Ultraschall-verstärkte multifunktionale Nanopartikel: Neue Plattform für Bildgebung und synergistische Therapie von metastasiertem Brustkrebs

Zusammenfassung

Die Metastasierung von Brustkrebs wirkt sich negativ auf die Prognose aus. Aufgrund der bemerkenswerten tiefen Penetration und nicht-invasiven Eigenschaften zeigt die Sonodynamische Therapie (SDT) großes Potenzial für die Krebsbehandlung. Um die Einschränkungen der Monotherapie zu überwinden, wurde eine multifunktionale Nanoplattform erforscht, um synergistische Behandlungseffizienz zu realisieren. Hier etablieren wir ein neuartiges multifunktionales Nanosystem, das Chlorin e6 (Ce6, für SDT), Perfluorpentan (PFP, für Ultraschallbildgebung) und Docetaxel (DTX, für Chemotherapie) in einer gut gestalteten PLGA-Kern-Schale-Struktur einkapselt. Die synergistischen Ce6/PFP/DTX/PLGA-Nanopartikel (CPDP NPs) zeichnen sich durch ausgezeichnete Biokompatibilität und Stabilität aus, was ihre weitere Anwendung ermöglicht. Bei Bestrahlung mit niedrigintensivem fokussiertem Ultraschall (LIFU) konnte eine verbesserte Ultraschallbildgebung sowohl in vitro als auch in vivo nachgewiesen werden. Noch wichtiger ist, dass die Nanopartikel in Kombination mit LIFU eine faszinierende Antitumor-Wirksamkeit durch Ce6-induzierte zytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sowie DTX-Freisetzung zeigen, um eine konzertierte therapeutische Effizienz zu erzeugen. Darüber hinaus aktiviert diese Behandlungsstrategie eine starke Anti-Metastasen-Fähigkeit, wodurch Lungenmetastasen signifikant reduziert werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die SDT-orientierte Nanoplattform in Kombination mit Chemotherapie als vielversprechender Ansatz zur Steigerung der effektiven synergistischen Therapie und Unterdrückung von Lungenmetastasen bei Brustkrebs dienen kann.

Einleitung

Brustkrebs bedroht Frauen seit Jahren als einer der bösartigsten Tumoren. Aufgrund der hohen Heterogenität und metastatischen Fähigkeit wird berichtet, dass die Fernmetastasierung von Brustkrebs für mehr als 90 % der Sterblichkeit verantwortlich ist, während die 5-Jahres-Überlebensrate bei fortgeschrittenen oder metastasierten Patientinnen nur 26 % beträgt, was zu einem schlechten klinischen Ergebnis führt [1-3]. Die negative Charakterisierung von Brustkrebs erschwert eine vollständige Heilung und macht die Behandlungsstrategie anspruchsvoller, sowohl den Primärtumor als auch die Fernmetastasen zu eliminieren.

Traditionelle therapeutische Ansätze wie Chirurgie und Chemotherapie gelten weiterhin als wirksam bei der Behandlung von Brustkrebs [4]. Unter allen chemotherapeutischen Medikamenten spielt Docetaxel (DTX) eine bedeutende Rolle bei der Behandlung von metastasiertem Brustkrebs (MBC) und fortgeschrittenem Brustkrebs (ABC) [5]. Als erstes Antitumor-Medikament, das aus chemischen Substanzen der Eibe synthetisiert wird, wird die antitumorale Wirkung von DTX hauptsächlich durch die Zerstörung der Mitose und Zellproliferation erreicht [6]. Aufgrund seiner umfassenden antitumorellen Wirksamkeit wird DTX zu einem der effektivsten chemotherapeutischen Mittel bei der Behandlung von Brustkrebs [7]. Allerdings induzieren Chemotherapeutika in der Regel unerwünschte Nebenwirkungen sowie Ganzkörper-Toxizität, was die therapeutische Effizienz stark einschränkt [8]. Zudem zeigen unterschiedliche klinische Stadien und verschiedene persönliche Bedingungen, dass ein einzelner therapeutischer Ansatz möglicherweise nicht effizient genug ist, um alle Erwartungen in der Brustkrebsbehandlung zu erfüllen. Daher besteht ein dringender Bedarf, die toxischen Nebenwirkungen zu begrenzen und die Behandlungseffektivität von DTX für zukünftige Anwendungen zu verbessern.

