hGC33-zielgerichtete Sorafenib-Nanopartikel hemmen Hepatom synergistisch durch Wnt-Pfad-Unterdrückung

Zusammenfassung

Die Abgabe tumor-spezifischer Inhibitoren ist eine Herausforderung in der Krebsbehandlung. Antikörper-modifizierte Nanopartikel können ihre geladenen Wirkstoffe gezielt an Tumorzellen liefern, die spezifische tumor-assoziierte Antigene überexpressieren. Hier konstruierten wir Sorafenib-beladene Polyethylenglycol-b-PLGA-Polymernanopartikel, modifiziert mit Antikörper hGC33 gegen Glypican-3 (GPC3⁺), ein Membranprotein, das in hepatozellulärem Karzinom überexprimiert ist. Wir fanden, dass hGC33-modifizierte NPs (hGC33-SFB-NP) GPC3⁺-HCC-Zellen durch spezifische Bindung an GPC3 auf der HCC-Zelloberfläche zielgerichtet ansteuern, Wnt-induzierte Signaltransduktion inhibieren und HCC-Zellen in G0/1 durch Herunterregulierung der Cyclin-D1-Expression arrestieren, wodurch die HCC-Zellmigration durch Hemmung des epithelial-mesenchymalen Übergangs abgeschwächt wird. hGC33-SFB-NP hemmte Migration, Zellzyklusfortschritt und Proliferation von HCC-Zellen durch Inhibition des Ras/Raf/MAPK-Pfads und des Wnt-Pfads in Tandem mit GPC3-Molekülen. hGC33-SFB-NP hemmte Leberkrebswachstum in vivo und verbesserte die Überlebensrate tumor-tragender Mäuse. Wir schließen, dass hGC33 das Targeting von SFB-NP auf HCC-Zellen erhöht. hGC33-SFB-NP hemmt synergistisch das Fortschreiten von HCC durch Blockade des Wnt-Pfads und des Ras/Raf/MAPK-Pfads.

Einleitung

Glypican-3 (GPC3) ist ein Heparansulfat-Proteoglykan, das über einen Mechanismus mit Glycerophosphatidylinositol-Ankern an Zelloberflächen exprimiert wird [1]. Obwohl GPC3 in verschiedenen Geweben während der Entwicklung exprimiert wird, ist seine Expression in den meisten adulten Geweben durch DNA-Methylierung im Promoterbereich zumindest teilweise inhibiert [2]. Allerdings ist GPC3-Protein in etwa 70 % der hepatozellulären Karzinom (HCC)-Patienten überexprimiert [3, 4] und stimuliert die klassische Wnt-Signaltransduktion [5] durch Interaktion mit Wnt-Ligand, was Wnt/Frizzled-Bindung fördert und HCC-Wachstum begünstigt [6]. Die Aktivierung des klassischen Wnt-Signalwegs ist eines der häufigsten Ereignisse, die mit maligner Transformation von HCC assoziiert sind [7, 8]. Basierend auf GPC3s Fähigkeit, Wnt-Signalgebung zu verstärken, hypothesierten wir, dass GPC3-Überexpression HCC-Wachstum durch Stimulation des klassischen Wnt-Pfads fördert.

Therapeutische monoklonale Antikörper, die ein Epitop im C-terminalen Bereich von GPC3 (524–563) erkennen (hGC33), hemmen Tumorwachstum in subkutanen Xenotransplantationen von HepG2 und Huh-7 in Mäusen [9, 10]. hGC33 wurde durch komplementärkeitsbestimmende Regionstransplantation humanisiert, und seine antikrebswirksame Wirkung ist für HepG2-Xenotransplantation genauso effektiv wie hGC33, und hGC33 wurde in klinischen Studien eingesetzt [11]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass hGC33 wichtige antitumorale Aktivität besitzt, und anti-GPC3-Behandlung wird direkt die Proliferation und/oder das Überleben von HCC-Zellen durch Blockade von Wnt- und/oder anderen Signalwegen inhibieren.

Aufgrund der komplexen Pathogenese von HCC ist die Wirksamkeit der alleinigen GPC3-Blockade jedoch begrenzt [12]. Daher kann die Erforschung des detaillierten Mechanismus der HCC-Pathogenese und die Identifizierung vielversprechender Biomarker für Diagnose und Prognose von HCC helfen, effektive therapeutische Targets bereitzustellen und die Prognose der Patienten zu verbessern. Anti-GPC3-Antikörper wurden vorgeschlagen, um die Sensitivität von HCC für chemotherapeutische Wirkstoffe zu erhöhen [13]. Die antitumorale Aktivität von hGC33 in Kombination mit Standard-Chemotherapeutika wurde kürzlich evaluiert [14]. Sorafenib ist ein neuartiges, orales gezieltes HCC-Medikament, das direkt die Proliferation von Tumorzellen durch Blockade des über RAF/MEK/ERK vermittelten Zellsignalwegs inhibieren und so Tumorwachstum eindämmen kann [15, 16]. Die nicht-gezielte Verteilung von Sorafenib in vivo und abnormal aktivierte Wnt-Signale in HCC begrenzen jedoch die Wirksamkeit des Medikaments und erhöhen seine Nebenwirkungen [14, 15, 16]. Wnt bindet an Rezeptoren der Frizzled-Familie, um intrazelluläre Signaltransduktion zu aktivieren, die Zellproliferation, Apoptose und Zellmigration reguliert und Medikamentenresistenz in vielen Tumoren wie HCC verursacht [17, 18, 19].

In HepG2-Xenotransplantationsmodellen ist die Kombination von hGC33 und Sorafenib effektiver bei der Hemmung von Tumorwachstum als Sorafenib allein [15], und Wirkstoffabgabe mit Polymer-Nanoträgern hat in der Krebsbehandlung viel Aufmerksamkeit erhalten. Antikrebs-Wirkstoff-beladene Nanoträger können unspezifische Verteilung und Degradation in vivo verhindern, die Bioverfügbarkeit und antitumorale Targeting-Wirksamkeit verbessern und die Bewertung von Pharmakokinetik und Behandlung vereinfachen [15, 16]. In verschiedenen polymerbasierten Nanopartikeln gelten Poly(lactid-co-glycolidsäure) (PLGA)-basierte Formulierungen als ideale und sichere Wirkstoffträger [17, 18]. In diesem Zusammenhang basieren Poly(ethylenglycol)-b-poly(d,l-laktid-co-glycolid) (PEG-b-PLGA) auf Polyethylenglycol- und PLGA-Copolymeren, die nach Hydrolyse sicher und ungiftig sind und von der US Food and Drug Administration zugelassen wurden [19, 20, 21, 22]. Daher ist intravenöse Injektion mit PEG-b-PLGA-Copolymer-Nanoträgern eine vielversprechende Strategie für gezielte Abgabe und Wirksamkeitssteigerung. Darüber hinaus kann die Anwendung des spezifischen Antikörpers hGC33 gegen GPC3-Moleküle auf HCC-Zellmembran nicht nur die Abgabe von Nanowirkstoffen in vitro und in vivo verbessern [18, 19], sondern auch Wnt- und/oder andere mit GPC3 verbundene Signalwege blockieren, die Proliferation und/oder das Überleben von Krebszellen inhibieren und synergistische antitumorale Aktivität erzielen.

