Verstärkte Wirkung der Kombination von Chlorogensäure auf Selen-Nanopartikel bei der Hemmung der Amyloid-β-Aggregation und der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies in vitro

Hintergrund

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine irreversible progressive neurodegenerative Erkrankung, die durch progressive kognitive Beeinträchtigungen und neuronalen Verlust gekennzeichnet ist [1]. Es ist mittlerweile allgemein anerkannt, dass die Ansammlung von extrazellulären amyloiden Plaques im Gehirn ein häufiges pathologisches Merkmal bei AD ist [2, 3]. Die Plaques enthalten die Fehlfaltung und Aggregation des Amyloid-β (Aβ)-Proteins [4]. Obwohl die genaue Rolle von Aβ-Protofibrillen oder -Oligomeren in der AD-Pathogenese nicht vollständig verstanden ist, deuten immer mehr Beweise darauf hin, dass die meisten von ihnen toxische Spezies sind, die für die Funktionsstörung und den Tod von Neuronen verantwortlich sind [5,6,7,8]. Darüber hinaus sind die Aβ-Aggregate bereits im Gehirn eines AD-Patienten vorhanden. Diese Aggregate werden weiterhin Neurotoxin-reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bilden, die eine Reihe von Schäden an zellulären Komponenten wie DNA, Lipiden und Proteinen auslösen und den oxidativen Stress bei AD verursachen [9]. Eine Schädigung des Neurons führt in der Regel zu Lern- und Gedächtnisdefiziten. Daher wird angenommen, dass die Hemmung der Amyloid-β-Aggregation und der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies vielversprechende therapeutische Ziele zur Vorbeugung oder Linderung der Pathologie der AD sein könnte.

Nanomaterialien haben einzigartige physikalisch-chemische Eigenschaften wie geringe Größe, große Oberfläche und hohe Reaktivität. Kürzlich hat die Forschung betont, dass Nanopartikel (NPs) mit geeigneten Oberflächenmodifikationen als Werkzeuge für die Wirkstoffabgabe, Bildgebung und therapeutische Anwendungen bei AD verwendet werden können [10,11,12]. Im Allgemeinen haben NPs eine große Oberfläche, die große Adsorptionskapazitäten mit sich bringt. Insbesondere kann Aβ an einige NPs binden, um die Fibrillierungsprozesse von Aβ zu verzögern. Beispielsweise würde die Bindung eines Aβ-Monomers an Polyoxometallate die Konzentration an freien Monomeren senken und das Gleichgewicht weg von der Fibrillierung verschieben [13]. Unter diesen Nanomaterialien weisen Selen-Nanopartikel (SeNPs) mehrere Eigenschaften auf, die sie für biomedizinische Anwendungen gut geeignet machen, wie z. B. einfache Herstellung und Stabilität. Selen ist ein essentielles Spurenelement, das eine wichtige Rolle bei der zellulären Redoxregulation, Entgiftung und dem Schutz des Immunsystems spielt [14]. Daher weisen SeNPs im Vergleich zu anorganischen und organischen Selenverbindungen eine bessere Biokompatibilität und eine geringere Toxizität auf [15]. Heutzutage erleichtern Oberflächenmodifikationen von NPs die Bindungsaffinität zwischen NPs und Aβ und helfen, die biochemischen Eigenschaften der konjugierten Moleküle zu verbessern. Unsere vorherige Studie ergab, dass die Anti-Amyloid-Kapazität von SeNPs durch Aufpfropfen eines Anti-Amyloid-Peptids (LPFFD) auf eine SeNP-Oberfläche weiter verbessert werden könnte [12]. Die meisten dieser Untersuchungen konzentrierten sich jedoch nicht auf die Antioxidationsfähigkeit von NPs nach Oberflächenmodifikationen.

