Aptamer-modifizierter magnetischer Nanosensibilisator für die In-vivo-MR-Bildgebung von HER2-exprimierendem Krebs

Hintergrund

Der humane epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2), der zur Familie der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) gehört, spielt eine Schlüsselrolle bei menschlichen Malignomen und wird bei etwa 30 % der menschlichen Brustkrebserkrankungen [1] und bei vielen anderen Krebsarten überexprimiert , einschließlich Magen-, Blasen-, Eierstock- und Lungenkarzinome [1,2,3,4]. Patientinnen mit HER2-überexprimierendem Brustkrebs haben tendenziell wesentlich niedrigere Überlebensraten als Patientinnen mit nicht überexprimierenden HER2-Krebsen [5]. Darüber hinaus führt die Überexpression von HER2 zu einer erhöhten Metastasierung von Brustkrebs [6,7,8]. Aus diesem Grund dient HER2 als wichtiger Biomarker in der Krebsdiagnose. Im klinischen Umfeld wird HER2 als typischer biologischer Marker zusammen mit dem Östrogenrezeptor (ER) und dem Progesteronrezeptor (PR) zur Diagnose von Brustkrebs verwendet. Somit erhalten Brustkrebspatientinnen nach histologischer Überprüfung der HER2-, ER- und PR-Expressionsspiegel eine sichere Diagnose. Die histologische Überprüfung ist jedoch invasiv und wird nur bei einer begrenzten Anzahl von Läsionen durchgeführt. Aus diesem Grund wurden verschiedene Untersuchungen durchgeführt, um die diagnostischen Marker nicht-invasiv mittels radiologischer Untersuchung vor histologischer Überprüfung anhand von Computertomographie [9, 10], Positronen-Emissions-Tomographie [11,12,13], Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie . zu visualisieren [14,15,16], Magnetresonanztomographie (MRT) [17,18,19,20] und multimodale Bildgebungswerkzeuge [21,22,23].

Eisenoxid-Nanopartikel (IONPs) werden in verschiedenen nicht-invasiven radiologischen Untersuchungen zur Beobachtung klinisch relevanter Biomarker eingesetzt [24, 25]. IONPs sind mit der molekularen Bildgebung kompatibel, da sie eine höhere magnetische Empfindlichkeit oder Biokompatibilität aufweisen als andere schwermetallbasierte MRT-Kontrastmittel wie z. B. gadoliniumbasierte Kontrastmittel (GBCAs) oder nickel- oder kobalthaltige Kontrastmittel. Obwohl kommerziell erhältliche MRT-Kontrastmittel und GBCAs aufgrund der Freisetzung von Gd ³⁺ . mit Problemen im Zusammenhang mit der In-vivo-Toxizität verbunden sind, Ionen haben die IONP-basierten MRT-Kontrastmittel eine höhere In-vivo-Sicherheit als GBCAs, da sie zu Eisen abgebaut, absorbiert oder eliminiert werden können [26, 27].

Um IONPs für die molekulare Bildgebung anzuwenden, sind die Targeting-Einheiten äußerst wichtig und können Chemikalien, Kohlenhydrate, Proteine, Antikörper oder Aptamere sein [25, 28, 29]. Unter diesen Molekülen haben Aptamere eine stabile dreidimensionale Struktur einer einzelsträngigen Nukleinsäure, die eine hohe Bindungsaffinität und Spezifität für spezifische Moleküle aufweist. Die hohe Bindungsaffinität der Aptamere wird durch ihre Entwicklungstechnik und die systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) verursacht [30]. SELEX verwendet sehr große Bibliotheken von Oligonukleotiden mit zufälliger Sequenz (~ 10 ¹⁵ ) durch chemische Synthese bereitgestellt und parallel gescreent werden, um Aptamere zu finden, die eine hohe Bindungsaffinität an das Zielmolekül aufweisen. Als Ergebnis von SELEX konnten Aptamere mit einer hohen Bindungsaffinität von pikomolaren Konzentrationsniveaus im Allgemeinen entwickelt werden, während die anderer Biomoleküle von Mikromol bis Subnanomol reicht [31, 32]. Im Fall der neu entwickelten Aptamere der dritten Generation weisen sie aufgrund ihrer verbesserten Resistenz gegen DNase bzw. RNase durch den Einsatz modifizierter Nukleinsäuren auch in vitro und in vivo Stabilität auf [33, 34]. Aus diesen Gründen kristallisieren sich Aptamere als bevorzugte Einheiten in der molekularen Bildgebungsforschung heraus [35].

