Icariin-beladene mPEG-Nanopartikel: Verbesserter Schutz vor LPS-induzierter Kardiotoxizität in H9c2-Zellen

Abstract

Icariin (ICA), ein Flavonolglykosid aus Epimedium, zeigt kardioprotektive, antioxidative und entzündungshemmende Eigenschaften, leidet aber unter schlechter Wasserlöslichkeit, rascher Clearance und niedriger oraler Bioverfügbarkeit. Wir synthetisierten ein hydrophiles Polyethylenglycol-monomethylether (mPEG) Konjugat (mPEG-ICA) über Succinsäureanhydrid-vermittelte Veresterung und verkapselten freies ICA durch Dialyse in das Polymer, um ICA-beladene mPEG-ICA-Nanopartikel (NPs) zu bilden. Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FT-IR) und Protonen-Kernresonanzspektroskopie (¹H-NMR) bestätigten die erfolgreiche Konjugation. Dynamische Lichtstreuung (DLS) ergab einen durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser von 220 ± 13,7 nm mit ζ-Potenzial von +2,30 ± 1,33 mV, während Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) eine gleichmäßige, kugelförmige Morphologie zeigte. In Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei pH 7,4 setzten die Nanopartikel 52,8 ± 1,7 % ICA über 72 h frei; bei pH 6,8 beschleunigte sich die Freisetzung auf 75,7 ± 0,2 % innerhalb von 48 h. In vitro bewahrten die NPs die H9c2-Zellviabilität, reduzierten Lactatdehydrogenase (LDH)-Leckage und hemmten Apoptose, induziert durch Lipopolysaccharid (LPS). Zudem wurden mRNA-Level der proinflammatorischen Zytokine TNF-α, IL-1β und IL-6 deutlich unterdrückt. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass ICA-beladene mPEG-ICA-NPs eine vielversprechende Nanomedizin-Plattform zur Milderung LPS-vermittelter myokardialer Verletzung darstellen.

Einleitung

Herzremodellierung nach myokardialer Verletzung wird weitgehend durch anhaltende entzündliche Signalwege getrieben, insbesondere durch TNF-α, IL-1β, IL-6 und IL-18. Diese Zytokine lösen oxidativen Stress, Fibroblastenaktivierung und Kardiomyozytenapoptose aus, was letztlich die Herzfunktion beeinträchtigt. Icariin (C₃₃H₄₀O₁₅) wurde ausführlich für immunmodulatorische, antioxidative und anti-apoptotische Effekte in präklinischen Modellen berichtet, doch sein therapeutisches Potenzial wird durch Hydrophobie, rasche systemische Clearance und schlechte orale Absorption limitiert. Nanoträgersysteme – wie Mizellen, Liposomen, polymere Nanopartikel – haben sich als effektive Strategien erwiesen, um Arzneimittellöslichkeit zu verbessern, Zirkulationszeit zu verlängern und gezielte Lieferung in entzündetes Herzgewebe zu erreichen, indem der Enhanced Permeability and Retention (EPR)-Effekt genutzt wird.

Polyethylenglycol-monomethylether (mPEG) bietet überlegene Hydrophilie, Biokompatibilität und minimale Immunogenität im Vergleich zu linearem PEG. Durch kovalente Bindung von ICA an mPEG-COOH über eine Esterbindung schaffen wir ein hydrophiles-hydrophobes Amphiphil, das sich selbst in Nanopartikel zusammenlagert. Die Esterbindung ist säurelabil, was pH-responsive Freisetzung von ICA im leicht sauren Mikromilieu (pH ≈ 6,8) entzündeten Myokards ermöglicht. Diese Studie beschreibt die Synthese von mPEG-ICA, Einkapselung von ICA in Nanopartikel, physikochemische Charakterisierung, in-vitro-Freisetzungsprofile und Evaluation der kardioprotektiven Wirksamkeit gegen LPS-induzierte Schädigung in H9c2-Zellen.

Materialien und Methoden

Experimentelle Geräte

Wesentliche Analysegeräte: JA302 Elektronenwaage, RE52CS-1 Rotationsverdampfer, 78HW-1 Magnetrührer, 101-OA Trockenschrank, NEXUS670 FT-IR-Spektrometer, UV-Vis-Spektrophotometer, TEM Glacios, JP-010S Ultraschall-Dispergierer, Echtzeit-qPCR-System, Enzym-gekoppelter Fluoreszenzanalysator, Olympus-Inversmikroskop, Leica-Fluoreszenzmikroskop, Thermo CO₂-Inkubator.

