ml Eisenstandardlösungen konfiguriert, um die Standardkurve zu zeichnen, dann wurden 100 μl USPIO-PAA- oder USPIO-PAA/PEG-Dispersionslösung mit Salpetersäure gelöst, und der Eisengehalt wurde in einem 50-ml-Messkolben bestimmt.

Die Magnetresonanztomographie der Nanopartikel wurde an klinischen Scannern mit einem Magnetfeld von 3 T in der Bildgebungsabteilung des ersten angeschlossenen Krankenhauses der Soochow-Universität durchgeführt. Die Nanopartikel wurden gemäß der entsprechenden Konzentration in 1 % Agarose-Gel-Lösung dispersiert. Nach Aushärtung der Lösung wurde die transversale Relaxationszeit der Proben mit einer Multi-Echo-Sequenz gemessen. Export der MRT-Aufnahmen im DICOM-Format und anschließendes Öffnen und Auslesen der Grauwerte mit dem RadiAnt DICOM Viewer; durch Importieren der Grauwerte verschiedener Echozeiten in Origin für die Anpassung wurden die transversalen Relaxationszeitwerte der USPIO-Dispersionen mit unterschiedlichen Konzentrationen ermittelt; schließlich wurde die transversale Relaxationsrate r2 von USPIO-PAA- und USPIO-PAA/PEG-Proben durch lineare Anpassung der transversalen Relaxationsrate 1/T2 und der Fe-Konzentration der Proben erhalten. Die magnetischen Hysterese-Schleifen von USPIO-PAA und USPIO-PAA/PEG wurden mit einem Quantum Design DynaCool-9-Gerät an der Suzhou University of Science and Technology gemäß zuvor beschriebenen Methoden [24] aufgenommen.

HADSCs-Isolierung und Identifizierung

Alle Studien wurden in Übereinstimmung mit den „Ethischen Leitprinzipien zur Forschung an menschlichen embryonalen Stammzellen“ (des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie und des Gesundheitsministeriums, Volksrepublik China, 2003) und der Helsinki-Erklärung durchgeführt. Fettgewebeproben wurden mit informierter Einwilligung und ethischer Genehmigung vom ersten angeschlossenen Krankenhaus der Soochow-Universität erhalten. Das Fettgewebe wurde gewaschen und nach Entfernung der Blutgefäße und Bindegewebe unter einem anatomischen Mikroskop in kleine Stücke geschnitten. Die Blöcke wurden mit Typ-I-Kollagenase (0,3 pzu/ml) bei 37 °C für 30 min verdaut, gefolgt von Zentrifugation bei 500 g für 10 min. Der Zellpellet wurde in DMEM + 10 % FBS suspendiert und mit einer Dichte von 8 × 10⁴/cm² ausgesät. Nach 48 h wurde das alte Medium mit schwimmenden Zellen verworfen und durch frisches Medium ersetzt.

HADSCs wurden durch Durchflusszytometrie für Oberflächenmarker charakterisiert, die spezifisch mesenchymale (CD90 und CD105) und hämatopoetische (CD34 und CD45) Stammzellen markieren. Insgesamt 1 × 10⁵ Zellen wurden geerntet und mit entweder PE-, FITC-, APC/Cy7- oder PerCP-konjugierten Antikörpern gegen CD34, CD45, CD90 und CD105 menschliche monoklonale Mausantikörper und entsprechende Isotypkontrollen inkubiert. Gefärbte Zellen wurden mit einem Durchflusszytometer (LSRFortessa, BD, USA) analysiert, und die Daten wurden mit FlowJo-Software ausgewertet. Vier Phänotypen CD90+, CD105+, CD34− und CD45− wurden für die Oberflächenmarker der HADSCs ausgewählt. Expressionsniveaus von Zelloberflächenmarkern wurden durch Durchflusszytometrie (BD LSRFortessa) identifiziert.

Die adipogene und osteogene Differenzierung der HADSCs wurde durch Oil Red O- und Alizarin-Rot-Färbung bewertet. HADSCs wurden entweder mit MesenCultTM adipogenem Differenzierungsmedium (Stem cell Tech., 05412) oder OriCellTM osteogenem Differenzierungskit (Cyagen, HUXMA-90021) kultiviert. Für die adipogene Differenzierung der HADSCs wurden die Zellen am Tag 14 durch qualitative Oil Red O-Färbung auf lipidgefüllte reife Adipozyten bewertet (VivaCell Biosciences, C37A00150). Für die osteogene Differenzierung der HADSCs wurden die Zellen am Tag 21 durch Alizarin-Rot-Färbung auf Kalziumnodulen in reifen Osteozyten bewertet (VivaCell Biosciences, C37C00150). Bilder wurden mit einem invertierten Nexcope-Mikroskop aufgenommen.