Ziel dieser Studie war die Entwicklung eines Aptamer-modifizierten T2-Kontrastmittels auf Basis magnetischer Nanokristalle (MNCs) mit hoher Spezifität für HER2-überexprimierende Krebszellen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden MNCs mit hoher magnetischer Empfindlichkeit durch ein thermisches Zersetzungsverfahren und ein HER2-spezifisches Aptamer (K _d = 0,42 nM) verwendet wurde. Die synthetisierten Kontrastmittel wurden durch Analyse der Morphologie, der Magnetisierungseigenschaften und der magnetischen Relaxivität charakterisiert. Außerdem führten wir in vitro und in vivo Targeting-Assays gegen HER2-Proteine ​​in einem Tumor-Xenotransplantat-Tiermodell durch, in das eine HER2-exprimierende Krebszelllinie implantiert wurde.

Methoden

Materialien

TWEEN® 80 (T80), 4-(Dimethylamino)pyridin, N ,N ′-Dicyclohexylcarbodiimid, Triethylamin, wasserfreies Dichlormethan, Eisen(III)acetylacetonat, 1,2-Hexadecandiol, Dodecansäure, Dodecylamin und Benzylether wurden von Sigma-Aldrich (USA) bezogen und 3-Maleimidopropionsäure (MPA) wurde von TCI Amerika (USA). Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640), Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, fötales Rinderserum und Gibco® antibiotisch-antimykotische Lösung wurden von Life Technologies (USA) bezogen. Das NIH3T6.7 wurde von American Tissue Type Culture (USA) erworben. Mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltes Wasser wurde von Biosesang Inc. (Korea) bezogen. Das thiolierte Anti-HER2-Aptamer [Apt_HER2 , Sequenz:5'-6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A-3' (6:NapdU), 5'-SH-Modifikation, 40-mer] wurde von Aptamer Science Inc. (Korea) bezogen.

Synthese von MNCs

Die monodispersen magnetischen Eisenoxid-Nanopartikel wurden mit der thermischen Zersetzungsmethode von Sun synthetisiert [36]. Diese magnetischen Nanopartikel werden aufgrund ihrer Eisen(III)-Acetylacetonat- und Ölsäure-Vorstufen als MNCs bezeichnet. Kurz gesagt wurde eine Mischung aus Eisen(III)-acetylacetonat (2 mmol), Ölsäure (6 mmol), 1-Octadecen (6 mmol), 1,2-Hexadecandiol (10 mmol) und Benzylether (20 ml) geladen einem Dreihalsrundkolben und mechanisch gerührt. Um restliche Sauerstoffmoleküle und Wasser zu entfernen, wurde die Mischung 30 Minuten auf 100 °C vorgewärmt. Die vorgewärmte Mischung wurde dann 2 h auf 200 °C erhitzt und 30 min unter einem Stickstoffstrom bei 300 °C am Rückfluss gehalten. Nachdem die Reaktanten durch Entfernen der Wärmequelle auf Raumtemperatur abgekühlt worden waren, wurden die Reaktanten mit überschüssigem Ethylalkohol gereinigt. Die Zentrifugation wurde dreifach durchgeführt, um das Produkt von jeglichem undispergierten Rückstand zu trennen. Das Fe₃ O₄ Nanopartikelprodukte wurden dann in 5 ml Hexan redispergiert. Das Endprodukt wurde synthetisiert, indem das oben beschriebene Verfahren mit 100 mg Fe₃ . wiederholt wurde O₄ und seine Vorläufer. Die MNC-Morphologien wurden unter Verwendung eines hochauflösenden Transmissionselektronenmikroskops (HR-TEM, JEM-2100, JEOL Ltd., Japan) bewertet. Die Magnetisierungssättigung wurde unter Verwendung eines Vibrationsprobenmagnetometers (VSM, MODEL-7300, Lakeshore, USA) bei Raumtemperatur bewertet. Die Menge an MNCs im Produkt wurde durch Messung des Gewichts mit einem thermogravimetrischen Analysator (SDT-Q600, TA Instrument) analysiert und die MNCs wurden gewaschen, bis der Gehalt an Fe₃ . erreicht war O₄ ca. 80 % erreicht.

