Entwicklung von elektrogesponnenem Chitosan-Polyethylenoxid/Fibrinogen-Biokomposit für potenzielle Wundheilungsanwendungen

Hintergrund

Trotz zahlreicher Fortschritte auf dem Gebiet der Wundbehandlung wurden nur wenige bioaktive Verbände mit der Fähigkeit, den Heilungsprozess zu verbessern, kommerzialisiert. Dieser Mangel an erfolgreichem Produkt kann auf die Komplexität des Wundheilungsprozesses zurückgeführt werden, an dem zahlreiche lösliche Mediatoren, Blutzellen, Parenchymzellen und Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) beteiligt sind. Wachstumsfaktoren spielen eine zentrale Rolle im Wundheilungsprozess, indem sie die Zellproliferation, -migration und -differenzierung fördern. Die schnelle Elimination und kurze Halbwertszeiten im Körper [1,2,3] haben jedoch die klinische Akzeptanz der Wachstumsfaktortherapie zur Förderung der Heilung und Geweberegeneration eingeschränkt [4, 5]. Derzeit ist eine wiederholte in-vivo-Verabreichung von Wachstumsfaktoren erforderlich, um therapeutische Wirkungen (z. B. zelluläre Rekrutierung und Differenzierung) zu erzielen. Die Entwicklung eines Wundverbands, der eine anhaltende, lokalisierte Abgabe von Wachstumsfaktoren ermöglicht, würde die Behandlungsergebnisse erheblich verbessern und die klinische Akzeptanz beschleunigen.

Der Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) spielt eine entscheidende Rolle als Initiator und Mediator der Wundheilung; es wirkt als chemotaktisches Mittel für Neutrophile, Monozyten und Fibroblasten [6] und hilft, die Matrixablagerung zu regulieren. Darüber hinaus kann PDGF die Differenzierung von Fibroblasten in Myofibroblasten hemmen, was die Wundkontraktionen beeinflussen und die Narbenbildung verringern kann [6]. PDGF, das unter dem Markennamen Regranex® vertrieben wird, ist der einzige Wachstumsfaktor, der derzeit von der FDA zugelassen ist und zur Behandlung von diabetischen Geschwüren an den unteren Extremitäten vorgesehen ist. Einmal täglich topische Anwendung von Regranex® Gel (2,2 μg/cm ² .) von Geschwüren) führt nachweislich zu einer 30 % schnelleren Heilungszeit mit minimalen Nebenwirkungen. Die tägliche topische Anwendung und Entfernung von Regranex® ist jedoch unbequem und kann die Lebensqualität des Patienten beeinträchtigen.

Elektrospinnen hat sich als bemerkenswerte Technik bei der Herstellung biomimetischer Nanofasergerüste unter Verwendung biologisch signifikanter Polymere etabliert. Zahlreiche biologisch abbaubare synthetische (z. B. Polycaprolacton) und natürliche Polymere (z. B. Kollagen) wurden zu nichtgewebten Nanofasergerüsten elektrogesponnen, die ein hohes Oberflächen-Volumen-Verhältnis und Porositätseigenschaften aufweisen, die für Arzneimittelabgabe- und Wundverbandanwendungen wichtig sind. Natürlich vorkommende Polymere (z. B. Collagen, Elastin und Fibrinogen) sind aufgrund ihrer Bioaktivität, Biokompatibilität und einzigartigen Fähigkeit, spezifische Wachstumsfaktoren wie PDGF zu binden, besonders attraktive Wundverbandmaterialien. Fibrinogen (Fb), ein globuläres Plasmaprotein mit 340 kDa, spielt durch seine aktivierte Form Fibrin, das als temporäre Matrix für die Gewebereparatur und -regeneration fungiert, eine wichtige Rolle bei der Gerinnselbildung. Das Fehlen von Fb und Fibrin wurde mit Wundheilungsstörungen korreliert [7]. Fb-basierte Produkte zeigen biologische Abbaubarkeit, Nicht-Immunogenität und Förderung der Zellmigration und wurden zuvor als Hydrogele [8,9,10] und Nassextrusionskabel [11, 12] entwickelt; jedoch haben die physikalischen und strukturellen Eigenschaften dieser Materialien ihre klinische Anwendung eingeschränkt. Hydrogelen fehlt die strukturelle und mechanische Integrität für den Langzeitgebrauch, und Nassextrusionsfasern weisen exponentiell größere Durchmessergrößen (200–250 μm) auf als die native ECM (200–500 nm). Wnek et al. zeigten, dass Elektrospinnen jedoch die Möglichkeit bietet, Fb-Gerüste herzustellen, die natürlichen ECM-Strukturen sehr ähneln [13]. Obwohl die resultierenden Nanofasern gegenüber Hydrogelen verbesserte mechanische Eigenschaften aufwiesen, fehlten der Struktur noch optimale mechanische Eigenschaften für Wundauflagen [14].

