Auswirkungen des Mikroumgebungs-pH-Werts von Liposomen auf die chemische Stabilität des beladenen Arzneimittels

Hintergrund

Liposom, ein künstliches Membranvehikel, hat aufgrund seiner Wirkstoffbeladungskapazität, biologischen Abbaubarkeit und Biokompatibilität großes Potenzial für die Wirkstoffabgabe gezeigt [1, 2, 3, 4]. Das klassische Liposom hat eine ähnliche Struktur wie lebende Zellen, die typischerweise aus einer Phospholipid-Doppelschicht und einer wässrigen inneren Kammer besteht [5,6,7]. Aufgrund dieser Struktur ist das Liposom in der Lage, die unlöslichen Wirkstoffmoleküle zu solubilisieren und das beladene Arzneimittel vor der rauen physiologischen Umgebung zu schützen [8,9,10]. Darüber hinaus kann die Oberfläche von Liposomen modifiziert werden, um die Blutzirkulationszeit zu verlängern und/oder spezifische Gewebe anzugreifen [11,12,13,14,15]. Mit diesen oben genannten Vorteilen wurden verschiedene Liposomensysteme klinisch zugelassen [8, 9, 16].

Obwohl die Abgabe vieler Arzneistoffe durch den Einbau in Liposomen verbessert wurde, ist die Abgabe einiger pH-empfindlicher Arzneistoffe immer noch durch die Instabilität des Arzneistoffmoleküls selbst in physiologischer Umgebung (neutrale pH-Werte) begrenzt. Im Allgemeinen wird das Liposom in einer neutralen Pufferlösung hergestellt und somit befinden sich die beladenen Arzneimittelmoleküle auch nach dem Einbau in das Liposom in einer neutralen Umgebung. Dementsprechend wären diejenigen Moleküle, die nur in saurer Umgebung stabil sind, selbst in Form von Liposomen noch instabil. Daher ist die Entwicklung eines neuartigen Ansatzes zur Verbesserung der Stabilität pH-empfindlicher Medikamente von großer Bedeutung für die erfolgreiche Abgabe dieser Wirkstoffe durch Liposomen.

Wie oben erwähnt, hat das Liposom einen wässrigen Raum in seiner inneren Kammer, der verwendet werden kann, um Arzneimittelnutzlasten mit einer sauren Mikroumgebung bereitzustellen (Abb. 1). In dieser vorliegenden Arbeit verwenden wir Curcumin als Modellarzneimittel und zielen darauf ab, einen neuen Ansatz zur Verbesserung der chemischen Stabilität von in Liposomen beladenen Arzneimittelmolekülen bereitzustellen. Es ist allgemein bekannt, dass Curcumin ein lipophiles Molekül ist und aufgrund seiner verschiedenen Bioaktivitäten in großem Umfang in Lebensmitteln, Medikamenten und Kosmetika verwendet wird [17,18,19,20,21]. Seine Abgabe ist jedoch durch seine Unlöslichkeit und Instabilität in biologischen Flüssigkeiten stark eingeschränkt [22,23,24,25]. Bisher muss es sein klinisches Versprechen teilweise aufgrund der pH-vermittelten Instabilität noch erfüllen [26]. Curcumin ist daher ein geeignetes Modellarzneimittel für diese Arbeit.

Schema des Liposoms mit unterschiedlicher Mikro-Umwelt-Acidität in seiner inneren wässrigen Kammer

Methoden

Materialien

Phospholipide (Sojabohnenlecithin zur Injektionsverwendung) wurden von Shanghai Tai-Wei Pharmaceutical Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Cholesterin wurde von Amresco (Solon, OH, USA) bezogen. Poloxamer 188 (F68) wurde freundlicherweise von BASF (China) Co., Ltd., (Shanghai, China) gespendet. Curcumin wurde von Sigma (St. Louis, MO, USA) geliefert. Fötales Rinderserum (FBS) wurde von HyClone (Logan, UT, USA) bezogen. Alle anderen in dieser Studie verwendeten chemischen Reagenzien waren von analytischer Qualität oder besser.