In dieser Studie untersuchten wir, ob hGC33-Antikörper-modifizierte Copolymer-PEG-b-PLGA-Nanopartikel die Abgabe von Sorafenib (hGC33-SFB-NP) an HCC in vivo und in vitro erleichtern und die Effizienz der HCC-Behandlung durch HCC-aktives Targeting zur Veränderung der Wirkstoffpharmakokinetik verbessern können. Anhand von Partikelgröße, Zeta-Potenzial, Partikelmorphologie, Wirkstoff-Einkapselungseffizienz, Wirkstoffbeladungskapazität und In-vitro-Wirkstofffreisetzung wurde das gezielte NP umfassend charakterisiert. Die In-vitro-Targeting-Fähigkeit wurde durch zelluläre Aufnahme von HepG2-Hepatomzellen charakterisiert. Die Biodistribution und der synergistische therapeutische Effekt von hGC33-SFB-NP auf HCC wurden durch Vergleich mit Sorafenib und SFB-NP evaluiert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass hGC33-SFB-NP GPC3⁺-HCC zielgerichtet ansteuern kann. Es kann Zellzyklusfortschritt, Zellproliferation und Tumorinvasion durch Hemmung von Wnt- und Ras/Raf/MAPK-Signalwegen inhibieren und das Fortschreiten von Leberkrebs synergistisch hemmen.

Materialien und Methoden

Materialien

Der hGC33-Antikörper, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), 4',6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochlorid (DAPI), 5,5',6,6'-Tetrachlor-1,1',3,3'-tetraethyl-benzimidazolyl-carbocyanin-iodid (JC-1) und Dimethylsulfoxid (DMSO) wurden von Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) bezogen. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimidhydrochlorid und N-Hydroxysuccinimid wurden von Qiyun Biotech (Guangzhou, China) bezogen. Das Bicinchonsäure-(BCA)-Proteinquantifizierungskit, Cumarin-6 und das Annexin V-FITC/PI-Apoptose-Detektionskit wurden von Beyotime Biotechnology (Shanghai, China) erworben. PEG-b-PLGA-Maleimid-Diblockcopolymer (mal-PEG-b-PLGA; 25.000–30.000 Da, PLGA, LA:GA, w/w; PEG, 13–15 %) wurde von Polyscitech (West Lafayette, IN, USA) gekauft. PI3K-Antikörperkit (9655#), p-Akt-Antikörperkit (9916#), mTOR-Antikörperkit (9964#), Bcl-2-Familie-Antikörperkit (9942#), Apoptose-Antikörperkit (9915#) und sekundäre Ziegen-anti-Rhabbit- und anti-Maus-Antikörper wurden von Cell Signal Technology (Danvers, MA, USA) gekauft; Cyclin B1 und Cyclin-abhängige Kinase wurden von Abcam Biological Technology (USA) erworben. Antikörper gegen Phospho-Rb, Cyclin D1, Checkpoint-Kinase 1 (CHK1), P53, phosphoryliertes Brustkrebs-Suszeptibilitätsgen 1 (p-BRCA1), RAD51, Cytochrom C und Matrix-Metalloproteinasen (MMP2 und MMP9) wurden von Abcam (USA) erworben. Alle anderen analytischen Chemikalien, Reagenzien und Lösungsmittel wurden von Standardlieferanten bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet.

Zellen und Tiere

HCC-Zelllinie HepG2 (erhalten von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)) wurde in DMEM-Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mit 10 % FBS (HyClone, Logan, UT, USA) und 80 U/ml Penicillin und 80 μg/ml Streptomycin in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO₂ bei 37 °C kultiviert. BALB/c-Nacktmäuse, 20–22 g (5–6 Wochen), wurden von Nanjing Junke Biotechnology Co., Ltd. (China) bereitgestellt. BALB/c-Nacktmäuse wurden in einem SPF-Raum gehalten. Alle Tierpflege und -behandlung erfolgten gemäß den Tierschutzanforderungen der Anhui University of Science and Technology. Alle experimentellen Protokolle wurden vom Tierversuchsethikkomitee der Anhui University of Science and Technology geprüft und genehmigt (Genehmigungsnr.: 2019dw013).

Herstellung von NPs

Zur Herstellung von NPs wurden mal-PEG-b-PLGA und SFB oder Cumarin-6 abgewogen und in der organischen Phase (3:2 v/v Dichlormethan/Aceton) gelöst. Die Lösung wurde tropfenweise unter kontinuierlichem Vortexen in eine Polyvinylalkohol-(PVA)-Lösung (5 % w/v) gegeben. Das Gemisch wurde intermittierend mit einem Sondensonicator (Ausgangsleistung 550 W, 8-mal) auf Eis soniziert, um eine Öl-Wasser-Emulsion zu erzeugen. Die Emulsion wurde in eine PVA-Lösung (1 % w/v) mit magnetischem Rühren gegeben. SFB- und Cumarin-6-NPs wurden durch Zentrifugation bei 8000 U/min für 30 min gesammelt und dreimal in Milli-Q-Wasser gewaschen.

Zur Erzeugung von hGC33-NP durch Thioetherbindungen, die durch Reaktion von Maleimid mit freien Sulfhydrylresten im Antikörper hGC33 gebildet werden, wurde hGC33-Antikörper mit maleimid-funktionalisierten NPs im Molverhältnis 5:1 (hGC33 : mal-PEG-b-PLGA) gemischt und bei 4 °C für 16 h unter kontinuierlichem Rühren inkubiert. hGC33 wurde durch Reaktion der Sulfhydrylgruppen am Antikörper hGC33 mit den Maleimidgruppen der PEG-Ketten an die NPs konjugiert. Nicht konjugierte Antikörper wurden durch Passage durch Sepharose CL-4B-Säulen entfernt. Effiziente Proteinkonjugation wurde mit einem BCA-Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bestätigt.