Um die mechanischen Eigenschaften des elektrogesponnenen Fibrinogengerüsts zu verbessern, könnte zusätzliches Polymer eingeführt werden, um die Nanofasern zu verstärken [15]. Insbesondere Chitosan (CS), ein N -deacetyliertes Derivat von Chitin, hat sich als wünschenswerte antimikrobielle Eigenschaften bei Wundauflagen erwiesen [16, 17]. CS ist nicht nur ein wirksames antimikrobielles Mittel, sondern wurde auch für verschiedene biomedizinische Anwendungen elektrogesponnen, einschließlich der gesteuerten Knochenregeneration [18, 19], der transdermalen Arzneimittelabgabe [20], der gezielten Stammzelldifferenzierung [21] und der Hämostase [22]. Aufgrund der polykationischen Natur von Chitosan gibt es erhebliche Schwierigkeiten beim Elektrospinnen unter Verwendung üblicher Lösungsmittel. Um diese Schwierigkeiten zu überwinden und die Elektrospinnbarkeit zu verbessern, wurde CS mit verschiedenen anderen Polymeren wie Poly(vinylpyrrolidon) [23], Poly(ethylenoxid) (PEO) [16] und Poly(vinylalkohol) [24] gemischt. In ähnlicher Weise hat die polykationische Natur von CS aufgrund starker elektrostatischer Wechselwirkungen eine erfolgreiche Kombination mit Fb zu einem einzigen Gerüst eingeschränkt. In dieser Arbeit wurde diese Einschränkung durch die Verwendung eines vielseitigen Doppeldüsen-Elektrospinnsystems überwunden. Die resultierenden Nanofasergerüste wurden unter Verwendung verschiedener physikalisch-chemischer Charakterisierungen analysiert. Wir stellten die Hypothese auf, dass das neuartige kombinatorische CS-Fb-Nanofasergerüst einen brauchbaren Kandidaten für einen bioaktiven und biomimetischen Wundverband darstellen würde, der PDGF liefern und die für die Wundheilung erforderliche Fibroblastenmigration wirksam beeinflussen könnte.

Methoden

Materialien

Essigsäure (Eissäure, ≥ 99,85%), CS (niedriges Molekulargewicht, 75–85% Deacetylierung), PEO (MW 300.000 g/mol), Fb (Typ IS, 65–85% Protein), 1,1,1, 3,3,3-Hexafluorisopropanol (HFIP) und Rinderserumalbumin (BSA, ~96 %) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde von EMD Millipore (Billerica, MA, USA) bezogen. Humane dermale Fibroblasten (PCS-201-012) und Zellkulturreagenzien wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) erworben. Trägerfreier rekombinanter humaner von Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor-BB (rhPDGF-BB) wurde von PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) bezogen. Alle Reagenzien waren von Reagenzqualität und wurden ohne weitere Reinigung oder Modifikation verwendet.

Vorbereitung von elektrogesponnenen Chitosan-Polyethylenoxid/Fibrinogen-Verbundgerüsten

Chitosan-PEO-Stammlösungen wurden durch Auflösen von CS und PEO in 1 % Essigsäure mit BSA (0,5 % v /v ) und DMSO (10 % v /v ), um einen Gesamtpolymergehalt von 5,5 Gew. % mit einem Massenverhältnis von CS zu PEO von 2:1 zu erhalten. Polyethylenoxid wurde hinzugefügt, um die Fähigkeit zum Elektrospinnen von CS zu verbessern, wie zuvor beschrieben [16]. Fibrinogen-Stammlösungen (110 mg/ml) wurden durch Auflösen von Fb in einem Teil 10× Eagle’s Minimum Essential Media (EMEM) und neun Teilen HFIP hergestellt. CS-PEO- und Fb-Stammlösungen wurden bei Raumtemperatur gerührt, bis sie vollständig gelöst waren. Bei beladenen Gerüsten wurde PDGF unmittelbar vor dem Elektrospinnen in jede Polymerlösung eingemischt. Elektrogesponnene CS-PEO/Fb-Komposit-Nanofasergerüste wurden unter Verwendung eines Elektrospinnsystems mit mehreren Düsen hergestellt (Abb. 1). Die Lösungen wurden einzeln geladen und mit einer Einwegspritze, die an eine 18-Gauge-Spinndüse und eine NE-1000-Spritzenpumpe (New Era Pump Systems, Farmingdale, NY) angeschlossen war, mit einer Flussrate von 0,7 und 1,0 ml h<. mechanisch in das System gepumpt sup> −1 für CS-PEO bzw. Fb. Der mit 25 U/min rotierende Dornkollektor befand sich zwischen den Spinndüsenspitzen in einem Abstand von 22 cm für CS-PEO und 12,5 cm für Fb. Während des Herstellungsprozesses wurden Gleichspannungen von 28 kV und 22 kV an die Spinndüsenspitzen für CS-PEO- bzw. Fb-Polymerlösungen angelegt. Hergestellte Nanofasergerüste wurden entweder für biologische Assays auf 18-cm-Glasdeckgläsern gesammelt oder zur Permeabilitäts- und Zugfestigkeitsanalyse direkt vom Dorn geschnitten. Alle Elektrospinning-Experimente wurden bei Raumtemperatur und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 35–45 % für 3 h durchgeführt. PDGF enthaltende Proben wurden bei - 20 °C in einem Exsikkator gelagert, während unbeladene Gerüste nach der Herstellung bei Raumtemperatur in einem Exsikkator gelagert wurden.