Herstellung von Curcumin-beladenen Liposomen (Cur-LPs)

Die Liposomen mit unterschiedlichen Mikroumgebungs-pH-Werten wurden nach früheren Arbeiten mit einigen Modifikationen nach der Verdampfungsmethode hergestellt [27, 28]. Kurz gesagt, Phospholipide (75 mg) und Cholesterin (5 mg) wurden in 0,5 ml Ethanol mit 2 mg/ml Curcumin gelöst. Die Ethanollösung wurde mit 5 ml 0,001 M PBS mit 1 % (w /v ) F68, das als Tensid zur Einengung der Größenverteilung diente. Nach 1 Minute magnetischem Rühren (Magnetmischer mit konstanter Temperatur, DF-101S, Zhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co., Ltd., Zhengzhou, China) wurde die resultierende Emulsion unter Vakuum verdampft und 30 Minuten bei 35 °C bis dunkel gehalten Ethanol entfernen. Der Säuregehalt in der inneren Kammer von Cur-LP wurde während der Herstellung über PBS mit variierenden pH-Werten von 2,5, 5,0 oder 7,4 eingestellt. Die resultierende Suspension wurde bei niedriger Geschwindigkeit (3000 U/min, 5 min) zentrifugiert, um freies Curcumin auszufällen. Der Überstand wurde dann mit hoher Geschwindigkeit (16 krpm, 10 min) zentrifugiert und die Pellets wurden vor der weiteren Verwendung in PBS (pH 7,4) resuspendiert. Dieses Verfahren stellte diesen LPs eine identische externe Umgebung zur Verfügung. Die erhaltenen Liposomen mit unterschiedlichen Mikroumgebungs-pH-Werten wurden als Cur-LP-2.5, Cur-LP-5.0 bzw. Cur-LP-7.4 präsentiert. Es wurden auch leere Liposomen wie oben hergestellt.

Charakterisierung von Liposomen

Die hydrodynamische Größe, Größenverteilung und das Zetapotential sind die drei Grundparameter für Liposomensysteme. Die Größe und das Zetapotential von LP wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) bzw. elektrophoretische Lichtstreuung (ELS) unter Verwendung von ZetasizerNano ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK) bei 25 °C bestimmt [29]. Der Messzyklus wurde vom Instrumentensystem automatisch bestimmt. Die Partikelgröße wurde durch die Intensitätsverteilung dargestellt und die Größenverteilung wurde durch den Polydispersitätsindex (PDI) bewertet.

Bestimmung der Kapselungseffizienz (EE)

EE, ein wichtiger Parameter für die Qualitätskontrolle, ist von großer Bedeutung bei der Entwicklung von Liposomen-basierten Abgabesystemen. Die EE-Bestimmung basierte auf der Hochgeschwindigkeits-Zentrifugationsmethode. Kurz gesagt wurden 100 μl Cur-LPs bei niedriger Geschwindigkeit (3000 U/min, 5 min) zentrifugiert, um nicht gelöstes freies Curcumin auszufällen, und 50 μl Überstand wurden einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation (16 krpm, 10 min) unterzogen, um Cur- LPs aus dem winzigen gelösten Curcumin. Die Pellets wurden in 500 μl PBS (d. h. 10-fache Verdünnung) resuspendiert, von denen ein Aliquot von 10 μl durch Vortexen und Beschallen für 30 s mit 300 μl Ethanol vermischt wurde. Die Fluoreszenzintensität von Curcumin in der resultierenden Lösung wurde bestimmt (Anregungswellenlänge (Ex), 458 nm; Emissionswellenlänge (Em), 548 nm) und als F . dargestellt _e , d. h. die Fluoreszenzintensität von eingekapseltem Curcumin. Weitere 50 μl frisches Cur-LP, das eingekapseltes und freies Curcumin enthielt, wurden ebenfalls mit PBS 10-fach verdünnt, und 10 μl der verdünnten Lösung wurden mit 300 μl Ethanol vermischt. Die Fluoreszenzintensität der resultierenden Lösung wurde gemessen und als F . dargestellt _t , d. h. die Fluoreszenzintensität von Gesamtcurcumin. Die EE wurde daher mit folgender Gleichung berechnet: EE = F _e /F _t .