In-vitro-Zellaufnahme von USPIO-PAA/PEG und Biokompatibilitätsbewertung

HADSCs wurden in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 1 × 10⁶ pro Well ausgesät. Zellen wurden 2 h lang mit Medium inkubiert, das USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/ml und 0,1 μg/ml) enthielt, und mit Preußisch-Blau (PB)-Färbung für intrazelluläre Fe-Identifikation gefärbt.

Die Biokompatibilität von USPIO-PAA/PEG wurde durch MTT-Kolorimetrie und 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin (EdU)-Inkorporationsassay (EdU-Proliferationskit, Thermo) bestimmt. Für MTT wurden HADSCs in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 5 × 10³ pro Well ausgesät und 24 h, 48 h oder 72 h mit verschiedenen Konzentrationen (0, 10, 20, 40, 80, 160 Fe μg/ml) von USPIO-PAA/PEG inkubiert. 20 μl MTT-Lösung (5 mg/ml) wurden jedem Well für 4 h zugesetzt, gefolgt von 150 μl Dimethylsulfoxid zum Auflösen der Kristalle. Der Absorptionswert jedes Wells wurde bei OD 570 nm mit einem Enzymmarkierungsgerät (BioTek Synergy HT) gemessen. Für den EdU-Assay wurden HADSCs mit SPIO-PAA/PEG bei 160 Fe μg/ml für 72 h inkubiert, gefolgt von der Inkubation mit 10 μM EdU für 24 h. Zellen wurden gesammelt, mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit 2 mg/ml Glycin neutralisiert. Nach Permeabilisierung wurden die Zellen mit der Farblösung (Azid-647-Komplex) inkubiert, und die EdU-Inkorporationsraten wurden durch Durchflusszytometrie bewertet.

6-OHDA-induziertes PD-Modell

15–20 männliche Wistar-Ratten (SPF-Grad, Gewicht 220 ± 20 g) wurden für die in-vivo-Nachverfolgung von USPIO-PAA/PEG-markierten HADSCs an PD-Tieren verwendet. Alle Verfahren wurden gemäß den Vorschriften in China (Verwaltungsvorschriften für Angelegenheiten betreffend Versuchstiere, 2017) durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Chinesischen Akademie der Wissenschaften genehmigt. Währenddessen wurden die Tiere unter kontrollierter Beleuchtung (12/12-h Licht/Dunkel-Zyklus, „an“ um 7 Uhr morgens) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Das PD-Modell wurde durch 2-Punkt-Injektion von 6-Hydroxydopamin (6-OHDA, Sigma, St. Louis, MO, USA) in den unilateralen Striatum der Ratten hergestellt. Wie zuvor beschrieben [25, 26], wurden Ratten stereotaktisch mit 3 μl 6-OHDA-Lösung (5 μg/μl) an 2 Koordinaten injiziert (AP: 1,2 mm, ML: 2,2 mm, DV: −4,0 bis 6,0 mm; und AP: −1,0 mm, ML: 4,4 mm, DV: −4,5 bis 6,5 mm). Apomorphin-induzierte Rotation (0,5 mg/kg, subkutan) Tests wurden verwendet, um die Validität der PD-Modelle zu testen. Die Ratten wurden in der 1., 2. und 3. Woche nach 6-OHDA-Behandlung subkutan mit Apomorphin (0,5 mg/kg) injiziert, und die Rotationswerte wurden 30 min in einem offenen Feld bewertet. Das PD-Modell mit mehr als 7 Rotationen pro Minute, induziert durch Apomorphin, wurde als erfolgreich betrachtet.

Zelltransplantation und In-vivo-MRT-Bildgebung

HADSCs wurden 2 h lang mit USPIO-PAA/PEG (Eisenkonzentration 10 μg/ml) inkubiert, als sie 80 % Konfluenz erreichten. 3 Wochen nach PD-Modellherstellung wurden 3 × 10⁶ USPIO-PAA/PEG-markierte HADSCs oder Kochsalzlösung in den linken Striatum von PD-Rattenmodellen an der folgenden Koordinate injiziert (AP: 1,2 mm, ML: 2,2 mm, DV: −4,0 bis 6,0 mm). Tiere, die Transplantation erhielten, wurden sofort nach der Operation und für 2 Tage danach mit Buprenorphin (0,5 mg/kg) verabreicht. Diese Tiere wurden 1, 2 oder 3 Wochen nach der Transplantationsoperation Apomorphin-induzierten Rotationstests unterzogen.