Chlorogensäure (CGA) ist der wichtigste Polyphenolbestandteil in Früchten wie Äpfeln, Birnen und Beeren und kommt besonders häufig in Kaffee vor [16]. CGA hat eine Reihe von pharmakologischen Eigenschaften, wie z. B. krebshemmend, entzündungshemmend und antibakteriell [16]. CGA hat insbesondere antioxidative und neuroprotektive Aktivitäten, was eine Anwendung zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit ermöglicht [17, 18]. Die Wirkung von CGA auf die Aβ-Aggregation wurde jedoch nie berichtet. Darüber hinaus ist die Verwendung von CGA durch seine geringe Bioverfügbarkeit und Stabilität eingeschränkt, und nur ein Drittel des aus dem Magen-Darm-Trakt resorbierten CGA gelangt in den Blutkreislauf [19]. Eine Reihe von Studien hat berichtet, dass NPs aufgrund der geringen Größe durch Inhalation, Einnahme und Transport durch den Kreislauf zu vielen Organen direkt in den Blutkreislauf gelangen können. Um dieses Problem zu lösen, haben wir daher die Bindung von CGA an SeNPs (CGA@SeNPs) untersucht, um die potenzielle therapeutische Wirksamkeit von CGA zu verbessern. In diesem Zusammenhang war das Ziel dieser Studie, die potenzielle therapeutische Wirksamkeit von CGA@SeNPs bei der Anti-Aβ-Aggregation und Antioxidation zu untersuchen. Nach unserem besten Wissen gibt es keinen früheren Bericht über die Verwendung von CGA@SeNPs für die AD-Therapie.

Methoden/Experimental

Materialien und Zelllinien

Aβ40 wurde bei GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) synthetisiert. Selendioxid (Na₂ .) SeO₃ ), NaBH₄ , Thiazolylblautetrazoliumbromid (MTT), Thioflavin T und 2',7'-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA) stammten von Sigma (St. Louis, MO, USA). CGA wurde von Aladdin (Shanghai, China) bezogen. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), fötales Rinderserum (FBS) und Pferdeserum wurden von Gibco (Life Technologies AG, Schweiz) bezogen. PC12-Zellen (Ratten-Phäochromozytom, American Type Culture Collection) wurden in DMEM-Medium, ergänzt mit 5 % FBS und 10 % Pferdeserum, bei 37 °C in 5 % CO₂ . kultiviert befeuchtete Umgebung bei 37 °C.

Vorbereitung von CGA@SeNPs

Zuerst Stammlösungen von 25 mM CGA, 0,1 M Na₂ SeO₃ , und 0,1 M NaBH₄ waren vorbereitet. Dann 200 μl-Aliquot von Na₂ SeO₃ Lösung wurde mit unterschiedlichen Volumina von CGA gemischt und die Reaktantenkonzentrationsverhältnisse von Na₂ SeO₃ zu CGA waren 1:1, 1:2, 1:4, 1:6 und 1:8. Danach 200 μl 0,1 M NaBH₄ wurde in die Mischung gegeben und 30 min gerührt. Die Farbe der Lösung wurde zu rot geändert. Überschüssiges CGA und Na₂ SeO₃ wurden durch Dialyse entfernt. Wir haben festgestellt, dass das beste Konzentrationsverhältnis von Na₂ SeO₃ zu CGA war 1:6.

Charakterisierung von CGA@SeNPs

Die so hergestellten CGA@SeNPs wurden durch Transmissionselektronenmikroskop (TEM; Hitachi, H-7650), Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR; Equinox 55 IR-Spektrometer) und UV-Vis-Spektroskopie (Carry 5000 Spektrophotometer) charakterisiert. Die Größenverteilung wurde mit dem Partikelanalysator Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Limited) bestimmt. Die Fluoreszenz von Nanopartikeln wurde mit einem JASCO FP6500 Spektrofluorometer (λ ex =350 nm).

H₂ O₂ Generationstest

Das Hydroxylradikal 2, 29-Azinobis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS ⁺ ) und die Superoxidanionen-Abfangaktivitäten von CGA und CGA@SeNPs wurden mit kommerziellen Kits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) analysiert. Die Reduktionskraft der Proben wurde wie folgt gemessen:2 ml CGA oder CGA@SeNPs wurden mit 2 ml Phosphatpuffer (0,2 mol/l, pH 6,6) und 2 ml K₃ . inkubiert Fe(CN)₆ (1%, w /v ) bei 50 °C für 20 min. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 2,5 ml Trichloressigsäure (10 %, w .) gestoppt /v ) und 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert. Zwei Milliliter des Überstands wurden mit 2 ml destilliertem Wasser und 1 ml FeCl₃ . vermischt (0,1 %, w /v ) bei Raumtemperatur für 10 min. Schließlich wurde die Extinktion bei 700 nm gemessen. Vitamin C (Vc) wurde als positive Kontrolle im Antioxidationsaktivitätsassay verwendet.

