Ein neuartiger magnetoelastischer Immunsensor zum ultrasensitiven Nachweis von karzinoembryonalem Antigen

Hintergrund

Krebs ist eine der tödlichsten Krankheiten der Welt [1]. Der Krebs bei Patienten kann klinisch nachgewiesen werden, wenn die Konzentration von Tumorbiomarkern im Serum eine bestimmte Menge erreicht [2]. Daher ist es unbedingt erforderlich, empfindliche, schnelle und genaue Assays für Tumormarker zu erzielen, die eine wirksame Strategie für die Krebsdiagnose bieten [3]. Das karzinoembryonale Antigen (CEA) gehört zu einer Familie von Zelloberflächen-Glykoproteinen mit einem Molekulargewicht von 180∼200 kDa. Es wurde erstmals 1965 im menschlichen Dickdarmkrebsgewebe entdeckt [4, 5]. CEA zeigt sich normalerweise in sehr niedrigen Konzentrationen (0~5 ng/ml) im Blut gesunder Erwachsener [6]. Im Allgemeinen kann ein anormaler CEA-Spiegel als Zeichen von Krebs angesehen werden, wie beispielsweise Magenkarzinom [7], Pankreaskarzinom [8], kolorektales Karzinom [9], Lungenkarzinom [10] und Mammakarzinom [11]. Das bedeutet, dass CEA als Tumor-Biomarker verwendet werden könnte. Die Überwachung des CEA-Spiegels im Blut könnte verwendet werden, um Krebs vorzuwarnen, zu untersuchen und zu diagnostizieren. Inzwischen kann das CEA auch für die Nachuntersuchung von klinisch Behandelten eingesetzt werden. Die Sensitivität der CEA gegenüber Tumorrezidiven liegt bei über 80 % und damit vor der klinischen und pathologischen Untersuchung. Die kontinuierliche Beobachtung des CEA bietet somit eine wichtige Grundlage für die Diagnose und Prognose der kurativen Wirkung [12].

Biosensoren reagieren auf spezifische Erkennungen von messbaren biologischen molekularen Ausgangssignalen durch einige Disziplinen, was schnelle Reaktionen, hohe Empfindlichkeit und niedrige Kosten ermöglicht. In letzter Zeit wurden immunologische Biosensoren intensiv untersucht, wie der enzymatische Immunoassay [13], der Fluoro-Immunoassay [14] und der elektrochemische Immunoassay [15,16,17]. Aufgrund ihrer hervorragenden Spezifität und Sensitivität boten Immunsensoren vielversprechende Mittel zur Analyse von Tumorbiomarkern, selbst wenn die Zielverbindungen in sehr geringen Konzentrationen vorliegen [18,19,20,21].

Die Nanotechnologie bietet neuartige Methoden zur Anwendung von Nanopartikeln (NPs) in der Biosensorik. Metall-NPs weisen viele besondere Eigenschaften auf, die bemerkenswerte Plattformen für die Verknüpfung von Bioerkennungselementen bieten [22, 23]. Auf NPs basierende Immunassays haben bei den Forschern große Aufmerksamkeit auf sich gezogen [24,25,26]. Die magnetoelastischen Biosensoren werden von Umgebungstemperatur und pH-Wert mit hoher Ansprechempfindlichkeit nicht beeinflusst. Daher haben wir in dieser Studie eine magnetoelastische Immunoassay-Methode vorgeschlagen, die auf Goldnanopartikeln (AuNPs) und magnetoelastischen Mikrochips basiert. Zum Nachweis von CEA-Biomarkern wurde erfolgreich ein Immunsensor entwickelt.

Ergebnisse und Diskussion

Aufgrund der bandförmigen Form des magnetoelastischen (ME) Mikrochips ist die magnetische Permeabilität entlang seiner Länge am größten [27]. Die vorläufigen Ergebnisse haben gezeigt, dass die optimale Breite und Dicke des ME-Chips 1 mm bzw. 28 µm betrug [28]. Zur Optimierung der Chiplänge wurde eine Simulation verwendet, wie in Abb. 1b gezeigt.

Optimale Länge des ME-Chips. a Die relative Verschiebung ist mit der Längenänderung unterschiedlich. b Simulation wurde verwendet, um die Länge des Chips zu optimieren

Die relative Verschiebung ist bei der Längenänderung in Fig. 1a unterschiedlich. Die maximale relative Verschiebung wird bei einer Länge von 6 mm bei der Modalanalyse erster Ordnung erhalten. Es bedeutet die theoretisch höchste Empfindlichkeit. Daher wurden die optimalen Abmessungen des Chips in diesem Papier mit 6 mm × 1 mm × 28 μm entworfen.