Charakterisierung von Nanopartikeln (NPs)

Morphologie, Partikelgröße, Einkapselungseffizienz (EE) und Stabilität von NPs

Die Morphologie der NPs wurde mit Transmissionelektronenmikroskopie (TEM, H-600; Hitachi, Tokyo, Japan) bewertet. Wirkstofffreie hGC33-NPs und wirkstofffreie NPs wurden mit FTIR-Spektrophotometer (Thermo Nicolet, Madison, WI, USA) unter Verwendung von Kaliumbromid aufgezeichnet. Die mittlere Partikelgröße und das Zeta-Potenzial der NPs wurden mit einem Malvern Zetasizer ZEN3600 Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) bei 20 °C charakterisiert. Die Wirkstoff-Einkapselungseffizienz (EE) und Wirkstoffbeladung (LC) wurden durch Ultrafiltration bewertet. Proben wurden in ein Ultrafiltrationsgerät (100 kMWCO; Sartorius, Göttingen, Deutschland) geladen und bei 8000 U/min für 25 min bei 4 °C zentrifugiert, um freien Wirkstoff zu entfernen. Das gleiche Volumen jeder Probe wurde in Acetonitril gelöst, um die Gesamtwirkstoffmenge zu bestätigen. Die Konzentration wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen. Die Absorptionswellenlänge betrug 266 nm. Folgende Formel wurde zur Berechnung der Wirkstoff-EE (%) der NPs verwendet: (Gewicht des eingekapselten Wirkstoffs / Gesamtgewicht des Wirkstoffs) × 100 %. LC (%) wurde berechnet als (Gewicht des eingekapselten Wirkstoffs / Gewicht der NPs) × 100 %. Um die Stabilität der NPs bei Raumtemperatur zu verstehen, wurde die Änderung der NP-Größe durch dynamische Lichtstreuung (DLS) zu vorgegebenen Zeitpunkten (0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 und 24 h) bei 25 °C bewertet.

In-vitro-Wirkstofffreisetzung und zellulärer Aufnahmeassay

Die Wirkstofffreisetzung aus NPs wurde mit Dialysetaschen mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 10 kDa untersucht. Kurz gesagt, 1 mL NPs wurde in eine Dialysetasche (MWCO 8.000–10.000 Da; Spectrum Labs Inc., CA, USA) geladen. Die Dialysetaschen wurden in PBS getaucht und bei 25 °C mit einem Magnetrührer gerührt. Die Wirkstofffreisetzungsprofile der NPs wurden in 100 mL 0,2 M Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS; pH = 7,4) für 7 Tage gemessen. Die Wirkstoffkonzentration in den Proben wurde mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen. In nachfolgenden Studien wurde hGC33-Cumarin-6-NP mit gleicher Partikelgröße wie hGC33-SFB-NP verwendet, um das Targeting von hGC33-SFB-NP zu evaluieren. HepG2 (GPC3⁺) und Li-7 (GPC3⁻) wurden mit hGC33-Cumarin-6-NP für 0,5, 2 oder 4 h bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubiert. Die ko-kultivierten Zellen wurden gewaschen und mit 4 % Formaldehyd für 10 min fixiert; die Zellkerne wurden mit 5 μg/mL Hoechst 33.342 für 15 min gefärbt, um intrazelluläre NPs zu lokalisieren. Konfokalmikroskopie zur Analyse intrazellulärer Nanopartikelbilder wurde mit Konfokalmikroskopie (Olympus FV1000; Olympus Corporation, Tokyo, Japan) analysiert.

In-vitro-Zelluläreffekt

Die Zytotoxizität von freiem hGC33(Ab), freiem SFB, hGC33-null-NP oder hGC33-SFB-NP wurde mit einem MTT-Assay bestimmt. HepG2 (GPC3⁺) und Li-7 (GPC3⁻) Zellen in logarithmischer Phase wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 4000 Zellen/Well ausgesät und 48 h bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden mit hGC33, freiem SFB, hGC33-null-NP oder hGC33-SFB-NP für 48 h bei 37 °C in 5 % CO₂ behandelt. Nach Ko-Kultivierung für eine definierte Zeit wurde die anti-Zellproliferationsaktivität durch MTT-Assay bestimmt wie beschrieben [20]. Die Absorption jedes Wells wurde bei 490 nm gemessen und der halbe maximale Inhibitions-Konzentrationswert (IC₅₀) mit SPSS 17.0 berechnet.

Messung der Zellinvasionsfähigkeit

Zellen in logarithmischer Wachstumsphase wurden in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/Well ausgesät, mit einer Saugspitze gekratzt und durch serumfreies Kultivierungsmedium ersetzt. Wundheilung wurde bei 0 h, 24 h und 48 h in Kontroll- und Experimentgruppe aufgezeichnet. Gleichzeitig wurde die gleiche Zellzahl in Transwell-Kammern ausgesät und mit freiem hGC33, freiem SFB, hGC33-null-NP oder hGC33-SFB-NP behandelt. 500 μL 10 % FBS-Medium wurden in die untere Kammer gegeben. Nach 24 h Inkubation wurde die Transwell-Kammer entnommen, Zellen mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit 0,1 % Kristallviolett gefärbt. Die Größe der Wundheilung und die Anzahl der migrierten Zellen wurden berechnet, um die Migrationsfähigkeit zu bewerten.

Zellzyklusbestimmung

Nach übernachtiger Inkubation in 6-Well-Platten wurden die Zellen mit freiem hGC33 (Ab), freiem SFB, hGC33-null-NP oder hGC33-SFB-NP für 24 h behandelt, dann gesammelt und mit Ethanol fixiert. Nach Färbung mit Propidiumiodid wurde Durchflusszytometrie durchgeführt und der Zellzyklus mit ModFit 3.0 (Verity Software House, Topsham, ME) analysiert.

Western Blotting

Zur Evaluierung des Aktivierungsstatus von Signalwegen und Expression von Target-Molekülen wurden die Zellen übernacht in 6-Well-Platten inkubiert, und freies hGC33, freies SFB, hGC33-null-NP oder hGC33-SFB-NP wurden für 24 h appliziert. Die Zellen jeder Behandlungsgruppe wurden gesammelt, Protein extrahiert und gemessen. Die Proteinkonzentration wurde mit BCA-Proteinkit (Biosharp, Hefei, China) gemessen und kalibriert. Protein der Proben wurde durch 12 % SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt, auf PVDF-Membran transferiert und mit fettfreier Milch blockiert. Der Primärantikörper (verdünnt 1:1000) wurde übernacht bei 4 °C inkubiert, und die Sekundärantikörper (1:2000) wurden 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Bänder wurden mit ECL-Substraten (Thermo Fisher Scientific Waltham, MA, USA) visualisiert, und die Bilder wurden durch Gel-Bildanalysesystem angezeigt, wobei β-Actin als Kontrolle diente.