Synthese von Maleimidyl-TWEEN ^® 80

Zur Herstellung von Maleimidyl T80 (Tm80), 15,3 mmol MPA und 22,9 mmol N ,N ′-Dicyclohexylcarbodiimid wurde jeweils in 10 ml Dichlormethan gelöst und anschließend gemischt. Die Mischung wurde dann zu 20 ml Dichlormethan mit 7,6 mmol T80 gegeben, gefolgt von der Zugabe von 3,2 ml Triethylamin in die Mischung. Schließlich wurden 22,9 mmol 4-(Dimethylamino)pyridin in 10 ml Dichlormethan gelöst und alle Reagenzien wurden in einem 70 ml-Fläschchen gemischt. Die endgültige Mischung wurde 48 h lang mit einem Magneten gerührt. Die Farbe der Mischung änderte sich von Aprikose in eine Rotweinfarbe. Nach 48 h Reaktion wurde der kristallisierte Harnstoff durch Filtration entfernt. Zur Entfernung des Dichlormethans wurde die Reaktion am Rotationsverdampfer (N-1100, EYELA, Japan) eingedampft. Das resultierende Produkt wurde in entionisiertem Wasser suspendiert und die unkonjugierten Reagenzien wurden durch Dialyse entfernt (Spectra/Por®, 1 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., USA). Das Endprodukt wurde durch Gefriertrocknen hergestellt. Das synthetisierte Tm80 wurde durch Vergleich mit MPA und T80 unter Verwendung eines UV-Vis-Spektrometers (UV-1800, Shimadzu, Japan), eines Fourier-Transform-Infrarot-(FT-IR)-Spektrometers (PerkinElmer, Spektrum zwei) und ^{1<. bestätigt /sup> H-Kernmagnetresonanz(NMR)-Spektrometer (Bruker Biospin, Advance II, siehe Zusätzliche Datei 1:Abbildung S1).}

Vorbereitung von Maleimidyl-MNCs

Wasserdispergierbare Maleimidyl-MNCs (mWMNCs) wurden mit der Nanoemulsionsmethode hergestellt [37]. Kurz gesagt, 100 mg Tm80 wurden in 20 ml entionisiertem Wasser vollständig gelöst, und 4 ml n-Hexan, das 20 mg MNCs enthielt, wurden unter Ultraschall (190 W) und Rühren (1200 U/min) schnell in das Tm80-gelöste Wasser injiziert. Der Emulsionsprozess wurde 10 Minuten mit einem eisgekühlten Bad fortgesetzt. Das verbleibende organische Lösungsmittel wurde 12 h bei Raumtemperatur verdampft und die Produkte wurden durch Dialyse (Spectra/Por®, 3,5 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., USA) gereinigt, um überschüssiges Tensid 3 Tage lang zu entfernen. Die mWMNCs wurden dann mit einem Zentrifugalfilter (NMWL 3000, Amicon® Ultra, Merk Milipore Ltd., Deutschland) auf 1,25 mg_Fe . konzentriert /ml in DEPC-behandeltem Wasser. Die T80-enveloped MNCs (WMNCs) wurden ebenfalls mit der gleichen Methode hergestellt.

Vorbereitung von Apt_HER2 -MNS

Vor der Konjugation zwischen mWMNCs und Anti-HER2-Aptameren wurde der Reduktionsschritt von Thiol-modifizierten Aptameren durchgeführt. Kurz gesagt, 1 nmol Aptamer wurde in 0,3 ml entionisiertem Wasser gelöst und Triethylaminacetat und 1,4-Dithiltret-Lösung wurden zugegeben, wobei die Endkonzentration 50 bzw. 25 mM betrug. Diese Mischung wurde 1,5 h bei Raumtemperatur geschüttelt und durch Ethanolfällung gereinigt und entsalzt. So bereiten Sie den Apt_HER2 vor -MNS, HER2-spezifische MRT-Sonde, das Molekulargewicht der MNCs wurde theoretisch berechnet (siehe zusätzliche Datei 1:Abbildung S2) und das Mischungsverhältnis von mWMNCs und Aptamer wurde als 1:7 bezeichnet. Daher 100 μg (Fe) mWMNCs (als Fe₃ O₄ , 45 pmol) wurde in PBS (1 ml) gelöst und mit 5 μg (0,35 nmol) Aptamer versetzt. Die Mischung wurde 5 min bei Raumtemperatur gerührt und 2 h bei 4 °C inkubiert. Die Verteilung des hydrodynamischen Durchmessers des Apt_HER2 -MNS wurde dann unter Verwendung eines dynamischen Laserstreuungsanalysators (ELS-Z, Otsuka Electronics, Japan) analysiert. Um die Fähigkeit des Apt_HER2 zu bestätigen -MNS als MRT-Kontrastmittel, T2-Relaxivitätsanalyse (R2) wurde mit einem klinischen 1,5 T-MRT-Instrument mit einer Mikro-47-Oberflächenspule (Intera, Philips Medical System, Niederlande) unter Verwendung verschiedener konzentrierter Phantome von Apt_{HER2<. durchgeführt /sub> -MNS. Der R2 des AptHER2 -MNS wurde mit der Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)-Sequenz bei Raumtemperatur gemessen:TR = 10 s, 32 Echos mit 12 ms geradem Echoraum, Anzahl der Akquisitionen = 1, Punktauflösung = 156 μm × 156 μm, und Abschnittsdicke   =  0,6 mm. Der R2 wurde als 1/T2 mit s ⁻¹ . definiert Einheiten.}

