Herstellung von ICA-beladenen mPEG-ICA-Nanopartikeln und ihre Anwendung bei der Behandlung von LPS-induzierter H9c2-Zellschädigung

Einführung

Die Entzündungsreaktion nimmt am gesamten pathologischen Prozess des ventrikulären Remodellings teil und ist der Hauptgrund für das rationale Remodeling von Herzerkrankungen nach Herzverletzungen [1, 2]. Diese proinflammatorischen Zytokine, zu denen Tumornekrosefaktor (TNF)-a, IL-1β, IL-6 und IL-18 gehören, führen zu einer Myokardschädigung und einem langfristigen pathologischen Umbau [3]. Wenn Kardiomyozyten geschädigt sind, können sie auch DAMPs (injury-related molekulare Modelle) wie HMGBI freisetzen, um Endothelzellen zu aktivieren, um Chemokinrezeptoren zu exprimieren, Entzündungsfaktoren zu erzeugen und Kardiomyozytennekrose oder Apoptose zu induzieren [4, 5]. Darüber hinaus fördert HMGB die Ansammlung von Entzündungszellen wie Makrophagen und Neutrophilen im geschädigten Herzen durch CXCL12/CXCR4, was die Herzbelastung und -verletzung verschlimmert [5]. Daher kann die Blockierung der Aktivierung der Entzündungsreaktion als wirksame Strategie verwendet werden, um den pathologischen Umbau des Herzens zu reduzieren.

Icariin (ICA C₃₃ H₄₀ O₁₅ ) ist eine Liposomenverbindung, die aus der chinesischen Heilpflanze epimedii gewonnen wird [6]. Umfangreiche Studien haben gezeigt, dass ICA als immunregulatorisches, kardioprotektives, antioxidatives, entzündungshemmendes und antiapoptotisches Mittel ermutigend ist [7, 8]. Trotz der positiven Eigenschaften von ICA gibt es verschiedene Faktoren, die seine Anwendung einschränken, darunter eine geringe Wasserlöslichkeit, eine kurze Halbwertszeit und eine geringe orale Bioverfügbarkeit [9]. Nanocarrier haben sich zu einer neuen Strategie entwickelt, um die zielgerichtete Wirksamkeit, die Entzündungshemmung und den Herzschutz zu verbessern; Darüber hinaus können Nanocarrier die Nachteile von ICA überwinden [10, 11].

In letzter Zeit haben sich Forscher auf Wirkstoffabgabesysteme konzentriert [12]. Es wurden verschiedene Nanocarrier entwickelt, wie Micellen [13], Liposomen [14] und Kohlenstoffnanoröhren [15]. Um die Mortalität und Morbidität von Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu reduzieren, ist es dringend erforderlich, eine neue Nanodosierungsform zu entwickeln, die genügend ICA enthält und über zielgerichtete Freisetzungseigenschaften verfügt.

Um die Einschränkungen der ICA-Anwendung zu überwinden, verwendeten wir Polyethylenglycolmonomethylether (mPEG) als Träger [16, 17]. mPEG ist ein Derivat von Polyethylenglykol, das stabile chemische Eigenschaften und eine stärkere Hydrophilie als PEG aufweist [18]. Da die terminale Hydroxylaktivität von mPEG jedoch sehr gering ist, muss mPEG als arzneimittelbeladenes Nanomaterial eine Hydroxylaktivierung durchlaufen. Daher verwendeten wir ICA als hydrophobes Ende und Carboxyl-mPEG, das durch die Veresterung von mPEG und Bernsteinsäureanhydrid gebildet wurde, als hydrophiles Ende für die chemische Verbindung. Die gebildete Esterbindung kann die Spaltung unter sauren Bedingungen beschleunigen.

Nanopartikel haben einzigartige Vorteile bei der Wirkstofffreisetzung von unlöslichen Wirkstoffen [19], polymeren Wirkstoffen [20] und der Gentherapie [21]. Ähnlich wie Tumorgewebe haben myokardiale Entzündungsorte ähnliche Permeabilitäts- und Retentionsfunktionen (EPRs) [22]. Nanopartikel mit einer Größe von ca. 200 nm können die interstitielle Lücke durchdringen, um eine Wirkstoffanreicherung zu erreichen [23]. Die mPEG-ICA-NPs wurden in einem frühen Stadium hergestellt, was ihre Rolle bei der myokardialen Ischämie bestätigte, aber aufgrund der fehlenden ICA-Beladung konnten sie nicht die beste Wirkung erzielen [24]. Daher kann eine neue Art von ICA-beladenen mPEG-ICA-Nanopartikeln, die durch die Kombination von chemischer Synthese und physikalischem Einschluss hergestellt werden, nicht nur die Wasserlöslichkeit und Wirkstoffbeladung von ICA verbessern, sondern auch die verzögerte Freisetzungszeit von Nanopräparaten bei Myokardentzündungen verlängern und effektiv verbessern die Bioverfügbarkeit von Medikamenten, wodurch die beste Wirkung einer gezielten Behandlung von LPS-induzierten H9c2-Zellschäden mit ICA erzielt wird. Wir untersuchten die Freisetzung von ICA aus ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs in PBS-Lösungen mit pH 7,4 und 6,8. Um die Wirkung von mPEG-ICA-Nanopartikeln auf Herzmuskelentzündungen zu untersuchen, verwendeten wir Lipopolysaccharid (LPS), um H9C2-Zellen zu induzieren, um ein externes Entzündungsmodell zu etablieren, wiesen die Zelllebensfähigkeit, Apoptoserate und mRNA-Expression von proinflammatorischen Zytokinen nach und untersuchten dann die pharmakodynamische Wirkung von ICA-beladenen mPEG-ICA-Nanopartikeln im Prozess einer Herzmuskelentzündung.