Die H₂ O₂ Generation in Aβ40 wurde durch DCFH-DA analysiert. DCFH-DA-Stammlösung (1 mM), bezogen vom Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China). Vier Mikromolare Meerrettichperoxidase (HRP) wurden in Puffer (20 mM Tris-HCl/150 mM NaCl, pH 7,4) hergestellt. Probenlösungen mit 35 μM Aβ40 mit oder ohne 20, 40 und 60 μg/ml CGA@SeNPs/CGA wurden 3 Tage bei 37 °C inkubiert. Ascorbat (10 μM) wurde jeder Probe zugesetzt und 1 h weiter inkubiert. Probenanalysen wurden durch Zugabe von DCFH-DA (20 μl, 100 μM) und HRP (2 μl, 0,04 μM) zur Probenlösung (10 μl) durchgeführt. Fluoreszenzspektren mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 488 und 525 nm wurden mit einem JASCO FP6500-Spektrofluorometer gemessen.

Thioflavin-T-Fluoreszenzmessungen

Die Kinetik der Aβ40-Fibrillation wurde unter Verwendung des Farbstoffs Thioflavin T (ThT) nachgewiesen. Kurz gesagt, 35 μM Aβ40 wurde mit 20, 40 und 60 μg/ml CGA@SeNPs/CGA bei 37 °C von 0 bis 5 Tagen inkubiert. Jeden Tag wurden 50 μl Lösung entnommen und in 200 μl ThT-Lösung (15 μM ThT in 50 mM PBS, pH 7,4) gegeben. Dann betrug die Anregung von ThT 440 nm und die Emissionswellenlänge von 490 nm wurde aufgezeichnet.

TEM

Morphologien von Aβ40 in Gegenwart oder Abwesenheit von CGA@SeNPs/CGA wurden durch TEM (Hitachi, H-7650) beobachtet. Die Probenvorbereitung erfolgte analog zum ThT-Fluoreszenz-Assay. Nach 3 Tagen Inkubation wurden 10 μL der Probenlösung 10 Minuten lang auf die kohlenstoffbeschichteten Kupfergitter aufgetragen. Dann wurde jedes Gitter mit 1,5 % (w /v ) Phosphorwolframsäure (pH 7,4) und trocknen gelassen.

Die Bindung von Nanopartikeln an Aβ40 wurde auch durch TEM bestätigt. Zunächst wurden 35 μM Aβ40 3 Tage lang inkubiert, um die Fasern zu formatieren. Anschließend wurden 20 μg/ml Nanopartikel in die vorinkubierte Lösung gegeben und weitere 6 h inkubiert. Danach wurde diese Probe mit TEM untersucht.

Resonanzlichtstreuungsmessungen

Die Resonanzlichtstreuung (RSL) wurde nach der Methode von Yu et al. [20] mit einigen Modifikationen. Eine bestimmte Menge Aβ40-Dispersion wurde mit H₂ . auf 1 ml verdünnt O, während die Endkonzentration von CGA@SeNPs von 0,05 bis 0,45 μg/ml variierte. Die Mischung wurde 10 Minuten lang inkubiert. Die RLS-Intensitäten wurden auf einem Cary Eclipse-Fluorospektrophotometer (Agilent technologies, USA) durch synchrones Scannen der Anregungs- und Emissionsmonochromatoren (Δλ = 0 nm) zwischen 200 und 800 nm. Sowohl die Anregungs- als auch die Emissionsspaltbreite wurden auf 5 nm eingestellt.

Zytotoxizitäts-Assay

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung des MTT-Assays analysiert. PC12-Zellen wurden mit einer Dichte von 5000 Zellen pro Vertiefung auf 96-Well-Platten in frischem Medium ohne FBS ausplattiert. Aβ (35 μM) wurde mit oder ohne 60 μg/ml CGA@SeNPs/CGA 3 Tage lang koinkubiert. Danach wurden die Zellen weitere 72 h mit diesen Proben behandelt. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit 10 μL MTT pro Vertiefung behandelt, gemäß dem Handbuch des Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega). Die Freisetzung von Lactatdehydrogenase (LDH) wurde unter Verwendung des kommerziellen Nachweiskits getestet. Die PC12-Zellen wurden wie oben behandelt. Am Ende der Behandlungen wurde die 96-Well-Platte bei 1500 × g . zentrifugiert für 10 min. Die LDH-Aktivität in den Überständen wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

Intrazelluläre ROS-Erzeugung

Die Wirkungen von CGA@SeNPs/CGA auf die Aβ40-induzierte intrazelluläre ROS-Erzeugung wurden durch den DCFH-DA-Assay überwacht. Die PC12-Zellen (1 × 10 ⁵ pro Well) wurden wie im MTT-Assay behandelt. Dann wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit DCFH-DA (10 mM) bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert. Der intrazelluläre ROS-Spiegel wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop (Vergrößerung × 200) mit den Anregungs- und Emissionswellenlängen bei 488 nm bzw. 525 nm untersucht. Zur Messung des intrazellulären ROS-Spiegels wurden die Zellen in gleicher Weise behandelt und durch Zentrifugation geerntet, in PBS resuspendiert. Dann wurden die Zellen durch Durchflusszytometrie analysiert.

TUNEL-DAPI-Co-Färbungsassay

Die PC12-Zellen wurden wie im MTT-Assay behandelt. Danach wurden Zellen in Kammer-Objektträgern mit 3,7% Formaldehyd fixiert und mit 0,1% Triton X-100 in PBS permeabilisiert. Der Färbetest wurde unter Verwendung des Terminal-Transferase-dUTP-Nick-End-Labeling-(TUNEL)-Testkits (KeyGen BioTECH, Nanjing, China) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Vergrößerung ×200) aufgenommen.

Statistik

Die statistische Signifikanz wurde mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) und anschließendem Bonferroni-Post-hoc-Test geschätzt. Die statistische Signifikanz wurde auf P festgelegt < 0.05.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung von CGA@SeNPs

In dieser Studie verwenden wir eine einfache Methode, um CGA@SeNPs zu synthetisieren, indem wir eine Mischung aus CGA und Na₂ . reduzieren SeO₃ mit NaBH₄ . Nanopartikel mit einer Größe von 30 bis 150 nm waren für die zelluläre Aufnahme günstiger [21]. TEM zeigte, dass CGA@SeNPs eine kugelförmige Struktur mit einem Durchmesser von etwa 100 nm haben (Abb. 1a), was darauf hindeutet, dass die Größe von CGA@SeNPs für die biologische Anwendung geeignet war. Die Analyse der Elementarzusammensetzung zeigte, dass Se, C und O in der energiedispersiven Röntgenspektroskopie (EDX) von CGA@SeNPs leicht zu finden sind (Abb. 1b). Das Signal der Se-Atome betrug 30.00%, zusammen mit dem starken C-Atom-Signal (52.60%) und O-Atom-Signal (1.50%) von CGA, was darauf hindeutet, dass wir die CGA@SeNPs erfolgreich hergestellt haben.

Charakterisierung von CGA@SeNPs. a TEM-Bilder von CGA@SeNPs. b EDX-Analyse von CGA@SeNPs. c UV-Vis-Absorptionsspektrum von CGA@SeNPs. d Das Emissionsspektrum von CGA@SeNPs

Das UV-Vis-Absorptionsspektrum von CGA zeigt einen charakteristischen Absorptionspeak bei 334 nm (Abb. 1c). Im UV-Vis-Absorptionsspektrum von CGA@SeNPs wurde jedoch eine leichte Verschiebung beobachtet und der Absorptionspeak wurde auf 337 nm geändert. Die Emissionswellenlängen von CGA und CGA@SeNPs wurden mit einem Fluoreszenzspektrophotometer nachgewiesen. Die Emissionswellenlänge von CGA betrug 442,9 nm, die in CGA@SeNPs zu 437,5 nm verschoben war (Abb. 1d). Diese Ergebnisse bestätigten das Vorhandensein von CGA auf der Oberfläche von SeNPs. Das FT-IR-Spektrum von CGA@SeNPs belegt, dass CGA ein Teil des Nanokomposits ist. Die OH-Dehnungsfrequenz liegt bei 3353,99 cm ⁻¹ im FT-IR-Spektrum von CGA (Zusätzliche Datei 1:Abbildung S1); dieser charakteristische Peak in CGA@SeNPs wurde jedoch auf 3419,00 cm ⁻¹ . geändert . Die Verschiebung bestätigte, dass CGA über die -OH-Gruppe an die Oberfläche von SeNPs konjugiert war.

Die Stabilität von CGA@SeNPs unter physiologischen Bedingungen ist wichtig für die Bewertung ihrer zukünftigen Anwendungen. Daher wurde die Größenverteilung von CGA@SeNPs in PBS (pH 7,4) bei Raumtemperatur 7 Tage lang überwacht. Wie in Zusatzdatei 1:Abbildung S2 gezeigt, blieb die Größe von CGA@SeNPs mit einer durchschnittlichen Größe von etwa 100 nm stabil, und CGA@SeNPs behielten innerhalb von 7 Tagen eine gute Wasserdispergierbarkeit in PBS bei. Die günstige Stabilität von CGA@SeNPs unterstützt ihre potentielle Anwendung im medizinischen Bereich.

Hemmung der ROS-Erzeugung

Das abgelagerte Aβ kann Mikroglia aktivieren und Mikroglia zur Produktion von Neurotoxinen wie ROS anregen, die im Gehirn weitere schwere neuronale Schäden verursachen können [22]. Außerdem können ROS wie Wasserstoffperoxid (H₂ O₂ ) kann auch durch Aβ-Aggregate erzeugt werden [23]. Daher untersuchten wir die antioxidativen Aktivitäten von CGA@SeNPs und die Wirkung von CGA@SeNPs auf Aβ-Aggregat-induziertes H₂ O₂ Formation. Wie in Zusatzdatei 1:Abbildung S3 gezeigt, haben die CGA@SeNPs konzentrationsabhängig starke Abfangaktivitäten gegen Radikale. Als die Konzentration 60 μg/ml erreichte, wurde das Hydroxylradikal ABTS ⁺ und die Superoxidanionen-Fängeraktivitäten erreichten 70,3%, 95,2% bzw. 95,1%. Offensichtlich nahm die Reduktionskraft von CGA@SeNPs mit steigender Konzentration zu. Von allen Proben zeigten CGA@SeNPs eine starke Reduktionskraft und Abfangkapazität für Hydroxylradikale, ABTS ⁺ und Superoxidanion als Vc und CGA. Diese Ergebnisse legten nahe, dass CGA@SeNPs eine höhere antioxidative Aktivität zeigten, was bei der Aufnahme von aktivem Sauerstoff bei AD helfen könnte. Zu beachten ist, dass die Modifikation von CGA auf SeNPs einen synergistischen Effekt auf die antioxidative Aktivität ausübt.

Die Wirkung von CGA@SeNPs auf das Aβ-vermittelte H₂ O₂ Generation wurde durch einen DCFH-DA-Assay untersucht [24], der die Bildung von H₂ . anzeigen kann O₂ aus dem Aβ in Gegenwart oder Abwesenheit von CGA@SeNPs. Wie in Abb. 2 gezeigt, verringerten CGA@SeNPs und CGA H₂ O₂ dosisabhängig. Noch wichtiger ist, dass die Aβ-Proben, die CGA@SeNPs enthalten, weniger H₂ . aufweisen O₂ als diejenigen, die CGA enthielten, was zeigt, dass die hohe antioxidative Aktivität von CGA@SeNPs eine stärkere Wirkung als CGA bei der Reduzierung des Aβ-induzierten H₂ . zeigte O₂ Generation.

H₂ O₂ Generierung aus Reaktionen von Aβ40 in Gegenwart oder Abwesenheit von Nanopartikeln. Aβ =35 μM, Nanopartikel/CGA =20, 40 und 60 μg/ml

Hemmung der Aβ-Aggregation durch CGA@SeNPs

Obwohl die antioxidative Aktivität von CGA eine bekannte Eigenschaft ist, ist die Anti-Amyloid-Aggregationsaktivität von CGA noch unbekannt. Um die Durchführbarkeit der CGA@SeNPs für therapeutische AD-Anwendungen zu verifizieren, wurde die Hemmwirkung von CGA@SeNPs auf die Aβ-Aggregation zunächst mit einem ThT-basierten fluorometrischen Assay untersucht, einer etablierten Methode zur Überwachung der β-Faltblatt-Bildung unter kontinuierlichen Zeit [25]. Wie in Abb. 3a gezeigt, aggregierte Aβ40 spontan und die Fluoreszenz der Aβ-Fibrillen nahm allmählich zu, bis sie nach 3 Tagen Inkubation ein Plateau erreichte. Wir haben beobachtet, dass CGA@SeNPs in der Lage waren, mit zunehmender Konzentration langsam Amyloidproteine ​​zu aggregieren. Die Fluoreszenzintensität von Aβ40-Fasern wurde etwa doppelt so hoch wie die von Aβ40 inkubiert mit 60 μg/ml CGA@SeNPs. Bei CGA wurde jedoch nur eine geringe oder keine Änderung der ThT-Fluoreszenzintensität beobachtet, was darauf hindeutet, dass CGA die Aβ40-Aggregation nur geringfügig hemmte.

Hemmwirkung von CGA@SeNPs auf Aβ40-Fibrillation. a ThT-Fluoreszenz der Aβ40-Fibrillenbildung in Gegenwart oder Abwesenheit von Nanopartikeln/CGA von 0 bis 5 Tagen. Aβ40 =35 μM, Nanopartikel/CGA =20, 40 und 60 μg/ml. b Morphologie von Aβ40, inkubiert mit oder ohne Nanopartikel oder CGA für 3 Tage. Aβ40 =35 μM, Nanopartikel/CGA =60 μg/ml

Die morphologischen Veränderungen von Aβ40 inkubiert mit oder ohne CGA oder CGA@SeNPs sind in Abb. 3b gezeigt. Aβ40, das in 3 Tagen inkubiert wurde, bildete reichlich Fibrillen, während sich in Gegenwart von CGA@SeNPs (60 μg/ml) keine Fibrillen bildeten. Wie erwartet hemmte CGA die Aβ-Fibrillogenese nicht signifikant, wohingegen große Mengen an Aggregaten in der Lösung von CGA-behandeltem Aβ40 beobachtet wurden, was mit dem fluorometrischen ThT-Assay übereinstimmte. Diese Ergebnisse zeigten, dass nach der Modifikation von CGA auf SeNPs die Bildung von β-Faltblättern offensichtlich verringert werden könnte.

Bindungsaktivität von CGA@SeNPs an Aβ40

Um die inhibitorische Aktivität von CGA@SeNPs auf die Aβ-Aggregation besser zu verstehen, untersuchten wir die Bindungsaffinität von CGA@SeNPs für Aβ40. Um zunächst die Bindung von Nanopartikeln an Aβ40-Fasern auf ultrastruktureller Ebene zu bewerten, wurden Aβ40-Fasern mit CGA@SeNPs inkubiert. Wir beobachteten, dass die Fibrillen spezifisch an die Oberfläche von SeNPs binden, ohne dass freie, nicht assoziierte suspendierte Nanopartikel vorhanden sind (Abb. 4a).

Affinität von CGA@SeNPs für Aβ40. a Die Bindungskapazität von CGA@SeNPs auf Aβ40-Fasern. Die durchgeführten Fasern von Aβ40 wurden mit CGA@SeNPs inkubiert und auf TEM untersucht. Aβ40 =35 μM, CGA@SeNPs =60 μg/ml. b Affinität und Spezifizierung von CGA@SeNPs für Aβ40-Monomer. Die RLS-Spektren von Aβ40-Monomer in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von CGA@SeNPs. Aβ40 =600 nM, Nanopartikelkonzentration, 1–9:0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35 und 0,4 μg/ml. c Die RLS-Spektren von CGA@SeNPs, Nanopartikelkonzentration, 1–9:0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4 und 0,45 μg/ml

Resonanzlichtstreuung (RLS) ist eine leistungsstarke optische Technik, die auf elastischer Lichtstreuung basiert und weit verbreitet zur Untersuchung der Größe, Form und Verteilung von Nanopartikeln in Lösung eingesetzt wird [26]. Daher verwendeten wir als nächstes RLS, um die Wechselwirkung zwischen Aβ40-Monomer und CGA@SeNPs zu analysieren. Wie in Abb. 4b, c gezeigt, ist die RLS-Intensität von NPs viel niedriger als die von NPs, die mit 600 nM Aβ40-Monomer bei derselben Konzentration inkubiert wurden. Sobald die CGA@SeNPs Aβ-Molekülen ausgesetzt wurden, wird angenommen, dass Aβ an die Oberfläche von SeNPs über N-Donoren bindet, die Seitenketten von Aminosäuren enthalten, um eine Se-N-Bindung zu bilden [27]. Die Bildung von Konjugaten von Aβ-Molekülen auf CGA@SeNPs führt zu einer Vergrößerung der Streuung, was die RLS-Intensität des Systems erhöht (Abb. 4b). In Kombination mit den Ergebnissen des ThT-Assays und des TEM wird spekuliert, dass die Wechselwirkungen zwischen der großen CGA@SeNP-Oberfläche und dem Aβ40-Monomer durch die Blockierung des direkten Kontakts zwischen den Monomeren zu ungünstigen Bedingungen für die Keimbildung und das Fibrillenwachstum führen könnten. Somit üben CGA@SeNPs eine stärkere Wirkung als CGA bei der Hemmung der Aβ40-Aggregation aus.

Hemmung der Aβ40-Neurotoxizität

Die Zytotoxizität von Aβ40 in Gegenwart oder Abwesenheit von CGA@SeNPs in PC12-Zellen wurde mittels MTT-Assay untersucht. Abbildung 5a zeigt, dass Aβ40-Fasern für die PC12-Zellen toxisch waren, was die Lebensfähigkeit der Zellen auf 53 % reduzierte. In Gegenwart von CGA@SeNPs erhöhte sich das Überleben der Zellen auf etwa 95 %. Eine Vorbehandlung der Zellen mit CGA erhöhte jedoch das Überleben der Zellen nur geringfügig auf 66%. Darüber hinaus waren die CGA@SeNPs für PC12-Zellen nicht toxisch (zusätzliche Datei 1:Abbildung S4), was darauf hindeutet, dass CGA@SeNPs die Neurotoxizität von Aβ40 hemmen könnten.

Die Neurotoxizität von Aβ40 inkubiert mit oder ohne CGA@SeNPs/CGA. a Die Zelllebensfähigkeit von PC12-Zellen gegenüber Aβ40 in Gegenwart von CGA@SeNPs oder CGA wurde durch MTT-Assay getestet. b Die Freisetzung von LDH in das Kulturmedium. Aβ40 =35 μM, CGA@SeNPs/CGA =60 μg/ml

Es wurde berichtet, dass Aβ bevorzugt an der Zelloberfläche immobilisiert und die Zellmembranschädigung verursacht hat [28]. Um die Integrität der Zellmembran nach Exposition gegenüber Aβ40 in Gegenwart oder Abwesenheit von NPs/CGA zu bestimmen, haben wir daher die extrazellulären LDH-Spiegel in Zellkulturmedium gemessen. In diesem Assay spiegelt der hohe LDH-Spiegel die Schädigung der Zellmembran wider. Wie in Abb. 5b gezeigt, erhöhte sich die LDH-Freisetzung im Vergleich zur Kontrolle nach Exposition gegenüber Aβ40 auf 142%. In Übereinstimmung mit dem Ergebnis von MTT wurde in Gegenwart von CGA@SeNPs die LDH-Freisetzung auf ein normales Niveau reduziert. Interessanterweise haben wir beobachtet, dass CGA die LDH-Konzentration nicht reduziert, was darauf hindeutet, dass CGA PC12-Zellen nicht vor einer durch Aβ-Aggregate induzierten Zellmembranschädigung schützen kann.

Verhinderung der Aβ40-induzierten ROS-Erzeugung in PC12-Zellen

Aβ-Aggregate sind in der Lage, ROS zu produzieren, die bei AD oxidativen Stress verursachen können [29]. Aufgrund der Antioxidations- und Antiaggregationseigenschaften von CGA@SeNPs stellten wir die Hypothese auf, dass es in der Lage wäre, die Aβ40-induzierte ROS-Erzeugung in PC12-Zellen zu reduzieren. Somit wurde die Wirkung von NPs auf die Aβ40-Aggregat-induzierte ROS-Erzeugung durch DCFH-DA gemessen. DCF ist ein fluoreszierender Marker, der aus der Reaktion von nicht fluoreszierendem DCFH-DA mit ROS abgeleitet wird und auf die durch Aβ40-Aggregate induzierte Bildung von ROS hinweisen kann. Wie in Zusätzliche Datei 1:Abbildung S5 gezeigt, führte die Behandlung mit Aβ40-Aggregaten zu einem mehr als 1,5-fachen Anstieg des ROS-Gehalts im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Die CGA@SeNP-Behandlung verringerte die DCF-Fluoreszenzintensität in PC12-Zellen, was darauf hindeutet, dass die CGA@SeNPs die Aβ-Fibrillen-induzierte ROS auf ein normales Niveau senkten. Interessanterweise reduzierte CGA auch die ROS-Erzeugung in PC12-Zellen, aber nicht so offensichtlich wie CGA@SeNPs.