Schema eines Elektrospinners mit zwei Spinndüsen

Nanofaser-Morphologie und -Durchmesser

Elektrogesponnene Nanofasergerüste wurden mit Gold sputterbeschichtet und unter Verwendung von Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FESEM) (Zeiss Sigma VP-40, Deutschland) beobachtet. Pro Gerüst wurden 20 mikroskopische Aufnahmen gemacht, und pro Formulierung wurden drei einzeln gesponnene Gerüste analysiert. Die mittleren Nanofaserdurchmesser wurden berechnet, indem fünf zufällige Punkte pro Mikroaufnahme unter Verwendung von ImageJ (NIH, Bethesda, MD) gemessen wurden. Pro Gerüstformulierung wurden insgesamt 100 Messungen durchgeführt.

Oberflächenchemische Charakterisierung

Flugzeit-Ionen-Massenspektrometrie (ToF-SIMS) wurde verwendet, um die Oberflächenchemie und die Beiträge der Polymerkomponenten im Gerüst zu analysieren. ToF-SIMS ist eine empfindliche und tiefgreifende oberflächenanalytische Methode, die die chemische Zusammensetzung der obersten Nanometerschicht eines Materials durch Beschuss mit hochenergetischem Bi₃ . bewertet ²⁺ Cluster im Ultrahochvakuum [25, 26]. Von der Materialoberfläche ausgestoßene Sekundärionenfragmente werden dann basierend auf ihrem Verhältnis von Atommasse zu Ladung (m/z) analysiert und verwendet, um auf die chemische Zusammensetzung der gesamten Oberfläche zu schließen.

Die ToF-SIMS-Analyse wurde von Evans Analytics Group (EAG, Sunnyvale, CA) unter Verwendung eines ToF-SIMS IV (Ion-ToF GmbH, Deutschland) mit einer Bismut-Flüssigmetall-Ionenkanone (30 kV) durchgeführt. Das Instrument wurde in einem Ionenmikrosondenmodus betrieben, bei dem drei positive und negative Ionenspektren von jeder Probe aufgenommen wurden. Ausgewählte positive und negative Ionen wurden über einen 50 × 50-μm-Rasterbereich mit einer 2048 × 2048-Pixel-Bildauflösung kartiert, um eine Polymerkomponentenkartierung der Gerüste bereitzustellen. Für jedes Fragment wurde eine normalisierte Intensität angegeben, die als die Zahl jedes Sekundärions dividiert durch die Gesamtzahl der aufgezeichneten Ionen multipliziert mit 10.000 definiert ist. Der Mittelwert von drei verschiedenen Stellen auf der Oberfläche von sechs unabhängig hergestellten Proben wurde analysiert (n = 6). Die von ToF-SIMs analysierte CS-PEO- und Fb-Polymerverteilung war repräsentativ für das gesamte Gerüst.

Wasserkontaktwinkel von CS-PEO-, CS-PEO/Fb- und Fb-Gerüsten wurden gemäß den American Standards for Testing Methods (ASTM) D7334-08 bestimmt. Nanofaserige Gerüste wurden auf Deckgläser aus Glas elektrogesponnen. Ein einzelner Tropfen destilliertes Wasser (2 μL) wurde auf die Oberfläche des Gerüsts aufgetragen und der Kontaktwinkel innerhalb von 30 s mit dem Krüss DSA10 MK2 Drop Shape Analyzer (Krüss, Hamburg, Deutschland) gemessen. Die Messungen wurden für jede Probe dreimal an verschiedenen Stellen wiederholt und der mittlere Kontaktwinkel wurde berechnet. Sechs unabhängig voneinander elektrogesponnene Gerüste wurden analysiert (n = 6).

Mechanische einachsige Zugfestigkeit

Die mechanischen Eigenschaften von elektrogesponnenen Gerüsten wurden bei Raumtemperatur mit einem Instron® E3000 ElectroPuls (Instron, Canton, MA) mit einer 250-N-Wägezelle bei einer Dehnungsrate von 1 mm min ⁻¹ . gemessen . Die Dicke der Proben wurde an sechs zufälligen Positionen mit dem Keyence 3D Laser Scanning Microscope VK-200 (Keyence, Itasca, IL) gemessen. Die Dicke der für die Zugprüfung verwendeten Gerüste betrug 93,8 ± 7,4 µm. Vor dem Test wurden die Gerüste in rechteckige Proben von 40 ×   25 mm geschnitten. Die erhaltenen Daten wurden aufgezeichnet und als Spannungs-Dehnungs-Kurven aufgetragen, wobei die Zugspannung als das Verhältnis der Kraft zur Querschnittsfläche der Probe und die Dehnung als die Längenänderung über die ursprüngliche Länge definiert wurde. Elastizitätsmodul, Zugspannung und Bruchdehnungsberechnungen wurden aus Spannungs-Dehnungs-Kurven von durchschnittlich zehn Proben pro Formulierung erhalten.