Materialien und Methoden

Experimentelle Instrumente

Die folgenden wurden verwendet:elektronische Waage JA302 (Shanghai Suzhan Metrology Instrument Co., Ltd.); Rotationsverdampfer RE52CS-1 (Shanghai Yarong biochemische Instrumentenfabrik); Digitalanzeige-Konstanttemperatur-Magnetrührwerk 78HW-1 (Hangzhou Instrument Motor Co., Ltd.); elektrischer Strahltrockner 101-OA (Tianjin Telester Instrument Co., Ltd.); Fourier-Transformations-Infrarotspektrometer NEXUS670 (Neliko Co., Ltd.); UV-Vis-Spektrophotometer (Beijing Leiboteke Instrument Co., Ltd.); Transmissionselektronenmikroskopie (TEM Glacios); Ultraschall-Dispersionsextraktionsinstrument Wasserbadoszillator JP-010S (China Jiemeng Co., Ltd.); quantitatives Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Instrument; Multifunktions-Enzymmarkierungsinstrument; inverses Mikroskop (Firma Olympus) Fluoreszenzmikroskop (Leica, Heidelberg, Deutschland); Inkubator für Kohlendioxidzellen (Firma Thermo).

Experimentelle Reagenzien

Folgendes wurde verwendet:Reagenzname Reinheit/Spezifikation/Produktionschargennummer (Hersteller):Icariin (95%/1 g/DL070208 Sahn Chemical Technology Co., Ltd.); Lipopolysaccharid (Modell 055-100 g/Z06J9Y52452 B5 25 mg Sigma Co., Ltd.); Polyethylenglycolmonomethylether (Analytical Pure/250 g/MKBT7172 V, Sigma Co., Ltd.); Dichlormethan (analytisch rein/500 ml/20171103 Sinopharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.); 4-Dimethylaminopyridin (analytisch rein/100 g/L170741 Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.); N-Hydroxysuccinimid (biologisches Reagenz/100 g/RA328L758 Shanghai Ruiyong Biotechnology Co., Ltd.); FastKing-Einschrittverfahren zum Entfernen des ersten Strangs des vorgemischten Kits für die genomische cDNA-Synthese (Tiangen Biotechnology Co., Ltd.); Kit zum Nachweis von Apoptose (Biyuntian); SYBR Green Fluoreszenz quantitatives Kit (Firma QIAGENGmbH).

Synthese von mPEG-COOH

mPEG (5,00 g), Bernsteinsäureanhydrid (SA, 0,40 g) und 4-Dimethylaminopyridin (Molverhältnis 1:1,5/1,5, 0,50 g) wurden abgewogen und in einen 250-ml-Rundkolben gegeben. Fünfzig Milliliter Dichlormethan wurden zugegeben, unter Rückfluss erhitzt und 2 h bei 60 °C gerührt. Das Dichlormethan wurde einen halben Tag bei 35 °C am Rotationsverdampfer entfernt, und es wurde ein weißer Feststoff erhalten, der einen halben Tag bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck gehalten wurde, bis kein Etherrückstand mehr auftrat. Das Pulver wurde in 50 ml sekundärem destilliertem Wasser gelöst und in einem 2-kDa-Dialysebeutel 48 h lang dialysiert, wobei das Wasser ständig ersetzt wurde. Gelöstes SA wurde entfernt und ungelöste Substanz wurde abfiltriert. Carboxyliertes mPEG (mPEG-COOH) wurde durch Gefriertrocknen des Filtrats und Wiegen erhalten.

Synthese von mPEG-Icariin-Polymer

mPEG-COOH (0,37 g), N -Hydroxysuccinimid (0,024 g) und 4-Dimethylaminopyridin (0,026 g) wurden in einen 250-ml-Rundkolben eingewogen, und dann wurden 10 ml dehydratisiertes Dimethylsulfoxid (DMSO) als Lösungsmittel zugegeben und die Hälfte bei Raumtemperatur gerührt einen Tag, um die Carboxylgruppe zu aktivieren. Dann wurden 100 mg Icariin-Standard in ein kleines Röhrchen gegeben und 5 ml DMSO, aus dem das Wasser entfernt worden war, wurden zugegeben, um den Standard vollständig aufzulösen. Dann wurde die Standardprobe in den Rundkolben gegeben und 48 h unter dem Schutz von Stickstoffgas bei Raumtemperatur gerührt. Nach kontinuierlicher Dialyse mit sekundärem destilliertem Wasser enthielt die Standardprobe kein DMSO, und wir bestätigten die Entfernung von DMSO unter Verwendung von UV. Dann wurde das dialysierte Material in einem Vakuumgefriertrockner 48 h lang gefriergetrocknet, um ein hellgelbes Produkt, nämlich mPEG-ICA-Polymer, zu erhalten.