In-vivo-Antitumoraktivität

Die Inhibition von freiem hGC33, freiem SFB, hGC33-null-NP, SFB-NP und hGC33-SFB-NP auf HCC-Wachstum in vivo wurde bestimmt. Gemäß Vorschriften und Richtlinien zum Tierschutz des Ethikkomitees der Anhui University of Technology wurden alle Experimente in BALB/c-Mäusen in Käfigen in einem temperaturkontrollierten Raum (23 ± 2 °C) mit 12 h/12 h Licht/Dunkel-Zyklus durchgeführt. Eine 50-μL-Suspension mit 5 × 10⁶ lebenden HepG2-Zellen wurde subkutan in den rechten Bauch von 5 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen (20–22 g) injiziert. Als das Tumorvolumen etwa 50 mm³ erreichte, wurden die Mäuse zufällig in 6 Gruppen (je 10 Mäuse) aufgeteilt. Kochsalzkontrolle NS (200 mg/kg null NP in 200 μL PBS), hGC33-null-NP (hGC33-null-NP in 200 μL PBS, äquivalent zu hGC33 = 100 μg/kg/Zeit), freies hGC33 (hGC33 in 200 μL PBS, 100 μg/kg/Zeit), freies SFB (SFB-Dosis: 8 mg/kg/Zeit), SFB-NP (SFB-Dosis: 8 mg/kg/Zeit) und hGC33-SFB-NP (äquivalent zu SFB = 8 mg/kg/Zeit, hGC33 = 100 μg/kg/Zeit) wurden alle 2 Tage für 10-mal über den Schwanzvene injiziert. Gewicht und Tumorgröße der Mäuse wurden alle 4 Tage gemessen. Die Berechnungsformel für Tumorvolumen war Volumen = 0,5 × L × W², wobei L und W Länge und Breite des Tumors darstellen. Vier Wochen nach Verabreichung wurden die Tiere mit Diethylether anesthesiert, und Tumorgröße und -gewicht wurden gemessen. Zusätzlich wurden Tumor, Herz, Leber, Niere, Lunge und Milz entnommen, mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, um histologische Veränderungen durch digitale Mikroskopie zu bewerten.

Statistische Analyse

Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt und wurden mit SPSS 18.0 durch Varianzanalyse evaluiert. Paarweise statistische Vergleiche wurden mit zweiseitigem Student's t-Test durchgeführt. Unterschiede wurden als statistisch signifikant für P < 0,05 angesehen.

Ergebnisse

Charakterisierung von NPs und Wirkstofffreisetzung in vitro

Da Durchmesser und Oberflächeneigenschaften von NP die Zellaufnahme, Wirkstofffreisetzung und NP-Verteilung in vivo beeinflussen, charakterisierten wir das hergestellte NP mit entsprechenden Parametern. Morphologie, Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung von SFB-NP, hGC33-null-NP und hGC33-SFB-NP-Polymeren sind in Abb. 1 zusammengefasst. Die Morphologie von hGC33-SFB-NP, beobachtet durch Transmissionelektronenmikroskop (Abb. 1a), zeigt starre Kerne mit unscharfen Kanten, was darauf hindeutet, dass hGC33 auf der NP-Oberfläche vorhanden ist. Die Partikelgrößen von SFB-NP, hGC33-null-NP und hGC33-SFB-NP lagen zwischen 100 und 150 nm und wiesen typische unimodale Partikelgrößenverteilung auf. Der durchschnittliche Durchmesser von hGC33-SFB-NP (120,2 ± 10,2 nm) war leicht größer als der von hGC33-null-NP, SFB-NP und null NP (Abb. 1a, Tabelle 1). Dünne kugelförmige unklare Filme mit einer einzelnen Oberfläche waren auf der Oberfläche von hGC33-SFB-NP und hGC33-null-NP vorhanden, was darauf hindeutete, dass Antikörper hGC33 auf der NP-Oberfläche vorhanden war. Die Größenzunahme bei hGC33-SFB-NP und hGC33-null-NP bestätigte das Vorhandensein des hGC33-Films. Die Synthese von hGC33-SFB-NP wurde mit ¹H-NMR (Abb. 1b) vor NP-Herstellung bestätigt. Die Peaks bei 5,2 ppm und 1,58 ppm wurden den –CH₃-Protonen der Milchsäure zugeordnet; der Peak bei 4,8 ppm den –OCH₂- der Glycolsäure; und der Peak bei 3,6–3,8 ppm den –CH₂CH₂O- Protonen der PEG-Wiederholungseinheiten. Die Oberflächenchemie von PEG-b-PLGA und Ab-PEG-b-PLGA NPs wurde auch durch FTIR-Spektroskopie untersucht (Abb. 2c). Im Spektrum von PEG-b-PLGA-Polymer stammte ein starkes Band bei etwa 1750 cm⁻¹ von der Streckung der Carbonylgruppen (C=O) in der PLGA-Kette. Ein Band bei 2880 cm⁻¹ war auf Streckung einer –CH-Gruppe in der PEG-Kette zurückzuführen. Gleichzeitig erschien ein Peak bei 2520 cm⁻¹, den wir der –SH-Streckung des hGC33-Antikörpers zuschrieben. Die ¹H-NMR- und FTIR-Ergebnisse zeigten, dass Antikörper auf das Rückgrat der PEG-b-PLGA-Polymere gepfropft war.

Charakterisierung von NPs. a TEM-Charakterisierung von NPs, der Skalenbalken zeigt 100 nM; b ¹H-NMR-Spektren von synthetischem hGC33-PLGA-b-PEG in CDCl₃; c FTIR-Spektren von hGC33-PEG-b-PLGA und PEG-b-PLGA; d Kumulative Freisetzungsprofile von SFB-NP und hGC33-SFB-NP in PBS (pH = 7,4) bei 37 °C; e Größenänderungen von NPs inkubiert in DMEM-Medium mit 10 % FBS über 14 Tage; f Größenänderungen von NPs inkubiert in PBS über 14 Tage. SFB, Sorafenib; TEM, Transmissionelektronenmikroskopie; NPs, Nanopartikel; ¹H-NMR, ¹H-Kernresonanzspektroskopie; FTIR, Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie.

Expression von GPC3 und Aufnahme von hGC33-Cumarin-6-NP in Li-7- und HepG2-Zellen. Die Zellen, in Kulturplatten ausgesät, wurden mit PBS gewaschen und mit 100 μg/ml hGC33-Cumarin-6-NP in DMEM für 2, 4 und 8 h inkubiert. Kerne wurden mit DAPI gefärbt, und die Zellen wurden fixiert und mit konfokalem Laserscanning-Mikroskop detektiert. GPC3 wurde in Li-7-Zellen nicht detektiert, war aber in HepG2-Zellen hoch exprimiert, wie durch Immunzytochemie detektiert. Der Skalenbalken zeigt 50 μM.

Interessanterweise zeigten hGC33-SFB-NP und SFB-NP-Nanopartikel in DMEM-Medium mit 10 % FBS (pH = 7,4) schnelle Wirkstofffreisetzung bis etwa 4 Tage, dann relativ langsame und stabile Freisetzung; die kumulative SFB-Freisetzung von hGC33-SFB-NP und SFB-NP über 20 Tage betrug etwa 77 % bzw. 65 % (Abb. 1d). Der Unterschied könnte auf das hydrophile Molekül an der Oberfläche der PEG-b-PLGA-Matrix zurückzuführen sein, das die Degradation der Nanopartikel durch Erhöhung der Hydratisierung und damit Förderung der Hydrolyse beschleunigen könnte. Um die Stabilität der hergestellten NPs zu bestimmen, wurden hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, null-NP und SFB-NP in DMEM-Medium mit 10 % FBS (pH = 7,4) und in PBS (pH = 7,4) platziert. Die Größen der verschiedenen NPs blieben über 2 Wochen stabil. SFB wurde aus hGC33-SFB-NP über 14 Tage anhaltend und stabil freigesetzt, aber es gab eine bescheidene Änderung der Partikelgröße in DMEM-Medium im Vergleich zu 10 % FBS (Abb. 1e, f). Die Stabilität von hGC33-SFB-NP wäre für SFB mit anhaltender biologischer Rolle angemessen.