Wasserdampfübertragungsrate

Die Wasserdampfübertragungsrate von CS-PEO/Fb-Gerüsten wurde gemäß der Trockenmittelmethode ASTM E96/E96M gemessen. Pro Formulierung wurden insgesamt sechs unabhängig voneinander elektrogesponnene Proben hergestellt und auf die Öffnung von Testgefäßen gelegt, die wiederverwendbares Silicagel-Trockenmittel bei Raumtemperatur und einer relativen mittleren Luftfeuchtigkeit von 58,2 ± 5,2 % enthielten. Die Wasserdampfdurchlässigkeitsrate (WVTR) wurde aus dem Gewicht der Testbehälter berechnet, die zu verschiedenen Zeitpunkten über 48 Stunden gemessen wurden:

wo G stellt die Gewichtsänderung des Testbehälters dar, t ist die verstrichene Zeit und A ist die Querschnittsfläche des Gerüsts.

In-vitro-Zelllebensfähigkeit

Die indirekte Zytotoxizität der Gerüste wurde anhand eines an die ISO10993-5-Standardtestmethode angepassten Ansatzes bewertet [27, 28]. Humane dermale Fibroblasten wurden bei 37 °C und 5 % CO₂ . kultiviert in serumfreiem Fibroblastenmedium und alle 3 Tage aufgefrischt. Sobald die Zellen Konfluenz erreichten, wurden sie trypsiniert und in 12-Well-Platten ausgesät (10.000 Zellen/ml). Am folgenden Tag wurden die Medien aufgefüllt und Nanofasergerüste eingeführt. Die Zellproliferation wurde über 120 h mit einem 2-(4-Iodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliumnatrium (WST-1)-Zellproliferationsassay überwacht.

Visualisierung von Fibroblasten

Humane dermale Fibroblasten wurden trypsiniert und auf CS-PEO-, Fb- und CS-PEO/Fb-Gerüste ausgesät. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 °C und 5 % CO₂ , wurden die Zellen gewaschen und mit dem LIVE/DEAD™ Cell Viability Kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemäß den Herstellerangaben gefärbt. Zusätzlich wurden Adhäsion und Anheftung von humanen Fibroblasten an das Gerüst durch Anfärben mit Phalloidin-Atto 565 (Sigma Aldrich und 4′,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI; ThermoFisher Scientific) gemäß Herstellerangaben bewertet. Bilder wurden beobachtet und aufgenommen mit einem inversen konfokalen Mikroskop (Nikon C1, C1EZ, Melville, NY, USA).

In-vitro-Degradation

Der Abbau von CS-PEO/Fb-Nanofasergerüsten wurde in Fibroblasten-Basalmedium (FBM, ATCC) bei 37 °C und 5 % CO₂ . durchgeführt . Die Gerüste wurden in FBM eingetaucht und 1, 6, 24 oder 48 h inkubiert. Das anfängliche Trockengewicht jedes Gerüsts wurde notiert; Zu jedem Zeitpunkt wurden die Gerüste gewaschen, gefriergetrocknet und erneut gewogen. Der Abbau des Gerüsts wurde nach folgender Formel berechnet:

wo W ₀ ist das Anfangsgewicht des Gerüsts und W _t ist das Gewicht des Gerüsts zum jeweiligen Zeitpunkt.

PDGF-Freigabe und -Erkennung

Eluate, die von spezifischen Zeitpunkten während des in vitro-Abbauexperiments gesammelt wurden, wurden unter Verwendung eines rhPDGF-BB-spezifischen ELISA-Kits (R&D System, Minneapolis, MN) getestet. Die ermittelten Extinktionswerte wurden mit einem Standard verglichen, wie in den Anweisungen des Herstellers zur Bestimmung der PDGF-Konzentration angegeben. Die nachgewiesene PDGF-Menge wurde auf das Gewicht (mg) des entsprechenden verwendeten Gerüsts normiert.

Migrationseigenschaft des freigesetzten thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktors

Die Migration von menschlichen dermalen Fibroblasten wurde unter Verwendung des ORIS™-Zellmigrations-Assay-Kits (Platypus Technologies, Madison, WI) bewertet, um die PDGF-Bioaktivität zu bestimmen. Kurz gesagt, mit Mitomycin C (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) behandelte Fibroblasten wurden trypsiniert und in 96-Well-Platten mit vom Hersteller bereitgestellten Stopfen ausgesät und bei 37 ° . inkubiert C und 5 % CO₂ über Nacht. Am folgenden Tag wurden die Stopfen entfernt, wodurch Migrationszonen geschaffen wurden, in die 100 μl der zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelten Eluate gegeben und weitere 24 Stunden inkubiert wurden. Frisch zubereitet 50 ng ml ⁻¹ PDGF und basale Fibroblastenmedien wurden als positive bzw. negative Kontrollen verwendet. Die Fibroblasten-Migration wurde als fache Änderung ausgedrückt, verglichen mit der Migration, die durch die 50 ng ml ⁻¹ . ausgelöst wurde PDGF-Behandlung. Die Studien wurden dreifach in drei unabhängigen Experimenten für drei Beladungskonzentrationen (2, 4 und 8 μg/ml) durchgeführt.

Statistische Analyse

Kontinuierliche Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichungen ausgedrückt. Unterschiede zwischen den Gruppenmittelwerten wurden unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert. Tukeys Mehrfachvergleichstest wurde verwendet, um zu bestimmen, welche Mittelwerte innerhalb einer Mittelwertgruppe statistisch unterschiedlich waren. Die statistische Signifikanz wurde auf α . festgelegt = 0,05. Alle Daten wurden mit GraphPad Prism (San Diego, CA, USA) analysiert.