Herstellung von ICA-beladenen mPEG-ICA-Nanopartikeln (NPs)

mPEG-ICA (5 mg) wurde in ein kleines Röhrchen eingewogen, in 2 ml DMSO gelöst und dann 5 min bei 37 °C in Wasser geschüttelt. Fünf Milligramm ICA wurden in einer geeigneten Menge DMSO gelöst und in einen kleinen Becher gegeben, und mPEG-ICA wurde langsam zugegeben und in DMSO gelöst und 5 ml destilliertes Wasser wurden zugegeben. Die Lösung wurde dann auf einem Magnetrührer bei Raumtemperatur 15 min lang gerührt. Dann wurde der Reaktant in einem 3500-Dialysebeutel dialysiert und 24 h in Wasser dialysiert, wobei das Wasser ständig gewechselt wurde, das DMSO-Lösungsmittel wurde sauber dialysiert und die ICA-beladenen mPEG-ICA-Nanopartikel wurden nach der Filtration erhalten.

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

Geeignete Mengen an Standard-ICA-, mPEG-COOH- und mPEG-ICA-Polymeren wurden in einem Achatmörser zu Pulver gemahlen, mit geeigneten Mengen trockenem KBr-Pulver vermischt und zu feinen Pulvern gemahlen. Nach dem Pressen der Tabletten wurde die Mischung in einem Fourier-Infrarotspektrometer mit einem Scanbereich von 4000–4400 cm/mol ⁻¹ . gescannt , und seine Infrarotspektren wurden aufgezeichnet. ICA und mPEG-COOH wurden zur Materialcharakterisierung verwendet, und mPEG-ICA-Polymer wurde zur Produktcharakterisierung verwendet.

Kernmagnetisches Resonanz-Wasserstoffspektrum

ICA-, mPEG-COOH- und mPEG-ICA-Polymere wurden in deuteriertem Dimethylsulfoxid (DMSO-d6) gelöst und in das Probenröhrchen geladen, das in den Rotor eingesetzt wurde. Dann wurde die Probe auf ein 500 MHz-Kernresonanzspektrometer gegeben und die Probenahmeparameter wurden eingestellt.

UV–Vis-Spektrum

Icariin-Standard (4,0 mg) wurde in einen 25-ml-Messkolben gegeben, mit Methanol maßstabsgetreu zugegeben und dann geschüttelt und bis zur Klärung gelöst. Dann wurden 0,3 ml, 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml, 2,0 ml und 2,5 ml-Aliquote der Icariin-Standardlösung in 25-ml-Messkolben genau abgemessen und Methanol wurde zugegeben, um das Volumen einzustellen. Die Absorptionswerte der Lösungen wurden dann auf einem Ultraviolett-Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 270 nm (maximale Absorptionswellenlänge) mit Methanol als Blindwertkontrolle gemessen. Die Daten wurden aufgezeichnet, um eine lineare Regression zu erstellen.

mPEG-ICA-Polymer (4,3 mg) wurde genau in einen 25-ml-Messkolben eingewogen, wobei Methanol zur Waage zugegeben wurde. Die Lösung wurde geschüttelt, bis sie gelöst und geklärt war. Dann wurde eine 2,0-ml-Probenlösung dreimal genau abgemessen und in einem 25-ml-Messkolben gelöst, wobei das Volumen mit Methanol eingestellt wurde. Die Absorptionswerte der Lösungen wurden dann auf einem Ultraviolett-Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 270 nm (maximale Absorptionswellenlänge) mit Methanol als Blindwertkontrolle gemessen und die Daten wurden dreimal aufgezeichnet, wobei der Durchschnitt genommen wurde. Dann wurde der Gehalt an Icariin berechnet.

Die nach dem obigen Verfahren hergestellten ICA-beladenen mPEG-ICA-Nanopartikel wurden in einen 25-ml-Kolben gegeben, Methanol wurde bis zum Maßstab zugegeben und der Kolben wurde geschüttelt, bis die Lösung gelöst und geklärt war. Dann wurde eine 2,0-ml-Probenlösung dreimal genau abgemessen und in einem 25-ml-Messkolben gelöst, wobei das Volumen mit Methanol eingestellt wurde. Die Absorptionswerte der Lösungen wurden dann auf einem Ultraviolett-Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 270 nm (maximale Absorptionswellenlänge) mit Methanol als Blindwertkontrolle gemessen und die Daten wurden dreimal aufgezeichnet, wobei der Durchschnitt genommen wurde. Die Daten wurden gesammelt, um den durchschnittlichen ICA-Gehalt von ICA-beladenen mPEG-ICA-Nanopartikeln zu berechnen.

Charakterisierung von ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs

Dynamische Lichtstreuungserkennung

Ein dynamisches Lichtstreuungs-Partikelgrößenmessgerät (DLS; The zetasizer 3000hs, Malvern Instruments, Malvern, UK) wurde verwendet, um die Partikelgrößenverteilung und das Potenzial von ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs zu messen. Die neu hergestellten mPEG-ICA- und ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs wurden lyophilisiert und in destilliertem Wasser redispergiert, in einen kolorimetrischen Becher gegossen und dann zur Detektion in einen Probenpool eines dynamischen Lichtstreuungs-Partikelgrößenanalysators gegeben. Jede Probe wurde dreimal analysiert.

Beobachtung der Morphologie durch TEM

Die ICA-beladene mPEG-ICA-NPs-Lösung (1,0 mg/ml) wurde zum Trocknen auf ein Kupfernetz mit Kohlefilm und Filterpapier getropft. Das Gitter wurde in den Trockner gelegt und 2% (w/w) Phosphowolframsäure wurde zugegeben und 10 Minuten lang natürlich trocknen gelassen. Dann wurden die morphologischen Eigenschaften von ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs bei einer beschleunigten Spannung von 80 kV durch Transmissionselektronenmikroskopie beobachtet.

