Saure Mikroumgebungen in Liposomen erhöhen Curcumin-Stabilität und Antikrebswirksamkeit signifikant

Zusammenfassung

Liposome bieten eine vielseitige Plattform für die Verabreichung bioaktiver Verbindungen, doch die intrinsische Instabilität pH-empfindlicher Medikamente unter physiologischen Bedingungen bleibt eine Herausforderung. Wir entwickelten eine liposomale Formulierung, die eine saure Mikroumgebung in ihrem wässrigen Kern erzeugt, um die eingekapselte Fracht zu schützen. Curcumin-beladene Liposome (Cur-LPs) mit internen pH-Werten von 2,5, 5,0 und 7,4 wurden hergestellt, alle mit vergleichbaren Partikelgrößen (~300 nm), schmaler Polydispersität (<0,2) und ähnlichen In-vitro-Freisetzungsprofilen. Bemerkenswert war, dass die chemische Integrität von Curcumin in 50 % fötalem Rinderserum und seine Zytotoxizität gegen HepG2-Zellen stark vom internen pH abhingen: Cur-LP-2,5 > Cur-LP-5,0 > Cur-LP-7,4. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass ein saurer Kern in Liposomen eine praktische und effiziente Strategie zur Stabilisierung pH-empfindlicher Therapeutika darstellt.

Hintergrund

Künstliche Lipidvesikel, oder Liposome, emulieren Zellmembranen mit einer Phospholipid-Doppelschicht, die ein wässriges Inneres umgibt, und bieten hohe Arzneimittelladung, Bioabbaubarkeit und Biokompatibilität [1-5]. Ihre amphiphile Architektur ermöglicht die Solubilisierung hydrophober Medikamente, während sie diese vor der rauen extrazellulären Umgebung abschirmen [6-9]. Oberflächenmodifikation verlängert die systemische Zirkulation weiter oder leitet Frachten in spezifische Gewebe [10-14], und mehrere liposomale Formulierungen haben klinische Zulassung erreicht [15-18].

Trotz dieser Vorteile bleibt die Verabreichung von Medikamenten, die bei neutralem pH instabil sind, problematisch. Konventionelle Liposome werden typischerweise in phosphatgepuffertem Salin (PBS) bei pH 7,4 hergestellt, wodurch pH-empfindliche Frachten einer ungünstigen Umgebung ausgesetzt werden. Curcumin, ein lipophiles Polyphenol mit potenten entzündungshemmenden und antikrebswirksamen Eigenschaften, exemplifiziert dieses Problem: seine schlechte wässrige Löslichkeit und pH-vermittelte Degradation limitieren die klinische Translation [19-23]. Daher könnte die Erzeugung einer sauren Mikroumgebung im liposomalen Kern die Integrität solcher Medikamente bewahren.

In dieser Studie nutzten wir das innere wässrige Kompartiment von Liposomen, um einen einstellbaren Säuregradienten zu erzeugen und dessen Einfluss auf Curcumin-Einkapselung, Stabilität und Antikrebsaktivität zu bewerten.

Methoden

Materialien

Phosphatidylcholin aus Sojalezithin (Injektionsqualität) wurde von Shanghai Tai-Wei Pharmaceutical Co., Ltd. bezogen; Cholesterin wurde von Amresco gekauft; Poloxamer 188 (F68) wurde von BASF (China) gespendet; Curcumin (≥ 98 %) wurde von Sigma geliefert; fötales Rinderserum (FBS) stammte von HyClone. Alle Reagenzien waren analytischer Qualität.

Herstellung von Curcumin-beladenen Liposomen

Cur-LPs wurden über die Dünnschichtverdampfungsmethode [27,28] mit Modifikationen hergestellt. Phospholipide (75 mg) und Cholesterin (5 mg) wurden in 0,5 ml Ethanol mit 2 mg/ml Curcumin gelöst. Die Lösung wurde mit 5 ml 0,001 M PBS (pH 2,5, 5,0 oder 7,4) mit 1 % (Gew./Vol.) F68 gemischt, um die Größenverteilung zu verengen. Nach 1-minütigem magnetischem Rühren bei 35 °C wurde das Gemisch 30 min unter Vakuum und im Dunkeln verdampft, um Ethanol zu entfernen. Subsequentes Niedriggeschwindigkeitszentrifugieren (3.000 U/min, 5 min) entfernte freies Curcumin; der Pellet wurde dann hochgeschwindigkeitszentrifugiert (16.000 U/min, 10 min) und in PBS (pH 7,4) resuspendiert. Die resultierenden Formulierungen wurden als Cur-LP-2,5, Cur-LP-5,0 und Cur-LP-7,4 bezeichnet; leere Liposome wurden identisch hergestellt.

Charakterisierung

Dynamische Lichtstreuung (DLS) maß hydrodynamische Größe und Polydispersitätsindex (PDI); Zeta-Potenzial wurde durch elektrophoretische Lichtstreuung (ELS) mit einem Malvern Zetasizer Nano ZS90 bei 25 °C bewertet. Einkapselungseffizienz (EE) wurde per Fluoreszenz nach Trennung von eingekapseltem von freiem Curcumin durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation [29] berechnet.

Rasterelektronenmikroskopie

REM-Bilder (FEI INSPECT F) wurden nach 100-facher Verdünnung in destilliertem Wasser, Tropfenauftrag auf Glas, Lufttrocknung und Goldbeschichtung aufgenommen.

Physikalische Stabilität

Kolloidale Stabilität wurde durch Überwachung von Größenänderungen und Transmission (550 nm) über 72 h bei 37 °C bewertet. Aggregation (thermodynamisch) und Sedimentation (kinetisch) wurden jeweils quantifiziert.

In-vitro-Freisetzung

Curcumin-Freisetzung aus Cur-LPs wurde mit einem 10 kDa Dialysebeutel in PBS (pH 7,4, 0,1 % Tween 80) bei 37 °C mit 100 U/min Rühren gemessen. Proben wurden zu vorgegebenen Intervallen entnommen, mit frischem Medium ersetzt und per Fluoreszenz (Ex 458 nm, Em 548 nm) analysiert.

Chemische Stabilität in Serum

Cur-LPs (10-fach verdünnt) wurden mit 1 ml 50 % FBS gemischt und bei 37 °C, 100 U/min inkubiert. Zu festgelegten Zeiten wurden Aliquots entnommen, mit Ethanol gemischt, zentrifugiert, und das verbleibende Curcumin per Fluoreszenz quantifiziert.

In-vitro-Antikrebswirksamkeit

HepG2-Zellen wurden mit 10.000 Zellen/Well in 96-Well-Platten ausgesät, 24 h in PRIM-1640 + 10 % FBS kultiviert, mit PBS gewaschen und dann mit 4 µg/ml Curcumin (frei oder eingekapselt) in serumfreiem Medium behandelt. Zellviabilität wurde nach 1 und 3 Tagen mittels CCK-8-Assay bewertet. Viabilität wurde als % relativ zu unbehandelter Kontrolle ausgedrückt.

Statistik

Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. Zwei-seitiger Student's t-Test bestimmte Signifikanz; p < 0,05 galt als signifikant.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung der Liposome

Alle Cur-LPs wiesen ähnliche Partikelgrößen (~300 nm) und PDI < 0,2 auf (Abbildung 1a). Zeta-Potenziale waren für Cur-LP-5,0 und Cur-LP-2,5 negativer (~ −18 mV) im Vergleich zu Cur-LP-7,4 (−9 mV), was den Einfluss der internen Säure auf die Oberflächenladung widerspiegelt (Abbildung 1b). Die höhere EE für Cur-LP-2,5 (74 %) versus Cur-LP-5,0 (45 %) und Cur-LP-7,4 (64 %) deutet darauf hin, dass säurehaltige Innere die Curcumin-Beladung verbessern, möglicherweise aufgrund veränderter Löslichkeitsdynamik bei niedrigem pH [33].

REM-Bildgebung bestätigte kugelförmige Morphologie über alle Formulierungen hinweg (Abbildung 2). Geringfügige Aggregation wurde für Cur-LP-7,4 festgestellt, konsistent mit seinem niedrigeren Zeta-Potenzial, und die beobachteten REM-Durchmesser waren kleiner als DLS-Werte aufgrund von Dehydratationseffekten.

Physikalische Stabilität

Über 72 h bei 37 °C zeigten keine der Formulierungen signifikante Größenzunahme oder Transmissionsänderung (< 10 %), was robuste thermodynamische und kinetische Stabilität unabhängig vom internen pH anzeigt (Abbildung 3).

In-vitro-Freisetzung

Curcumin wurde aus freier Lösung schnell freigesetzt (> 80 % innerhalb von 6 h), was bestätigte, dass die Dialysemembran die Diffusion nicht behinderte. Cur-LPs zeigten anhaltende, nahezu nullte-Ordnung-Freisetzung mit ~30 % kumulativer Freisetzung über 72 h (Abbildung 4). Lineare Regression (R² > 0,99) unterstrich die konsistenten Freisetzungskinetiken, ein vorteilhaftes Merkmal für die Aufrechterhaltung therapeutischer Spiegel.

Einfluss des internen pH auf chemische Stabilität

Serum-Inkubation offenbarte eine ausgeprägte pH-Abhängigkeit: nach 6 h behielt Cur-LP-2,5 55 % des Curcumins, verglichen mit 43 % (Cur-LP-5,0) und 34 % (Cur-LP-7,4) (Abbildung 5). Dieser Trend spiegelt die bekannte pH-Sensitivität von freiem Curcumin [26] wider. Der saure Kern unterdrückt wahrscheinlich enzymatische Aktivität und schützt Curcumin innerhalb der Lipiddoppelschicht, die, entgegen der Erwartung, von einem kleinen wässrigen Volumen durchdrungen wird, das die Arzneimittelstabilität beeinflussen kann.

In-vitro-Antikrebswirksamkeit

Leere Liposome förderten die HepG2-Proliferation bei Tag 1 leicht, was einen nährstoffbedingten Effekt suggeriert [27]. Freies Curcumin zeigte begrenzte Zytotoxizität aufgrund schlechter Löslichkeit. Im Gegensatz dazu hemmten Cur-LPs das Zellwachstum signifikant in pH-abhängiger Weise: nach 1 Tag betrug die Viabilität 80 % (Cur-LP-2,5 & Cur-LP-5,0) versus 90 % (Cur-LP-7,4); nach 3 Tagen fiel die Viabilität auf 24 % (Cur-LP-2,5), 21 % (Cur-LP-5,0) und 39 % (Cur-LP-7,4) (Abbildung 6). Die überlegene Leistung von Cur-LP-2,5 stimmt mit seiner höheren EE und Stabilität überein.

Schlussfolgerungen

Die Modulation der internen Säure von Liposomen bietet eine einfache, aber leistungsstarke Strategie zur Verbesserung der chemischen Stabilität und therapeutischen Wirksamkeit pH-empfindlicher Medikamente, sogar für hydrophobe Moleküle, die in der Lipiddoppelschicht residieren. Die saure Mikroumgebung in Cur-LP-2,5 bewahrte nicht nur Curcumin vor Serumdegradation, sondern verstärkte auch seine Antikrebsaktivität in HepG2-Zellen. Dieser Ansatz lässt sich leicht auf andere labile Therapeutika erweitern und könnte deren klinische Leistung verbessern.