Für die in-vivo-MRT wurden Tiere mit einem In-vivo-Imaging-System (IVIS) Kleintier-Imaging-System (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) am 3., 9., 15. und 21. Tag nach der Kochsalzlösungs- oder HADSCs-Injektion abgebildet.

Histologische Analyse

Die Gehirne der verbleibenden Rattenmodelle wurden entnommen und in 30 μm Dicke geschnitten für die Analyse 3 Wochen nach Stammzelltransplantation (n = 5 pro Gruppe). Schnitte wurden mit Anti-Tyrosinhydroxylase (TH, abcam, England) inkubiert und mit Alexa-594-konjugiertem Esel-Anti-Kaninchen-Antikörper (Abcam) visualisiert. DAPI wurde für die Gegenfärbung der Kerne verwendet. Bilder wurden mit einem Leica TCS SP5 Konfokalmikroskop aufgenommen.

Statistische Analyse

Numerische Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Daten wurden 2-seitigen Student-t-Tests oder einseitigen ANOVA mit GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) unterzogen, um den Unterschied zu bewerten. * bedeutet p < 0,05 und NS bedeutet keinen signifikanten Unterschied.

Ergebnisse

Synthese und Charakterisierung der Nanopartikel

Das Experimentdesign ist in Abb. 1 dargestellt. Die hydrophoben USPIO-NPs wurden durch thermische Zersetzung hergestellt. Wie in Abb. 2a–c gezeigt, betrug der Durchmesser der ursprünglichen USPIO-NPs 4,07 ± 0,57 nm; durch Beschichtung mit PAA stieg der Durchmesser der USPIO-PAA-NPs auf 6,34 ± 0,54 nm; eine weitere Modifikation der NPs mit PEG ließ den Durchmesser der USPIO-PAA/PEG-NPs auf 10,07 ± 0,55 nm ansteigen. Alle drei Nanopartikel waren kugelförmig und gleichmäßig dispers. Statistische Analyse zeigte signifikante Unterschiede (F = 10, **p < 0,01, ##p < 0,01) zwischen den Durchmessern der USPIO, USPIO-PAA und USPIO-PAA/PEG-NPs, was eine erfolgreiche Modifikation mit PAA und PEG anzeigt (Abb. 2d).

Mithilfe der Infrarotabsorptionsmethode fanden wir, dass USPIO-PAA einen offensichtlichen Carbonyl-Absorptionspeak bei 1728 cm⁻¹ aufgrund der Carbonyl-Streckschwingung im PAA-Molekül aufweist; USPIO-PAA/PEG zeigt eine Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung in-plane-Biegeschwingung bei 1595 cm⁻¹ und eine Streckschwingung der Hydroxylgruppe bei 3440 cm⁻¹ (Abb. 2e). All diese Daten bestätigten weiter, dass PAA- oder PEG-Moleküle erfolgreich an die Oberfläche der NPs modifiziert wurden.

USPIO-PAA/PEG zeigten gute in-vitro-Magnetantwort und Biokompatibilität mit HADSC

Die in-vitro-Bildgebungsfähigkeit von USPIO-PAA und USPIO-PAA/PEG wurde durch die Grauwerte der MRT-Bilder bei verschiedenen Konzentrationen (entsprechend Fe-Konzentrationen) bewertet. Nach Anpassung wurden die transversalen Relaxationszeitwerte der Dispersionen bei verschiedenen Konzentrationen erhalten. Durch Festlegung der transversalen Relaxationsrate 1/T2 als vertikale Koordinate und der Fe-Konzentration als horizontale Koordinate wurde die transversale Relaxationsrate von USPIO-PAA als 107,94 s⁻¹ mM⁻¹ berechnet (Abb. 3a), und 84,65 s⁻¹ mM⁻¹ für USPIO-PAA/PEG (Abb. 3b). Beide Partikel zeigten gute MRT-Bildgebungseigenschaften. Die magnetischen Hysterese-Schleifen von SPIO-PAA und SPIO-PAA/PEG zeigten, dass der Sättigungsmagnetisierungswert von SPIO-PAA über 10.000 Oe bei 57 emu/g liegt (Abb. 3c), und der von SPIO-PAA/PEG bei 40 emu/g über 10.000 Oe (Abb. 3d). Die Koerzitivfeldstärke und Remanenz waren nahe null (Abb. 3c, d), was weiterhin anzeigt, dass sowohl SPIO-PAA als auch SPIO-PAA/PEG superparamagnetisch sind.