Ein schematisches Diagramm des Nano-ME-Biosensors ist in Abb. 2 dargestellt. Zunächst wurde der Nano-ME-Chip chemisch mit Cystein behandelt, um die selbstorganisierenden molekularen (SAM)-Filme auf der Oberfläche als funktionelle Schicht zur Immobilisierung von herzustellen CEAAb. Dann fördert Rinderserumalbumin (BSA) die Leistung von CEAAb, indem es unspezifische Bindung und sterische Hinderung reduziert. Zur Beobachtung der Oberflächenmorphologie des Chips wurden Bilder mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) durchgeführt. Wie in Fig. 3a angegeben, betrug die Dicke der SAM-Schicht 120 nm. Die Abbildung in Fig. 3b zeigt, dass der CEAAb mit zunehmender Rauheit kovalent an die SAM-Schicht gebunden wurde. In Abb. 3c wurde deutlich gezeigt, dass der CEA spezifisch erkannt und effektiv kombiniert wurde, mit einer ungefähren Höhe von 200 nm und größer.

Schema des konstruierten Nano-ME-Biosensors

AFM-Bilder der SAM-Schicht (a ). CEAAb-SAM-Schicht (b ). Komplex von CEA-CEAAb(c )

In einer bestimmten Dimension des Chips ist die Antikörperkonzentration ein wichtiger Faktor in Bezug auf die Empfindlichkeit des Immunsensors. Daher war es notwendig, die Antwortsignale unterschiedlicher Konzentrationen von CEAAb (20, 50, 70 und 100 µg/ml, wie in Abb. 4a gezeigt) auszuwerten. Die Ergebnisse zeigen, dass die optimale Reaktion bei ungefähr 448 Hz ( 4b ) erhalten wurde, wenn die Konzentration von CEAAb 50 μg/ml beträgt. Wenn die Konzentration von CEAAb auf 70 μg/ml anstieg, begann die Reaktion aufgrund der sterischen Hinderung und der elektrostatischen Abstoßung abzunehmen [29].

a Die Kurve des Frequenzgangs gegen CEAAb. b Häufigkeitshistogramm

Grundsätzlich wird das CEA mit Antikörpern spezifisch erkannt, was zu einer Abnahme der Ansprechhäufigkeit führt. Abbildung 5a zeigt die Echtzeit-Antwortkurve des Immunsensors gegenüber CEA. In der Zwischenzeit erhalten wir eine lineare Anpassungskurve in Abb. 5b.

Echtzeitantwort (a ) und Anpassungskurven (b ) des Biosensors versus CEA

Im Allgemeinen wurde die stabile Reaktion des Sensors nach 40 min erreicht (Abb. 5a). Die Änderung der Resonanzfrequenz wurde mit entsprechenden Konzentrationen von CEA aufgezeichnet. Die Hz-Änderung hängt linear vom Logarithmus der CEA-Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 100 ng/ml (R ² = 0,9688), mit der Nachweisgrenze von 2,5 pg/mL (Abb. 5b). Der lineare Bereich und die Nachweisgrenze sind unseres Wissens offensichtlich niedriger als bei den bisherigen Methoden [28]. Die Ergebnisse zeigten, dass eine drahtlose und hochempfindliche Methode zur CEA erfolgreich etabliert wurde.

Schlussfolgerungen

In diesem Beitrag wurde ein Nano-ME-Immunsensor zum hochsensitiven Nachweis von CEA auf Basis eines ME-Chips erfolgreich entwickelt. AuNPs und BSA verbesserten effektiv die Empfindlichkeit und Stabilität. Der vorgeschlagene Nano-ME-Immunsensor weist einen breiten CEA-Bestimmungsbereich von 0,1 bis 100 ng/mL mit einer niedrigen Nachweisgrenze von 2,5 pg/mL auf. Daher wurde die genaue Bestimmung von CEA durch den so hergestellten Immunsensor mit zufriedenstellenden Ergebnissen erreicht. Die vorgeschlagene Plattform profitiert von ihrer Spezifität, Einfachheit und Reproduzierbarkeit und zeigt eine vielversprechende Anwendung bei der Entwicklung der nicht-invasiven Krebserkennung.

Methoden

Unter dem sich zeitlich ändernden Magnetfeld vibriert der ME-Mikrochip entlang der Länge. In dem modulierten Magnetfeld, das den ME-Mikrochip zum Schwingen bringt, wird die Energie des Magnetfelds in elastische potentielle Energie umgewandelt, um den Maximalwert zu erreichen. Aufgrund der Form des bandförmigen Sensorchips ist die magnetische Permeabilität entlang seiner Länge am größten; daher erzeugt ein einfallendes Magnetfeld im Sensor Längsschwingungen aus fast jeder Ausrichtung außer senkrecht zur Grundebene des Sensors. Gegeben nach Gl. (1):

wo E bezeichnet den Elastizitätsmodul, v ist die Poisson-Zahl, ρ die Dichte des Sensormaterials ist und L ist die Längsabmessung des Chips. Bei konstanter Testtemperatur, Feuchtigkeit und anderen Umgebungsparametern hängt die Resonanzfrequenzänderung des magnetoelastischen Sensors empfindlich nur von der Massenänderung (△m ) auf seiner Oberfläche, wie durch Gl. (2)