Großes Zeta-Potenzial kann starke elektrostatische abstoßende Wechselwirkung zwischen NP verursachen und die Stabilität des NP-Dispersionssystems aufrechterhalten [23, 24]. Wie in Tabelle 1 gezeigt, betragen die Zeta-Potenziale von hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP und SFB-NP −18,2 ± 2,2 mV, −18,5 ± 1,8 mV bzw. −15,9 ± 2,1 mV, was durch negative Ladungen verursacht sein könnte, die durch Aldehydgruppe, Carboxylgruppe und Phosphatgruppe im hGC33-Antikörper-Glykoprotein erzeugt werden. Negativ geladene NPs können zu hoher Stabilität der NP-Suspension führen. Zudem stoßen die hergestellten NPs aufgrund der negativ geladenen Zelloberfläche in normalen physiologischen Umgebungen Zellen mit niedriger Ladung ab und sind weniger toxisch für Gewebe und Zellen. Außerdem war die Größenverteilung von null-NP und SFB-NP (Polydispersitätsindex [PDI] 0,18 und 0,19) leicht, aber nicht signifikant kleiner als die von hGC33-null-NP (PDI = 0,21) und hGC33-SFB-NP (PDI = 0,23). Somit haben die Nanopartikel eine gute Gleichmäßigkeit in der Größe. Partikelgröße, Partikelgrößenverteilung und Zeta-Potenzial der NPs sind in Tabelle 1 gemäß den Ergebnissen der SFB-Einkapselungseffizienz und Beladungskapazität dargestellt. Der unkonjugierte GPC3-Antikörper hGC33 wurde durch Ultrazentrifugation entfernt, und die Bindungseffizienz des hGC33-Antikörpers an NPs wurde bewertet. BCA-Proteinanalyse zeigte, dass die Bindungseffizienz des hGC33-Antikörpers an NPs 79,5 % ± 2,9 % betrug.

hGC33-Cumarin-6-NP zielgerichtet effektiv GPC3⁺ HCC-Zelllinie HepG2

Um herauszufinden, ob der hGC33-Antikörper der Nanopartikel noch die Fähigkeit hat, spezifisch GPC3 zu targeten, verwendeten wir GPC3⁺ HepG2- und GPC3⁻ Li-7-Zellen als Target-Zellen und hGC33-Cumarin-6-NP als Tracer-Nanopartikel und inkubierten die verschiedenen Zellen für 2 h, 4 h und 8 h. Die Zellen wurden 3-mal mit PBS gewaschen und mit DAPI zur Kernfärbung reagiert. Die Zellen wurden fixiert und mit Leica-Fluoreszenzmikroskop (DMi8, Deutschland) fotografiert. Es zeigte sich, dass die grüne Fluoreszenz in HepG2-Zellen bei gleicher Inkubationszeit signifikant höher war als in Li-7-Zellen (Abb. 2), was darauf hindeutet, dass die Menge an hGC33-Cumarin-6-NP, die in HepG2-Zellen eindrang, signifikant höher war als in Li-7-Zellen. Die Ergebnisse dokumentierten, dass der hGC33-Antikörper auf hGC33-Cumarin-6-NP noch die Fähigkeit hatte, GPC3 zu targeten und die Internalisierung von Nanopartikeln zu vermitteln. Die Expression von GPC3 in HepG2- und Li-7-Zellen wurde mit indirekter Fluoreszenz und zytochemischer Färbung untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass HepG2-Zellen GPC3 überexprimierten, während Li-7-Zellen GPC3 nicht exprimierten (Abb. 2).

hGC33-null-NP hemmt Proliferation von HepG2-Zellen

Um zu bestimmen, ob hGC33-modifizierte NPs (hGC33-null-NP) das Wachstum von HCC inhibieren können, maßen wir die Zellwachstumsinhibition der GPC3-positiven HCC-Zelllinie HepG2 und der GPC3-negativen Zelllinie Li-7. Wir fanden, dass sowohl hGC33-null-NP als auch hGC33 das Wachstum der GPC3-positiven HCC-Zelllinie HepG2 nach 24 h Behandlung hemmten, aber hGC33 einen signifikant stärkeren hemmenden Effekt auf HepG2-Zellen hatte als hGC33-null-NP (Abb. 3a); im Gegensatz dazu beeinflussten hGC33-null-NP und hGC33 das Wachstum der GPC3-negativen Li-7-Zelllinie nicht (Abb. 3b). Der repräsentative Zeitverlauf von hGC33-null-NP (äquivalent 0,1 μM hGC33) und hGC33 (0,1 μM) auf HepG2-Zellproliferation ist in Abb. 3c dargestellt. Da hGC33 ein C-terminales Peptid ist, das GPC3 erkennt, ist hGC33 superior zu hGC33-null-NP in der Hemmung von HepG2. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das hGC33-Molekül in hGC33-null-NP einen sterischen Hinderungseffekt haben könnte, der die Bindungsfähigkeit von hGC33 an Epitope beeinträchtigen könnte.

Die Proliferation von HepG2- und Li-7-Zellen wurde durch hGC33, null-NP und hGC33-null-NP inhibiert. a Zellproliferationstest an GPC3-positiven HepG2-Zellen, behandelt mit hGC33, null-NP oder hGC33-null-NP; b Zellproliferationstests an GPC3-negativen Li-7-Zellen, behandelt mit hGC33, null-NP und hGC33-null-NP. Die Zellen wurden mit 0–2,5 μM hGC33, null-NP oder hGC33-null-NP für 1 Tag inkubiert. Die Zellproliferation wurde mit MTT-Methode gemessen und auf unbehandelte Zellen standardisiert. Alle Werte repräsentieren Mittelwert ± SD. Im Vergleich zur Kontrollgruppe (0 μM) ohne Antikörperbehandlung: *P < 0,01; c Repräsentative Ergebnisse der Reaktion von HepG2 auf hGC33, null-NP und hGC33-null-NP bei hGC33-Behandlung (1,0 μM).

hGC33-null-NP hemmt Zellzyklus von HepG2-Zellen

Um den Mechanismus der molekularen Aktivität von hGC33-Antikörper, modifiziert auf hGC33-null-NP-Nanopartikeln, zu verstehen, untersuchten wir den Zellzyklusfortschritt von HepG2, behandelt mit hGC33-null-NP. In der HepG2-Zelllinie erhöhten hGC33-null-NP und hGC33 signifikant den Anteil der Zellen in G1 (Abb. 4a, b), was darauf hindeutet, dass sowohl hGC33-null-NP als auch hGC33 Zellzyklusarrest in G1-Phase induzieren konnten. Zudem konnten hGC33-null-NP und hGC33 Cyclin-D1-Expression in HepG2-Zellen signifikant herunterregulieren (Abb. 4c, d).