Durch Inkubation der USPIO-PAA/PEG-NPs mit HADSCs für verschiedene Zeiten fanden wir, dass USPIO-PAA/PEG-NPs keine signifikanten Auswirkungen auf das Überleben der Zellen haben (p > 0,05). Die Zellvitalität der HADSCs bleibt über 96 %, wenn die äquivalente Fe-Konzentration von 0 bis 160 μg/ml reicht. Zudem induziert die Verlängerung der Inkubationszeit (von 24 auf 72 h) keinen signifikanten Zellverlust bei jeder Fe-Konzentration (Abb. 4a). Eine ähnliche Beobachtung wurde gemacht, als USPIO-PAA/PEG-NPs mit iPSCs bei verschiedenen Konzentrationen inkubiert wurden (Abb. 4b). Selbst wenn HADSCs mit 160 μg Fe/ml USPIO-PAA/PEG für 72 h behandelt wurden, wurde die Proliferationsfähigkeit, angezeigt durch die EdU-Inkorporationsraten, durch die Präsenz von USPIO-PAA/PEG nicht beeinträchtigt (Abb. 4c). All diese Daten wiesen auf die Biosicherheit der synthetisierten USPIO-PAA/PEG-NPs hin.

Um zu identifizieren, ob Zellen effektiv durch USPIO-PAA/PEG-NPs markiert werden können, inkubierten wir HADSCs mit USPIO-PAA/PEG-NPs bei äquivalentem Fe 10 μg/ml oder 0,1 μg/ml für 2 h. Wie in Abb. 4d gezeigt, wurde eine große Anzahl von NPs, die blau gefärbt waren, in fast 100 % der HADSCs in Gegenwart von USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/ml) beobachtet. Selbst bei Reduzierung der Dosis von USPIO-PAA/PEG auf 0,1 μg Fe/ml beobachteten wir immer noch eher gleichmäßige und dispersierte PB-Färbung in fast allen HADSCs. Im Vergleich zu einigen anderen berichteten SPIOs [14, 27, 28] zeigten USPIO-PAA/PEG eine hohe Zellaufnahmeeffizienz.

Langzeit-Tracking von USPIO-PAA/PEG-NPs-markierten HADSCs in PD-Rattenmodellen

HADSCs, markiert mit USPIO-PAA/PEG-NPs, wurden durch stereotaktische Injektion in den linken Striatum von PD-Rattenmodellen transplantiert. Wie in Abb. 5 gezeigt, beobachteten wir ein klares MRT-Signal im linken Striatum 3 Tage nach der HADSC-Transplantation, was eine ordnungsgemäße in-vivo-Nachverfolgung der transplantierten Zellen anzeigte. Eine dynamische Beobachtung an D3, D9, D15 und D21 nach der Transplantation zeigte, dass die transplantierten Zellen mit NP-Markierung bis zu 3 Wochen klar nachverfolgt werden konnten, und die MRT-Signale zeigten während des Prozesses keine offensichtliche Reduktion. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die synthetisierten Nanopartikel gutes Potenzial für die in-vivo-Nachverfolgung transplantierter Zellen haben.

USPIO-PAA/PEG-NPs-markierte HADSCs zeigten therapeutische Effekte im PD-Modell

Um zu bewerten, ob NPs-markierte HADSCs therapeutische Effekte aufwiesen, führten wir zunächst eine phänotypische Charakterisierung der isolierten HADSCs durch. Wie in Abb. 6a gezeigt, waren die kultivierten HADSCs spindelförmige Zellen. Die Durchflusszytometrie-Analyse zeigte, dass die HADSCs Marker für mesenchymale Zellen wie CD90 (> 99 %) und CD105 (> 99 %) hoch exprimierten, während nur wenige von ihnen hämatopoetische Marker wie CD34 und CD45 exprimierten (Abb. 6b–g). Die HADSCs konnten unter bestimmten Bedingungen entweder in adipogene oder osteogene Linien differenzieren, und die Differenzierungskapazität wurde durch Oil Red O- bzw. Alizarin-Rot-Färbung gezeigt (Abb. 5h). Beachten Sie die Lipidtröpfchen oder verkalkten Nodulen in den differenzierten HADSCs, während keine solchen Strukturen in den Kontroll-HEK293-Zellen vorhanden waren (Abb. 6h). All dies deutet darauf hin, dass HADSCs die Kriterien mesenchymaler Zellen erfüllen.