Rasterelektronenmikroskopie (REM)

Die Morphologie von LP wurde durch Rasterelektronenmikroskopie (REM, INSPECT F, FEI, Niederlande) beobachtet [30]. Kurz gesagt wurde die LP-Suspension mit destilliertem Wasser 100-fach verdünnt und ein Tropfen der verdünnten Suspension wurde auf eine saubere Glasplatte gegeben. Nach der Lufttrocknung wurde die Probe direkt vor dem SEM mit Gold beschichtet.

Physische Stabilität von Liposomen

Die physikalische Stabilität ist ein sehr bedeutsamer Parameter für die Lagerung und den Transport eines kolloidalen Systems. Die physikalische Stabilität von Liposomen wurde durch kolloidale Stabilität dargestellt und nach einer früheren Methode untersucht [31]. Kurz gesagt wurden 100 μl LP in die Röhrchen gegeben und bei 37 °C aufbewahrt. In verschiedenen Zeitintervallen wurde die LP-Größe gemessen und mit der Ausgangsgröße verglichen, um die thermodynamische Stabilität anzuzeigen. Darüber hinaus wurden weitere 300 μl LP in die Röhrchen gegeben und bei 37 °C aufbewahrt. Zu den gleichen Zeitintervallen wurden 100 μl der Flüssigkeit der oberen Schicht gesammelt. Die Transmission der gesammelten Proben wurde bei 550 nm gemessen und mit dem Ausgangswert verglichen, um die kinetische Stabilität anzuzeigen.

In-vitro-Release

Das Freisetzungsprofil von Liposomen spielt eine wichtige Rolle bei der Vorhersage des in-vivo-Verhaltens und der Wirksamkeit von Liposomen. Die in vitro-Freisetzung von Curcumin aus Cur-LP wurde mit der Methode der dynamischen Dialyse untersucht [32]. Kurz gesagt wurde 1 ml jedes Cur-LP in einen Dialysebeutel (Molekulargewichtsgrenzwert, 10 kD) gegeben, der verwendet wurde, um Liposomen zurückzuhalten, aber die freigesetzten Curcuminmoleküle durchlässig zu halten. Der mit einer Probe beladene Dialysebeutel wurde in 4 ml Freisetzungsmedium (0,001 M PBS mit 0,1 % Tween 80, pH 7,4) getränkt, und die Freisetzungsstudie wurde lichtgeschützt (37 °C, 100 U/min) durchgeführt. Zu jedem festgelegten Zeitintervall wurde das Freisetzungsmedium gesammelt und durch 4 ml frisches Medium ersetzt, um Sinkbedingungen zu simulieren. Das gesammelte Medium wurde mit PBS auf 5 ml verdünnt und mit Ethanol weiter um das 15-fache verdünnt. Das Curcumin in der resultierenden Lösung wurde durch Fluoreszenzspektrophotometrie (Ex 458 nm, Em 548 nm) quantifiziert. Außerdem wurde Curcuminpulver in dem obigen Freisetzungsmedium gelöst und die Freisetzung der Curcuminlösung bei pH 7,4 durchgeführt, um zu untersuchen, ob der Dialysebeutel Curcuminmoleküle zurückhält.

Chemische Stabilität von liposomalem Curcumin

Die chemische Stabilität ist ein Schlüsselparameter für die Vorhersage von Wirkstoffmetabolismus, Wirksamkeit und Toxizität. Die chemische Stabilität von Cur-LPs wurde in 50% FBS untersucht. Kurz gesagt, 100 μl Cur-LPs wurden mit PBS (pH 7,4) 10-fach verdünnt und dann mit 1 ml FBS gemischt. Die Proben wurden auf einem horizontalen Schüttler lichtgeschützt geschüttelt (37 °C, 100 U/min). In festgelegten Zeitintervallen wurde ein Aliquot von 10 μl Probe entnommen und mit 300 μl Ethanol vermischt, unmittelbar gefolgt von einer Zentrifugation (16 krpm, 5 min). Das restliche Curcumin im Überstand wurde wie oben quantifiziert.