hGC33-null-NP und hGC33 induzieren Zellzyklusarrest in G1-Phase und hemmen Cyclin-D1-Expression in HepG2-Zellen. a Repräsentatives Zellzyklus-Diagramm verschiedener Gruppen, behandelt mit hGC33-null-NP und hGC33. b Zellzyklusanalyse verschiedener Gruppen, behandelt mit hGC33-null-NP und hGC33. HCC-Zellen wurden mit 0,5 μM hGC33 oder hGC33-null-NP (mit molarer Konzentration von hGC33 als Referenz) inkubiert. *P < 0,05, G1-Phase von hGC33-null-NP oder hGC33-Zellen verglichen mit 0-h-Zellen. c, d Nach hGC33-null-NP- oder hGC33-Behandlung war Cyclin D1 in HepG2-Zellen signifikant herunterreguliert im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Wnt-Aktivierung in HepG2-, Huh-7- und Li-7-Zellen

Um die Aktivierung des klassischen Wnt/β-Catenin-Signals in HCC-Zellen zu verstehen, detektierten wir zunächst die Expression von Wnt-Ligand und Rezeptor-Crimp-Protein (Frizzled, FZD oder Frz) in verschiedenen HCC-Zelllinien: HepG2 (GPC3⁺⁺), Huh-7 (GPC3⁺) und Li-7 (GPC3⁻). Die Ergebnisse zeigten, dass Wnt3a und FZD-Rezeptor, der den β-Catenin-Pfad transduziert, in allen Zelllinien exprimiert waren, besonders in HepG2- und Huh-7-Zellen (Abb. 5).

Expression von Wnt3a, FZD1 und FZD3 in HCC-Zelllinien.

hGC33-null-NP hemmt Wnt-Signaltransduktions-abhängige Zellproliferation induziert durch Wnt3a

Einige Studien haben gezeigt, dass der extrazelluläre Teil von GPC3 ein Co-Rezeptor von Wnt sein könnte, der Wnt/β-Catenin-Signalaktivierung und -transduktion fördert. Daher wurde, als HepG2 (GPC3⁺), Huh-7 (GPC3⁺) und Li-7 (GPC3⁻) Zellen mit hGC33 und hGC33-null-NP ko-inkubiert wurden, die Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signals durch hGC33 und hGC33-null-NP blockiert, und die Proliferation von HepG2 und Huh-7, aber nicht Li-7, in Wnt3A-konditioniertem Medium inhibiert. Dass die Proliferation von Li-7-Zellen höchstwahrscheinlich auf das Fehlen von GPC3 auf der Li-7-Zelloberfläche zurückzuführen ist (Abb. 6). Unsere Ergebnisse zeigen, dass hGC33 und hGC33-null-NP-Nanopartikel spezifisch an GPC3-Moleküle auf Zellmembran binden. hGC33 und hGC33-null-NP neutralisieren teilweise die mitogene Aktivität von Wnt3a und inhibieren den Wnt/β-Catenin-Signalweg. Die Hemmung der Proliferation durch hGC33-null-NP-Nanopartikel war jedoch geringer als durch hGC33. Vielleicht interferiert die räumliche Struktur der Nanopartikel mit hGC33-null-NP und limitiert die Funktion des hGC33-Moleküls auf den Nanopartikeln, sodass sie die Interaktion zwischen GPC3 und Wnt3a nicht vollständig blockieren können.

GPC3-aktivierte Wnt-Signaltransduktion in HCC. 50 % Wnt3a-DMEM-Medium wurde mit Anti-Wnt3a-Antikörper, hGC33 oder hGC33-null-NP versetzt. HepG2 (GPC3⁺⁺), Huh-7 (GPC3⁺) und Li-7 (GPC3⁻) Zellen wurden 48 h ko-inkubiert, und Zellproliferation wurde durch MTT-Assay gemessen. Daten als Mittelwert ± SD (*P < 0,01).

hGC33-null-NP hemmt Wnt3a-induzierte Signaltransduktion in HepG2- und Huh-7-Zellen

Um den Effekt von hGC33-null-NP auf Wnt/β-Catenin-Signalgebung in HCC-Zellen zu verstehen, extrahierten wir Proteine von HepG2- und Huh-7-Zellen, behandelt mit hGC33 oder hGC33-null-NP. Die Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass nach hGC33-null-NP-Behandlung die Level von pYAP und pβ-Catenin erhöht waren, aber die Level von YAP und β-Catenin verringert waren. Weiterhin waren die Level von Cyclin D1, CD44, VEGF und c-MYC in der hGC33-null-NP-Gruppe niedriger als in der Kontrollgruppe, aber der Level war geringer als bei hGC33-Behandlung. Ähnliche Effekte wurden in HepG2- und Huh-7-Zellen beobachtet, wie in Abb. 7 gezeigt.

Inhibition von Wnt3a-induzierter β-Catenin-Signalgebung durch hGC33-null-NP oder hGC33. a Im Vergleich zur Kontrollgruppe wurde der Wnt/β-Catenin-Signalweg in HepG2- und Huh-7-Zellen, behandelt mit hGC33-null-NP oder hGC33, inhibiert, und die Level von β-Catenin und YAP waren verringert, während die erhöhten phosphorylierten β-Catenin- und phosphorylierten YAP-Moleküle instabil waren und im Zytoplasma degradierten. Die verringerte β-Catenin war schwer im Kern zu halten und die Expression von Cyclin D1, CD44, VEGF und c-MYC anzutreiben, was zur Abnahme der Cyclin D1, CD44, VEGF und c-MYC-Proteinlevel führte. b Der Mechanismus-Muster des Wnt/β-Catenin-Signalwegs, inhibiert durch hGC33-null-NP oder hGC33.

hGC33-SFB-NP oder hGC33 schwächt HCC-Zellmigration durch Hemmung des epithelial-mesenchymalen Übergangs (EMT)

HCC ist einer der tödlichsten Krebserkrankungen weltweit, und seine Inzidenz nimmt stetig zu. Sorafenib ist die einzige zugelassene Standardbehandlung für Patienten mit fortgeschrittenem HCC, da gezeigt wurde, dass es die Überlebensrate dieser Patienten verbessert. Klinische und präklinische Beobachtungen deuten jedoch darauf hin, dass Sorafenib-Therapie aufgrund schneller Entwicklung von Medikamentenresistenz limitierte Wirksamkeit hat. Daher ist die Aufklärung des Mechanismus der Entkommen-Resistenz gegen Sorafenib ein Hauptschwerpunkt in der HCC-Forschung. In jüngster Zeit wurde der Rolle des epithelial-mesenchymalen Übergangs (EMT) im Fortschreiten von HCC und der Entwicklung von Medikamentenresistenz immer mehr Aufmerksamkeit geschenkt. EMT bezeichnet die Transformation von epithelialen zu mesenchymalen Zellen, die Zellen die Fähigkeit verleiht, zu metastasieren und zu invadieren, einschließlich Erwerb von Stammzelleigenschaften, Reduktion von Apoptose und Alterung, Förderung von Immunsuppression und Beteiligung an Entstehung und Entwicklung von Krebs. Der Verlust der E-Cadherin-Expression wird als Schlüsselschritt in der Karzinogenese und EMT betrachtet. EMT ist ein entwicklungsbiologischer multi-step molekularer und zellulärer Reprogrammierungsprozess, den Krebszellen nutzen, um Aggressivität zu erreichen. Dies geschieht hauptsächlich durch Downregulation der Expression von E-Cadherin, Keratin, Mucin, ZO-1 (Tight-Junction-Protein); Upregulation der Expression von Vimentin, Alpha-Smooth-Muscle-Actin (α-SMA), FN Fibronektin, MMPs (Matrix-Degradation), N-Cadherin, Snail, Slug, Twist, Rho, TGF-β, FGF, Typ-I-Kollagen und Typ-II-Kollagen, um Invasion, Metastasierung und Anti-Apoptose von EMT-charakteristischen Tumoren zu erreichen. Die Änderungen dieser Proteinausdrücke betreffen hauptsächlich die Aktivierung von Wnt/β-Catenin- und Ras/Raf/MAPK-Signalwegen.

Unsere Experimente haben gezeigt, dass hGC33-Antikörper auf der NP-Vektoroberfläche Wnt3a-induzierte β-Catenin-Signaltransduktion inhibieren und dann die Expression von β-Catenin, CD44, vaskulärem Endothelwachstumsfaktor (VEGF), Cyclin D1 und c-MYC herunterregulieren. Darüber hinaus inhibiert hGC33-SFB-NP die Aktivierung des Ras/Raf/MAPK-Signalwegs und inhibiert Proliferation und Apoptose von HCC-Zellen. hGC33 und SFB haben einen synergistischen Effekt, hemmen EMT und verringern die Migration von HCC-Zellen (Abb. 8).

Effekt von hGC33-SFB-NP auf EMT-Hemmung. a Im Vergleich zur Kontrollgruppe hatte die hGC33-SFB-NP-Behandlungsgruppe weniger Zellmigration. Fotografien wurden unter Lichtmikroskop (Vergrößerung ×200) aufgenommen. Der Fehlerwert repräsentiert die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. *Verglichen mit der Kontrollgruppe, p < 0,01. b Im Vergleich zur Kontrollgruppe verringerten sich die EMT-bezogenen Proteine Snail, Vimentin und MMP-2 in HCCs, behandelt mit hGC33-SFB-NP, während E-Cadherin zunahm. c Molekularer Mechanismus von EMT. EMT, epithelial-mesenchymaler Übergang; MMP-2, Matrix-Metalloproteinase-2; SFB, Sorafenib; NP, Nanopartikel.

hGC33-SFB-NP hemmt Wachstum von hepatozellulärem Karzinom in vivo und verbessert Überlebensrate tumor-tragender Mäuse

Um die antitumorale Aktivität von hGC33-SFB-NP in vivo zu evaluieren, wurden HepG2- und Huh-7-Zellen subkutan in den rechten Bauch und die Rückenseite weiblicher BALB/c-Nacktmäuse injiziert. Als das Tumor-Xenotransplantat-Wachstum etwa 30 mm³ erreichte, wurden die Mäuse zufällig in Gruppen aufgeteilt, um die Inhibition jeder Gruppe (hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, SFB-NP, freies hGC33, freies SFB und Kontrollgruppe) auf HCC weiter zu evaluieren (n = 5 pro Gruppe). Aus Abb. 9a, b ist ersichtlich, dass hGC33-SFB-NP das Tumorwachstum in Mäusen im Vergleich zur PBS-Kontrolle und anderen Behandlungen signifikant verlangsamte. Im Vergleich zur PBS-Kontrolle hatten hGC33-null-NP, SFB-NP, freies hGC33 und freies SFB ebenfalls eine gewisse Hemmung von HCC, da freies hGC33 und freies SFB direkt Wnt-Signal und Ras/Raf/MAPK inhibieren. Solche Wege können die Proliferation von HCC-Zellen in gewissem Maße inhibieren. Obwohl das nanopartikel-modifizierte hGC33 (hGC33-null-NP) durch chemische Bindungen an die Nanooberfläche gekoppelt ist, beeinträchtigte dies nicht hGC33s Targeting von GPC3-Molekülen und Inhibition von Wnt-Aktivität. Nanopartikel-beladenes SFB (SFB-NP) wurde nach Endozytose durch Zellen degradiert, um SFB aus dem Copolymer freizusetzen und HCC-Wachstum zu inhibieren. Insgesamt war der hemmende Effekt von hGC33-SFB-NP auf HepG2-Zelltransplantate, wie erwartet, stärker als auf Huh-7-Zelltransplantate, wahrscheinlich weil HepG2 GPC3-Moleküle exprimiert.

Effekt von hGC33-SFB-NP auf Xenotransplantation von HCC in Nacktmäusen und Änderungen des Mäusengewichts. Leberkrebszellen wurden subkutan auf dem Rücken jeder Nacktmaus injiziert (n = 10). Nach 10 Tagen wurden die tumor-tragenden Mäuse mit PBS (Kontrolle), freiem hGC33, freiem SFB, hGC33-null-NP, SFB-NP und hGC33-SFB-NP behandelt. Tumorgröße (a, b) und Körpergewicht (c, d) der Mäuse wurden zu festgelegten Zeitpunkten überwacht.

Das Körpergewicht der Nacktmäuse in jeder Behandlungsgruppe wurde ebenfalls gemessen, wie in Abb. 9c, d gezeigt. Das Körpergewicht der Kontrollgruppe nahm allmählich ab. Das Gewicht der Mäuse in den Gruppen freies hGC33, freies SFB, SFB-NP und hGC33-null-NP nahm ebenfalls progressiv ab und nicht signifikant weniger als in der Kontrollgruppe. Allerdings nahm das Gewicht der Nacktmäuse, die HepG2 und Huh-7 trugen und mit hGC33-SFB-NP behandelt wurden, nur leicht ab, und das Gewicht blieb während des Behandlungszyklus relativ stabil. Diese Ergebnisse unterstützen, dass das neuartige hGC33-SFB-NP-Nanowirkstoff keine signifikante Toxizität in Nacktmäusen aufweist, und das auf dem Nanoträger beladene SFB und das oberflächenmodifizierte hGC33 additive oder sogar synergistische antitumorale Effekte erzeugen können.

Diskussion

Um die Eignung von hGC33-SFB-NP für gezielte HCC-Therapie zu prüfen, testeten wir die Modellkonjugate auf ihre Fähigkeit, an menschliches Glypican-3 auf HCC-Zellen in vitro zu binden; GPC3-positive HCC-Zellproliferation, Migration und Wnt/β-Catenin-Signaltransduktion zu inhibieren; und HCC, das Glypican-3 überexprimiert, in vivo zu inhibieren.