Die Apomorphin-induzierten Rotationen betrugen 17,1 ± 1,79, 28,7 ± 1,77 und 31,86 ± 1,72 pro Minute in der 1., 2. und 3. Woche nach 6-OHDA-Injektion, was die erfolgreiche Etablierung des Ratten-PD-Modells bestätigte. Wie in Abb. 7 gezeigt, reduzierten sich die Rotationszahlen der PD-Rattenmodelle auf 32,59 ± 1,12, 31,85 ± 1,98 und 31,54 ± 1,73 in der 1., 2. und 3. Woche nach der Transplantation von NPs-markierten HADSCs in den Striatum der Läsionsseite. Statistische Analyse ergab einen signifikanten Unterschied zwischen der Kochsalzlösungs- und der HADSC-verabreichten Gruppe ab der 2. Woche nach Transplantationsoperation (p < 0,01 in der 2. Woche, p < 0,01 in der 3. Woche; n = 5 in jeder Gruppe), was anzeigt, dass die NPs-markierten HADSCs die Verhaltensbeeinträchtigungen in den PD-Modellen verbessern.

PD ist durch den Verlust von Neuronen gekennzeichnet, die Tyrosinhydroxylase (TH) in der Substantia nigra exprimieren. Durch Immunfärbung gegen TH fanden wir, dass 6-OHDA die TH-exprimierenden Neuronen in der Substantia nigra reduziert, und die Transplantation mit HADSCs im Striatum von PD-Rattenmodellen konnte diese Reduktion lindern (Abb. 8). In Kombination mit der Beobachtung, dass Zelltransplantation die Verhaltensbeeinträchtigungen von PD-Ratten lindert, schlossen wir, dass USPIO-PAA/PEG-NPs-markierte HADSCs therapeutische Effekte in PD-Rattenmodellen ausüben.

Diskussion

Zelltherapie ist eine vielversprechende Strategie für die Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen und steht seit den letzten 20 Jahren an der Spitze der präklinischen Forschung [29, 30]. Das Tracking der transplantierten Zellen ist ein unverzichtbarer Teil für die Klärung der zugrunde liegenden Mechanismen sowie die Bewertung klinischer Effekte; es ist jedoch herausfordernd und behindert in gewissem Maße die Anwendung der Zelltherapie [31, 32]. Computertomographie (CT), Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung (NIFI) und MRT sind die am häufigsten verwendeten Methoden für die in-vivo-Nachverfolgung transplantierter Zellen [31, 32]. Im Vergleich zur eher hohen Strahlung von CT und der geringen Sensitivität von NIFI zeigt MRT eine gute Bildgebung von Tiefengewebe, hohen Kontrast und geringe ionisierende Strahlung, was es zu einem guten Kandidaten für die in-vivo-Nachverfolgung macht [33,34,35,36]. Die Entwicklung geeigneter Tracer für MRT wird daher zu einem unverzichtbaren Teil der Förderung der Anwendung von Zelltherapie.

SPIO ist eine einfache und zuverlässige Markierungsstrategie für MRT-Visualisierung. Um langfristige in-vivo-Nachverfolgung transplantierter Zellen zu erreichen, müssen die SPIO-Partikel eine einheitliche und ultrasmall Größe haben, da große Partikel zu einer ungleichmäßigen Verteilung der Tracer führen und die normale Blutzirkulation beeinträchtigen können [33]. Zudem sind die Internalisierungseffizienz und Biokompatibilität von Nanopartikeln ein weiterer wichtiger Index zur Bewertung der Tracer. Nanopartikel gelangen üblicherweise durch Flüssigphasen-Endozytose [37], rezeptorvermittelte Endozytose [38] und Phagozytose [39] in Zellen. Um eine bessere zelluläre Aufnahme zu erreichen, werden SPIO-Partikel üblicherweise mit intermediären Liganden modifiziert [18, 40, 41].