Messung der Stabilität

Die präparierten ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs wurden mit 5% Mannit in einem Vakuumgefriertrockner 48 h lang gefriergetrocknet, und dann wurden die gefriergetrockneten Nanopartikel in doppelt destilliertem Wasser wieder aufgelöst, um die Änderungen ihrer Partikelgröße und des PDI-Werts zu erkennen .

Bestimmung der Wirkstoffbeladung und Einschlusseffizienz

Eine 1,8-ml-ICA-beladene mPEG-ICA-NP-Lösung wurde in einem 10-ml-Messkolben genau gemessen, 0,2 ml DMSO wurden zugegeben und 2 Minuten lang Ultraschall durchgeführt. Die Extinktion der Lösung wurde bei 270 nm bestimmt und das mPEG-ICA-Polymer mit dem gleichen Lösungsmittel wurde als Blindwert verwendet. Die Extinktion der bestimmten Probe wurde in die Standardkurvengleichung eingesetzt und der Icariin-Gehalt wurde berechnet. Im DMSO/H₂ O = 1/9 Lösungsmittelsystem, die Quasi-Kurvengleichung von Icariin wurde bei 270 nm gemessen und die Wirkstoffbeladung (EE %) und die Einschlusseffizienz (LC %) der Nanopartikel berechnet.

• Wirkstoffbeladung (EE%) = Wirkstoffmasse der Nanopartikel/Gesamtmasse der Wirkstoffbeladung Nanopartikel × 100%

• Verkapselungsrate (LC%) = Arzneimittelmasse in Nanopartikeln/Dosierung × 100%.

Arzneimittelfreisetzung in vitro

Fünf Milliliter freies ICA, mPEG-ICA-Polymer und ICA-beladene mPEG-ICA-NPs wurden in Dialysebeutel (3500 kDa), die an beiden Enden befestigt waren, gegeben und in 25 ml PBS (Freisetzungsmedium) bei 37 °C und dialysiert 100 U/min Ultraschallvibration (pH = 7,4). Zwei Milliliter wurden innerhalb vorgegebener Zeiträume (Tn, n = 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 und 72 h) und durch eine frische Lösung des gleichen Volumens ersetzt. Es wurde eine UV-Vis-Spektrophotometrie durchgeführt, um die Absorption des Dialysats bei 270 nm zu den verschiedenen Zeiten zu bestimmen. Das prozentuale Verhältnis der ICA-Freisetzung wurde wie beschrieben berechnet und drei Proben wurden gemessen, um die durchschnittliche Arzneimittelfreisetzung zu berechnen. Der Dialysatgehalt wurde nach der Standardkurvenmethode bestimmt und der Freisetzungstest wurde dreimal in vitro wiederholt.

Die Formel der Wirkstofffreisetzung ist Q % = (C _n × V + V _n Σ ⁿ _{t =0} C _ich )/(W_NP × LC%), wobei W das Gewicht von NP ist, LC% die Wirkstoffbeladung der Nanopartikel ist, C _n ist die Probenkonzentration bei Tn, V ist das Gesamtprodukt des Freisetzungsmediums (25 ml), Vn ist das Probengewicht (2 ml) und C _ich ist T _ich (ich = 0, 0.5, 1, …., n h ,V ₀ = C ₀ = 0).

Freigabe von mPEG-ICA-ICA-NPs in verschiedenen Freigabemedien

Zwei Milliliter ICA-beladene mPEG-ICA NP-Lösung wurden in einen Dialysebeutel (4–88 kDa, Molekulargewichtsgrenzwert) gegeben und in phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit pH 7,4 und pH 6,8 (PBS-Freisetzungsmedium, 37 °C, 25 .) gegeben ml). Dann wurden 2 ml des Freisetzungsmediums zur Probenahme gesammelt und in vorgegebenen Intervallen (Tn, n .) durch eine frische Lösung des gleichen Volumens ersetzt = 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24 und 48 h). Die Absorption des Dialysats bei 270 nm zu den verschiedenen Zeiten wurde durch UV-Vis-Spektrophotometrie bestimmt. Das prozentuale Verhältnis der ICA-Freisetzung wurde berechnet und drei Proben wurden gemessen, um die durchschnittliche Wirkstofffreisetzung zu berechnen.

Zelltestexperiment

H9c2 (Ratte H9c2), eine ventrikuläre Myoblastenlinie der Ratte, wurde vom Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, China, erworben. Die Zellen wurden in DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum (Gibco, USA) bei 37 °C in einem CO₂ . kultiviert -haltige Atmosphäre. H9c2-Zellen wurden üblicherweise in eine 10-cm-Kulturschale überimpft [25]. Als die Zellen auf ungefähr 80 % wuchsen, wurden sie mit 0,25 % Trypsin (Gibco) subkultiviert. Anschließend wurden die Zellen für die folgenden Studien in die entsprechenden Kulturschalen oder 96-Well-Platten ausgesät.

Zellbehandlung mit LPS oder ICA-Nanopartikeln

H9c2-Zellen wurden wie folgt in fünf Gruppen eingeteilt:(1) Kontrollgruppe:unter Verwendung von normalem Kulturmedium, (2) LPS-Gruppe:die Zellen wurden 24 h mit 10 mg/l LPS behandelt; (3) ICA-Gruppe:Die Zellen wurden mit 20 μmol/L ICA (1:1000, DMSO) und 10 mg/L LPS für die gleiche Dauer behandelt, (4) mPEG-ICA-Polymergruppe:Die Zellen wurden mit 20 μmol . behandelt /L mPEG-ICA-Polymer und dieselbe Endkonzentration von LPS für dieselbe Dauer; (5) ICA-beladene mPEG-ICA NPS-Gruppe:Die Zellen wurden mit 20 μmol/l ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs und 10 mg/l LPS behandelt, wobei die anderen Bedingungen dieselben wie in der obigen Gruppe waren.

