Die PRISM-Technik durchbricht Lichtbeugungsgrenzen für die Bildgebung lebender Zellen in Raum und Zeit

• Forscher entwickeln eine neue Technik (PRISM), die über die Beugung von Licht hinaus beobachten kann. 
• Es kann durch hochauflösende räumliche und zeitliche Bildgebung außergewöhnliche Ansichten innerhalb lebender Zellen einfangen. 

Seit einigen Jahrzehnten verwenden wir Weitfeld-Fluoreszenzbildgebungsmethoden wie PALM und STORM, um subzelluläre Strukturen zu beobachten. Diese Methoden erfordern Hunderte und Tausende von Rohbildern in langen Sequenzen. Daher verringert eine zunehmende räumliche Auflösung die Zeitauflösung.

Jetzt haben Forscher der EPFL (Forschungseinrichtung in Lausanne, Schweiz) ein System entwickelt, das durch hochauflösende räumliche und zeitliche Bildgebung (sowohl räumlich als auch zeitlich) außergewöhnliche Einblicke in das Innere lebender Zellen einfangen kann.

Die neue Mikroskopieplattform mit dem Namen PRISM (Phase Retrieval Instrument with Super-resolution Microscopy) kann über die Beugung von Licht hinaus beobachten. Es integriert dreidimensionale Mikroskopie und eine neuartige Technik zur dreidimensionalen Phasenwiederherstellung mit weißem Licht.

Es kombiniert die räumliche Auflösung der Fluoreszenz-Superauflösung und molekularen Spezifität mit der schnellen und empfindlichen quantitativen Phasenbildgebung und ermöglicht so eine multimodale 4-dimensionale Bildgebung. 

Wie funktioniert die 4D-Zellmikroskopie?

Forscher nutzten die Fourier-Filterung, um die quantitative 3D-Phase aus einer Reihe von Weißlichtbildern zu extrahieren. Anschließend erklärten sie diese tiefenaufgelöste Hellfeld-Phasenbildgebung durch teilweise kohärente 3D-Bilderzeugung.

Sie demonstrierten ihr Konzept, indem sie die hochauflösenden 3D-Phasendaten stabiler Zellen aus einem großen Stapel z-verschobener Intensitäten abgerufen haben. Sie haben PRISM für die gleichzeitige Erfassung von 8 Ebenen entwickelt – es kann Hochgeschwindigkeits-3D-Phasenbildgebung über ein Volumen von 2,5 x 50 x 50 Mikrometern durchführen. Schließlich bildeten sie nacheinander Zellproben mit 3D-Phasenmikroskopie und hochauflösender optischer Fluktuationsbildgebung (SOFI) ab.

SOFI unterstützt die 3D-Bildgebung lebender Zellen mit einer Zeitauflösung von fast einer Sekunde pro rekonstruiertem Bild in einem Mehrebenenmikroskop. Darüber hinaus bietet es eine quantitative Bewertung molekularer Parameter und toleriert hohe Markierungsdichten.

Referenz: Nature Photonics | doi:10.1038/s41566-018-0109-4 | EPFL

Einfach ausgedrückt ist PRISM ein Add-on zu aktuellen Weitfeldmikroskopieplattformen, das eine einfache und schnelle Implementierung von hochauflösender 3D-Fluoreszenzbildgebung und quantitativer 3D-Phase ermöglicht. Unterm Strich bietet das neue System eine bessere Möglichkeit, die zeitliche Physiologie und komplexe räumliche Lage lebender Zellen zu beobachten.

Technische Details

Eine mit der PRISM-Technik beobachtete Zelle | Bildnachweis:T. Lasser / EPFL

Basierend auf der Helmholtz-Wellengleichung ist die Technik in den Rahmen des Wiener-Khintchine-Theorems eingebettet. Der Prozess der Dekodierung der Phasendaten entlang der Z-Achse erfolgt durch Berechnung der Vorwärtsstörung mit schwacher Streuung.

Sie entwickelten einen effizienten Algorithmus zur Wiederherstellung der 3D-Phasendaten aus einem erfassten volumetrischen Intensitätsstapel. Die hohe numerische Apertur für die Detektion und die Weißlicht-Koehler-Beleuchtung ermöglichen eine fleckenfreie, hochauflösende und stabile quantitative Phasenbildgebung lebender Zellen. Darüber hinaus bestätigten die Simulationen eine axiale Auflösung von 350*560 Nanometern. 

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Insgesamt ermöglicht das Verfahren die Weiterentwicklung eines herkömmlichen Hellfeldmikroskops zu einem einfachen, schnellen und zuverlässigen 3D-Phasenmikroskop, das die Erwartungen für zahlreiche Untersuchungen und Anwendungen in den Lebenswissenschaften und der Biologie erfüllen soll.