In-vitro-Wirksamkeit bei Krebs

Die vorläufige Antikrebswirksamkeit der drei Cur-LPs wurde unter Verwendung von HepG2-Zellen des humanen hepatozellulären Leberkarzinoms untersucht. Kurz gesagt, HepG2-Zellen wurden auf die 96-Well-Zellkulturplatten mit einer Dichte von 10.000 Zellen pro Well ausplattiert und unter Standardbedingungen (37 °C/5% CO₂ .) kultiviert ) für 24 h in PRIM-1640-Kulturmedium, ergänzt mit 10 % FBS. Anschließend wurde das Kulturmedium entfernt und die Zellen mit PBS gewaschen. Die Cur-LPs wurden in serumfreiem Kulturmedium (4 μg/ml Curcumin) verdünnt und den Zellen zugesetzt, gefolgt von einer kontinuierlichen Inkubation für 1 und 3 Tage bei 37 °C. Der OD-Wert lebensfähiger Zellen wurde durch den cck-8-Assay gemessen. Die mit leerem Kulturmedium behandelten Zellen dienten als Kontrolle und die Lebensfähigkeit der Zellen (%) war der OD-Wert-Prozentsatz der Proben relativ zur Kontrolle.

Statistik

Alle Daten werden als Mittelwert ± sd (Standardabweichungen) dargestellt. Die Unterschiede zwischen zwei Gruppen, analysiert vom t . des Schülers wurden als statistisch signifikant erachtet, wenn die p Wert war kleiner als 0,05.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung von Liposomen

Der Mikroumgebungs-pH-Wert des Liposoms bezieht sich auf den Säuregehalt in der inneren wässrigen Kammer des Liposoms (Abb. 1), der sich vom pH-Wert in der äußeren Umgebung unterscheidet. In dieser Arbeit betrug der externe Umgebungs-pH-Wert aller Liposomensuspensionen 7,4, sofern nicht anders angegeben.

Partikelgröße, Zetapotential und Verkapselungseffizienz (EE) sind wichtige Parameter für die Qualitätskontrolle von Liposomen. Die Größe von drei Cur-LPs war einander ähnlich (ca. 300 nm, Abb. 2a). Der PDI jeder Formulierung war niedriger als 0,2, was auf eine enge Größenverteilung hinweist. Interessanterweise ist das negative Zetapotential von Cur-LP-7.4 (−9 mV) deutlich niedriger als das der anderen beiden Cur-LPs (~−18 mV). Normalerweise würde das negative Zeta-Potential abnehmen und sogar in einen positiven Wert übergehen, wenn der pH-Wert der dispersen Phase aufgrund des Anstiegs von H ⁺ . sinkt Konzentration. Wir beobachteten dieses Phänomen tatsächlich bei der Herstellung von Cur-LPs in Nicht-Puffer-HCl/NaOH-Lösungen mit pH-Werten von 2,5, 5,0 und 7,4 (Abb. 2b). Im Fall von PBS ist jedoch die Existenz von PO₄ ³⁻ , HPO₄ ²⁻ , und/oder H₂ PO₄ ⁻ und ihre Interaktion mit LP kann zu komplizierteren Situationen und anderen Ergebnissen führen. Es ist allgemein anerkannt, dass das Zetapotential eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der kolloidalen Stabilität von Suspensionen im Nanomaßstab spielt. Im Allgemeinen führt ein höherer Absolutwert des Zetapotentials zu einem stabileren kolloidalen Suspensionssystem.

Physikochemische Charakterisierung von Liposomen. a Hydrodynamische Größe und Zetapotential von Cur-LPs, die in PBS mit pH 2,5, 5,0 bzw. 7,4 hergestellt wurden. b Zetapotential von Cur-LPs, die in HCl/NaOH-Lösungen mit pH 2,5, 5,0 bzw. 7,4 hergestellt wurden. c Einkapselungseffizienz von Cur-LPs, die in PBS hergestellt wurden. Daten als Mittelwert ± SD (n .) = 3). Statistische Signifikanz zwischen den Gruppen:***p < 0,001

EE ist während der Liposomenentwicklung von Bedeutung. Normalerweise ist eine Erhöhung der EE wichtig, um die Kosten zu senken und die Wirksamkeit zu steigern. In dieser Arbeit beträgt der EE von Cur-LP-2.5 74 % (Abb. 2c), was der höchste von Cur-LP-5.0 (45 %) und Cur-LP-7.4 (64 %) ist, was darauf hindeutet, dass Cur- LP-2.5 ist die beste Formulierung für die Bereitstellung von Curcumin aus Sicht der EE. Die Gründe für die unterschiedlichen EE-Werte bei unterschiedlichen pH-Werten sind nicht ganz klar, können aber mit der Löslichkeit von Curcumin zusammenhängen, das in alkalischen oder extrem sauren Lösungsmitteln löslich ist [33].