MTT

Die Zelllebensfähigkeit von ICA-Nanopartikeln gegen LPS-induzierte Kardiomyozyten-Schädigung wurde durch MTT bestimmt. Kurz gesagt, H9c2-Zellen wurden 24 h lang mit LPS und verschiedenen ICA-Nanopartikeln behandelt. Danach wurden die Zellen mit MTT in einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml 4 h bei 37 °C gefärbt und dann wurden 150 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) zugegeben, um Schilddrüsenkristalle aufzulösen. Die optische Dichte wurde bei 570 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät (*/SpectraMax i3 Molecular Devices, Afghanistan) gemessen.

Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH)

Um die Wirkung von Nano-ICA auf LPS-induzierte H9c2-Schäden zu untersuchen, haben wir die LDH-Freisetzung im Kulturmedium untersucht. Kurz gesagt wurde gemäß den entsprechenden Behandlungen für 24 h das Kulturmedium gesammelt und LDH wurde gemäß dem Protokoll des LDH Detection Kit (Beyotime Biotechnology) nachgewiesen. Schließlich wurde der OD-Wert bei 490 nm mit einem Spektrometer gemessen.

Hoechst 33.258 Färbung

Hoechst 33,258-Färbung wurde verwendet, um die Kernmorphologie durch Fluoreszenzmikroskopie zu beobachten. Nach der Behandlung wurden H9c2-Zellen zweimal mit PBS gewaschen, in 4% Paraformaldehyd-Puffer (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa) fixiert, mit PBS gespült und mit Hoechst 33.258 bei 37 °C für 15 min gefärbt [26]. Nach der Färbung wurden die nuklearmorphologischen Aspekte sofort mit einem Fluoreszenzmikroskop (Leica, Heidelberg, Deutschland) beobachtet. Apoptoseindex = Anzahl apoptotischer Kerne/Gesamtkerne × 100%.

TUNEL-Test (terminal dUTP Nick-End-Markierung)

Für den Nachweis der H9c2-Zell-DNA-Integrität haben wir die TUNEL-Technik übernommen. H9c2-Zellen wurden in einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen kultiviert. Nach der Behandlung wurden sie dreimal mit PBS gewaschen und mit 4% Polyformaldehyd für 30 Minuten fixiert [27]. Dann wurde 1% Triton X-100 für 5 Minuten hinzugefügt, um die Permeabilität der Zellmembran zu erhöhen. Dann wurden die Zellen mit einem TUNEL One-Step Detection Kit (Beyotime Biotechnology) gemäß den Anweisungen gefärbt und die Zellapoptose wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die Apoptoserate jeder Gruppe wird als Prozentsatz der grün fluoreszierenden Kerne (TUNEL-positiv) zu den gesamten Kernen (blau) ausgedrückt (die Kerne sind mit DAPI gefärbt) [28].

Durchflusszytometrie zum Nachweis von Apoptose

Um die Auswirkungen verschiedener ICA-Nanopartikel auf die LPS-induzierte Zellapoptose weiter zu untersuchen, verwendeten wir die Annexin V-FITC/PI-Doppelfärbungsmethode, um die Apoptoserate zu analysieren. Nach der H9c2-Behandlung wie oben beschrieben wurden die Zellen geerntet und in 195 μl Bindungspuffer, der 10 μl Annexin V-FITC und 5 μl PI enthielt, resuspendiert und dann 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach Zentrifugation bei 1500 U/min für 10 Minuten bei 4 °C wurde der Färbepuffer abgesaugt und die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und in 100 µl PBS resuspendiert. Schließlich wurden die Proben mit einem Durchflusszytometer gemessen.

Quantitative Polymerase-Kettenreaktion der reversen Transkription (RT–qPCR)

RT-qPCR wurde verwendet, um die mRNA-Expressionsniveaus von Entzündungsmarkern, einschließlich TNF-α, IL-1β und IL-6, nachzuweisen. Nachdem H9c2-Zellen 24 h lang behandelt worden waren, wurde die Gesamt-RNA mit TRIzol wie zuvor beschrieben extrahiert und mit einem NanoDrop™ One/OneC-Mikro-UV-Vis-Spektrophotometer (Thermo, ND-ONEC-W, USA) gemessen. cDNA wurde mit einem ExScript RT-Kit synthetisiert und die Amplifikation wurde auf einem quantitativen Fluoreszenz-PCR-Gerät (BIO-RAD CFX96 Touch*) mit SYBR Green-Reagenz unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:95 °C für 5 min, 95 °C für 30 s, 58 °C für 30 s und insgesamt 28 Zyklen. Die in dieser Studie verwendeten Primer sind wie folgt:

Actin::

Weiter 5′ GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′;

Rückwärts 5′-TTGATGTCACGCACGATTT-3′;

TNF-α::

Weiter 5′TCTATACCACTTCACAAGTCGGA-3′;

Reverse 5′-GAATTGCCATTGCACAACTCTTT-3′;

IL-1β::

Weiter 5′GGATGATGACGACCTGCTA 3′;

Rückwärts 5′-CACTTGTTGGCTTATGTTCTG3′

IL-6::

Weiter 5′TGCCTTCTTGGGACTGAT-3′;

5′-CTGGCTTTGTCTTTCTTGTTAT-3′ umkehren.