Ergebnisse und Diskussion

Es hat sich gezeigt, dass die Kombination verschiedener Polymere die Eigenschaften des resultierenden Komposits deutlich verbessert [29, 30]. Kombinierte Polymersysteme ermöglichen effektiv die Modulation von Gerüstfestigkeit, Flexibilität, biologischem Abbau und Wirkstofffreisetzungskinetik, die wichtige Parameter für Wundverbandanwendungen sind. Die Herstellung einzigartiger Verbundstoffe kann jedoch durch intrinsische chemische Wechselwirkungen zwischen den konstituierenden Polymeren eingeschränkt werden. Beispielsweise wurde beobachtet, dass sich ein Polymerniederschlag bildete, wenn negativ geladenes Fb und positiv geladenes CS gemischt wurden; diese Beobachtung ist für Moleküle mit starken elektrostatischen Wechselwirkungen unter verschiedenen Lösungsmittelbedingungen gut dokumentiert [31,32,33]. Folglich erforderte die Herstellung eines CS-Fb-Polymer-Verbundgerüsts die Verwendung einer dualen Extrusions-Elektrospinntechnik, wie zuvor beschrieben [34].

Morphologie von CS-PEO/Fb-Nanofasern

Die mittleren Faserdurchmesser für CS-PEO-, CS-PEO/Fb- und Fb-Gerüste betrugen 269,9 ± 68,4, 202,3 ± 113,2 bzw. 351,1 ± 101,7 nm (Abb. 2). Interessanterweise wiesen CS-PEO/Fb-Verbundgerüste dünnere Nanofasern auf als die CS-PEO- oder Fb-Gerüste. Die Abnahme der Faserdurchmessergröße könnte auf zusätzliche elektrostatische Kräfte zurückzuführen sein, die durch gleichzeitig geladene Polymerstrahlen erzeugt werden [35,36,37]. Die durch diese Kräfte verursachte Abstoßung der Polymerstrahlen voneinander könnte daher sowohl den Abstand zwischen den Spinndüsen als auch die Abscheidungszeit erhöhen. Die resultierende verlängerte Abscheidungszeit korreliert mit erhöhten Biegeinstabilitäten, von denen bekannt ist, dass sie eine Faserdehnung und eine dünnere Faserbildung verursachen.

Repräsentative FESEM-Aufnahmen von elektrogesponnenen Gerüsten. a CS-PEO, mittlerer Durchmesser 269,9 ± 68,4 nm. b CS-PEO/Fb, mittlerer Durchmesser 202,3 ± 113,2 nm. c Fb, mittlerer Durchmesser 351,1 ± 101,7 nm (n = 100)

Oberflächenchemische Charakterisierung mittels ToF-SIMS und Wasserkontaktwinkel

Die ToF-SIMS-Spektren von CS-, Fb- und PEO-Gerüsten sind in Abb. 3 dargestellt. Normalerweise können einzigartige chemische Fingerabdruckspezies verwendet werden, um einzelne Polymerkomponenten zu unterscheiden. Aufgrund der chemischen Ähnlichkeiten zwischen CS und Fb gab es jedoch eine Reihe von stickstoffhaltigen Spezies (C₃ H₆ NEIN ⁺ , CH₄ N ⁺ , CN ⁻ , und CNO ⁻ ) in beiden Spektren vorhanden, wodurch es schwierig wird, die Polymere voneinander zu unterscheiden. Wenn jedoch Fb in das Gerüst eingebaut wurde, war die Gesamtzahl der CN ⁻ und CNO ⁻ Arten zugenommen, während die anderen Fragmente unverändert blieben oder abnahmen. Untersuchen Sie daher Änderungen in CN ⁻ und CNO ⁻ Fragmentintensitäten ermöglichten den indirekten Nachweis von Fb. Ebenso der Anstieg von C₂ H₅ O ⁺ (45 m/z)-Ionen wurden verwendet, um die Ethylenoxidfragmente des PEO in den Verbundgerüsten zu identifizieren.

Vertreter a positiv und b negative Ionen-ToF-SIMS-Spektren für reines CS (oben), Fb (Mitte) und PEO (unten). Eingekreiste Ionenfragmente wurden als einzigartiger Fingerabdruck verwendet, um die Verbindung zu identifizieren

Um das Vorhandensein und die Verteilung von Fb-Komponenten innerhalb der Verbundgerüste aufzuklären, CNO ⁻ und CN ⁻ Ionen wurden über ein 50 × 50-μm-Raster der unberührten und zusammengesetzten Gerüste kartiert, um Heatmaps zu erhalten (Abb. 4a, b). Dieselbe Kartierungstechnik wurde auf C₂ . durchgeführt H₅ O ⁺ um die PEO-Verteilung zu bestimmen (Abb. 4c). Eine erhöhte Heatmap-Intensität wurde mit einem höheren Polymergehalt von Fb oder PEO korreliert. Wir haben beobachtet, dass die Intensitäten von CNO ⁻ , CN ⁻ , und C₂ H₅ O ⁺ gleichmäßig über den 50 × 50-μm-Rasterbereich der Verbundgerüste verteilt waren. Aufgrund der Dicke der Gerüste (93,8 ± 7,4 μm) und der schichtweisen Faserabscheidung wird erwartet, dass die Oberflächenzusammensetzung für das gesamte Gerüst repräsentativ ist. Daher legen die ToF-SIM-Daten nahe, dass bei der Herstellung von CS-PEO/Fb-Nanofasergerüsten durch Elektrospinnen mit zwei Spinndüsen die einzelnen Komponenten gleichmäßig im Verbundgerüst abgeschieden werden.