Die Morphologie der durch SEM untersuchten Liposomen ist in Abb. 3 dargestellt. Die Partikel von LP-2.5 (Abb. 3a) und LP-5.0 (Abb. 3b) sind kugelförmig und weisen eine gleichmäßige Partikelverteilung auf. Das LP-7.4 weist ebenfalls eine kugelförmige Form auf, jedoch kann eine deutliche Adhäsion zwischen den Partikeln beobachtet werden (Abb. 3c), was darauf hindeutet, dass der Trocknungsprozess während der REM-Probenpräparation zu einer Aggregation von LP-7.4 führen würde. Dies kann auf den relativ niedrigen absoluten Wert des Zetapotentials von LP-7.4 zurückzuführen sein (Abb. 2a). Darüber hinaus ist die durch SEM gemessene Partikelgröße kleiner als die durch DLS gemessene hydrodynamische Größe, was auf den Verlust der Hydratationshülle des Liposoms nach dem Trocknungsprozess für SEM zurückzuführen ist.

SEM-Bilder von Liposomen mit einem Mikroumgebungs-pH-Wert von a 2.5, b 5.0 und c 7.4. Skalierungsleiste , 1 μm

Physische Stabilität von Liposomen

Liposom ist ein kolloidales System und seine physikalische Stabilität kann durch kolloidale Stabilität dargestellt werden, was erhebliche Auswirkungen auf die Liposomenlagerung und weitere Anwendungen hat [34, 35]. Partikelaggregation (thermodynamische Instabilität) und Sedimentation (kinetische Instabilität) sind die beiden wesentlichen Aspekte der kolloidalen Instabilität. Aggregation führt zu einer größeren scheinbaren Größe und Sedimentation führt zu Veränderungen der Transmission der Suspension. Noch wichtiger ist, dass eine Größenzunahme die Wirksamkeit von Nanosystemen direkt beeinflussen kann, da gezeigt wurde, dass die Partikelgröße einen großen Einfluss auf die zelluläre Aufnahme, Zytotoxizität, das pharmakokinetische Profil und die Gewebeverteilung hat [36, 37].

Hier haben wir die Aggregations- und Sedimentationseigenschaften von drei Liposomensystemen untersucht, um ihre thermodynamische bzw. kinetische Stabilität aufzuzeigen. Wie in Abb. 4a gezeigt, zeigten die drei LPs innerhalb von 72 h keine wesentlichen Änderungen der hydrodynamischen Größe, was darauf hindeutet, dass alle diese LPs eine sehr hohe thermodynamische Stabilität aufweisen. Währenddessen betrug die Transmissionsänderung aller drei LPs weniger als 10 % (Abb. 4b), was auf eine geringe Partikelsedimentation und damit auf eine hohe kinetische Stabilität hindeutet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die drei LPs innerhalb von 72 h eine ausgezeichnete kolloidale Stabilität aufweisen und der pH-Wert der Mikroumgebung keinen Einfluss auf die physikalische Stabilität des Liposoms hat.

Physikalische Stabilität von Liposomen mit unterschiedlichen Mikroumgebungs-pH-Werten (pH 2,5, 5,0 und 7,4). a Thermodynamische Stabilität, die eine Partikelaggregation anzeigt. b Kinetische Stabilität, die auf Partikelsedimentation hinweist. Die Daten werden als Mittelwert ± sd (n = 3)

