In-vitro-Studie zum Einfluss von Au-Nanopartikeln auf HT29- und SPEV-Zelllinien

Hintergrund

Die Herstellung und Untersuchung der Goldnanopartikel (AuNPs) haben nicht nur ein hohes Potenzial für eine breite therapeutische Anwendung von Gold [1, 2], sondern haben sie auch für spezifische biomedizinische Anwendungen wie Zieltherapien geeignet gemacht [3, 4]. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass die Verwendung von AuNPs eine Möglichkeit für neuartige Antitumortherapien mit einem verringerten Risiko für die Entwicklung von Resistenzen bietet. Daher haben mehrere Studien die Antitumoraktivität von Nanopartikeln gegen Brust-, Leber-, Magen-, Dickdarm- und Lungenkrebs nachgewiesen [5, 6].

Es ist bekannt, dass Nanopartikel (NPs) das Zellschicksal modulieren, Mutationen induzieren oder verhindern, die Zell-Zell-Kommunikation initiieren und die Zellstruktur modulieren können [7, 8]. Darüber hinaus haben AuNPs aufgrund ihrer Biokompatibilität und Antitumoraktivität Vorteile gegenüber anderen Metall-NPs [8,9,10,11,12]. Die zytotoxischen und genotoxischen Wirkungen von AuNPs hängen mit ihrer Form, Größe, Ladung, Konzentration, Wechselwirkungszeit usw. zusammen [12,13,14]. Daher sind Informationen über ihre potenzielle Toxizität und Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit für den Einsatz von Nanomaterialien in klinischen Umgebungen erforderlich.

Trotz der großen Erfolge in der zielgerichteten Therapie bleibt das Problem der selektiven Abgabe von AuNPs in das Zielgewebe derzeit ungelöst. Einige Studien haben unterschiedliche Aufnahmeraten von NPs durch Epithelzellen unterschiedlicher Herkunft festgestellt [15, 16]. Untersuchungen zur Erklärung dieses Phänomens fehlen jedoch, obwohl sie helfen könnten, ein gewebeselektives Targeting von AuNPs zu erreichen. Anatomische oder physiologische Unterschiede zwischen verschiedenen Epithelien könnten Unterschiede in den Aufnahme- und Transportraten von AuNPs erklären. Insbesondere kann die Aufnahmegeschwindigkeit durch die Plasmamembraneigenschaften der Zellen und die Bindung von Nanopartikeln an Glykoproteine ​​und Proteoglykane der Zelloberfläche sowie die Fähigkeit der Zellen zum vesikulären Transport beeinflusst werden [17]. Unter Berücksichtigung der Unmöglichkeit einer ausschließlich selektiven Interaktion von Nanopartikeln mit Zielzellen ist daher die vergleichende Untersuchung der Merkmale ihrer Interaktion mit normalen und onkogenen Zellen zur Vermeidung unerwünschter Folgen einer Krebstherapie aktuell [8,9,10].

Obwohl In-vivo-Modelle für die Bewertung der biologischen Toxizität von Nanopartikeln wertvoll sind, sind Zellkulturmodelle für präklinische physiologische und toxikologische Studien sehr nützlich. Derzeit werden Zellkulturen in verschiedenen Bereichen der Biologie, Medizin, Veterinärmedizin und Biotechnologie verwendet. Die Verwendung von Zellkulturen ermöglicht es, schwierige und manchmal unmögliche biologische Prozesse auf der Ebene von Organismen zu untersuchen. Zellkulturen spielen in der Biotechnologie eine wichtige Rolle bei der Herstellung vieler Impfstoffe, Testsysteme und biologisch aktiver Substanzen. Zellkulturen werden zur Diagnose von Krankheiten unterschiedlicher Ätiologie verwendet, als Testobjekte bei der Erprobung neuer pharmakologischer, therapeutischer und kosmetischer Wirkstoffe sowie von Lebensmittelzusatzstoffen [18].

In dieser Arbeit an Zellkulturmodellen haben wir versucht, die Wirkungsmerkmale von AuNPs auf Epithelzellen kontinuierlicher und onkogener Zelllinien zu untersuchen. Monolayer-Kultur von Epithelzellen SPEV (embryonic porcine niere epithelial inoculated line) und HT-29 (Coloncarcinoma cell line)-Zellen können als Modell für normales und krebsartiges Epithelgewebe angesehen werden, wenn eine Antitumortherapie mit AuNPs angewendet wird. Mehrere traditionelle Zytotoxizitätsassays, einschließlich Adhäsion, Proliferation, Nekrose/Apoptose und multizelluläre Sphäroide, wurden verwendet, um die Zellzytotoxizität von AuNPs zu validieren.

Methoden

Kultur der SPEV-Zellen

SPEV-Zellen wurden in Plastikflaschen in DMEM (Sigma, USA) mit 5% FCS (v /v ) (HyClone, USA) ergänzt mit Penicillin/Streptomycin (PAA, Österreich) und Amphotericin B (5 μg/ml) (5 % CO₂ .) , 95% Luftfeuchtigkeit) wie von [19] berichtet. Die Saatkonzentration betrug 0,5–2 × 10 ⁴ Zellen/cm ² . Das Kulturmedium wurde alle 2 Tage ausgetauscht. Die Zellen wurden bei 100 % Konfluenz passagiert [20]. Die SPEV-Zelllinie wuchs und bewahrte die anfängliche morphologische Struktur der Monoschicht während serieller Passagen ohne Anzeichen einer Zelldegeneration in der Kultur.

Kultur der HT29-Zellen

HT29-Zellen wurden in Plastikflaschen (Nunc, Dänemark) in RPMI-1640-Medium (Sigma, USA) mit 10 % FCS (v /v ) (HyClone, USA) ergänzt mit 2 mM L-Glutamin (Sigma, USA) und 40 mg/ml Gentamycin (Sigma, USA) unter Standardbedingungen (5 % CO₂ .) , 95 % Luftfeuchtigkeit) [21]. Die optimale Zelldichte betrug 0,5–4,0 × 10 ⁴ Zellen /cm ² . Die Zellen wurden uns freundlicherweise von der Bank of Cell Lines from Human and Animal Tissue des RE Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology NAS der Ukraine zur Verfügung gestellt.

Manipulationen mit AuNPs

AuNPs wurden freundlicherweise vom Institut für Biochemie und Physiologie von Pflanzen und Mikroorganismen der Russischen Akademie der Wissenschaften zur Verfügung gestellt. AuNPs wurden durch die Citratmethode synthetisiert [22]. Die durchschnittliche Größe der Nanopartikel betrug 15 nm. Die anfängliche Goldkonzentration betrug 57 μg/ml. Die Ergebnisse der Dunkelfeld-Elektronenmikroskopie, eine Aufnahme von 15 nm AuNPs und Extinktionsspektren von 15 nm AuNPs (b) sind in Abb. 1 dargestellt (Abb. 1a; Hinweis––Diagramm der Größenverteilung) [23]. AuNPs wurden durch passive Diffusion bei 37 °C in Zellen eingebracht. Die untersuchten Konzentrationen betrugen 1, 3, 6 und 12 µg/ml. Zellen ohne AuNPs unter den gleichen Bedingungen wurden als Kontrollzellen verwendet.

Ergebnisse der Dunkelfeld-Elektronenmikroskopie, a Bild von 15 nm großen AuNPs (Hinweis––Diagramm der Größenverteilung), b Extinktionsspektren von 15 nm großen AuNPs

Adhäsions- und Proliferationszellen

Der morphofunktionelle Zustand der Zellkulturen wurde anhand der Adhäsionseigenschaften und der proliferativen Aktivität beurteilt. Die Adhäsionseigenschaften von SPEV- und HT29-Zellen wurden visuell unter Verwendung eines inversen Mikroskops bewertet; die Anzahl der anhaftenden und abgeflachten Zellen wurde 30, 60, 120, 180 und 1440 Minuten nach Beginn der Kultivierung gezählt.

Die Proliferationsdynamik von SPEV- und HT29-Zellen wurde 1–4 Tage lang untersucht. Um den Zellzahlzuwachs in den untersuchten Kulturen zu den Untersuchungsbedingungen zu untersuchen, wurden diese enzymatisch (1:1 (0,25% Trypsinlösung:EDTA, PAA)) vom Kunststoff abgelöst und die Zellzahl gezählt. Die Gesamtzahl der kultivierten Zellen wurde nach der traditionellen Methode in Goryaevs Kammer gezählt.

Apoptotische/nekrotische Prozesse

Apoptotische und nekrotische Prozesse in SPEV- und HT29-Zellen, die AuNPs ausgesetzt waren, wurden in 4 Tagen mit Annexin-V (BD, USA), 7-Amino-Actinomycin (7AAD) (BD)-Farbstoffen unter Verwendung eines FACS Calibur Becton-Dickinson untersucht. Die Ergebnisse wurden mit der Software WinMDI v.2.8 analysiert.

Mehrzellige Sphäroide

Die multizellulären Sphäroide (MSs) wurden generiert, um den in vitro-Einfluss von AuNPs auf das Migrations- und Aggregationspotential der untersuchten Zellen abzuschätzen. Das sphäroide (3-D) Modellsystem von SPEV- und HT29-Zellen wurde nach der konventionellen Methode kultiviert, die von [24] beschrieben und in unserem Labor modifiziert wurde [25]. Kurz gesagt, die Zellsuspension wurde unter Verwendung von Trypanblau und einer gleichen Anzahl von Zellen (5 × 10 ⁴ .) gezählt Zellen/cm ² ) wurden in vollständig ergänztem Kulturmedium gepflanzt. Die MS-Erzeugung wurde durch die Handhabung von Zellkulturen mit 0,24 % Carboxymethylcellulose (CMC) in Platten mit 24 Vertiefungen, die mit 1 % Agar beschichtet waren, mit Rotation (80 U/min) für 24 Stunden erreicht. Danach wurde die 3-D-Zellkultur unter Standardbedingungen gehalten. Um die Abhängigkeit der Größe und Anzahl von MSs von der AuNP-Konzentration zu untersuchen, wurden MSs in Gegenwart von AuNPs erzeugt. Die weitere Kultivierung wurde 48 h lang mit konstanter Rotation der Platten durchgeführt. Im nächsten Schritt wurden Mikrofotoaufnahmen im Dunkelfeldverfahren mit einem Carl Zeiss Stemi 2000 Mikroskop gemacht. Die MS-Morphologie wurde mit Hilfe des Programms Axio Vision Release 4.7 (Zeiss) untersucht. Dieses Programm ermöglicht die Messung der geometrischen Abmessungen von Zellaggregaten. Dann wurde das Volumen aller MSs berechnet, die sich in den Akten befanden. Es wurde mit der folgenden Formel verwendet:V = 0,4 × a × b ² , wobei a und b ––Geometrische Durchmesser von MS [24]. Für die statistische Analyse wurden alle Zellaggregate nach Größe von 1 × 10 ^–4 . gruppiert mm ³ bis 1 × 10 ⁻² mm ³ in Schritten von 1 × 10 ⁻³ mm ³ . Die MS-Zahl und der Median der MS-Volumina wurden für jede Gruppe geschätzt.

Statistische Analyse

Eine einfaktorielle Varianzanalyse und Student's t test wurden zur statistischen Aufbereitung der Daten mit dem Softwarepaket Statistica 8 verwendet. Die Signifikanzschwelle lag bei 0,05. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte und Standardfehler (M ± SE) dargestellt.

Ergebnisse

Auswirkung von AuNPs auf die Adhäsion von SPEV- und HT-29-Zellen

Die Zelladhäsion ist ein Indikator für den Funktionszustand von Zellen und ist für das weitere Wachstum der Kultur notwendig. Als die Adhäsion beendet war, wurden die Zellen abgeflacht und erhielten eine geeignete Morphologie. Die Adhäsionseigenschaften von SPEV-Zellen sind in Abb. 2 dargestellt.

Adhäsionsdynamik von SPEV-Zellen nach Exposition von AuNPs, *p ≤ 0,05 ist signifikant gegenüber der Kontrolle

Nach 1 h Kultivierung von SPEV-Zellen mit AuNPs bei 1, 3 und 6 μg/ml war die Anzahl der adhärierten Zellen geringer als der Kontrollwert. Der Prozentsatz abgeflachter Zellen in Proben mit AuNPs für diese Konzentrationen unterschied sich nicht signifikant von der Kontrolle. Die Adhäsion wurde nach 1 h Inkubation mit AuNPs bei 12 μg/ml verlangsamt. Die Zahl der anhaftenden Zellen pro Quadratzentimeter wurde im Vergleich zur Kontrolle um das 1,8-fache reduziert. Diese Adhäsionsneigung hielt über alle Testzeiträume an. Nach 24 Stunden Beobachtung war die Anzahl der adhärierten Zellen im Vergleich zur Kontrolle um das 1,3-fache niedriger. Gleichzeitig hatte die Inkubation von AuNPs in geringen Konzentrationen (1 und 3 μg/ml mit Tumorzellen (HT29) keinen signifikanten Einfluss auf die Menge an adhäsiven Zellen. Eine Erhöhung der AuNP-Konzentration auf 6 und 12 μg/ml führte zu einer Verringerung der Anzahl der Tumorzellen in der adhäsiven Fraktion um das 1,16- bzw. 1,28-fache (Abb. 3) Die erhaltenen Daten können durch mehrere Prozesse beeinflusst werden:Der eine ist die zytostatische/zytotoxische Wirkung von AuNPs auf die Adhäsionsfraktion von Tumor und embryonalen Zelllinien, die zum Zelltod, Übergang zur Apoptose oder Nekrose führen.Der andere Prozess ist die Verringerung der Zelladhäsion unter dem Einfluss von AuNPs und der Transfer von Zellen in die Suspensionsfraktion.Bemerkenswerterweise können beide Prozesse gleichzeitig realisiert werden, und jede einzelne kann zur Verringerung der Anzahl lebender Zellen in der Adhäsionsfraktion beitragen.

Adhäsionsdynamik von HT29-Zellen nach Exposition von AuNPs, *p ≤ 0,05 ist signifikant gegenüber der Kontrolle

Auswirkung von AuNPs auf die Proliferation von SPEV- und HT-29-Zellen

Die Wirkung von AuNPs im Konzentrationsbereich von 1–12 μg/ml auf proliferative Prozesse in SPEV-Zellkulturen wurde untersucht (Abb. 4). An den Tagen 2–4 der Kultivierung mit AuNPs bei 1, 3 und 6 μg/ml unterschied sich die Zellzahl nicht signifikant von der Kontrolle. An Tag 4 der Kultivierung mit AuNPs von 3 und 6 μg/ml nahm dieser Index im Vergleich zur Kontrolle um das 1,15- bzw. 1,23-Fache ab. Eine Verringerung der Zellzahl um das 1,5-Fache (Tage 2 und 3) und um das 1,15-Fache an Tag 4 der Kultivierung mit AuNPs bei 12 μg/ml wurde in SPEV-Kultur im Vergleich zur Kontrolle beobachtet. Somit verlangsamte die AuNP-Konzentration von 12 μg/ml das Zellwachstum innerhalb des beobachteten Zeitraums.

Proliferation von SPEV-Zellen nach Exposition von AuNPs, *p ≤ 0,05 ist signifikant gegenüber der Kontrolle

Die Wirkung von AuNPs in Konzentrationen von 1 bis 12 μg/ml auf die Anzahl der HT 29-Zellen in einer Monolayer-Kultur ist in Abb. 5 dargestellt der AuNPs war statistisch nicht unterschiedlich. Am 4. Kultivierungstag wurde eine dosisabhängige Abnahme der Zellzahl in der 2D-Kultur festgestellt. Nach 4 Tagen der Kultivierung unterscheidet sich die Anzahl der HT 29-Zellen für niedrige Konzentrationen von AuNPs (1 und 3 μg/ml) also nicht signifikant von der Kontrolle. Bei höheren AuNP-Konzentrationen (6–12 μg/ml) war die HT29-Zellzahl jedoch 1,33- bzw. 1,44-mal niedriger als die der Kontrolle.

Proliferation von HT29-Zellen nach Exposition von AuNPs, *p ≤ 0,05 ist signifikant gegenüber der Kontrolle

Wirkung von AuNPs auf apoptotische/nekrotische Prozesse in SPEV- und HT-29-Zellen

SPEV- und HT-29-Zellen in Gegenwart von AuNPs wurden 4 Tage unter Standardbedingungen kultiviert. Die Kultivierung von SPEV- und HT29-Zellen mit AuNPs bei 1 und 3 μg/ml und die Indizes apoptotischer/nekrotischer Prozesse unterschieden sich nicht signifikant von der Kontrolle (Tabellen 1 und 2).

Die Kultivierung mit AuNPs bei 6–12 μg/ml erhöhte den Prozentsatz an Annexin V+/7AAD+-, Annexin V–/7AAD+- und Annexin V+/7AAD-Zellen sowie reduzierte den Prozentsatz an lebenden Zellen. Die Anzahl von Annexin V ⁺ /7AAD ⁺ SPEV-Zellen waren um 7,8 ± 0,7 % höher als der Kontrollwert (p ≤ 0,05) mit 12 μg/ml AuNPs. Die Anzahl von Annexin V ⁺ /7AAD ⁺ HT 29-Zellen waren um 3,2 ± 0,4 % höher als der Kontrollwert (p ≤ 0,05) mit 6 μg/ml AuNPs und um 4,8 ± 0,6 % (p ≤ 0,05) mit 12 μg/ml AuNPs.

Auswirkung von AuNPs auf die Erzeugung multizellulärer Sphäroide aus SPEV- und HT29-Zellen

Um die Abhängigkeit von Größe und Anzahl multizellulärer Sphäroide (MSs) von der AuNP-Konzentration zu bestimmen, wurden MSs mit verschiedenen Konzentrationen von AuNPs während 48 Stunden erzeugt. Unsere Daten zeigten die Vielfaltsfähigkeit von HT29- und SPEV-Zellen, multizelluläre Sphäroide unter den gleichen Bedingungen der Mikroumgebung zu bilden (Abb. 6 und 7).

Anzahl und Volumen der MS-Zellen SPEV nach Inkubation mit AuNPs, #p ≤ 0,01 (für die Anzahl der MS); **p ≤ 0,01 (für das Volumen der MS)

Anzahl und Volumen der MS-Zellen HT29 nach Inkubation mit AuNPs. #p ≤ 0,01 (für die Anzahl der MS); **p ≤ 0,01 (für das Volumen der MS)

Wenn also die Kontrollproben von HT29-Zellen für 48 h Sphäroide mit einem durchschnittlichen Volumen von 5,19 × 10 ⁻³ . bildeten mm ³ , das durchschnittliche Volumen des Sphäroids von SPEV-Zellen betrug 0,79 × 10 ^–5 mm ³ . Gleichzeitig zeigte der Einfluss von AuNPs auf die HT29- und SPEV-Zellen den gleichen Trend. Die Anwesenheit von AuNPs in der Mikroumgebung der Zellen stimulierte die Bildung mehrzelliger Sphäroide in beiden Kulturen. Wenn die Konzentration der AuNPs 1 betrug und 3 μg/ml MSs-Volumen für SPEV um das 9,7- bzw HT29 um das 1,4- bzw. 1,2-fache (Abb. 7).

Eine weitere Erhöhung der AuNP-Konzentration führte in beiden Kulturen zu einem abnehmenden durchschnittlichen Volumen an MS. Die Erhöhung der AuNP-Konzentration von 1 auf 12 μg/ml verringerte das Volumen der HT29-MS von 7,18 × 10 ⁻³ mm ³ bis 4,24 × 10 ⁻³ , in 1,69-mal, nach der Kontrolle. Bei SPEV verringerte sich das MS-Volumen von 7,69 auf 4,58 × 10 ^–5 ., wenn die Konzentration der AuNPs von 1 auf 12 μg/ml erhöht wurde mm ³ , in 1,68-mal, nach Kontrolle. Jedoch fällt eine steigende AuNP-Konzentration mit einer Verringerung des Volumens von MSs zusammen und korreliert mit einer Erhöhung der Anzahl von Sphäroiden in der Kultur von HT29-Zellen (Fig. 6 und 7). Die Anzahl der HT29-MS stieg von 3 auf 10 pro Sichtfeld bei einer AuNP-Konzentration von 1 auf 12 μg/ml. Gleichzeitig ging die Zahl der SPEV-MS von 32 auf 19 zurück.

Die erhaltenen Daten (Abb. 6 und 7) zeigen, dass AuNPs in der Lage sind, kohäsive Wechselwirkungen im Zell-Zell-System zu beeinflussen. Unsere Daten zeigen, dass geringe Konzentrationen von AuNPs (1–3 μg/ml) die Bildung multizellulärer Sphäroide sowohl von embryonalen als auch von Tumorzellen stimulierten. Höhere AuNP-Konzentrationen (6–12 μg/ml) hatten jedoch sowohl zytotoxische als auch antikohäsive Wirkungen auf Zellen in Suspension. Dieser Prozess trug zur Bildung einer größeren Anzahl von HT29-MS mit einem verringerten durchschnittlichen Volumen bei. Bei SPEV kann die hohe Konzentration von AuNPs einen zytostatischen Effekt haben, der die Zellzahl in der adhäsiven Fraktion und die Zahl der MS in Suspension reduziert. Zuvor berichteten die Autoren, dass Kohlenstoff-Nanopartikel die Adhäsion von Zellen an das Substrat reduzieren, den Zelltransfer in die Suspension stimulieren und zur Bildung mehrzelliger Sphäroide führen [25, 26]. In der Literatur gibt es Daten über die Fähigkeit von AuNP, die Struktur von Aktin/Myosin-Mikrofilamenten zu brechen und die Zellproliferation, -adhäsion und -differenzierung zu verringern [27]. Unsere Daten haben diese Annahme bestätigt.

Diskussion

Wir untersuchten die Auswirkungen von AuNPs auf die Proliferation, Nekrose/Apoptose und die Bildung von multizellulären Sphäroiden der Epithelzellen kontinuierlicher und onkogener Zelllinie. Es wurde gezeigt, dass die AuNPs bei 6–12 μg/ml die Anzahl der SPEV- und HT29-Zellen reduzierten und die Zellanzahl in frühen und späten Stadien der Apoptose und Nekrose erhöhten. Die geringen Konzentrationen von AuNPs stimulieren die Bildung multizellulärer Sphäroide durch HT29- und SPEV-Zellen. Höhere AuNP-Konzentrationen hatten jedoch sowohl zytotoxische als auch antikohäsive Wirkungen auf Zellen in Suspension. Die große Empfindlichkeit gegenüber der Wirkung von AuNPs wurde durch die Linie von HT29 (6 μg/ml) im Vergleich zu den SPEV-Zellen (12 μg/ml) gezeigt.

Die Auswirkungen von AuNPs auf die Zellmorphologie und das Zytoskelett haben erst vor kurzem mehr Aufmerksamkeit erhalten, und der zugrunde liegende Mechanismus und die bevorstehenden Konsequenzen wurden nicht eingehend untersucht [28,29,30]. In diesem Zusammenhang ist es für alle neuen AuNP-Typen wichtig, ihren endozytischen Aufnahmeweg und ihre intrazelluläre Lokalisation als Funktion der Zeit zu bewerten. Für verschiedene Arten von AuNPs wurden die Wirkungen als abhängig von der intrazellulären AuNP-Konzentration und als vorübergehend beschrieben, wobei nach wiederkehrenden Zellteilungen die intrazellulären AuNP-Konzentrationen exponentiell abnehmen und die Wirkungen nicht mehr beobachtet werden. Auch muss ein mögliches endosomales Entweichen der AuNPs beurteilt werden. Da Zytoskelettdefekte als eindeutig von der AuNP-Konzentration abhängig beschrieben wurden, sollte ein breiter Konzentrationsbereich von Partikeln getestet werden, um zu versuchen, die maximale zelluläre Beladungskapazität ohne Effekte zu bewerten. Da das Zytoskelett auch an vielen intrazellulären Signalwegen beteiligt ist, muss noch untersucht werden, ob die durch die AuNPs induzierte Zytoskelettstörung zu Sekundäreffekten führt [31].

Da NPs bestimmte physikalische Dimensionen haben, kann das von ihnen eingenommene intrazelluläre Volumen zu Veränderungen der Zellmorphologie führen oder die Struktur des zellulären Zytoskelettnetzwerks beeinflussen [28, 29, 31]. Die späteren Effekte können auch auf die hohen Anforderungen der NP-Pose an die zelluläre Endozytose zurückzuführen sein. Es wurde beschrieben, dass AuNPs einen tiefgreifenden Einfluss auf die Morphologie mehrerer Zelltypen haben, wie zum Beispiel A549 humane Karzinom-Lungenzellen [32]. Auch eine konzentrationsabhängige Wirkung von AuNPs auf die Aktinfibrillen humaner dermaler Fibroblasten wurde beschrieben [33, 34]. Mironavaet al. [35, 36] zeigten außerdem, dass die Zytoskelett-Filamente als Funktion der AuNP-Expositionszeit, Konzentration und Größe der NPs zerstört wurden, obwohl die Expressionsspiegel des Aktin- oder β-Tubulin-Proteins nicht beeinflusst wurden.

Auch der verwendete Zelltyp ist von großer Bedeutung, da unterschiedliche Zelltypen, selbst bei enger Verwandtschaft, auf die gleiche Art von Nanomaterialien ganz unterschiedlich reagieren können [37, 38]. Vorzugsweise sollten diejenigen Zelltypen getestet werden, die an den (zukünftigen) biomedizinischen Anwendungen der NPs am stärksten beteiligt sind (z. B. Epithel-, Endothelzellen) oder multiple Zellen, die aus den verschiedenen Keimblättern stammen. Bei der Untersuchung zytotoxischer Effekte sollte der Einsatz von Krebszelltypen minimiert werden, da diese zu abweichenden Ergebnissen führen können [39]. Krebszellen haben mehrere spezifische Eigenschaften und veränderte intrazelluläre Signalwege, die dazu bestimmt sind, die Proliferation hochzuregulieren und die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, was sie weniger anfällig für einige NP-vermittelte zytotoxische Wirkungen macht.

Unserer Meinung nach kann die Bindung von AuNPs an funktionelle Oberflächengruppen (z. B. Transmembranproteine) von Zellen reversibel oder irreversibel sein, was zu temporären oder permanenten strukturellen Schäden führt [40, 41]. Mögliche Auswirkungen von Veränderungen der biomechanischen Eigenschaften (z. B. Härte und Elastizität), der Haftfähigkeit und der elektrischen Oberflächeneigenschaften von Zellen sind wahrnehmbar. Daher beeinflussen Änderungen der Härte oder Elastizität wahrscheinlich die strukturelle Oberflächenflexibilität, die Erzeugung mechanischer Energie für die Zellteilung und die Zellmotilität. Was die Adhäsion betrifft, so besteht die Zellmikroumgebung normalerweise aus einer extrazellulären Matrix mit spezifischen Molekülen, die es den Zellen ermöglichen, an ihre Umgebung zu haften [42]. Die Oberflächenladung spielt zweifellos eine wichtige Rolle bei den Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer Umgebung.

Die anderen Autoren, über die ebenfalls berichtet wurde, dass die NPs bevorzugt in Mitochondrien lokalisiert sind und oxidativen Stress verursachen sowie strukturelle Schäden verstärken [40]. Ein kürzlich erschienener Artikel von Pan et al. beschreibt, dass 1,4-nm-AuNPs über oxidativen Stress und mitochondriale Schäden in Hela-Zellen Nekrose induzieren [43]. Die Ansammlung von Nanopartikeln im Zellmedium beim biologischen Abbau ist unsicher, da sie Organellen zerstören und sogar genetische Mutationen verursachen kann.

Veränderungen, die während der Apoptose in Zellen auftreten, sind für die meisten Zelltypen ähnlich. In apoptotischen Zellen kommt es zu Veränderungen der Lipidzusammensetzung der Plasmamembran:Phosphatidylserin wird vom zytoplasmatischen Teil der Doppelschicht zur Außenseite übertragen, was eine Aktivierung der Caspase-Kaskade, eine Chromatinkondensation und eine Störung der Elektronentransportkette in den Mitochondrien verursacht und schließlich die ATP-Synthese stoppt. Der programmierte Zelltod kann durch rezeptorvermittelte physiologische Reize ausgelöst werden, die aus genetischen Störungen, Exposition gegenüber chemischen oder physikalischen Faktoren sowie durch andere Veränderungen in Zellen resultieren. Wir haben diesen Effekt bei 6–12 μg/ml AuNPs beobachtet.

Mehrzellige Aggregate (Sphäroide, Embryoidkörper) stellen eine intermittierende Ebene zwischen einschichtig wachsenden Zellen und Gewebekultur dar. Sphäroide sind ein objektives Modell des dreidimensionalen Wachstums und der Organisation von Zellen, der Zell-Zell-Interaktionen und des Einflusses von Mikroumgebungsbedingungen, beispielsweise der AuNP-Konzentration, auf die Intensität der Proliferation sowie auf die Zelladhäsion und die Bildung von Mikroaggregaten. Die MS-Bildung ist eine etablierte Kulturmethode sowohl für Tumor- als auch für embryonale Zelllinien [24, 44, 45]. In unserer Arbeit wird die Bildung und das Wachstum von Sphäroiden durch Zugabe von CMC als Teil einer künstlichen extrazellulären Matrix und Oberflächenbeschichtung mit 1% Agar erreicht, der die Zelladhäsion an die Oberfläche hemmt und die Zellaggregation stimuliert. Unter diesen Bedingungen kann eine MS-Kultur durchgeführt werden, bis die Aggregate aufgrund des begrenzten Zellmassenwachstums oder der spontanen Differenzierung embryonaler Zellen eine zentrale Nekrose bilden.

In der Literatur gibt es Informationen über die Interaktion von AuNPs mit Dickdarmkrebszelllinien und embryonalen Zelllinien [46, 47]. Diesen Daten zufolge kann die Exposition selbst sehr geringer Konzentrationen von AuNPs eine schädigende Wirkung auf die humanen embryonalen neuralen Vorläuferzellen und HT29 haben, indem sie die Zellproliferation, -differenzierung und den apoptotischen Zelltod betont.

Es gibt veröffentlichte Daten, dass die Wirkung von AuNPs auf einer Akkumulation in der G0/G1-Phase, einer Depletion in der S- und G2/M-Phase sowie auf reduzierten ATP-Spiegeln in humanen oralen Plattenepithelkarzinomzellen (HSC-3) beruht [48]. Die Regulierung des Zellzyklus kann durch Verletzung der fokalen Kontakte von Zellen mit Substrat und Zelltransfer in die suspendierte Fraktion in 2D-Kultur und Hemmung von Zell-Zell-Kontakten in Gap Junction in 3D-Kulturen angegangen werden [48,49,50]. Aufgrund der Nanogröße von AuNPs (nahe 15 nm) können sie keine Kohäsionszentren für Zellen sein. Gleichzeitig können die Interkalation von AuNPs in die Zellmembran [51], der Einfluss auf das AuNP-Zetapotential der Zellmembran [32] und der Einfluss auf die Bildung von Zell-Zell/Zell-Oberfläche-Kontakten offensichtlich Mechanismen für Nekrose/Apoptose auslösen , zytotoxische Wirkung und Zellzyklusarrest. Die Verletzung fokaler Kontakte von Zellen mit dem Substrat und der Zelltransfer zur suspendierten Fraktion ist ein Weg der Zellzyklusregulation [48, 49]. Geringe Konzentrationen von AuNPs übten keine statistisch signifikante zytotoxische Wirkung auf Zellen aus. Höhere AuNP-Konzentrationen hatten jedoch sowohl zytotoxische als auch antikohäsive Wirkungen auf Zellen in Suspension. Dieser Prozess trug zur Bildung einer größeren Zahl von Mitgliedstaaten mit einem geringeren durchschnittlichen Volumen bei. Wir nehmen an, dass sich AuNP in kohäsive Kontakte von Zellen einkeilen und diese beeinträchtigen. Somit unterstützen unsere Experimente zu den Wirkungen von AuNPs auf SPEV- und HT29-Zelllinien ihre weitere Anwendung bei der Entwicklung von AuNP-vermittelten Krebstherapien.

Zukünftige Studien werden jedoch erforderlich sein, um die Antikrebswirkung in den in-vivo-Tierstudien zu bestätigen. Dennoch sind wir der festen Überzeugung, dass wir mit Kenntnis der Substanz und ihrer möglichen negativen Einflüsse die schädlichen Wirkungen von AuNP vermeiden und ihr positives biotechnologisches Potenzial nutzen können. Unsere Untersuchung konnte recht zuverlässig in wirksamen Materialien für den Kontext der Krebsbehandlung mit maximalem Nutzen für die Medizin angewendet werden.

Schlussfolgerungen

Unsere Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass AuNPs eine dosisabhängige Zytotoxizität in SPEV- und HT29-Zellen induzieren. Darüber hinaus zeigt dieser Bericht zum ersten Mal, dass 15 nm AuNPs in Konzentrationen von 6–12 μg/ml die Proliferation von SPEV- und HT29-Zellen reduzierten und die Zellzahl im frühen und späten Stadium der Apoptose und Nekrose erhöhten. Außerdem wurde gezeigt, dass geringe Konzentrationen von AuNPs (1–3 μg/ml) die Bildung mehrzelliger Sphäroide stimulieren. Höhere AuNP-Konzentrationen hatten jedoch sowohl zytotoxische als auch antikohäsive Wirkungen auf Zellen in Suspension. Die große Empfindlichkeit gegenüber der Wirkung von AuNPs wurde durch die Linie von HT29 (6 μg/ml) im Vergleich zu den SPEV-Zellen (12 μg/ml) gezeigt.