Ultraschall wurde erstmals in der klinischen Diagnostik aufgrund seiner außergewöhnlichen Vorteile wie strahlungsfrei, nicht-invasiv und kosteneffizient erforscht [9, 10]. Trotz der genannten einzigartigen Eigenschaften hat er auch viel Aufmerksamkeit in therapeutischen Aussichten auf Basis nanostrukturierter Materialien gewonnen [11]. Die Sonodynamische Therapie wurde ursprünglich durch Kavitation und den „Sonoporation-Effekt“ ausgelöst durch Ultraschall realisiert. Die Erzeugung von ROS während dieses Prozesses induziert effektiv Zytotoxizität gegenüber Krebszellen, was zu schneller DNA-Schädigung und Apoptose von Tumorzellen führt [9]. Im Gegensatz zur oberflächlichen Anwendung der Photodynamischen Therapie (PDT) erzielt SDT ein angenehmeres therapeutisches Ergebnis bei der Behandlung tiefsitzender Tumoren durch niedrigintensiven fokussierten Ultraschall (LIFU), der den Vorteil besitzt, unerwünschte thermische Schäden während der Behandlung zu verhindern [12, 13]. Als eines der Essentials in SDT wurden Sonosensibilisatoren in verschiedenen Tumortherapien erforscht [14]. Chlorin e6 (Ce6) wurde ursprünglich als gängiger Photosensibilisator eingesetzt, aber seine wünschenswerte therapeutische Fähigkeit und ausgezeichnete Affinität zu Tumorengewebe machten es auch als Sonosensibilisator einsetzbar [15]. Als zweite Generation der Chlorin-Familie hat Ce6 aufgrund seiner wünschenswerten ROS-Erzeugung große Aufmerksamkeit in der Tumorbehandlung erregt [16]. Die Einzelanwendung von Ce6 hat jedoch ständig Instabilität sowie unerwünschte Hauttoxizität hervorgerufen, was die umfangreiche SDT-Erforschung einschränkte.

In den letzten Jahren hat die Entwicklung der Nanotechnologie eine sehr wichtige Rolle in vielen Bereichen gespielt, einschließlich Biosensing, Umweltverschmutzung und Schadstoffabbau [17-23]. Nanotechnologie-basierte Nanopartikel bieten viele Vorteile, wie kleineren Durchmesser, größere äußere Oberfläche und geringeren internen Diffusionswiderstand [24]. Zuvor wurden Nanopartikel in der Anwendung verschiedener Materialien wie MOF [25], Titandioxid [26] und Graphen [21] einbezogen. Der rasant wachsende Trend der Nanotechnologie in Kombination mit Krebsbehandlung wurde ebenfalls breit erforscht und ebnete einen machbaren Weg für die Förderung einer kombinierten therapeutischen Strategie [27]. Um effektive tumortherapeutische Anwendungen zu realisieren, sind fein designte Nanopartikel primär darauf ausgerichtet, den Transport toxischer Chemotherapeutika über den Enhanced Permeability and Retention (EPR)-Effekt zu verbessern, was eine erhöhte Anreicherung am Tumorort ermöglicht [28, 29]. Zusätzlich könnte die unerwünschte Nebenwirkung durch Einkapselung der Chemotherapie verringert werden. Es wurde berichtet, dass Perfluorpentan (PFP) eine herausragende Fähigkeit besitzt, unter Bestrahlung von der flüssigen in die gasförmige Phase überzugehen, was als neuartiger Ultraschall-Molekularprobe, besonders in ultraschallbasierter Bildgebung und Behandlung, angewendet werden kann [30]. Wichtiger noch, die ursprüngliche flüssige Phase ermöglicht es PFP, leicht in verschiedene Materialien eingekapselt zu werden [31]. Außerdem kann die Einkapselung von PFP die Ultraschallbildgebungsfähigkeit am Tumorort gemäß dem oben genannten EPR-Effekt erheblich verbessern und Größenbeschränkungen vermeiden, die durch größere mikrometergroße Mikroblasen entstehen. Neben der Tumorbildgebung ist die Kombination mehrerer therapeutischer Ansätze von enormem Wert in der nanosystemorientierten Krebstherapie. Speziell legen Praktiken, einschließlich der Integration von Sonodynamischer Therapie und Chemotherapie, Wert darauf, die traditionellen therapeutischen Effizienzen zu revolutionieren. Xu et al. [32] demonstrierten, dass durch SDT ein verbessertes therapeutisches Ergebnis mit Chemotherapeutika erzielt werden konnte und somit die mitochondrial-zielgerichtete Tumorzellapoptose aktiviert wurde. Dieses Muster enthüllt die synergistische Behandlung, die in der zukünftigen Nutzung von großer Bedeutung ist.

Hierbei beabsichtigen wir, mit den oben genannten Inspirationen, die All-in-One-Nanopartikel (CPDP NPs) einzusetzen, um ein Diagnose- und Therapiesystem zu etablieren, das durch die SDT-orientierte synergistische Therapie in Kombination mit Chemotherapie sowie die verbesserte Ultraschallbildgebung realisiert wird. Aufgrund der ausgezeichneten Sicherheit und idealen metabolischen Stabilität als wünschenswerter Nanoträger hat PLGA sich als günstig für die Erforschung verschiedener antitumoreller Fähigkeiten erwiesen [33, 34]. Daher wird in dieser Strategie PLGA als Außenmaterial verwendet, wobei PFP die Ultraschallbildgebung durch seine Phasenwechsel-Fähigkeit, ausgelöst durch LIFU, signifikant verbessern kann, während Ce6, ein wünschenswerter Sonosensibilisator zweiter Generation, ebenfalls LIFU ausgesetzt werden kann, um ROS-Erzeugung zu induzieren. Zusätzlich wird, begleitet von DTX-Freisetzung, sowohl Chemotherapie als auch SDT realisiert, um letztendlich eine synergistische Therapie zu erreichen. Wichtig ist, dass die Kern-Schale-Struktur der CPDP NPs stabil verabreicht werden kann, ohne normale Gewebe oder Zellen zu schädigen, und den Nanopartikeln auch eine relativ höhere Einkapselungseffizienz ermöglicht [35]. Zudem können Inhalte in dieser Kern-Schale-Struktur gut geschützt werden [36-38], besonders PFP, das aufgrund der Struktur effektiv von flüssig in gasförmig transformiert werden kann. Mit dieser Kern-Schale-Struktur konnte die synergistische Strategie gleichzeitig auf stabilere Weise demonstriert werden. Erstens hilft die synergistische Strategie, die Nebenwirkungen von DTX durch effektive Einkapselung signifikant zu reduzieren, was von großer Bedeutung ist, um das Leiden bei der Behandlung maligner und aggressiver Tumore zu lindern; zweitens wurde die Kombination von SDT und Chemotherapie im Vergleich zur Einzelchemotherapie als vielversprechende Strategie zur Stärkung der therapeutischen Effizienz verifiziert. Drittens hat die durch PFP realisierte verbesserte Ultraschallbildgebung die Diagnosestrategie optimiert und auch geholfen, die antitumorelle Wirksamkeit zu verifizieren. Last but not least ist das gesamte System sicher und stabil mit ausgezeichneter Biokompatibilität. Es wird hervorgehoben, dass in dieser Strategie Lungenmetastasen sowie Tumorwachstum sowohl in vitro als auch in vivo bemerkenswert inhibiert wurden. Zusammenfassend zeigte die synergistische Strategie eine produktive Behandlungseffizienz gegen bösartige Brusttumore und deren Fernmetastasen und könnte, kombiniert mit ihrer Ultraschallbildgebungsfähigkeit, eine vielversprechende Behandlungsstrategie in der weiteren klinischen Anwendung werden.

Materialien und Methoden

Materialien

PLGA-COOH (Mw 12.000 Da) wurde von Jinan Daigang Biomaterial Co., Ltd (Jinan, China) bezogen. Perfluorpentan (PFP) und Agarose wurden von Sigma-Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, MO) bezogen. Chlorin e6 (Ce6) wurde von Melone Pharmaceutical Co., Ltd. (Dalian, China) gekauft. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Zytotoxizitätsassay-Kit wurde von Dojindo Molecular Technologies (Tokyo, Japan) bezogen. 2′,7′-Dichlordihydrofluorescein-diacetat (H2DCFDA) wurde von MedChemExpress Co., Ltd. (NJ, USA) gekauft. Propidiumiodid (PI) wurde von Solarbio Science and Technology Co. Ltd. (Peking, China) bezogen. Annexin V-FITC/PI wurde von BD Biosciences (USA) bezogen. Docetaxel (DTX) wurde von MedChemExpress Co., Ltd. (NJ, USA) gekauft. Alle anderen Reagenzien waren analytisch reine Produkte ohne weitere Reinigung. Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (DMEM), fetales Kälberserum und Trypsin wurden von Gibco (ThermoFisher Scientific, USA) und UV-Spektrophotometer (UV-Vis, Hitachi, Japan) bezogen.

Synthese der CPDP NPs

Ce6-PFP-DTX/PLGA-Nanopartikel (CPDP NPs) wurden nach vorherigem Bericht [39, 40] durch eine W/O/W-Doppelmulsionsmethode hergestellt. Kurz gesagt: 2 mg Ce6 wurden zunächst in 500 µl Methanol gelöst. Anschließend wurden 50 mg PLGA-COOH und Docetaxel (2 mg) in 4 ml Dichlormethan gelöst, und die vorherige Lösung wurde gleichzeitig hinzugefügt. Dann wurden 200 µl PFP zur obigen Lösung gegeben. Folglich wurde das Gemisch mit einer Ultraschallsonde (Sonics & Materials Inc., USA) behandelt, um eine erste Emulsion zu erhalten (5 s an und 5 s aus, 3 min). Um die zweite Emulsion zu erhalten, wurden 8 ml einer Poly(vinylalkohol)- (PVA-) Lösung (Gewichts/Volumen = 4 %) in die obige Emulsion gegeben, wobei dieselbe Ultraschallsonde für 2 min verwendet wurde. Nach Zugabe von 10 ml 2 % Isopropylalkohol in die finale Emulsion wurde die Lösung bei Raumtemperatur mechanisch für mindestens 4 h gemischt, um das Dichlormethan vollständig verdampfen zu lassen. Schließlich wurden die CPDP NPs dreimal zentrifugiert (12.000 U/min, 5 min) und dann gesammelt und bei 4 °C für weitere Verwendung gelagert. Die PDP NPs wurden auf die gleiche Weise hergestellt, außer dass Ce6 weggelassen wurde. Alle experimentellen Prozesse wurden über Eis durchgeführt und streng im Dunkeln durchgeführt.

Charakterisierung der CPDP NPs

Die Partikelgröße und das Zeta-Potenzial von CPDP NPs und PDP NPs wurden mit einem Malvern Zetasizer Nano-Instrument (Malvern, UK) ermittelt. Die Morphologie wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Lichtmikroskopie charakterisiert. Zur Bewertung der Stabilität wurden CPDP NPs in phosphatgepuffertem Puffer (PBS) gelöst und die Größen über 7 Tage jeweils gemessen. Jedes Sample wurde dreimal gemessen. Die Einkapselungseffizienz der CPDP NPs wurde durch folgende Formel berechnet:

Einkapselungseffizienz (%) = (Gewicht des geladenen DTX oder Ce6 / Gewicht des gesamten DTX oder Ce6) × 100 %. Zur Verifizierung der Einkapselung der verschiedenen Materialien wurden UV-Vis-Spektren verschiedener Proben untersucht (UH5300, Hitachi). Die effektive Einkapselung wurde auch durch TEM analysiert.

Medikamentenfreisetzungsrate der CPDP NPs

Um die Medikamentenfreisetzungsfähigkeit von Ce6 und DTX in CPDP NPs zu bewerten, wurden zwei Lösungen mit unterschiedlichen pH-Werten (Phosphatpufferlösung, PBS: 7,4; Acetatpufferlösung, ABS: 5,6) verwendet, um die kumulative Freisetzungseffizienz zu testen. Kurz gesagt: CPDP NPs wurden zunächst mit 1 ml PBS oder ABS dispergiert, nachdem das Gemisch in einen Dialysebeutel (Mw: 10.000) versiegelt wurde; die gesamte Lösung wurde dann in ein Glasfläschchen (Gesamtvolumen: 150 ml) überführt, in dem 149 ml PBS oder ABS hinzugefügt wurden, um das Gesamtlösungsvolumen bei 150 ml zu halten. Das Glasfläschchen wurde dann in einen 37 °C konstanten Temperaturschüttler gelegt, und zu verschiedenen Zeitpunkten (0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 h) wurde die Lösung entnommen und sofort mit dem gleichen Volumen an Medium ergänzt. Jede Gruppe wurde dreimal wiederholt. Schließlich wurden die Konzentrationen von Ce6 und DTX mit einem Synergy Hybrid Multi-Mode Reader (BioTek, USA) bei 403 bzw. 229 nm gemessen, und die Medikamentenfreisetzungsrate zu jedem Zeitpunkt wurde berechnet.

In-vitro-Ultraschallbildgebung

Zur Untersuchung der ultraschallbasierten Fähigkeit von CPDP NPs wurde die Emulsion (1 mg/ml) zunächst durch einen niedrigintensiven fokussierten Ultraschall (LIFU)-Transducer (Ronghai Ultrasonic Medical Engineering Research Center, Chongqing, China) ausgelöst, und das Leitmuster wurde als 50 % Tastverhältnis, 1 s Pulsdauer unter verschiedenen Intensitäten (1–2 W/cm²) für verschiedene Dauern eingestellt. Für die Ultraschallbildgebung wurden bestrahlte CPDP NPs in das zuvor vorbereitete Agarose-Modell gegeben, jeweils unter Verwendung des Philips EPIQ5 Ultraschall-Diagnosegeräts (Sondenfrequenz: 12 MHz, MI: 0,06), um sowohl 2D- als auch CEUS-Bildgebung der CPDP NPs zu beobachten. Gleichzeitig wurde die ImageJ-Software angewendet, um den Grauwert jeder Gruppe zu analysieren.

Zelluläre Aufnahme und In-vitro-ROS-Erzeugung der CPDP NPs durch LIFU-Bestrahlung

Die murine Brustkrebszelllinie 4T1 wurde von der Shanghai-Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) bezogen und in RPMI-1640-Medium gemischt mit 10 % FBS und 1 % Streptomycin/Penicillin bei 37 °C in einem 5 % CO₂-befeuchteten Inkubator inkubiert.

4T1-Zellen wurden zunächst unter den vorherigen Bedingungen bei einer Dichte von 1 × 10⁴ Zellen pro Schale inkubiert, um die zelluläre Aufnahme mittels CLSM in verschiedenen Zeitintervallen (1 h, 2 h, 4 h, 8 h) zu testen. Zur Verifizierung der ROS-Erzeugung wurden die Zellen in folgende 5 Gruppen unterteilt: Kontrolle, CPDP NPs, LIFU, Ce6 + LIFU, CPDP NPs + LIFU. Nach 24-stündiger konventioneller Kultur wurde das Medium durch CPDP NPs (200 µl, 0,8 mg/ml) bzw. Ce6-Lösung (200 µl) ersetzt, und die Zellen wurden für weitere 3 h koinkubiert. Dann wurde LIFU-Bestrahlung (2 W/cm², 120 s) entsprechend den verschiedenen Gruppen durchgeführt. Nach Koinkubation und LIFU-Behandlung wurden 100 µl verdünnte DCFH-DA-Lösung hinzugefügt, und jede Gruppe wurde für 15 min im vorherigen Inkubator kultiviert. Ein Konfokal-Laserscanning-Mikroskop (CLSM) wurde verwendet, um das Ergebnis der reaktiven Sauerstoffspezies-Produktion zu bestätigen, und die entsprechenden Fluoreszenzintensitäten wurden mit der ImageJ-Software gemessen.

In-vitro-Zytotoxizität und konzertierte Behandlungsfähigkeit der CPDP NPs

Ein CCK-8-Assay wurde angewendet, um die In-vitro-Zytotoxizität der CPDP NPs zu bewerten. Kurz gesagt: 4T1 murine Brustkrebszellen wurden in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 1 × 10⁴ pro Well für 24 h inkubiert. Dann wurden CPDP NPs mit serumfreiem RPMI-1640-Medium bei verschiedenen Konzentrationen (0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 mg/ml, n = 3) verdünnt, mit oder ohne LIFU-Bestrahlung (2 W/cm², 120 s). Nach weiteren 24 h Koinkubation wurde die Zelllebensfähigkeit der 4T1-Zellen durchgeführt.

Zur Bewertung der Zellapoptose-Effizienz der konzertierten Behandlung wurden 4T1-Zellen wie zuvor für 24 h koinkubiert und dann in folgende fünf Gruppen unterteilt: (1) Kontrolle (ohne Behandlung), (2) LIFU (nur LIFU-Exposition bei 2 W/cm²), (3) CPDP NPs (nur CPDP NPs-Lösung bei 0,8 mg/ml), (4) PDP NPs + LIFU und (5) CPDP NPs + LIFU. Nach verschiedener Nanopartikel-Koinkubation (200 µl) und LIFU-Exposition wurde jede Gruppe mit Annexin V (5 µl) und Propidiumiodid (5 µl) Doppelfärbung für 20 min behandelt und durch ein Fluesszytometrie-Protokoll analysiert.

In-vitro-Hemmung der Zellmetastasierung

Zur Untersuchung der Hemmung der zellulären Metastasierungsfähigkeit wurden Wundheilungsassay und Transwell-Assay entworfen. Für den Wundheilungsassay wurden 4T1-Zellen konventionell wie zuvor in der 6-Well-Platte kultiviert. Nach Zellwachstum auf 80 % Konfluenz wurde eine Pipettenspitze (10 µl) verwendet, um einen künstlichen Kratzer entlang der Mitte der 6-Well-Platte durchzuführen. Dann wurden die Zellen in den gleichen oben genannten Gruppen behandelt. Nach kontinuierlicher Koinkubation für 24 h wurden die Zellen 3-mal mit PBS gewaschen und unter Lichtmikroskopie (Olympus, Japan) beobachtet.

Für den Transwell-Assay wurde das obere Fach der Transwell-Kammer (Corning, San Diego, USA) primär verwendet, um die extrazelluläre Matrix in vivo nachzuahmen. 4T1-Zellen bei einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen pro Well wurden in serumfreiem RPMI-1640-Medium in die obere Kammer gesät, während das untere Fach mit einem vollständigen Kultivierungsmedium gemischt mit 10 % FBS gefüllt wurde. Dann wurden die Zellen wie oben in die gleichen Gruppen unterteilt und jeweils 24 h behandelt. Danach wurden die Zellen auf der unteren Oberfläche mit Paraformaldehyd fixiert und mit Kristallviolett gefärbt. Die Ergebnisse wurden mit Lichtmikroskopie (Olympus, Japan) beobachtet.

In-vivo-Ultraschallbildgebung

Gesunde weibliche BALB/c-Mäuse (4 Wochen) und Kunming-Mäuse (4 Wochen) wurden vom Ningxia Medical University Laboratory Animal Center bezogen. Alle Tierexperimente wurden unter der Richtlinie durchgeführt, die vom Tierethikkomitee der Ningxia Medical University genehmigt wurde. Um das Mäuse-Tumortragermodell zu etablieren, wurden BALB/c-Mäuse mit 4T1-Brustkrebszellen (1 × 10⁷/ml) in die rechte Flanke injiziert. Nachdem die Tumorgröße auf 60–80 mm³ angewachsen war, wurden BALB/c-Mäuse intravenös über den Schwanz mit CPDP NPs (200 µl, 1 mg/ml) injiziert. 24 h später wurden die Tumorstellen der Mäuse mit LIFU (2 W/cm², 120 s) bestrahlt, und dann wurden die 2D- und CEUS-Bildgebung durch das zuvor erwähnte Philips EPIQ5 Ultraschall-Diagnosegerät aufgenommen. Die Grauwertanalyse wurde mit der ImageJ-Software gemessen.

In-vivo-Synergistische Therapeutische Effizienz der CPDP NPs

Nach Inokulation der 4T1-Krebszellen wurde die Tumorgröße alle zwei Tage aufgezeichnet, und das Tumorvolumen wurde durch die Formel berechnet: Volumen = 1/2 × Länge × Breite². Tumorgröße und Mäusegewicht wurden alle 2 Tage aufgezeichnet, während Bilder des Tumorwachstums alle 3 Tage aufgenommen wurden. Als das Tumorvolumen 60–80 mm³ erreichte, wurden Mäuse mit ähnlicher Tumorgröße zufällig in die gleichen fünf Gruppen unterteilt: Kontrolle, LIFU, CPDP NPs, PDP + LIFU und CPDP NPs + LIFU (n = 3). Jede Gruppe wurde intravenös über den Schwanz mit verschiedenen NPs (200 µl) injiziert, außer der Kontrollgruppe (200 µl PBS stattdessen). 24 Stunden später wurde die Tumorstelle mit LIFU-Bestrahlung (2 W/cm²) für 120 s bestrahlt. Die gesamte SDT-Verabreichung wurde alle 3 Tage wiederholt und dauerte 18 Tage. Körpergewicht und Tumorvolumen der Mäuse wurden gemessen und berechnet. Nach der Behandlung wurden die Mäuse euthanasiert und Tumorgewebe für weitere histologische Analysen an H&E, TUNEL und PCNA geschickt.

Biosicherheit der CPDP NPs In Vivo

Um die Biosicherheit der CPDP-Nanopartikel in vivo zu untersuchen, wurden gesunde weibliche Kunming-Mäuse (n = 3) in folgende 4 Gruppen unterteilt: Kontrolle, 5 mg/ml, 10 mg/ml und 20 mg/ml. Die CPDP NPs (200 µl) wurden über den Mäuseschwanz injiziert; dann hatten die Mäuse freien Zugang zu Futter und Wasser ohne weitere Verabreichung. Das Körpergewicht der Mäuse wurde alle 2 Tage gemessen. Nach 30 Tagen wurden die Mäuse euthanasiert und Blutproben für Blutzell- und Biochemieanalysen entnommen. Die Hauptorgane (Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere) wurden entnommen und für H&E-Färbung jeweils untersucht.

In-vivo-Hemmung der Lungenmetastasierung

Zur Bewertung der Lungenmetastasierungshemmung jeder Gruppe wurde der gesamte Prozess durch Beobachtung der Anzahl der metastatischen Knötchen in der Lunge sowie einer H&E-Färbung-Histologie-Bewertung durchgeführt. Nach Euthanasie aller Mäuse wurden die Lungengewebe entnommen und fixiert; dann wurden Fotografien der KrebsnODULEN aufgenommen und die Lungengewebe weiter mit H&E-Färbung analysiert.

Statistische Analyse

Messdaten wurden alle 3-mal durchgeführt und als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt und durch Einfaktorielle Varianzanalyse (one-way ANOVA) oder einen Standard Student's t-Test mittels SPSS-Software (Version: 19.0) analysiert, während ein p-Wert < 0,05 als statistisch signifikant betrachtet wurde.

Ergebnisse

Charakterisierung der CPDP NPs und Medikamentenfreisetzungseffizienz

Eine Doppelmulsionsmethode wurde bei der Herstellung der CPDP NPs angewendet, die sowohl Phasenwechselmaterial PFP, Sonosensibilisator Ce6 als auch Chemotherapeutikum DTX gleichzeitig einkapselte. In PBS oder deionisiertem Wasser dispergiert, zeigte die Lösung ein hellgraues Erscheinungsbild. CPDP NPs wiesen eine homogene kugelförmige Form und eine klare Kern-Schale-Struktur auf, سواء durch Lichtmikroskopie oder Transmissionselektronenmikroskopie beobachtet (Abb. 1a, b). Die mittleren Durchmesser von CPDP NPs und PDP NPs betrugen 249,5 ± 77,46 nm bzw. 246,6 ± 81,01 nm, und die durchschnittlichen Oberflächen-Zeta-Potenziale betrugen -18,47 ± 0,55 mV bzw. -3,987 ± 0,66 mV (Abb. 1c, d). Die Größe der CPDP NPs garantierte, dass sie passiv über den EPR-Effekt in den Tumorort akkumulieren konnten [40]. Die unterschiedliche Ladung zwischen CPDP NPs und PDP NPs ist hauptsächlich auf das negativ geladene Ce6 zurückzuführen [41]. Darüber hinaus zeigte das negative Zeta-Potenzial der CPDP NPs eine geringere Plasmaproteinadsorption, was die relative Stabilität der Nanopartikel verifizierte. Die Partikelgrößenverteilungen blieben über 7 Tage in einem Bereich von 249,5 bis 385,1 nm erhalten (Abb. 1e), was die relative Stetigkeit der CPDP NPs demonstrierte. Gemäß der Standardkurve betrugen die Einkapselungseffizienzen von DTX und Ce6 83,84 ± 1,39 % bzw. 60,54 ± 3,79 %.