In-vitro-Release

Das Wirkstofffreisetzungsprofil aus Liposomen wird normalerweise untersucht, um die Formulierungsqualität zu bewerten, eine Referenz für das Dosierungsschema bereitzustellen und die Wirksamkeit in vivo vorherzusagen. Im Allgemeinen haben fast alle liposomalen Systeme eine Eigenschaft zur verzögerten Wirkstofffreisetzung. Hier haben wir das In-vitro-Freisetzungsverhalten von drei Cur-LPs in PBS (pH 7,4) untersucht. In der Zwischenzeit wurde auch die Freisetzung von Curcuminlösung untersucht, um zu bestätigen, ob die Dialysemembran die Curcumindiffusion beeinträchtigen würde. Wie in Abb. 5a gezeigt, wurde Curcumin sehr schnell aus seiner Lösung freigesetzt (>80 % nach 6 h), was darauf hindeutet, dass der Dialysebeutel keinen Einfluss auf die Curcumin-Diffusion hatte. Im Gegensatz zur schnellen Freisetzung von Curcuminlösung zeigten alle Cur-LPs eine offensichtliche verzögerte Freisetzungseigenschaft (Abb. 5b), und die Freisetzungsprofile waren einander sehr ähnlich, was darauf hindeutet, dass der pH-Wert der Mikroumgebung keinen signifikanten Einfluss auf Curcumin hatte Geschwindigkeit loslassen. Im Detail wurde Curcumin in den ersten 8 h etwas schneller freigesetzt, wahrscheinlich aufgrund der anfänglichen Freisetzung (der kumulative Freisetzungsprozentsatz lag bei etwa 5 %). Nach 8 h wurde Curcumin etwas langsamer freigesetzt und der kumulative Freisetzungsprozentsatz betrug innerhalb von 72 h ~30 %. Es wird angenommen, dass die Freisetzungsgeschwindigkeit in vivo oder in Gegenwart von Serum aufgrund des Fettstoffwechsels wesentlich schneller wäre.

In-vitro-Freisetzungsprofile verschiedener Curcumin-Formulierungen in PBS (pH 7.4). a Curcuminlösung, in der Curcumin in PBS gelöst wurde, das 0,1 % Tween 80 (pH 7.4) enthält. b Cur-LPs mit unterschiedlichem Mikroumgebungs-pH-Wert von 2,5, 5,0 bzw. 7,4. Die Daten werden als Mittelwert ± sd (n = 3)

Interessanterweise sind die Veröffentlichungsprofile aller drei Cur-LPs nahe an geraden Linien. Daher wurde die lineare Anpassung an die drei Auslöseprofile durchgeführt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, zeigten alle diese Profile eine sehr gute Linearität mit einem Anpassungsgrad von mehr als 0,99 (Regressionsgleichungen werden ebenfalls angezeigt), was darauf hindeutet, dass die Freisetzung von Cur-LPs an eine Kinetik nullter Ordnung angepasst ist. In anderen ähnlichen Studien wurde festgestellt, dass die Freisetzung von Curcumin aus Liposomen nicht linear ist [38, 39]. Aus Sicht der Arzneimittelforschung und -entwicklung ist die Freisetzungskinetik nullter Ordnung das idealste Freisetzungsprofil, da sie eine konstante Wirkstofffreisetzungsrate bietet und somit in der Lage ist, die therapeutische Wirkung über einen langen Zeitraum aufrechtzuerhalten, die Verabreichungszeiten zu verkürzen und Nebenwirkungen zu reduzieren . Daher können die in dieser Arbeit hergestellten LPs vielversprechende Träger für die kontrollierte Arzneimittelabgabe sein.

Auswirkung des Mikroumgebungs-pH-Werts auf die chemische Stabilität von Cur-LP

Die chemische Stabilität von liposomalem Curcumin in FBS ist in Abb. 6 dargestellt. Nach 2 h Inkubation verblieben 89 % Curcumin für Cur-LP-2.5, signifikant höher als 74 % für Cur-LP-5.0 und 61 % für Cur-LP -7.4 (p < 0,001). 4 h nach der Inkubation verblieben 69 % Curcumin für Cur-LP-2.5, signifikant mehr als 53 % für Cur-LP-5.0 und 40 % für Cur-LP-7.4 (p < 0,01). 6 h nach der Inkubation verblieben 55 % Curcumin für Cur-LP-2.5, immer noch deutlich mehr als 43 % für Cur-LP-5.0 und 34 % für Cur-LP-7.4 (p < 0,05). Es ist klar, dass die chemische Stabilität von Cur-LPs vom pH-Wert der Mikroumgebung abhängt:Cur-LP-2.5 > Cur-LP-5.0 > Cur-LP-7.4. Diese pH-abhängige chemische Stabilität von Cur-LP stimmt mit einer anderen Arbeit überein, die die pH-abhängige Stabilität von freiem Curcumin zeigte [26]. Die in vitro-Freisetzung wurde in serumfreiem Medium durchgeführt und die kumulative Freisetzung konnte nach 72 h 30 % betragen. Die chemische Stabilitätsstudie wurde jedoch in einer serumhaltigen Lösung durchgeführt, in der Serumenzyme das freigesetzte Curcumin abbauen und auch Liposomen brechen und somit das nicht freigesetzte Curcumin abbauen konnten. Aus diesem Grund wurden in der In-vitro-Freisetzungsstudie 30 % Curcumin nach 72 Stunden freigesetzt, während bei Cur-LP-2.5 in der Serumstabilitätsstudie nur 55 % nach 6 Stunden verblieben.