Apt_HER2 -MNS-Bindungsaffinitätsassay

Zur Validierung der HER2-Spezifität von Apt_HER2 -MNS wurde die Nitrocellulose-Filterbindungsmethode verwendet [38]. Das nackte Apt_HER2 und Apt_HER2 -MNS wurden unter Verwendung von alkalischer Phosphatase (New England Biolabs, MA, USA) dephosphoryliert. Das 5′- oder 3′-Ende der Aptamere wurde durch T4-Polynukleotidkinase und [ ³² P]-ATP (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA) [39]. Die Bindungsassays wurden durch Inkubieren der ³² P-markierte Aptamere in einer Konzentration von 10 pM mit dem HER2-Protein in Konzentrationen von 100 bis 10 pM in Selektionspuffer (20 mM Tris·HCl, pH 7,5 bei 4 °C, 6 mM NaCl, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM Na₃ EDTA, 10 % v /v Glycerin) bei 37 °C für 30 min. Die Mischung der ³² P-markierte Aptamere und das HER2-Protein wurden durch eine G-50-Säule (GE Heathcare Life Science, UK) filtriert, um freie Radioisotope zu entfernen. Die filtrierten Mischungen wurden auf dem wiederverwendbaren Film entwickelt und Fraktionen der HER2-Protein-gebundenen Aptamere wurden unter Verwendung eines Phosphorimagers (Fuji FLA-5100 Image Analyzer, Tokyo, Japan) quantifiziert. Um den Effekt der unspezifischen Hintergrundbindung des radioaktiv markierten Aptamers an den Nitrozellulosefilter zu eliminieren, wurden die Rohbindungsdaten korrigiert, indem das Experiment mit ³² . durchgeführt wurde Nur P-markierte Aptamere.

In-vivo-MRT

Alle Tierversuche wurden unter Genehmigung der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International durchgeführt. Die In-vivo-MRT-Scans wurden mit einem syngenen Maustumormodell durchgeführt, das durch die Implantation von NIH3T6.7-Zellen (1,0 × 10 ⁷ Zellen) in die Oberschenkel von 5 Wochen alten weiblichen BALB/c-Nacktmäusen. Nach 2 Wochen wurde die Tumorgröße durch MRT beurteilt. Wenn die Tumorgröße ungefähr 500 mm ³ . erreicht hat , 100 μg (5 mg/kg) Apt_HER2 -MNS wurde in die Schwanzvene injiziert. In-vivo-MRT-Experimente wurden mit einem klinischen 3,0 T-MRT-Instrument und einer menschlichen 8-Kanal-Handgelenkspule durchgeführt. Für die T2-gewichtete MRT bei 3,0 T wurden die folgenden Parameter verwendet:TR/TE = 1054/70 ms, Anzahl der Aufnahmen = 2, Punktauflösung = 400 × 319 mm und Schichtdicke = 1 mm TSE-Faktor = 8 Kontrollexperimente wurden mit WMNCs mit der gleichen Methode durchgeführt. Alle T2-Signalintensitäten wurden durch Mittelung von ungefähr fünf interessierenden Regionen (ROIs) berechnet, die auf den T2-gewichteten MRT-Bildern jedes Mausmodells gezeichnet wurden (n = 3), und der R2-(oder R2*)-Wert, der umgekehrte Wert von T2, wurde in der Signalintensitätsanalyse verwendet. Die zeitlichen Änderungen der relativen Signalintensität wurden durch die anfängliche Signalintensität (Vorinjektion) normalisiert. Die Histogrammanalyse wurde auch an der R2-Signalintensität des Voxels im ROI durchgeführt.