Die Menge jedes Zielgens wurde auf die des Actin-Gens normalisiert. Die Experimente wurden dreifach wiederholt.

Ergebnisse und Diskussion

FTIR und H ¹ NMR-Spektren

Aus den mPEG-ICA-Spektren lagen die Streckschwingungsabsorptionspeaks von zwei Esterbindungen (–C=O–) bei 1700 ⁻¹ und 1740 ⁻¹ cm. Im Vergleich zu den mPEG-COOH-Spektren gab es einen übermäßigen C=C-Streckschwingungspeak bei 1650 cm ⁻¹ , was darauf hinweist, dass die Veresterungssynthese von ICA und mPEG-COOH erfolgreich bei der Bildung von mPEG-ICA war (Abb. 1).

FTIR-Spektren von mPEG-ICA (A ), ICA (B ) und mPEG-COOH (C ). H ¹ NMR-Wasserstoffspektren für mPEG-COOH und mPEG-ICA

Aus dem mPEG-ICA-Wasserstoffspektrum zeigen 12,6 ppm die phenolischen Hydroxylgruppen des ICA aufgrund des Vorhandenseins von -C=O starken Absorptionselektronengruppen an, die sich in das niedrige Feld bewegen. Der Wasserstoffpeak im Benzolring bei etwa 7,5 ppm und die Peakfläche bei 3,5 ppm sind sehr groß und werden als –CH₂ . bewertet –O– Wasserstoffpeak im mPEG-Polymer. Zahlreiche Analysen zeigen, dass das Alkylwasserstoffsignal 0–2 ppm beträgt. Daraus kann geschlossen werden, dass 1,7 ppm der Wasserstoffpeak der Doppelbindung in ICA ist. Die charakteristischen Peaks von mPEG-COOH und ICA erscheinen in mPEG-ICA-Polymeren und zeigen die erfolgreiche Synthese von mPEG-COOH mit ICA (Abb. 1).

Partikelgröße, Zetapotential und TEM

Die durchschnittliche Partikelgröße der mPEG-ICA-Nanopartikel beträgt ungefähr (145,0 ± ± 15,2) nm und der Dispersionsindex (PDI) des Polymers beträgt (0,277 ± ± 0,00). Die Partikelgröße von ICA-beladenen mPEG-ICA-Nanopartikeln nahm leicht auf ungefähr (220,0 ± ± 13,7) nm zu und der PDI betrug (0,119 ± ± 0,00). Je kleiner der PDI ist, desto gleichmäßiger ist die Verteilung von ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs. Das Zetapotential der mPEG-ICA-Nanopartikel betrug (0,439 ± ± 0,258) mV und das Zetapotential der ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs betrug (2,30 ± ± 1,33) mV. Die Transmissionselektronenmikroskopie ergab, dass die ICA-beladenen mPEG-ICA-Nanopartikel kugelförmig waren, eine regelmäßige Morphologie und eine relativ einheitliche Größe hatten (Abb. 2).

Partikelgröße, Zetapotential und TEM von ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs

Wirkstoffbeladung und Verkapselungseffizienz

Der ICA-Gehalt in den ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs kann durch Ultraviolett-Spektrophotometrie berechnet werden. Die Standardkurve der ICA-Konzentration wurde erstellt und der ICA-Gehalt im Polymer wurde durch Berechnung der Arzneimittelkonzentration basierend auf der Standardkurve erhalten. Gemäß den Berechnungen, basierend auf der mPEG-ICA-Polymerabsorption (1,2397 ± 0,1024), betrug der ICA-Gehalt (0,4132 ± 0,0359) mg/ml, mit ICA-beladener mPEG-ICA-Nanopartikel-Absorption (1,6289 ±   0,0923), und die Der ICA-Gehalt betrug (0,5496 ± ± 0,3234) mg/ml. Berechnet nach der Formel des Verfahrens betrug die Wirkstoffbeladung des mPEG-ICA-Polymers (16,5 ± ± 0,014) % und die Einkapselungsrate (41,3 ± ± 0,036) %; Der Wirkstoffbeladungsgehalt der ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs betrug (21,9 ± ± 0,013) % und die Einkapselungsrate betrug (54,9 ± ± 0,032) % (Tabelle 1).

Stabilitätsbestimmung

Die Partikelgröße von ICA-beladenen mPEG-ICA-Nanopartikeln, die durch das Dialyseverfahren hergestellt wurden, betrug (220,0 ± ± 13,7) nm, und der PDI betrug (0,119 ± ± 0,00). Nach 48 h Gefriertrocknung in 5 % Mannit können die Nanopartikel wieder in Wasser aufgelöst werden, um stabile Nanopartikel zu bilden. Die Partikelgröße betrug 255 nm und der PDI (0,326 ± 0,00), was etwas größer war als der von Dialyse-Nanopartikeln (Abb. 3).