Neben Zelltracking wurde SPIO auch für Drug Delivery [42] angewendet. Die Gewebeverteilung und pharmakokinetische Clearance sind wichtige Indizes für beide Anwendungen. Im Vergleich zu NPs-PAA zeigten NPs-PAA/PEG längere Verweilzeit im Blut und langsamere renale Clearance [43]. Dicht mit PEG beschichtete NPs sorgen für viel gleichmäßigere Verteilung über mukosale Epitheloberflächen, einschließlich des gastrointestinalen Trakts [44], des respiratorischen Systems [45, 46] und von Hirntumoren [42] usw. Zudem reduziert PEG-Beschichtung die Anheftung von Proteinen und die Bildung von Korona, was wiederum eine gleichmäßigere Verteilung der NPs fördern könnte, auf Kosten reduzierter Aufnahme [47]. Als potenziell gutes diagnostisches und therapeutisches Werkzeug wurde die Markierungskapazität von SPIO-PAA/PEG für MSCs und deren weitere Anwendung bei Hirnerkrankungen wie PD nicht gut untersucht, und die vorliegende Studie wurde konzipiert, um diese Frage zu beantworten. In der vorliegenden Studie synthetisierten wir neuartige ultrasmall USPIO-PAA/PEG-Nanopartikel, indem wir die SPIO-Kerne mit PAA- und PEG-Liganden modifizierten. Die USPIO-PAA/PEG-NPs weisen einen einheitlichen ultrasmall Durchmesser (10,07 ± 0,55 nm), gute Dispersion in wässriger Lösung, Biokompatibilität mit verschiedenen Zelltypen sowie gute magnetische Reaktionsfähigkeit in vitro und in vivo auf. Wichtig ist, dass die Signale der markierten HADSCs nach Hirntransplantation bis zu drei Wochen unter MRT klar detektiert werden konnten, was das gute Potenzial für klinische Anwendung anzeigt.

PD ist durch einen fortschreitenden Verlust dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra und einen Mangel an dopaminergen Niveaus in den dopaminergen Netzwerken gekennzeichnet [1]; der am stärksten betroffene ist der nigrostriatale Pfad einschließlich des Striatums. In der vorliegenden Studie transplantierten wir USPIO-PAA/PEG-markierte HADSCs in den Striatum von PD-Rattenmodellen und fanden, dass eine solche Transplantation die Verhaltensbeeinträchtigungen verbesserte; zudem dämpfte sie den Verlust dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra in gewissem Maße ab. Ähnlich berichtete Ardeshir et al., dass die Transplantation von MSCs, die aus Rattenfettgewebe stammen, Apomorphin-induzierte Rotationen in PD-Modellen abschwächte [48]. Anders als die Transplantation von fötalem Mittelhirngewebe [49] oder dopaminergen neuralen Progenitoren [50] üben HADSCs ihre therapeutischen Effekte hauptsächlich durch parakrine Effekte [51, 52] aus, anstatt das geschädigte Gewebe zu ersetzen. Studien haben gezeigt, dass MSCs als Förderer von Immunmodulation, Neuroprotektion und neuronaler Differenzierung wirken, und diese Effekte werden im Wesentlichen durch das von MSCs freigesetzte Sekretom vermittelt [6, 7, 51]. Unser Ergebnis stimmt mit diesen Beobachtungen überein; zudem zeigt es, dass die neuartigen USPIO-PAA/PEG-Tracer die neuroprotektiven Effekte von HADSCs nicht beeinträchtigten.

Schlussfolgerungen

Wir haben neuartige USPIO-PAA/PEG-Tracer entwickelt, die hohe Zellaufnahmeeffizienz, ausgezeichnete Biokompatibilität und langfristige MRT-Nachverfolgungskapazitäten aufweisen. Die mit USPIO-PAA/PEG markierten HADSCs konnten 3 Wochen nach Zelltransplantation per MRT nachverfolgt werden. Zudem schwächten die markierten HADSCs die Verhaltensbeeinträchtigungen der PD-Modelle signifikant ab und erhöhten die Anzahl der dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra. Die Entwicklung von USPIO-PAA/PEG-Tracern könnte ein vielversprechendes Werkzeug in der Stammzellforschung und -anwendung bieten.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels stützen, sind im Artikel enthalten.

Abkürzungen

SPIO:

Kleine superparamagnetische Eisenoxid

USPIO:

Ultrasmall superparamagnetische Eisenoxid

PAA:

Polyacrylsäure

PEG:

Methoxypolyethylenglykolamin

HADSCs:

Humane adipöse Stammzellen

USPIO-PAA/PEG:

Ultrasmall superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel, beschichtet mit Polyacrylsäure und Methoxypolyethylenglykolamin

6-OHDA:

6-Hydroxydopamin

CT:

Computertomographie

NIFI:

Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung

MRI:

Magnetresonanztomographie

TH:

Tyrosinhydroxylase

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop