Auswirkungen von 15-nm-Goldnanopartikeln auf Proliferation, Apoptose und Sphäroidbildung in HT29 Darmkarzinom- und SPEV Embryonalnieren-Zellen

Zusammenfassung

Zellkulturmodelle bieten eine zuverlässige Plattform zur Bewertung potenzieller Nanomaterial-Toxizität und zur Aufschlüsselung ihres mechanistischen Einflusses auf Krebsbiologie. Hier evaluieren wir, wie 15-nm Citrat-stabilisierte Goldnanopartikel (AuNPs) zwei epitheliale Zelllinien unterschiedlichen Ursprungs beeinflussen: die kontinuierliche porzine embryonale Nierenlinie SPEV und die humane kolorektale Karzinomlinie HT29. Exposition gegenüber AuNP-Konzentrationen von 1 bis 12 µg mL⁻¹ ermöglichte Überwachung von Zelladhäsion, Proliferation, Apoptose/Nekrose und Kapazität zur Bildung multizellulärer Sphäroide. Wir fanden, dass 6–12 µg mL⁻¹ AuNPs die Zellproliferation signifikant reduzierten und frühe und späte apoptotische/nekrotische Populationen in beiden Linien erhöhten. Umgekehrt stimulierten niedrige AuNP-Dosen (1–3 µg mL⁻¹) die Sphäroidbildung, während höhere Dosen zytotoxische und anti-kohäsive Effekte in Suspensionskultur ausübten. Diese Ergebnisse unterstreichen die dosisabhängige Dualrolle von AuNPs und unterstützen ihre weitere Erforschung als gezielte Antikrebs-Strategie.

Hintergrund

Goldnanopartikel (AuNPs) werden für ihre Biokompatibilität, optischen Eigenschaften und aufkommendes therapeutisches Potenzial über ein Spektrum von Malignomen geschätzt, einschließlich Brust-, Leber-, Magen-, Darm- und Lungenkrebs [5–6]. Die einzigartigen physikochemischen Eigenschaften von AuNPs – Größe, Form, Oberflächenladung und Konzentration – bestimmen ihre zelluläre Aufnahme, Verteilung und biologische Effekte [12–14]. Während viele Studien die Antikrebs-Wirksamkeit von AuNPs fokussieren, bleibt umfassendes Toxizitätsprofiling in klinisch relevanten Modellen essenziell für sichere Translation.

Gezielte Lieferung von AuNPs an Tumorengewebe bleibt eine Herausforderung; differentielle Aufnahmeraten wurden unter epithelialen Zellen verschiedenen Ursprungs berichtet [15–16]. Variationen in Membranzusammensetzung, Glykoproteinexpression und endozytärer Kapazität liegen diesen Unterschieden wahrscheinlich zugrunde und unterstreichen den Bedarf an vergleichenden Studien in normalen und malignen epithelialen Linien [17].

Zellkultur-Assays bieten eine kontrollierte Umgebung zur Dissektion zellulärer Antworten auf AuNPs, was sowohl Sicherheitsbewertungen als auch therapeutische Optimierung informiert. In dieser Studie verglichen wir die Effekte von AuNPs auf eine normal-ähnliche embryonale Nierenlinie (SPEV) und eine kolorektale Karzinomlinie (HT29) باستخدام Adhäsion, Proliferation, Apoptose/Nekrose und Sphäroidbildungs-Readouts.

Methoden

Kultur von SPEV-Zellen

SPEV-Zellen wurden in DMEM (Sigma, USA) mit 5 % FCS (HyClone, USA), Penicillin/Streptomycin (PAA, Österreich) und Amphotericin B (5 µg mL⁻¹) unterhalten. Zellen wurden bei 0,5–2 × 10⁴ Zellen cm⁻² gesät und in 5 % CO₂ bei 95 % Luftfeuchtigkeit kultiviert. Medium wurde alle 48 h erneuert, und Passagen erfolgten bei Erreichen der Konfluenz, wobei die Monolayermorphologie über Passagen erhalten blieb.

Kultur von HT29-Zellen

HT29-Zellen wuchsen in RPMI-1640 (Sigma, USA) mit 10 % FCS, 2 mM L-Glutamin und 40 mg mL⁻¹ Gentamicin (Sigma, USA). Die Arbeitsdichte betrug 0,5–4 × 10⁴ Zellen cm⁻². Zellen wurden von der Zelllinienbank am RE Kavetsky Institut für Experimentelle Pathologie, Onkologie und Radiobiologie, NAS der Ukraine, bezogen.

Manipulation mit AuNPs

AuNPs wurden durch Citratreduktionsmethode [22] synthetisiert und vom Institut für Biochemie und Physiologie von Pflanzen und Mikroorganismen, Russische Akademie der Wissenschaften, geliefert. Die Partikel hatten einen Durchschnittsdurchmesser von 15 nm, mit einer Stockkonzentration von 57 µg mL⁻¹. Dunkelfeld-Elektronenmikroskopie und Extinktionsspektren bestätigten die Größenverteilung (Abb. 1). Zellen wurden mit 1, 3, 6 oder 12 µg mL⁻¹ AuNPs für 24–48 h behandelt; unbehandelte Kulturen dienten als Kontrollen.

Abbildung 1. (a) Dunkelfeld-TEM-Bild von 15-nm-AuNPs (Größenverteilung); (b) Extinktionsspektrum.

Adhäsions- und Proliferationsassays

Adhäsion wurde durch Zählen abgeflachter Zellen nach 30, 60, 120, 180 und 1440 min nach Aussaat quantifiziert, باستخدام invertiertem Mikroskop. Proliferation über 1–4 Tage wurde durch Trypsin-EDTA-Detachment und Zählung in einer Goryaev-Kammer bewertet. Daten wurden als Mittelwert ± SE ausgedrückt.

Apoptose/Nekrose-Bewertung

Nach 4 Tagen AuNP-Exposition wurden Zellen mit Annexin-V und 7-AAD gefärbt und durch Durchflusszytometrie (FACS Calibur, BD) analysiert. Ergebnisse wurden mit WinMDI v2.8 verarbeitet.

Multizelluläre Sphäroidbildung

Zur Sphäroidgenerierung wurden 5 × 10⁴ Zellen cm⁻² in 24-Well-Platten mit 1 % Agar beschichtet und in 0,24 % Carboxymethylcellulose (CMC) mit 80 rpm Rotation kultiviert. Sphäroide durften 24 h bilden, dann wurden sie weitere 48 h in Gegenwart von AuNPs unterhalten. Sphäroidgröße und -anzahl wurden durch Dunkelfeldmikroskopie gemessen und mit Axio Vision 4.7 analysiert, Volumenberechnung via V = 0,4 × a × b² (a, b = Durchmesser). Aggregate wurden nach Volumen (1 × 10⁻⁴–1 × 10⁻² mm³) gruppiert, um Medianvolumina und -zahlen zu bestimmen.

Statistische Analyse

Daten wurden mittels Einfaktorielle Varianzanalyse (one-way ANOVA) und Student's t-Test (Statistica 8) analysiert. Signifikanz wurde bei p ≤ 0,05 gesetzt, dargestellt als Mittelwert ± SE.

Ergebnisse

Adhäsion von SPEV- und HT29-Zellen

Abbildung 2 illustriert den Einfluss von AuNPs auf SPEV-Adhäsion. Nach 1 h reduzierten 1, 3 und 6 µg mL⁻¹ AuNPs die anhaftenden Zellzahlen relativ zur Kontrolle, wobei 12 µg mL⁻¹ eine 1,8-fache Abnahme verursachte, die über 24 h persistierte. HT29-Zellen zeigten einen ähnlichen Trend: niedrige Konzentrationen hatten vernachlässigbare Effekte, während 6 und 12 µg mL⁻¹ Adhäsion um 1,16- bzw. 1,28-fach reduzierten (Abb. 3).

Abbildung 2. Adhäsionsdynamik von SPEV-Zellen nach AuNP-Exposition (*p ≤ 0,05 vs. Kontrolle).

Abbildung 3. Adhäsionsdynamik von HT29-Zellen nach AuNP-Exposition (*p ≤ 0,05 vs. Kontrolle).

Proliferation von SPEV- und HT29-Zellen

Abbildung 4 zeigt, dass 1–6 µg mL⁻¹ AuNPs die SPEV-Proliferation an Tagen 2–4 nicht veränderten, während 12 µg mL⁻¹ Zellzahlen um bis zu 1,5-fach reduzierte (Abb. 4). HT29-Proliferation blieb bis Tag 3 unverändert; an Tag 4 senkten 6 und 12 µg mL⁻¹ Zellzahlen um 1,33- bzw. 1,44-fach (Abb. 5).

Abbildung 4. Proliferation von SPEV-Zellen nach AuNP-Exposition (*p ≤ 0,05 vs. Kontrolle).