ToF-SIMS-Mapping von a CNO ⁻ , b CN ⁻ , und c C₂ H₅ O ⁺ Ionenfragmente auf verschiedenen Gerüsten über einen 50 × 50-μm-Rasterbereich

Die Wasserkontaktwinkel von elektrogesponnenen CS-PEO-, CS-PEO/Fb- und Fb-Fasergerüsten wurden mit 44,2° ± 5,1°, 61,4° ± 7,6° bzw. 115,7° ± 16,2° bestimmt (Abb. 5). Basierend auf den Wasserkontaktwinkeln waren CS-PEO- und CS-PEO/Fb-Gerüste hydrophil (> 90°), während Fb-Gerüste hydrophob waren (<  90°). Die Wasserkontaktwinkel von CS-PEO/Fb-Verbundgerüsten zeigten Oberflächeneigenschaften, die zwischen denen ihrer Komponenten lagen, was darauf hindeutet, dass CS-PEO und Fb während der Herstellung homogen abgeschieden wurden. Oberflächeneigenschaften von Polymeroberflächen spielen eine wichtige Rolle bei der Ablagerung von Proteinen und Adhäsionsfaktoren. Insbesondere ist bekannt, dass wichtige bakterielle Adhäsionsfaktoren leichter auf hydrophoben Oberflächen auftreten, die die bakterielle Besiedlung fördern [38]. Daher könnte die hydrophile Natur des CS-PEO/Fb bei der Verhinderung der bakteriellen Anhaftung von Vorteil sein.

Verhalten von entionisiertem Wasser auf der Oberfläche eines Glassubstrats, CS-PEO-, CS-PEO/Fb- und Fb-Gerüste

Mechanische einachsige Zugfestigkeit von CS-PEO/Fb-Gerüsten

Einachsiger Zugversuch wurde an Nanofasergerüsten mit einer mittleren Dicke von 93,8 ± 7,4 μm durchgeführt. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse ist in Tabelle 1 gezeigt, und die entsprechenden Spannungs-Dehnungs-Kurven sind in Abb. 6 gezeigt. Im Allgemeinen korrelieren die mechanischen Eigenschaften von Verbundwerkstoffen mit ihrem schwächsten Bestandteil. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass reine Fb-Gerüste keine idealen mechanischen Eigenschaften für Wundauflagen aufweisen. Dies unterstreicht die Bedeutung der Einarbeitung von CS-PEO, um ein mechanisch stabileres Produkt zu erhalten.

Spannungs-Dehnungs-Kurven von CS-PEO-, CS-PEO/Fb- und Fb-Gerüsten. Die Daten sind repräsentativ für zehn unabhängig hergestellte Gerüste

Wasserdampfübertragungsrate von CS-PEO/Fb-Gerüsten

WVTR spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer idealen Feuchtigkeit des Wundmilieus, was sich positiv auf die zelluläre Granulation und Epithelisierung auswirkt [39, 40]. Höhere WVTR-Werte korrelieren mit einer schnellen Dehydration der Wunde aufgrund von Verdunstung und Exsudation, die die Körpertemperatur nachteilig senken und den Stoffwechsel erhöhen kann. Umgekehrt korrelieren extrem niedrige WVTR-Werte mit Exsudatakkumulation, Heilungshemmung und erhöhtem Infektionsrisiko. Lamkeet al. gaben die WVTR für normale Haut mit 204 ± 12 g m ⁻² . an Tag ⁻¹ und zwischen 279 und 5138 g m ⁻² Tag ⁻¹ bei verletzter Haut, je nach Wundzustand [41, 42]. Für die Wundepithelisierung und Heilungsverbesserung eine ideale WVTR von 2028,3 ± 237,8 g m ^–2 Tag ⁻¹ wurde berichtet [43]. WVTRs von CS-PEO- und Fb-Gerüsten lagen bei 693,2 ± 95,7 und 686,1 ± 44,17 g m ⁻² Tag ⁻¹ , bzw. CS-PEO/Fb-Gerüste sind zwar näher am idealen WVTR als die makellosen Gerüste (806,5 ± 56,1 g m ⁻² Tag ⁻¹ ) lag immer noch unter dem idealen WVTR (Abb. 7). Manipulationen an den physikalischen Parametern des Gerüsts könnten WVTRs verbessern, um die gemeldeten idealen Raten besser nachzuahmen.