Prävention der Aβ40-induzierten Zell-Apoptose in PC12-Zellen

Es wurde berichtet, dass der durch Aβ-Fibrillen verursachte Tod neuronaler Zellen ein kritisches Ereignis in der AD-Pathologie ist [30]. Um die Zytotoxizität von Aβ40-Fibrillen weiter zu untersuchen, führten wir eine TUNEL-DAPI-Co-Färbung durch, um die Wirkung von NPs oder CGA bei der Aβ40-induzierten Zellapoptose zu bestimmen. Die DNA-Fragmentierung ist ein Kennzeichen der Zellapoptose, die mit TUNEL in den frühen Stadien der Apoptose nachgewiesen werden konnte [31]. Wie in Fig. 6 gezeigt, wurden die apoptotischen Kerne durch TUNEL in hellem fluoreszierendem Grün gefärbt. Aβ40 erhöhte die Anzahl der TUNEL-gefärbten Kerne dramatisch, während die CGA@SeNP-Behandlung eine Abnahme der TUNEL-positiven Kerne verursachte, was zeigt, dass CGA@SeNPs Neuronen vor Aβ40-induzierter PC12-Zell-Apoptose schützen können. Ansonsten sind auch hohe ROS-Spiegel in Zellen an der Apoptose beteiligt [32]. Somit deuteten diese Ergebnisse darauf hin, dass die durch Aβ40 ausgelöste Apoptose der Erzeugung von ROS zugeschrieben werden könnte. Es ist erwähnenswert, dass CGA auch die Aβ40-induzierte Zellapoptose reduzieren kann. Aus dem MTT- und LDH-Test verbesserte CGA nicht das Überleben der Zelle und verringerte die durch das Aβ-Aggregat induzierte Zellmembranschädigung. Die kombinierten Ergebnisse des TEM- und ThT-Assays ergaben, dass CGA eine Antioxidationseigenschaft besitzt, die aktiven Sauerstoff im Prozess der Aβ-Aggregation entfernen kann, aber die Aβ-Aggregation nicht vollständig hemmen kann. Daher könnte CGA die ROS-Erzeugung in Inkubationslösung und PC12-Zellen verringern und die ROS-induzierte Zellapoptose schützen, aber es kann die durch das Aβ-Aggregat induzierte Zellmembranschädigung nicht verringern. Die Schädigung der Zellmembran führt zum Austritt von intrazellulärem Inhalt in das umgebende Gewebe, was zu Gewebeschäden und Entzündungen führen kann [33]. Somit könnte die Kombination von gehemmter Aβ-Aggregation und Bildung reaktiver Sauerstoffspezies als eine neue therapeutische Methode in Betracht gezogen werden.

CGA@SeNPs verhindern die Aβ40-induzierte Zellapoptose in PC12-Zellen. Die Zellapoptose wurde durch den TUNEL-DAPI-Co-Färbungsassay nachgewiesen. Normaler Zellkern wurde blau gefärbt und das DNA-Fragment wurde grün gefärbt. Aβ40 =35 μM, CGA@SeNPs/CGA =60 μg/ml

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend hat CGA eine antioxidative pharmakologische Eigenschaft, hat jedoch keine Wirkung auf die Hemmung von Aβ-Fibrillation. Die Oberflächenmodifizierung von CGA auf SeNPs verleiht ihm eine neue Antiaggregationseigenschaft. Aβ40 könnte an der Oberfläche von CGA@SeNPs binden, was zu ungünstigen Bedingungen für die Keimbildung und das Fibrillenwachstum führt, da der direkte Kontakt zwischen den Monomeren blockiert wird. In diesem Fall hemmten CGA@SeNPs die Aβ40-Aggregation, beseitigten die ROS und schützten PC12-Zellen vor der Zerstörung der Zellmembran und der ROS-vermittelten Apoptose, die durch Aβ40-Aggregate induziert wird. In der CGA-Gruppe jedoch immobilisierten die Aβ-Aggregate auf der Zelloberfläche und verursachten Schäden an der Zellmembran, die ebenfalls zum Zelltod führen. Insgesamt sind CGA@SeNPs bei der Reduzierung von Aβ40, das bei Langzeitgebrauch toxisch ist, effizienter als CGA.

Abkürzungen

ABTS ⁺ :

2, 29-Azinobis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)

AD:

Alzheimer-Krankheit

Aβ:

Amyloid-β

CGA:

Chlorogensäure

DCFH-DA:

2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat

DMEM:

Dulbeccos modifizierte Eagle medium

EDX:

Energiedispersive Röntgenspektroskopie

FBS:

Fötales Rinderserum

FT-IR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

HRP:

Meerrettichperoxidase

LDH:

Laktatdehydrogenase

MTT:

Thiazolylblau-Tetrazoliumbromid

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

RSL:

Resonanzlichtstreuungsmessungen

SeNPs:

Selen-Nanopartikel

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop

ThT:

Thioflavin T

TUNEL:

Terminale Transferase-dUTP-Nick-End-Markierung

Vc:

Vitamin C