Chemische Stabilität von liposomalem Curcumin (Cur-LPs) bei unterschiedlichen Mikroumgebungs-pH-Werten (pH 2,5, 5,0 und 7,4). Die Stabilität wurde durch Quantifizieren des verbleibenden Curcumins nach Inkubation von Cur-LPs mit 50% FBS untersucht. Die Daten werden als Mittelwert ± sd (n = 3). Statistische Signifikanz zwischen den Gruppen:***p < 0,001, **p < 0.01, *p < 0.05

Liposomen bestehen in ihrer Struktur aus zwei Teilen:einer ist die hydrophobe Lipiddoppelschicht und der andere ist die hydrophile innere wässrige Kammer. Es ist leicht zu verstehen, dass sich ein pH-sensitiver hydrophiler Wirkstoff in der inneren wässrigen Kammer befindet und seine Stabilität durch den pH-Wert der Mikroumgebung in der wässrigen Kammer erheblich beeinflusst würde, wo das Puffervolumen und die Pufferkapazität viel höher wären als in der Lipiddoppelschicht. Im Gegensatz dazu ist Curcumin ein hydrophobes Molekül und würde sich in der Lipiddoppelschicht befinden. Aus diesem Grund ist es sehr interessant, die von der Mikroumgebung pH-abhängige chemische Stabilität von liposomalem Curcumin zu finden. Es wird angenommen, dass der Raum in der Lipiddoppelschicht nicht absolut wasserfrei wäre, obwohl er hydrophob ist. Wie wir wissen, ist die lebende Zellmembran in ihrer Lipiddoppelschicht nicht absolut wasserfrei. Stattdessen enthält es ein bestimmtes kleines Volumen an wässriger Lösung zum Transport von wasserlöslichen Molekülen und Ionen. Ebenso würde auch in der hydrophoben Lipiddoppelschicht nach erfolgreicher Liposomenherstellung ein gewisses kleines Volumen an Pufferlösung mit den gleichen Komponenten wie die innere Kammer vorhanden sein. Somit kann der hydrophobe Wirkstoff, der sich in der Lipiddoppelschicht befindet, direkt durch den Mikroumgebungs-pH des Liposoms beeinflusst werden. Darüber hinaus kann die saure Mikroumgebung die Aktivitäten einiger Enzyme reduzieren, die unter normalen physiologischen Bedingungen die beste Aktivität zeigen. Dies trägt auch zur höheren chemischen Stabilität von liposomalem Curcumin bei einem niedrigeren pH-Wert der Mikroumgebung bei. Es wurde berichtet, dass Liposomen, die aus Ei-Phosphatidylcholin (EPC) bestehen, ihren internen pH-Gradienten in Puffer (pH 7,4) schnell verloren und die Fähigkeit zur Aufrechterhaltung des pH-Gradienten durch Substitution von EPC (Phasenübergangstemperatur (T _m ) ≈ −5 °C) mit dem hohen T _m (41 °C) Lipid DPPC (Dipalmitoylphosphatidylcholin) und durch Zugabe von Cholesterin [40]. In dieser Arbeit besteht das Liposom aus Sojabohnenlecithin (T _m liegt bei etwa 238,2 °C [41]) und Cholesterin. Daher kann erwartet werden, dass der Mikroumgebungs-pH-Gradient der in dieser Arbeit hergestellten Liposomen über einen langen Zeitraum erhalten bleibt. Dies ist eine starke Unterstützung für die oben gezeigten Ergebnisse und Annahmen.