Stabilität von ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs

mPEG-ICA-ICA-Wirkstofffreisetzung in vitro

In Abb. 4 hängt die ICA-Freisetzung weitgehend vom pH-Wert des Freisetzungsmediums ab. In phosphatgepuffertem Salzlösungsmedium (PBS) bei pH 7,4 wurde freies Icariin (77,21 ± ± 0,15) % innerhalb von 12 h freigesetzt und vollständig freigesetzt. Da die mit Icariin-Wirkstoffen beladenen mPEG-ICA-NPs die Freisetzung von Nanopartikeln erhöhen können, wurde die Wirkstofffreisetzung von mPE-ICA-Nanopartikeln innerhalb von 72 h auf (44,08 ± ± 0,12) % freigesetzt, und ICA-beladene mPEG-ICA-Nanopartikel erreichten (52,80 ± ± 1,70) %. ICA-beladene mPEG-ICA-Nanopartikel wurden in eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,8 gegeben, und wir fanden heraus, dass die durch Nanopartikel vermittelte Wirkstofffreisetzung innerhalb von 48 h (75,66 ± 0,17 %) erreichte. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass einige ICA-beladene mPEG-ICA-NPs depolymerisierte NPs aufwiesen oder mPEG-ICA-Moleküle in NPs brechen. Diese Beobachtungen zeigten, dass die Freisetzung von ICA unter sauren Bedingungen von pH 6,8 günstiger war. Es zeigte auch, dass die Freisetzungseigenschaften von ICA-beladenen mPEG-ICA-Nanopartikeln für die lokale Behandlung von entzündlichen Myokardverletzungen von Vorteil waren, da lokale Läsionen zu einem Fokus mit einer schwach sauren Umgebung führen.

A ICA-Freisetzung aus ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs in PBS bei pH 7,4. B ICA-Freisetzung aus ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs in PBS bei pH 7,4 und pH 6,8 bei 37 °C in vitro

Lebensfähigkeit von H9C2-Zellen und Freisetzung von Laktatdehydrogenase

Um die Zytotoxizität von ICA-beladenen mPEG-ICA-Nanopartikeln zu beobachten, haben wir zunächst freies Medikament (20 µM ICA), mPEG-ICA-NPs und ICA-beladene mPEG-ICA-NPs zu H9c2-Zellen gegeben, und die MTT-Ergebnisse zeigten keine ausgeprägte Zytotoxizität von die Nanopartikel (Abb. 5). Dann untersuchten wir weiter, ob sie H9c2-Zellen vor LPS-induzierter Verletzung schützen können (Abb. 6). Nach einer LPS-Behandlung für 24 Stunden war die Lebensfähigkeit der Zellen auf (50,0 ± 3,22) % (Kontrollgruppe 100 %) reduziert, wobei die Behandlung mit ICA, mPEG-ICA-NPs und ICA-beladenen mPEG-ICA-NPs die Lebensfähigkeit von H9c2-Zellen signifikant um . erhöhte (55.94 ± 1.06)%, (60.97 ± 2.615)%, and (65.36 ± 1.214)%, respectively (P  < 0.05).

Evaluation of the cytotoxicity of ICA nanoparticles on H9c2 cells. Data are expressed as the mean ± SEM of three separate experiments

Evaluation of the effects of ICA nanoparticles on LPS-induced H9c2 cell injury. Cell viability in different groups was measured by MTT assay. Data are the mean ± SME. (**P  < 0.01 vs. con; # P  < 0.05 and, ## P  < 0.01 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

In addition, LDH levels are a marker of cell damage; therefore, we measured the release level of LDH in the culture medium (Fig. 7). LDH levels were increased in the LPS group compared with the normal culture group. Treatment with ICA, mPEG-ICA NPs or ICA-loaded mPEG-ICA NPs reduced the LDH level increase induced by LPS, especially in the ICA-loaded mPEG-ICA NP group. These results showed that ICA nanoparticles could protect cells from LPS.

The effect of ICA nanoparticles on the LDH level induced by LPS in H9c2 cells. Data are the mean ± SD. ***P  < 0.01 versus con; ##P  < 0.01 versus LPS treatment group; *&P  < 0.05 versus LPS + mPEG-ICA group

Cell apoptosis induced by LPS

First, nuclear morphology was detected by Hoechst 33,258 staining (Fig. 8). Nuclear chromatin exhibited condensation, breakage and fragmentation after LPS damage in the LPS group. However, for ICA-loaded mPEG-ICA NP group, the number of apoptotic cells obviously decreased. Moreover, we used TUNEL staining to observe cellular DNA breaks or DNA damage (Fig. 9). The number of apoptotic nuclei in the LPS-induced group was (47.57 ± 3.41)% (P  ˂ 0.0001) compared to (6.47 ± 1.87)% in the normal culture group. After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA, the apoptosis rates decreased to (17.92 ± 3.12)% and (26.54 ± 3.68)% and (35.49 ± 4.25)%, respectively, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs significantly reduced the apoptosis rate compared with mPEG-ICA NPs. In addition, flow cytometric analysis in LPS-induced H9c2 cells showed that (35.93 ± 2.23)% of the cells were in the early and late apoptotic stages (Fig. 10). After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs or mPEG-ICA NPs, the total apoptotic rates were reduced to (16.70 ± 2.77)% and (19.15 ± 3.67)%, respectively. These results were in line with the Hoechst 33,258 staining and TUNEL staining findings and indicated that ICA-loaded mPEG-ICA NPs largely prevented the cells from undergoing apoptosis.