Histologische Analyse

Preußisch-Blau-Färbung, kann zum Nachweis von Fe-Ionen in Tumorgeweben verwendet werden, wurde durchgeführt, um das Apt_HER2 . zu bestätigen -MNS-Targeting von HER2-exprimierendem Krebs nach der Entnahme von Tumorgewebe aus jedem Tumormodell nach der in-vivo-MRT. Die entnommenen Tumorgewebe wurden für 24 h in 10 % Formalinlösung fixiert und nach Entwässerung in steigenden Ethanolkonzentrationen und Klärung in Histo-Clear® (National Diagnotics, USA) in Paraffin eingebettet. Die Preußischblau-Färbung wurde durchgeführt, indem die Gewebeschnitte (Dicke  = 5 μm) auf Glasobjektträger aufgebracht wurden, gefolgt von Entparaffinierung und Hydratation mit Histo-Clear® bzw. konzentriertem Ethanol. Danach wurden die Objektträger für 1 h in die Preußischblau-Arbeitslösung (10% Kaliumferrocyanid und 20% Salzsäurelösung = 1:1) gelegt. Die Kerne wurden unter Verwendung von Nuclear Fast Red (Sigma Aldrich, USA) gefärbt. Nach dreimaligem Waschen der Gewebeproben für 30 Minuten gaben wir 2–3 Tropfen der Eindecklösung auf die Objektträger und bedeckten die Objektträger anschließend mit Deckgläsern. Die gefärbten Gewebeschnitte wurden mit einem Olympus BX51 und Olyvia-Software (Olympus, Japan) betrachtet.

Ergebnisse und Diskussion

Apt_HER2 -MNS wurde als Einzelmolekül-Targeting-Wirkstoff basierend auf IONPs für die molekulare Bildgebung von HER2-exprimierenden Tumoren mittels MRT entwickelt. Daher Apt_HER2 -MNS musste eine hohe Spezifität für das Zielmolekül und eine große magnetische Suszeptibilität aufweisen. Um eine hohe magnetische Empfindlichkeit zu erreichen, verwenden die MNCs zunächst monodisperses Fe₃ O₄ Nanopartikel, wurden mit der Methode der thermischen Zersetzung und des Keimwachstums synthetisiert [36]. Experimentelles Verfahren zur Herstellung und in-vivo-Anwendung von Apt_HER2 -MNS wurde in Abb. 1 beschrieben. Zunächst wurden Größe und Form der MNCs durch HR-TEM bestätigt (Abb. 2a, b). In Abb. 2c wurde die durchschnittliche Größe von MNCs durch die zufällige Auswahl von 130 MNCs aus dem TEM-Bild gemessen, und es wurden eine sehr enge Größenverteilung (10,49 ± 1,74 nm) und eine Kugelform beobachtet. Die superparamagnetische Eigenschaft der MNCs wurde auch durch VSM bewertet, was einen MNC-Sättigungsmagnetisierungswert von 98,8 emu/g_Fe . ergab (Abb. 2d). Das derzeit intravenös injizierte T2-Kontrastmittel basierte auf superparamagnetischen Eisenoxiden (SPIO) oder ultrakleinen superparamagnetischen Eisenoxiden (USPIO) [40]. SPIO oder USPIO haben auch superparamagnetische Eigenschaften, aber einen Sättigungsmagnetisierungswert von weniger als 70 emu/g_Fe [40,41,42,43]. Die superparamagnetische Eigenschaft ist für die Verwendung von IONPs als intravenöses Kontrastmittel erforderlich, da sie bewirkt, dass IONPs nur dann eine magnetische Eigenschaft haben, wenn sie sich im Magnetfeld befinden, und verhindert, dass IONPs aggregieren. Darüber hinaus könnte ein höherer Sättigungsmagnetisierungswert von MNCs hilfreich sein, um die Injektionsdosis zu reduzieren als SPIO- oder USPIO-basierte Kontrastmittel.

Schematische Darstellung des experimentellen Verfahrens zur Herstellung eines Aptamer-modifizierten magnetischen Nanosensibilisators (Apt_HER2 -MNS) und deren In-vivo-Bildgebungsfähigkeitsbewertung

Das Ergebnis der morphologischen und magnetischen Charakterisierung von MNCs. a TEM-Bild. b Vergrößertes TEM-Bild. c Größenverteilungsmessung aus TEM-Bild (Gesamtzahl 100). d Magnetisierungsdiagramm

Um MNCs für In-vivo-Experimente zu verwenden, wurden WMNCs und mWMNCs durch eine Nanoemulsionsmethode unter Verwendung von T80 bzw. Tm80 hergestellt. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von hergestelltem Tm80 und seinen Vorläufern, MPA und T80, wurden durch Absorption, FT-IR, ¹ . bestätigt H-NMR-Spektralanalyse (siehe Zusätzliche Datei 1:Abbildung S1). Wie bereits veröffentlicht [44], werden mWMNCs, die durch die Nanoemulsionsmethode unter Verwendung von Tm80 hergestellt wurden, stabil in Wasser dispergiert. Darüber hinaus können die Maleimidylgruppen von mWMNCs leicht mit einem Molekül mit neutralen pH-Thiolgruppen konjugiert werden, und diese Konjugation erzeugt keine Nebenprodukte. Darüber hinaus wurde NapdU-modifiziertes Aptamer verwendet, um die In-vivo-Halbwertszeit zu erhöhen, und seine Halbwertszeit betrug 151 h in Humanserum (siehe zusätzliche Datei 1:Abbildung S3). Apt_HER2 -MNS wurde durch Konjugation zwischen mWMNCs und Apt_HER2 . hergestellt -SH und die hydrodynamischen Eigenschaften von Apt_HER2 -MNS wurden mit dynamischer Laserstreuung und MR-Relaxivitätsanalyse bewertet (Abb. 3). Die Durchmesser von WMNCs und Apt_HER2 -MNS betrugen 28,8 ± 7,2 bzw. 34,1 ±   8,2 nm (Abb. 3a). Weil der Apt_HER2 bestand aus 40-mer Oligonukleotiden und war ungefähr 5–10 nm lang, das Vorhandensein von Apt_HER2 kann die Differenz des hydrodynamischen Durchmessers verursachen. Die Relaxivität von WMNCs und Apt_HER2 -MNS betrug 265,7 und 257,2 mM ⁻¹ _Fe s ⁻¹ , bzw. (Abb. 3b), die bewertet wurde, um ihre magnetische Empfindlichkeit als MRT-Kontrastmittel zu bestätigen. Bei den T2-Kontrastmitteln auf Basis von SPIO oder USPIO, die von der FDA zugelassen sind, wurden diese fast durch die Co-Präzipitationsmethode synthetisiert. Aus diesem Grund wurde ihre Kristallinität verringert, was zu einer geringen Relaxivität führte (unter 190 mM ⁻¹ _Fe s ⁻¹ ) unter dem Magnetfeld [40]. Durch die Verwendung von MNCs in dieser Studie, Apt_HER2 -MNS hatte eine um 35 ~ 500% erhöhte magnetische Relaxivität als SPIO- oder USPIO-basierte T2-Kontrastmittel.

Die Charakterisierung von WMNCs und Apt_HER2 -MNS zur Verwendung als in-vivo-MRT-Kontrastmittel. a hydrodynamischer Durchmesser (n = 5, WMNCs 28,8 ± 7,2 nm, Apt_HER2 -MNS 34,1 ± 8,2 nm). b Entspannungsanalysegrafik (n = 3, WMNCs R ² = 265,7 mM ⁻¹ s ⁻¹ , R ² = 0,99 und Apt_HER2 -MNS R ² = 257,2 mM ⁻¹ s ⁻¹ , R ² = 0.99)

Die Bindungsaffinität von Apt_HER2 -MNS für das HER2-Protein wurde mit einem Filterbindungsassay bewertet (Abb. 4a) und das resultierende K _d Werte von Apt_HER2 -SH und Apt_HER2 -MNS wurden mit 26,88 ± 8,24 und 0,57 ± 0,26 nM gemessen (Abb. 4b, c). Apt_HER2 -OH hat eine sehr hohe Spezifität für HER2-Proteine ​​mit einem K _d -Wert von 0,42 ± 0,05 nM, und diese Bindungsaffinität ist ungefähr 10-fach höher als 5 nM von Herceptin® [45]. Die Bindungsaffinität des nackten Apt_HER2 können durch Konjugation mit den Chemikalien, Molekülen oder Nanopartikeln verändert werden. Daher ist die Bindungsaffinität von Apt_HER2 für HER2-Proteine ​​sollten nach Konjugation mit mWMNCs evaluiert werden. Die Bindungsaffinität von Apt_HER2 -SH für HER2 wurde eher durch die Anwesenheit einer Thiolgruppe als durch das nackte Apt_HER2 . reduziert weil die Thiolgruppe mit anderen Thiolresten in Proteinen oder anderen Thiol-modifizierten Aptameren gebunden werden kann. Die Bindungsaffinität von Apt_HER2 -MNS wurde ähnlich wie bei Apt_HER2 . gemessen , bedeutet dieses Ergebnis, dass weder nicht noch genügend ungebundenes Apt_HER2 . vorhanden ist -SH, das die Interaktion zwischen Aptamer und HER2-Protein unterbrechen kann, noch mWMNCs haben keinen oder nur sehr geringen Einfluss auf die Bindungsaffinität von Aptameren.

Bindungsaffinitätsdaten von Anti-HER2-Aptamer (Apt_HER2 -OH) thioliertes Anti-HER2-Aptamer (Apt_HER2 .) -SH) und Apt_HER2 -MNS auf HER2-Proteine ​​durch Messung des Filterbindungsassays. a Die schematische Darstellung zeigt den Prozess des Filterbindungsassays von Aptameren. b Das fraktionsgebundene Aptamerdiagramm gegen die HER2-Konzentration. c Die K _d Wertdiagramm von Apt_HER2 -OH (0,42 ± 0,05 nM, R ² = 0,99, p < 0,0001), Apt_HER2 -SH (26,88 ± 8,24 nM, R ² = 0.98, p < 0,0001) und Apt_HER2 -MNS (0,57 ± 0,26 nM, R ² = 0,91, p = 0,001) berechnet aus b . Fehlerbalken wurden durch positives y . dargestellt Nur -Achse

In-vivo-MRT-Experimente wurden unter Verwendung der syngenen Maustumormodelle durchgeführt, um die Fähigkeit von Apt_HER2 . zu bewerten -MNS zur Bekämpfung von HER2-überexprimierenden Tumoren. Unter Verwendung eines Tumormodells, das durch die Implantation von NIH3T6.7-Zellen in den Oberschenkel generiert wurde, wurde ein MRT-Experiment von der Vorinjektion bis 120 Minuten nach der Injektion von WMNCs oder Apt_HER2 . durchgeführt -MNS (Abb. 5, siehe auch Zusatzdatei 1:Abbildung S4). Der T2-Kontrastverstärkungseffekt durch IONP-basierte Kontrastmittel wird als dunkles Bild beobachtet, da sie den T2-Verkürzungseffekt um Protonen herum induzieren. Daher wurden in den Signalintensitätsanalysen T2- oder T2*-Werte durch R2 oder R2* repräsentiert. R2, ein umgekehrter Wert von T2, wird verwendet, um die Signalintensität mit einem positiven Wert zu vergleichen. Im Fall von WMNCs wurde die höchste R2-Signalintensität 30 Minuten nach der Injektion von WMNCs beobachtet, wonach sie allmählich abnahm (Abb. 5a, b). 120 Minuten nach der Injektion von WMNCs ähnelte die T2-Signalintensität dem Zustand vor der Injektion. Die Änderungsrate des Durchschnittswerts der R2-Signalintensität betrug weniger als 10 %; daher war es im T2-gewichteten MR mit bloßem Auge schwer zu erkennen. In der vorherigen Studie wurde gezeigt, dass sich die T80-umhüllten Eisenoxid-Nanopartikel um das Tumorgewebe herum ansammeln, obwohl keine Targeting-Einheiten vorhanden sind [46]. In dieser Studie wurde jedoch eine Kontrastmitteldosis von 1,4 mg_Fe pro Maus wurde in der T2-gewichteten MRT verwendet, die 14-mal höher war als die in dieser Studie verwendete Dosis. Dies bedeutet, dass WMNCs im Experiment bei einer Dosis von 0,1 mg_Fe . keine wirksame Kontrastmittelverstärkung zeigen konnten pro Maus (5 mg_Fe /kg). Die Zeitreihenänderung der R2*-Signalintensität betrug ebenfalls weniger als 10 % und es gab keine statistische Signifikanz. Im Gegensatz dazu, 120 Minuten nach der Injektion, Apt_HER2 -MNS verursachte eine 130 % höhere Signalintensitätsverstärkung als vor der Injektion von Apt_HER2 -MNS trotz Verwendung der gleichen Injektionsdosis wie bei WMNCs (Abb. 5c, d). Diese Injektionsdosis war 2- bis 30-fach niedriger als in anderen Studien zu aptamermodifizierten magnetischen Nanopartikel-basierten Kontrastmitteln [44, 47, 48]. Dieses Ergebnis zeigte, dass Apt_HER2 -MNS hat eine höhere Targeting-Fähigkeit als WMNCs oder andere Aptamer-modifizierte Kontrastmittel und deutet auch darauf hin, dass der hohe Kontrastverstärkungseffekt von Apt_HER2 -MNS kann trotz einer niedrigeren Dosis als bei WMNCs erwartet werden. Die Kontrastmittelanreicherung trat hauptsächlich in den peripheren Gefäßen und im Zentrum des Tumorgewebes auf. Obwohl sich die peripheren Gefäße kurz nach der Injektion von Apt_HER2 . verdunkelten -MNS, die Kontrastmittelanreicherung im Zentrum der Tumorläsion trat erstmals nach 60 Minuten auf und stieg tendenziell bis zu 120 Minuten an.

In-vivo-MR-Bilder eines HER2+-Tumor-Mausmodells mit WMNCs (n = 3) oder Apt_HER2 -MNS (n = 3). a T2- und T2*-gewichtete MR-Bilder bei der Prä- oder Postinjektion von WMNCs. b Diagramm der relativen Signalintensität gemessen von a . c T2- und T2*-gewichtete MR-Bilder vor oder nach der Injektion von Apt_HER2 -MNS. d Diagramm der relativen Signalintensität und e das Intensitätshistogramm der Tumorregion gemessen von c . f Histologische Analysedaten nach MR-Bildgebung. Fehlerbalken wurden durch positive y . dargestellt Nur -Achse. Relative Signalintensitäten von b , d , und e wurden anhand des rot durchgezogenen ROI von a . gemessen , c , und zusätzliche Datei 1:Abbildung S4

Um die sichtbare Änderung der Kontrastverstärkungseffekte vor und nach der Injektion von Apt_HER2 . hervorzuheben -MNS wurde eine Histogrammanalyse der R2-Signalintensität in den ROIs der T2-gewichteten MRT-Bilder durchgeführt (Abb. 5e). Da das T2-Signal in T2-gewichteten MRT-Bildern als negatives Enhancement zu erkennen ist, wurde es durch R2 repräsentiert. Nach Injektion von Apt_HER2 -MNS, das Zentrum des Histogramms wurde auf die rechte Seite verschoben. Die Erhöhung der Kontrastverstärkung um etwa 10 % wurde beobachtet, als die Differenz der Histogrammmitten berechnet wurde.

Um das Vorhandensein von Apt_HER2 . zu bestätigen -MNS im Tumor histologisch wurde eine Preußisch-Blau-Färbung durchgeführt (Abb. 5f). In preußischblau gefärbtem Gewebe wurden Kern und Zytoplasma tief oder hellrosa gefärbt, und mehrere blau gefärbte Punkte wurden um Tumorzellen herum beobachtet. Wir nahmen an, dass sich das Tumorgewebe blau färbte, wenn Apt_HER2 -MNS zielte auf den Tumor ab. Bei den Ergebnissen der Preußisch-Blau-Färbung wurden die blauen Punkte in den Tumorgeweben und den Gewebeschnitten von Apt_HER2 . beobachtet -MNS hatten ungefähr dreimal so viele blaue Punkte wie WMNCs. Mit Preußisch-Blau-Färbung kann das Fe-Ion in Geweben nachgewiesen werden; Somit wurde die Akkumulation des auf IONPs basierenden Kontrastmittels im Tumorgewebe bestätigt [44, 49, 50].

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend haben wir bestätigt, dass Apt_HER2 -MNS funktioniert als in-vivo-HER2-anzielbares MRT-Kontrastmittel durch physikalisch-chemische Charakterisierung und in-vivo-MRT-Experimente in HER2-exprimierenden Maustumormodellen. Apt_HER2 -MNS hat eine hohe Relaxivität und Spezifität für HER2 und zeigte trotz einer niedrigeren Verabreichungsdosis als andere T2-Kontrastmittel aufgrund der Eisenoxid-Nanopartikel deutliche kontrastverstärkende Effekte. Dieses Kontrastmittel soll Informationen über die Expression von HER2-Krebs bei Krebspatienten liefern und könnte zur Überwachung von HER2+-Krebspatienten während einer Chemotherapie mit HER2-Zielarzneimitteln verwendet werden. Wir erwarten, dass die Ergebnisse dieser Arbeit eine vielversprechende Strategie für die Diagnose von HER2-überexprimierendem Krebs und für die Patientenbehandlung bieten.