Abbildung 5. Proliferation von HT29-Zellen nach AuNP-Exposition (*p ≤ 0,05 vs. Kontrolle).

Apoptose/Nekrose-Induktion

Niedrige AuNP-Dosen (1–3 µg mL⁻¹) veränderten Annexin-V/7-AAD-Profile in keiner Linie signifikant (Tabellen 1–2). Bei 6–12 µg mL⁻¹ zeigten sowohl SPEV als auch HT29 erhöhte frühe und späte apoptotische/nekrotische Populationen. Für SPEV erhöhte 12 µg mL⁻¹ Annexin-V⁺/7-AAD⁺ Zellen um 7,8 % (p ≤ 0,05); für HT29 erhöhten 6 µg mL⁻¹ und 12 µg mL⁻¹ diesen Anteil um 3,2 % bzw. 4,8 %.

Sphäroidbildung

Abbildungen 6 und 7 zeigen, wie AuNPs Sphäroidanzahl und -volumen modulieren. Kontroll-HT29-Sphäroide durchschnittlich 5,19 × 10⁻³ mm³, während SPEV-Sphäroide 0,79 × 10⁻⁵ mm³ durchschnittlich. 1–3 µg mL⁻¹ AuNPs verstärkten SPEV-Sphäroidvolumen um 9,7- bzw. 7,4-fach und HT29-Volumen um 1,4- bzw. 1,2-fach. Erhöhung der AuNP-Konzentration auf 12 µg mL⁻¹ reduzierte Sphäroidvolumen in beiden Linien (HT29: 7,18 → 4,24 × 10⁻³ mm³; SPEV: 7,69 → 4,58 × 10⁻⁵ mm³), während HT29-Sphäroidanzahl von 3 auf 10 pro Feld stieg und SPEV-Sphäroide von 32 auf 19 sanken.

Abbildung 6. Anzahl und Volumen von SPEV-Sphäroiden nach AuNP-Exposition (#p ≤ 0,01 für Anzahl; **p ≤ 0,01 für Volumen).

Abbildung 7. Anzahl und Volumen von HT29-Sphäroiden nach AuNP-Exposition (#p ≤ 0,01 für Anzahl; **p ≤ 0,01 für Volumen).

Diskussion

Unsere Daten bestätigen ein dosisabhängiges zytotoxisches Profil von 15-nm-AuNPs in sowohl SPEV- als auch HT29-Zellen. Konzentrationen von 6–12 µg mL⁻¹ inhibierten Proliferation, erhöhten Apoptose/Nekrose und störten Zellkohäsion in Suspension, wie durch veränderte Sphäroidgröße und -anzahl belegt. Die erhöhte Sensitivität von HT29 (6 µg mL⁻¹) relativ zu SPEV (12 µg mL⁻¹) stimmt mit früheren Berichten über differentielle Aufnahme und zytoskelettale Disruption durch AuNPs [27–30] überein.

Mechanistisch können AuNPs Fokaladhäsionskomplexe interferieren, Aktindynamik modulieren und mitochondriellen oxidativen Stress triggern – Wege, die in Zellzyklusarrest und programmierten Zelltod münden [31–34]. Der beobachtete anti-kohäsive Effekt bei höheren Dosen spiegelt wahrscheinlich Disruption von Zell-Zell-Junctions wider, was zu erhöhter Sphäroidfragmentierung führt.

Während In-vitro-Befunde vielversprechend sind, ist In-vivo-Validierung essenziell, um therapeutische Wirksamkeit und Sicherheit zu bestätigen. Dennoch liefert unsere Studie einen rigorosen Benchmark für das Design AuNP-basierter Antikrebs-Strategien, die ihre duale Kapazität zur Inhibition von Tumorwachstum und Modulation zellulärer Mikroumgebungen ausnutzen.

Schlussfolgerungen

15-nm-AuNPs zeigen klare, konzentrationsabhängige Effekte auf sowohl normal-ähnliche SPEV- als auch maligne HT29-Zellen: reduzierte Proliferation, erhöhte Apoptose/Nekrose und veränderte Sphäroiddynamik. Niedrige Dosen (1–3 µg mL⁻¹) fördern Sphäroidbildung, während höhere Dosen (6–12 µg mL⁻¹) zytotoxische und anti-kohäsive Aktionen ausüben. Diese Befunde unterstützen weitere Untersuchung von AuNPs als gezielte Antikrebs-Modalität, mit Augenmerk auf Dosisoptimierung für maximalen therapeutischen Nutzen und minimale Off-Target-Toxizität.