Detection of apoptosis by Hoechst 33,258 staining. A Nuclear morphology in cells stained with Hoechst 33,258. B Quantitative analysis of the apoptosis rate by Hoechst 33,258 staining. Data are the mean ± SEM (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

Detection of apoptosis by TUNEL. A Cells with TUNEL and DAPI staining; B apoptosis rate. Data are the mean ± SEM (****P  < 0.0001 vs. con; ###P  < 0.005 vs. LPS; &&P  < 0.01 vs. LPS + mPEG-ICA)

A . Apoptotic rate detected by flow cytometry. H9c2 cells were stained by Annexin V/PI double staining. Q1-LL cells were Annexin V/PI double-negative stained, indicating viable cells; Q1-LR cells were Annexin V-positive and PI-negative stained, indicating early apoptosis; Q1-UR cells were Annexin V/PI double-positive stained, indicating late apoptosis. B . Apoptotic rate (%). Data are the mean ± SME. (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 and ##P < 0.01 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

Inflammatory cytokine mRNA in LPS-induced H9c2 cells

Next, we evaluated the effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 in LPS-induced H9c2 cells. After LPS treatment for 24 h in H9c2 cells, the mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 were increased. These increases were attenuated by ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA treatment, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs treatment markedly lowed TNF-α, IL-1β and IL-6 mRNA expression (Fig. 11).

Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA expression levels of IL-1β, TNF-α and IL-6 in LPS-induced H9c2 cells. Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA IL-1β in the LPS induced H9c2 cells. (**P  < 0.01 compared with con; #P  < 0.05 compared with LPS; &P  < 0.05 compared with LPS + mPEG-ICA.) (2) Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA TNF-α. (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS group; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA) (3) Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on mRNA IL-6. Data are the mean ± SEM (* P  < 0.05 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

In this study, we analyzed the suitability of polymer nanoparticles to load ICA for the treatment of LPS-induced H9c2 cell damage. The synthesis method is highly feasible and has many advantages. First, mPEG is nontoxic and has good biocompatibility [29]. In this study, a chemical bonding method was used to assemble mPEG and ICA into an mPEG-ICA polymer, and then dialysis was used to physically wrap the ICA and form stable nanoparticles [30]. Nanoparticles can significantly improve the water solubility of ICA and can realize the long circulation of nanoparticles in the body [31, 32]. Compared with mPEG-ICA nanoparticles, ICA-loaded mPEG-ICA nanoparticles have many significant advantages. First, their PDI value is smaller, which proves that the particle size distribution is more uniform [33]. Second, the drug loading and encapsulation efficiencies of ICA-loaded mPEG-ICA NPs are both higher than those of mPEG-ICA NPs, making it easier to reach the effective drug concentration of ICA [34]. In a pH 6.8 solution, nanoparticles release more drugs, and an acidic environment may destroy the self-assembly force of nanoparticles and accelerate the cleavage of ester bonds, resulting in faster release of the drug into the medium and effective enrichment of the drug in the inflammation site [35, 36]. Huang et al. used LPS-induced osteoblasts to validate the model to explore the anti-inflammatory mechanism of Icariin. They found that Icariin can significantly upregulate the expression of BMP-2 and Runx2 in LPS-induced osteoblasts, thereby achieving effective therapeutic effects [37]. A study has shown that ICA can inhibit the inflammatory response of chondrocytes induced by LPS and reduce collagen formation [38]. In addition, ICA can also inhibit the caspase-1 signaling pathway mediated by the NLRP3 inflammasome and reduce LPS-induced sagging [39]. However, LPS-induced cells cannot effectively absorb ICA. Making ICA nanoparticles can solve this problem well. It may be that ICA is loaded by nanocarriers, greatly increasing its water solubility and allowing it to enter cells through free diffusion. At the same time, studies have shown that nanoparticles can promote cell endocytosis and tissue cell efflux and significantly improve the bioavailability of ICA [40, 41].

The results of the MTT assay and lactate dehydrogenase release experiments showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could effectively alleviate the cell damage induced by LPS, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release ICA from the particles. Furthermore, compared with the mPEG-ICA NPs, ICA-loaded mPEG-ICA NPs could load more ICA and release more easily. We also found that these nanoparticles markedly decreased apoptosis induced by LPS to alleviate the inflammatory response in H9c2 cells. Moreover, the antiapoptotic effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs was better than that of mPEG-ICA NPs and ICA. These results indicated that ICA nanoparticles could protect cardiomyocytes from inflammatory injury.

Inflammatory cytokines are the key factors involved in the development and progression of cardiovascular disease and are markers of the inflammatory response [42, 43]. Some researchers have found that TNF-α, IL-1β and IL-6 were closely related to cardiac function. The addition of these inflammatory cytokines to isolated cardiomyocytes resulted in abnormalities in cardiac function and promoted cardiomyocyte loss [44]. Our RT–qPCR results showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could significantly inhibit the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6. Therefore, these results implied that the protective effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs may occur through controlling inflammatory cytokines.

Conclusion

ICA-loaded mPEG-ICA NPs are a new type of nanomedicine successfully synthesized through nanotechnology (a combination of chemical synthesis and physical embedding). This process not only converts the hydrophobic drug ICA into water-soluble nanomedicine but also successfully improves the load capacity of ICA. In the weakly acidic solution, the ICA release from ICA-loaded mPEG-ICA NPs was greater than that of the neutral solution, indicating that nanoparticles are meaningful for the treatment of inflammatory cardiovascular diseases. Treatment with ICA nanoparticles effectively protected against LPS-induced H9c2 damage, promoted cell viability and inhibited cell apoptosis. Further experiments demonstrated that the new ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release inflammatory cytokine production.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Not applicable.

Abkürzungen

mPEG:

Polyethylene glycol monomethyl ether

ICA:

Icariin

FT-IR:

Fourier transform infrared spectroscopy

NMR:

Nuclear magnetic resonance spectroscopy

DLS:

Dynamic light scattering

TEM:

Transmission electron microscope

TNF:

Tumor necrosis factor

EPRs:

Permeability and retention functions

SA:

Succinic anhydride

DMSO:

Dehydrated dimethyl sulfoxide