Wasserdampfübertragungsraten der elektrogesponnenen CS-PEO-, CS-PEO/Fb- und Fb-Gerüste. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar (n = 6, *p < 0,05 im Vergleich zu CS-PEO/Fb-Gerüsten)

Zelluläre In-vitro-Lebensfähigkeit von menschlichen dermalen Fibroblasten

Chitosan-PEO/Fb-Gerüste zeigten während der ersten 48 h keine signifikante proliferative Wirkung auf menschliche Fibroblasten (Abb. 8); eine verlängerte Exposition nach 72 Stunden führte jedoch zu einer statistisch signifikanten Verringerung der Proliferation im Vergleich zur Kontrolle ohne Gerüst. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Gerüst eine Hemmung der Zellproliferation zeigt, die sich im Laufe der Zeit kumulieren kann.

Vergleich der Proliferation menschlicher dermaler Fibroblasten bei Exposition gegenüber Fb und CS-PEO/Fb elektrogesponnenem Gerüst (n = 9, *p < 0,05 Vergleich mit „keine Gerüstkontrolle“ zu jedem Zeitpunkt)

Die verminderte proliferative Kapazität kann auf den mit CS assoziierten Acetylierungsgrad (DA) zurückzuführen sein, der durch seine positiven Ladungen nachweislich starke zelluläre Wechselwirkungen aufweist [44]. Younes et al. zeigten, dass mit CS (>   50 % DA) behandelte Blasenkarzinomzellen die Lebensfähigkeit nach 24 h signifikant reduzierten, was darauf hindeutet, dass die CS-Zytotoxizität direkt mit seiner DA zusammenhängt, die die Proliferation beeinflussen kann [45]. Dieser Effekt kann auch unter experimentellen In-vitro-Bedingungen isoliert werden; frühere Studien haben gezeigt, dass CS in vivo nicht toxisch ist, da seine biologischen Abbauprodukte über Stoffwechselwege beseitigt werden könnten [46]. Restliches HFIP aus dem Elektrospinnprozess kann ebenfalls zu der beobachteten Zytotoxizität beitragen. Die gleiche Zytotoxizität wurde jedoch im elektrogesponnenen reinen Fb-Gerüst, das auch in HFIP hergestellt wurde, nicht beobachtet. HFIP wurde aufgrund seiner hohen Flüchtigkeit wahrscheinlich während des Herstellungsprozesses aus elektrogesponnenen Gerüsten eliminiert. Eine beobachtbare Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen wäre offensichtlich, wenn restliches HFIP, das in das Fasersystem eingebaut wurde, während einer zeitgesteuerten Exposition gegenüber menschlichen dermalen Fibroblasten freigesetzt würde.

LIVE/DEAD Assay und Zellanhang

Abbildung 9a–c zeigt die Verteilung und Lebensfähigkeit dermaler Fibroblasten, die auf der Oberfläche von Fibronektin-beschichtetem Glas, unbeladenen CS-PEO/Fb-Gerüsten und PDGF-beladenen (4 μg/ml) CS-PEO/Fb-Gerüsten ausgesät wurden. Nach 24 h in Kultur wurden im Vergleich zu den lebenden Zellen nur minimale tote Zellen beobachtet. Es wurden keine erkennbaren Unterschiede zwischen PDGF-beladenen und unbeladenen Gerüsten festgestellt.

Konfokalmikroskopische Aufnahmen von Fibroblasten, die auf a . ausgesät wurden , d mit Fibronektin beschichtetes Glas; b , e unbeladenes CS-PEO/Fb-Gerüst; und c , f PDGF-loaded (4 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. a–c Cells were stained with LIVE/DEAD™:live cells (green), dead cells (red). d–f Cells were stained with DAPI (blue) and phalloidin (red)

Fibrinogen serves as an important mediator of cellular attachment and growth during wound healing. Phalloidin stains cellular actin filaments allowing for visualization of fibroblast attachment. Figure 9c, d shows the actin filament morphology of the fibroblasts on the surface of fibronectin-coated glass, unloaded CS-PEO/Fb scaffolds, and PDGF-loaded CS-PEO/Fb scaffolds. Overall, normal fibroblast morphology was observed, with the exception of some rounder cells being present on the scaffold samples. The changes in morphology may be attributed to the presence of CS, as shown in previous studies [47]. Alternatively, the differences could be due to the small porosity of the scaffold and dimensionality of the fiber surface in comparison to the flat surface of the control.

In Vitro Degradation of Electrospun CS-PEO/Fb Scaffolds

Scaffold degradation was evaluated by obtaining the dry weight of the scaffold after incubation in FBM for up to 48 h (Fig. 10). The scaffolds degraded at a linear rate after an initial burst release of material within the first hour. Weight loss in the initial hour was likely due to the solubility of PEO in aqueous solutions [16], and the subsequent weight loss was likely due to Fb and CS release. This highlights a unique biphasic degradation profile that could be beneficial for the delivery of bioactive molecules. Concurrently, CS-PEO/Fb scaffolds were shown to maintain their substructure for a minimum of 48 h (Fig. 10:insert), and the addition of 8 μg/mL of PDGF did not alter the scaffold degradation properties.

Degradation of electrospun unloaded CS-PEO/Fb scaffolds and PDGF-loaded (8 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. Insert:FESEM micrograph of CS-PEO/Fb scaffold after 48 h of incubation (n  = 6)

In Vitro Release of PDGF

Cumulative releases of PDGF after 48 h of incubation were 1.8 ± 0.7, 4.4 ± 1.8, and 11.4 ± 4.8 ng of PDGF/mg of scaffold for initially incorporated concentrations of 2, 4, and 8 μg/mL of PDGF, respectively. The results demonstrated that PDGF was released from the scaffolds in a dose-dependent manner (Fig. 11).