In-vitro-Wirksamkeit bei Krebs

Wir haben oben die mikroumgebungs-pH-abhängige chemische Stabilität von liposomalem Curcumin nachgewiesen. Hier führten wir eine vorläufige In-vitro-Studie durch, um die Antikrebswirksamkeit dieses liposomalen Curcumins zu untersuchen. Interessanterweise konnten die leeren LPs im Vergleich zur Kontrollgruppe das Zellwachstum an Tag 1 steigern und diese Funktion bis zu einem gewissen Grad bis Tag 3 aufrechterhalten (Abb. 7). Dies weist darauf hin, dass leere LPs die Zellen mit Nährstoffen versorgen können, was mit unserem vorherigen Bericht übereinstimmt [27]. Das freie Curcumin zeigte aufgrund seiner recht begrenzten Löslichkeit eine geringe Wirksamkeit gegen Krebs. Im Gegensatz dazu zeigten Cur-LPs eine signifikante Anti-Krebs-Wirksamkeit in einer pH-abhängigen Weise der Mikroumgebung. Nach einer eintägigen Behandlung zeigten Cur-LP-2.5 und Cur-LP-5.0 eine signifikant stärkere Fähigkeit, das HepG2-Zellwachstum zu hemmen als Cur-LP-7.4 (die Zelllebensfähigkeit betrug 80 % für Cur-LP-2.5 und Cur-LP -5,0 und 90 % für Cur-LP-7.4). Am Tag 3 nach der Behandlung nahm die Lebensfähigkeit der Zellen erheblich ab und Cur-LP-2.5 und Cur-LP-5.0 zeigten eine vergleichbare Antikrebswirksamkeit und waren signifikant höher als Cur-LP-7.4. Die Zelllebensfähigkeit betrug 24 % für Cur-LP-2.5 (p < 0,05 vs. Cur-LP-7.4), 21 % für Cur-LP-5.0 (p < 0,01 gegenüber Cur-LP-7.4) und 39 % für Cur-LP-7.4. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Wirksamkeit von liposomalem Curcumin gegen Krebs vom pH-Wert und der Zeit der Mikroumgebung abhängt. In Anbetracht der höheren EE und chemischen Stabilität von Cur-LP-2.5 als Cur-LP-5.0 hätten Liposomen mit einem Mikroumgebungs-pH von 2,5 das größte Potenzial für die praktische Anwendung.

Anti-Krebs-Wirksamkeit von liposomalem Curcumin mit unterschiedlichem Mikro-Umwelt-pH-Wert (2,5, 5,0 und 7,4). Die Lebensfähigkeit von HepG2-Zellen an den Tagen 1 und 3 nach der Behandlung mit leeren LPs, freiem Curcumin und Cur-LPs wurde durch den cck-8-Assay untersucht. Als Kontrolle dienten die mit serumhaltigem Leerkulturmedium behandelten Zellen. Die Daten werden als Mittelwert ± sd (n = 3). Statistische Signifikanz zwischen den Gruppen:**p < 0.01, *p < 0.05

Schlussfolgerungen

Liposom ist als ein weit verbreitetes Arzneimittelabgabesystem in der Lage, die Löslichkeit von wasserunlöslichen Arzneimitteln zu verbessern, die Arzneimittelnutzlasten vor der rauen physiologischen Umgebung zu schützen und die Nutzlasten an ein Zielgewebe abzugeben. Die Abgabe von pH-empfindlichen Arzneimitteln ist jedoch immer noch durch ihre natürliche Instabilität unter physiologischen Bedingungen (neutrale Umgebung) eingeschränkt. In dieser vorliegenden Arbeit schlagen wir einen neuen Ansatz zur Verbesserung der chemischen Stabilität von pH-sensitiven Wirkstoff-Nutzlasten vor, indem wir die Acidität von Liposomen in der Mikroumgebung regulieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die chemische Stabilität und In-vitro-Wirksamkeit des pH-sensitiven Modellwirkstoffs Curcumin durch die Ansäuerung der Mikroumgebung des Liposoms signifikant verbessert wird. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Regulierung des Mikroumgebungs-pH-Werts von Liposomen möglich ist, um die chemische Stabilität von pH-empfindlichen Wirkstoff-Nutzlasten zu verbessern, sogar für hydrophobe Wirkstoffe, die sich in der Lipiddoppelschicht befinden.