Um GPC3-spezifischen Antikörper hGC33 kovalent mit mal-PEG-b-PLGA-Nanopartikeln zu binden, vernetzten wir die freie Sulfhydrylgruppe im Fc-Segment von hGC33 mit maleimid-funktionalisiertem PEG-b-PLGA (mal-PEG-b-PLGA) durch Bildung stabiler Thioetherbindungen. Konjugation ist eine Voraussetzung für Targeting von GPC3-positivem HCC. Eine Reihe von Experimenten, einschließlich Änderungen des Nanopartikeldurchmessers und Zeta-Potenzials, detektiert durch Linse, und intrazelluläre Aufnahme von hGC33-SFB-NP, verifizierten das Targeting von hGC33-SFB-NP auf HepG2 (GPC3⁺) Zellen. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Bindungsaktivität des Antikörpers hGC33 durch die Konjugation nicht verändert wurde.

Wir detektierten direkt den phagozytischen Effekt von GPC3⁺ HepG2- und GPC3⁻ Li-7-Zellen auf PEG-b-PLGA-NP-oberflächenmodifiziertes hGC33 durch Konfokalmikroskopie. Nach Ko-Kultur von HepG2- und Li-7-Zellen mit hGC33-Cumarin-6-NP war die grüne Signalintensität in HepG2-Zellen signifikant höher als in Li-7-Zellen, was darauf hindeutet, dass mehr Nanopartikel in HepG2-Zellen waren. Dieser Befund ist konsistent mit dem hGC33-Antikörper, modifiziert auf der Oberfläche von PEG-b-PLGA-NP, der spezifisch an Glypican-3 auf der Oberfläche von HCC-Zellen bindet und internalisiert wird. Die Effizienz der hGC33-modifizierten NP-Internalisierung hängt vom Expressionslevel des GPC3-Antigens auf der Zelloberfläche ab.

Wir verwendeten den standardmäßigen MTT-Assay, um die Effizienz der Hemmung der Proliferation von Hepatomzellen zu messen. Sowohl hGC33-null-NP als auch hGC33 hemmten das Wachstum der GPC3-positiven HCC-Zelllinie HepG2, aber hGC33-null-NP und hGC33 beeinflussten die Proliferation der GPC3-negativen Li-7-Zellen nicht (Abb. 3b). Auf Tierebene hemmten hGC33-null-NP oder hGC33 allein das Wachstum von Huh-7- und HepG2-Xenotransplantaten in gewissem Maße, während hGC33-SFB-NP Wachstumsarrest von Huh-7- und HepG2-Hepatom-Xenotransplantaten in Mäusen verursachte. Die Feststellung, dass hGC33-null-NP GPC3-positive Hepatomzellen signifikant hemmte, zeigte, dass der hemmende Effekt von PEG-b-PLGA-NP-oberflächenmodifiziertem hGC33 auf HCC-Zellproliferation von der Expression des GPC3-Antigens auf der Zelloberfläche abhängt.

GPC3 reguliert viele Wege in der HCC-Pathogenese, einschließlich Wnt- und YAP-Signalgebung [25, 26, 27]. GPC3 interagiert mit Wnt-Ligand und könnte ein Co-Rezeptor für Wnt sein und Wnt/Frizzled-Bindung für HCC-Wachstum fördern [28, 29]. Wir untersuchten weiter den Effekt des nanowirkstoffs, oberflächenmodifiziert mit hGC33, auf den Wnt-Signalweg in Hepatomzellen. Wie freies hGC33 inhibierte nanowirkstoff-oberflächenmodifiziertes hGC33 die Proliferation von Hepatomzellen nicht nur durch Blockade der Wnt-induzierten Signaltransduktion in HepG2- und Huh-7-Zellen, die GPC3 exprimieren, sondern auch durch Inhibition der Wnt3a-induzierten β-Catenin- und YAP-Signaltransduktion. Frühere Studien haben gezeigt, dass YAP-Expression durch β-Catenin auf transkriptioneller Ebene von HCC reguliert wird [30, 31]. In dieser Studie inhibierten freies hGC33 und nanowirkstoff-oberflächenmodifiziertes hGC33 Wnt3a-induzierte YAP-Aktivität, was darauf hindeutet, dass Yap/TAZ, freigesetzt aus β-Catenin-Komplex, auch klassische Wnt-Signaltransduktion initiieren kann [32, 2]. Diese Ergebnisse zeigen, dass typische Wnt- und YAP-Wege durch verschiedene Mechanismen Crosstalk betreiben. Im Vergleich zu hGC33-null-NP und hGC33 hatte hGC33-SFB-NP stärkere anti-proliferative und anti-migratorische Fähigkeiten in vitro und in vivo. Somit bestimmt hGC33 nicht nur die Spezifität von HCC-Zellen, sondern erhöht auch den hemmenden Effekt von SFB auf Proliferation und Migration von HCC-Zellen durch Blockade von Schlüsselsignalen, die mit Tumorwachstum verbunden sind, wie Wnt/β-Catenin- und Wnt/YAP-Signalweg.

Schlussfolgerung

Antikörper hGC33 gegen Glypican-3, ein Membranprotein, das auf hepatozellulären Karzinomzellen überexprimiert ist, erhöhte die Bindung von Sorafenib-beladenen Polyethylenglycol-b-PLGA-Polymernanopartikeln (hGC33-SFB-NP) an Glypican-3 auf den Krebszellen. Die Verabreichung der antikörper-modifizierten Nanopartikel inhibierte synergistisch Wnt-induzierte Signaltransduktion und Ras/Raf/MAPK-Signalweg; hepatozelluläre Karzinomzellen wurden in G0/1-Phase durch Herunterregulierung der Cyclin-D1-Expression arrestiert, wodurch Krebszellmigration durch Hemmung des epithelial-mesenchymalen Übergangs abgeschwächt wurde. hGC33-SFB-NP hemmte Leberkrebswachstum in vivo und verbesserte die Überlebensrate tumor-tragender Mäuse.

Verfügbarkeit von Daten und Material

Ja, alle Daten wurden im Manuskript präsentiert.

Abkürzungen

AKT/PKB:

Protein Kinase B

c-MET:

HGFR: Hepatozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor

EE%:

Einkapselungseffizienz %

EMT:

Epithelial-mesenchymaler Übergang

FTIR:

Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie

¹H-NMR:

¹H-Kernresonanzspektroskopie

HCC:

Hepatozelluläres Karzinom

LC%:

Wirkstoffbeladung %

MAPK:

Mitogen-aktivierte Proteinkinasen

PDI:

Polydispersitätsindex

PI3K:

Phosphoinositid-3-Kinase

pRAD51:

Phospho-RAD51

SFB:

Sorafenib

TEM:

Transmissionelektronenmikroskopie

YAP:

Yes-assoziiertes Protein-1