PDGF is released from CS-PEO/Fb scaffolds for up to 48 h in a dose-dependent manner (n  = 10, *p  < 0.05 when compared to 2 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point, ^# p  < 0.05 when compared to 4 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point)

During the in vitro degradation, CS-PEO/Fb scaffolds exhibited a unique biphasic release profile, with 21.6 ± 0.1% of the total eluted PDGF being detected in the first hour followed by linear release kinetics. This observation was thought to be a result of the combined polymers and highlighted the functional importance of Fb as a reservoir for the sustained release of biologically critical molecules. Growth factors (e.g., PDGF/VEGF, FGF, and TGF-β families) have been shown to bind the Fb heparin domain with high affinity and have been reported to retain their bioactivity for over 7 days [48,49,50].

Effects of Released PDGF on Fibroblast Migration

Fold differences in fibroblast migration in response to the released PDGF eluates collected from the scaffolds at various time points are shown in Fig. 12. Previously published reports have demonstrated that fibroblast attachment and migration rates are affected by PDGF in a dose-dependent manner [51, 52]. For example, Gamal et al. showed when at least 50 ng/mL PDGF was delivered locally, adherent fibroblast migration was increased [52]. In addition, Thommen et al. reported that the distance of migration was significantly increased when exposed to PDGF concentrations greater than 10 ng/mL [53]. Therefore, the biological activity of the scaffold-eluted PDGF was measured by its ability to induce migration and was normalized to a single 50 ng/mL PDGF dose.

Human dermal fibroblast migration after 24 h exposure to scaffold eluates acquired at 1, 6, 24, and 48 h in FBM (n  = 8, *p  < 0.05 when compared to unloaded CS-PEO/Fb scaffold at each specific time point)

Eluates collected from electrospun scaffolds, which were loaded with 4 or 8 μg PDGF/mL polymer solutions, demonstrated similar levels of fibroblast migration when compared to a single 50 ng/mL treatment. The data suggest that PDGF delivered by electrospun nanofibers can be equally effective in promoting fibroblast migration as a single application of PDGF. Additionally, the migration elicited by the scaffold-released PDGF was sustained for 48 h. Sustained delivery of PDGF eliminates the need for daily applications, which is an advantage over commercially available treatments such as Regranex®.

Fibroblast migration reached a maximum when cells were treated with the 24-h eluates from each of the PGDF-loaded scaffolds. Notably, when fibroblasts were treated with the 6-h eluates from the 4 and 8 μg PDGF/mL electrospun scaffolds, the same level of maximum migration was achieved. This suggests that the rate of migration increased in response to increased PDGF loading. Additionally, 4 and 8 μg/mL PDGF-loaded scaffolds might be able to elicit fibroblast migration potentials beyond the detection limits of the current assay, which can only assess the endpoint of migration, but not the migration rate. Finally, results demonstrated that eluates from unloaded CS-PEO/Fb scaffolds were also capable of eliciting a linear increase in migration over the same elution time points, albeit less effectively than the PDGF-loaded scaffolds. This result is most likely mediated by the ability of fibrinogen to enhance fibroblast migration [54, 55]. In general, PDGF-loaded composite scaffolds significantly improved in vitro migration, compared to the individual components of the scaffold.

Conclusion

The versatility of electrospinning allows for the combination of advantageous properties of various polymers and proven bioactive molecules. We utilized this technique to fabricate unique CS-PEO/Fb scaffolds with the ability to release biologically active PDGF over 48 h. This study evaluated the chemical and physical properties of the nanofibrous scaffolds including (1) morphology, (2) physical and mechanical properties, (3) in vitro scaffold degradation, and (4) the ability to release functional PDGF in a dose- and time-dependent manner. Electrospun CS-PEO/Fb scaffolds demonstrated nanoscale morphological properties that are conducive to wound dressing applications, as well as an adequate WVTR, mechanical stability, and a unique biphasic PDGF delivery profile. Furthermore, PDGF maintained its biological function throughout the electrospinning process, and when combined with the natural, chemotactic properties of Fb elicited dermal fibroblast migration that is functionally equivalent to a single 50 ng/mL dose of PDGF. Overall, these results highlight the potential of CS-PEO/Fb scaffolds as a viable wound dressing capable of delivering bioactive PDGF to enhance fibroblast recruitment and wound healing.

Abkürzungen

CS:

Chitosan

DA:

Degree of acetylation

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

ECM:

Extracellular matrix

EMEM:

Eagle’s minimum essential media

Fb:

Fibrinogen

FBM:

Fibroblast blast media

FESEM:

Field emission scanning electron microscope

FGF:

Fibroblast growth factor

HFIP:

1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol

PDGF:

Platelet-derived growth factor

PEO:

Polyethylenoxid

PLGA:

Poly(lactide-co-glycolide)

TGF-β:

Transforming growth factor beta

ToF-SIMS:

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry

VEGF:

Vascular endothelial growth factor

WVTR:

Water vapor transfer rate