Basierend auf Gl. (2) ist die Änderung der Resonanzfrequenz proportional zur CEA-Menge. Daher können die CEA-Konzentrationen durch die Änderung der Frequenz erreicht werden, wobei f ₀ ist die anfängliche Resonanzfrequenz, M ist die Anfangsmasse, △m ist die Massenänderung und △f ist die Verschiebung der Resonanzfrequenz des Sensors. Gleichung 2 zeigt, dass die Sensorempfindlichkeit (△f /△m ) ist umgekehrt proportional zur anfänglichen magnetoelastischen Masse (M) des Sensors. Sensoren mit kleineren Abmessungen haben eine geringere Anfangsmasse, was zu einer höheren Empfindlichkeit führt. Das negative Vorzeichen in der Gleichung steht für eine Abnahme der Frequenz (△f ) zu einer Addition von nichtmagnetoelastischer Masse (△m ) am Sensor. Daher verursacht die Bindung der Zielorganismen an die Biosensoroberfläche eine Massenzunahme mit einer entsprechenden Abnahme der Grundresonanzfrequenz.

Magnetoelastische Basen aus Metglas-Legierung 2826MB (Fe40Ni38Mo4B18) wurden von Honey Well Corporation (Morristown, NJ, USA) verarbeitet. CEA, CEA-Antikörper, Rinderserumalbumin (BSA, 99%) und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH =7,4) wurden von Sangon (Shanghai, China) bezogen. Aceton, Isopropanol, Ethanol, 1-Ethyl-3-carbodiimid (EDC) und N -Hydroxysulfosuccinimid (NHS) wurden von Sigma-Aldrich Corporation (Saint Louis, MO, USA) bezogen. Alle anderen Reagenzien waren von analytischer Qualität. Das Reinstwasser wurde vom Mill-Q-System (Milli-pore, USA) bezogen. AFM Park System (ND-100, Korea), Plasma (P3C, Shanghai, China), Gauss Ohmmeter (GM500), ZNB Vector Network Analyzer (R&S, Deutschland), Laserschneider (AV3620A, Qingdao, China) und HT20 Gaussmeter (Hengtong, Shanghai) verwendet wurden.

Die ME-Basis aus Legierung wurde zu Mikrochips von 6 mm  ×  1 mm  ×  28 μm lasergeschnitten, dann mit Aceton, Isopropanol, Ethanol und entionisiertem Wasser 5 min mit Ultraschall gereinigt und mit Stickstoff getrocknet. Die Aktivierung der Oberflächenmodifikation der gereinigten Mikrochips erfolgt durch ein Plasmaverfahren. Beide Seiten des Mikrochips wurden mit einer Chromschicht (100 nm) gesputtert, gefolgt von einer Beschichtung mit einer AuNP-Schicht (40 nm), um Nano-ME-Chips herzustellen. Der Nano-ME-Chip verarbeitet Plasma mit hochreinem Sauerstoff (0.9999) und wird dann in 40 mM Cysteamin-Lösung getaucht und für 12 h bei Raumtemperatur aufbewahrt. Danach wurden die Nano-ME-Chips biologisch modifiziert und mit unterschiedlichen Konzentrationen von CEAAb für 1 h bei 37 °C in Gegenwart von 1-Ethyl-3-carbodiimid (EDC) und N . inkubiert -Hydroxysulfosuccinimid (NHS). Der CEAAb wurde zunächst mit 10 mg/ml EDC und 10 mg/ml NHS aktiviert. Schließlich wurde der mit CEAAb modifizierte Nano-ME-Chip mit 0,1% BSA für 30 Minuten weitergeführt.

Der Nano-ME-Biosensor wurde wie folgt aufgebaut:Ein Glasröhrchen wurde von der Spule umwickelt und an einen Vektornetzwerkanalysator angeschlossen. In der Zwischenzeit wurde durch das Hinzufügen eines Magnetfelds ein Wechselstrom bereitgestellt, um die Spule zu veranlassen, ein magnetisches Wechselfeld zu erzeugen. Die Resonanzfrequenz des Nano-ME-Biosensors kann mit einem Vektornetzwerkanalysator ermittelt werden. In das Reagenzglas wurden verschiedene Konzentrationen von CEA (0–100 ng/mL) gegeben und die Frequenzverschiebung alle 5 min bis 40 min aufgezeichnet. Danach wurde der Nano-ME-Chip zur AFM-Charakterisierung mit PBS gespült.

Abkürzungen

AFM:

Rasterkraftmikroskop

AuNPs:

Goldnanopartikel

BSA:

Rinderserumalbumin

CEA:

Karzinoembryonales Antigen

CEAAb:

CEA-Antikörper

EDC:

1-Ethyl-3-carbodiimid

Hz:

Häufigkeit

ICH:

Magnetoelastisch

NHS:

N -Hydroxysulfosuccinimid

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

SAM :

Selbstorganisierendes Molekül