Experimentelle Reagenzien

Analytische Reagenzien von kommerziellen Lieferanten: Icariin (95 %, 1 g, DL070208), LPS (55 mg, Sigma, Z06J9Y52452), mPEG-Me (250 g, Sigma, MKBT7172), Dichlormethan (500 ml, Sinopharm), 4-Dimethylaminopyridin (100 g, Aladdin), N-Hydroxysuccinimid (100 g, Ruiyong), FastKing cDNA-Synthesekit (Tiangen), Biyuntian Apoptosekit, SYBR Green qPCR-Kit (QIAGEN), u. a.

Synthese von mPEG-COOH

mPEG (5 g), Succinsäureanhydrid (0,40 g) und DMAP (0,50 g) reagierten in 50 ml Dichlormethan bei 60 °C für 2 h unter Reflux. Das Gemisch wurde eingedampft, der resultierende weiße Feststoff durch Dialyse (2 kDa MWCO) gegen Wasser 48 h gereinigt. Gefriertrocknung ergab mPEG-COOH.

Synthese von mPEG-ICA-Polymer

mPEG-COOH (0,37 g) wurde mit NHS (0,024 g) und DMAP (0,026 g) in 10 ml trockenem DMSO aktiviert, dann mit 100 mg ICA (in 5 ml trockenem DMSO gelöst) unter Stickstoff bei Raumtemperatur 48 h reagiert. Nach ausgiebiger Dialyse gegen Wasser und Gefriertrocknung wurde mPEG-ICA-Polymer erhalten.

Herstellung von ICA-beladenen mPEG-ICA-Nanopartikeln (NPs)

mPEG-ICA (5 mg) wurde in 2 ml DMSO gelöst und mit 5 mg ICA in DMSO gemischt, gefolgt von Zugabe von 5 ml destilliertem Wasser. Nach 15 min Rühren bei Raumtemperatur wurde die Mischung dialysiert (3500 Da MWCO) 24 h mit häufigem Wasserwechsel, dann filtriert, um ICA-beladene mPEG-ICA-NPs zu erhalten.

Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie

Proben wurden mit KBr gemischt, zu Pellets gepresst und von 4000 bis 400 cm⁻¹ gescannt, um Funktionsgruppentransformationen zu bestätigen.

Kernresonanzspektroskopie (¹H-NMR)

Proben wurden in DMSO-d₆ gelöst und an einem 500 MHz NMR-Spektrometer analysiert, um chemische Verschiebungen konsistent mit Veresterung zu bestätigen.

UV-Vis-Spektrum

Eine Kalibrationskurve von ICA bei 270 nm wurde erstellt; Konzentrationen von Polymer und Nanopartikeln wurden mittels dieser Kurve quantifiziert.

Charakterisierung der ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs

Dynamische Lichtstreuung

Partikelgrößenverteilung und ζ-Potenzial wurden mit einem Zetasizer 3000hs nach Lyophilisierung und Wiederauflösung in Wasser gemessen; jede Probe wurde in Triplicate analysiert.

Morphologiebeobachtung per TEM

1,0 mg/ml NP-Suspension wurde auf kohlenstoffbeschichtete Kupfergrids aufgebracht, mit 2 % Phosphortungstsäure gefärbt und bei 80 kV abgebildet.

Stabilitätsmessung

NPs wurden mit 5 % Mannitol gefriertrocknet, in Wasser redispergiert und Größe/PDI überwacht, um Lagerstabilität zu bewerten.

Bestimmung von Arzneimittelbeladung und Einkapselungseffizienz

Arzneimittelbeladung (EE %) und Einkapselungseffizienz (LC %) wurden aus UV-Vis-Absorption mittels Formeln berechnet: EE = Arzneimassenmasse in NPs / Gesamtmasse NPs × 100 %; LC = Arzneimassenmasse in NPs / initiale Arzneimassenmasse × 100 %.

In-vitro-Freisetzung

NPs wurden in 25 ml PBS (pH 7,4 oder 6,8) bei 37 °C mit 100 rpm Rühren inkubiert. Proben (2 ml) wurden zu definierten Intervallen entnommen, mit frischem Medium ersetzt und per UV-Vis bei 270 nm analysiert. Kumulative Freisetzung (%) wurde mittels Standardgleichung berechnet.

Zellexperimente

H9c2 Ratten-Kardiomyoblasten wurden in DMEM + 10 % FBS bei 37 °C/5 % CO₂ kultiviert. Zellen wurden in 96-Well-Platten (10⁴ Zellen/Well) für Viabilität, LDH, Apoptose und qPCR-Assays ausgesät.

Zellbehandlung mit LPS oder ICA-Nanopartikeln

Zellen wurden in fünf Gruppen unterteilt: (1) Kontrolle (keine Behandlung), (2) LPS (10 µg/ml) 24 h, (3) ICA (20 µM) + LPS, (4) mPEG-ICA-Polymer (20 µM) + LPS, (5) ICA-beladene mPEG-ICA-NPs (20 µM) + LPS.

MTT-Test

Nach 24 h Behandlung wurde 0,5 mg/ml MTT für 4 h zugegeben. Formazan wurde in DMSO gelöst und Absorption bei 570 nm gemessen.

Lactatdehydrogenase (LDH)-Freisetzung

LDH-Aktivität in Zellkulturüberständen wurde mit einem kommerziellen Kit quantifiziert; Absorption bei 490 nm.

Hoechst 33342-Färbung

Kernmorphologie wurde nach 15 min Färbung mit Hoechst 33342 (1 µg/ml) unter Fluoreszenzmikroskop untersucht. Apoptoseindex = apoptotische Kerne / Gesamtkerne × 100 %.

TUNEL-Assay

DNS-Fragmentierung wurde mit TUNEL-Kit detektiert; apoptotische Kerne als grüne Fluoreszenz relativ zu gesamten DAPI-gefärbten Kernen gezählt.

Durchflusszytometrie zur Apoptose-Detektion

Annexin V-FITC/PI-Doppelfärbung wurde durchgeführt; frühe und späte apoptotische Populationen per Durchflusszytometrie quantifiziert.

Reverse-Transkription quantitative PCR (RT-qPCR)

RNA wurde mit TRIzol extrahiert, revers transkribiert und auf Bio-Rad CFX96 mit SYBR Green amplifiziert. Genexpression von TNF-α, IL-1β, IL-6 und Aktin (Housekeeping) wurde auf Aktin normiert. Primersequenzen sind im Originalmanuskript aufgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

FTIR und ¹H-NMR Spektren

FT-IR-Spektren zeigten charakteristische Ester-Carbonyl-Absorptionen bei 1700 und 1740 cm⁻¹, was erfolgreiche Konjugation bestätigt. ¹H-NMR zeigte phenolische Hydroxylsignale bei 12,6 ppm, aromatische Protonen bei 7,5 ppm und Methylenprotonen der PEG-Kette bei 3,5 ppm, was das Vorhandensein sowohl von ICA- als auch mPEG-Moieties bestätigt.

FTIR-Spektren von mPEG-ICA (A), ICA (B), mPEG-COOH (C). ¹H-NMR-Spektren für mPEG-COOH und mPEG-ICA.

Partikelgröße, Zeta-Potenzial und TEM

Kernpolymer-NPs wiesen durchschnittlich 145 ± 15,2 nm (PDI = 0,277) auf, während ICA-beladene NPs auf 220 ± 13,7 nm (PDI = 0,119) expandierten. Zeta-Potenziale verschoben sich von +0,44 ± 0,26 mV auf +2,30 ± 1,33 mV bei Beladung, was verbesserte kolloidale Stabilität anzeigt. TEM-Bilder bestätigten kugelförmige, uniforme Morphologie (Abb. 2).

Partikelgröße, Zeta-Potenzial und TEM von ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs.

Arzneimittelbeladung und Einkapselungseffizienz

UV-Vis-Analyse ergab Arzneimittelbeladung von 21,9 ± 0,013 % und Einkapselungseffizienz von 54,9 ± 0,032 % für ICA-beladene NPs, überlegen gegenüber Polymer-nur-NPs (Beladung = 16,5 %; EE = 41,3 %). Diese Werte entsprechen der gewünschten therapeutischen Nutzlast.

Stabilitätsbestimmung

Nach Gefriertrocknung mit 5 % Mannitol zeigten redispergierte NPs eine moderate Größenvergrößerung auf 255 nm (PDI = 0,326), behielten aber akzeptable Uniformität, was Lagerstabilität bestätigt (Abb. 3).

Stabilität von ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs.

In-vitro-Freisetzung von mPEG-ICA-ICA

In pH 7,4 PBS setzte freies ICA 77,2 % innerhalb 12 h frei, während mPEG-ICA-NPs 44,1 % über 72 h freisetzten. ICA-beladene NPs setzten 52,8 % über 72 h bei neutralem pH und 75,7 % innerhalb 48 h bei pH 6,8 frei, was pH-responsive beschleunigte Freisetzung reflektiert (Abb. 4).

A ICA-Freisetzung aus ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs in PBS pH 7,4. B Freisetzung bei pH 7,4 vs pH 6,8.

H9c2-Zellviabilität und Lactatdehydrogenase-Freisetzung

MTT-Assays zeigten keine Zytotoxizität von ICA, mPEG-ICA oder ICA-beladenen NPs bei 20 µM. Nach LPS-Exposition fiel die Viabilität auf 50,0 % (Kontrolle = 100 %). Behandlung mit ICA, mPEG-ICA und ICA-beladenen NPs stellte Viabilität auf 55,9 %, 61,0 % bzw. 65,4 % wieder her (p < 0,05) (Abb. 5, 6).

Evaluation der Zytotoxizität von ICA-Nanopartikeln an H9c2-Zellen.

Effekt von ICA-Nanopartikeln auf LPS-induzierte H9c2-Zellschädigung.

LDH-Assays zeigten signifikanten Anstieg enzymatischer Leckage nach LPS-Behandlung; ICA, mPEG-ICA und ICA-beladene NPs reduzierten LDH-Freisetzung markant, mit stärkstem Effekt für ICA-beladene NPs (Abb. 7).

Effekt von ICA-Nanopartikeln auf LDH-Level durch LPS in H9c2-Zellen.

Zellapoptose induziert durch LPS

Hoechst 33342-Färbung zeigte Chromatinkondensation und -fragmentierung in LPS-behandelten Zellen; ICA-beladene NPs attenuierten apoptotische Morphologie signifikant (Abb. 8). TUNEL-Assay quantifizierte Apoptoseraten: LPS induzierte 47,6 % Apoptose, reduziert auf 35,5 % (ICA), 26,5 % (mPEG-ICA), 17,9 % (ICA-beladene NPs). Durchflusszytometrie bestätigte dies: Gesamtapoptose 35,9 % bei LPS vs 16,7 % (ICA-beladene NPs) und 19,2 % (mPEG-ICA) (Abb. 9–10).

Apoptose-Detektion durch Hoechst 33342-Färbung.

Apoptose-Detektion durch TUNEL.

Apoptoserate detektiert durch Durchflusszytometrie.

Entzündungszytokin-mRNA in LPS-induzierten H9c2-Zellen

RT-qPCR zeigte, dass LPS TNF-α, IL-1β, IL-6-Transkripte markant erhöhte. Behandlung mit ICA, mPEG-ICA und ICA-beladenen NPs unterdrückte diese Zytokine, wobei ICA-beladene NPs die stärkste Down-Regulierung erreichten (Abb. 11).

Effekte von ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs auf IL-1β, TNF-α und IL-6 mRNA-Expression.

Diese Befunde bestätigen, dass ICA-beladene mPEG-ICA-NPs durch gezielte Abgabe von ICA an entzündetes Myokard oxidativen Stress, Apoptose und entzündliche Zytokinproduktion effektiver reduzieren als freies ICA oder Polymer allein.

Fazit

Wir haben erfolgreich ICA-beladene mPEG-ICA-Nanopartikel via hybriden chemisch-physikalischen Ansatz hergestellt, der ICA-Löslichkeit, Beladungskapazität und nachhaltige, pH-responsive Freisetzung markant verbessert. In LPS-geforderten H9c2-Zellen stellten diese NPs Zellviabilität wieder her, attenuierten LDH-Leckage, hemmten Apoptose und unterdrückten proinflammatorische Zytokin-Expression effektiver als freies ICA oder Polymer allein. Die Daten unterstützen das Potenzial von ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs als gezielte Nanomedizin zur Behandlung entzündlicher Herzverletzung.