Wie die Medikamentenfreisetzungseffizienz von Ce6 und DTX aus CPDP NPs in Abb. 1f, g gezeigt, wurde ein fast zweifacher Anstieg des DTX-Freisetzungsindex bei pH 5,5 im Vergleich zu in pH 7,4 gelösten Nanopartikeln aufgezeichnet, was darauf hindeutete, dass eine vernünftige DTX-Freisetzungsrate effektiv in einer sauren Tumor-Mikroumgebung erreicht werden konnte. Die obigen Ergebnisse zeigten insgesamt, dass die fein designeten CPDP NPs eine stetige und zeitgerechte chemotherapeutische Medikamentenfreisetzung in der sauren Tumorumgebung ausüben können und auch grundlegend wünschenswert für die Vorbereitung auf SDT sind.

Wie das UV-Vis-Spektrum zeigte, wiesen DTX und Ce6 einzigartige Absorptionspeaks bei 229 nm bzw. 403 nm auf, während PFP/PLGA keine der Peaks zeigte. Es sei angemerkt, dass das Spektrum der CPDP NPs ähnliche Peaks in der Nähe der oben genannten beiden Wellenlängen aufwies, während der Rest die gleiche Tendenz wie das PFP/PLGA-Spektrum zeigte, was die erfolgreiche Einkapselung der verschiedenen Materialien anzeigte (Abb. 1h). Zur weiteren Verifizierung der effektiven Einkapselung zeigte Abb. 1i, dass das PFP/PLGA-Nanopartikel eine viel dünnere Schale und den runden Kern besitzt, während das CPDP-Nanopartikel eine relativ dickere Schale und den ovalen Kern aufgrund der Einkapselung sowohl von DTX als auch Ce6 offenbart.

In-vitro-Ultraschallbildgebung

Es wird hervorgehoben, dass PFP eine ausgezeichnete Phasenwechsel-Fähigkeit besitzt. Die Flüssig-Gas-Transformation hilft nicht nur, Nanopartikel im Tumorort anzureichern, sondern verleiht auch die Fähigkeit, die Effizienz der Ultraschallbildgebung zu verbessern [42]. Um dies zu demonstrieren, wurde LIFU-Bestrahlung als Auslöser angewendet, um den Phasenwechsel von PFP zu induzieren, nämlich den akustischen Tröpfchenverdampfungseffekt (ADV) [43]. Die Ergebnisse zeigten, dass die Grauwertintensitäten vor LIFU-Bestrahlung auf einem relativ niedrigen Niveau blieben, während nach Erhöhung der Intensität und Bestrahlungsdauer von LIFU die Tendenz zur verbesserten Ultraschallbildgebung sowohl in 2D als auch in CEUS offenbart wurde (Abb. 2a). Die akustische Analyse von ImageJ überzeugte das Ergebnis weiter durch erhöhte Grauwerte (Abb. 2b, c), was mit den Bildgebungsbefunden konsistent war. Es sei angemerkt, dass das signifikanteste Ergebnis von 2D und CEUS erzielt wurde, als die LIFU-Intensität 2 W/cm² erreichte und 120 s andauerte. Die obigen Ergebnisse demonstrierten, dass PFP erfolgreich in CPDP NPs eingekapselt war und die Ultraschallbildgebungsfähigkeit unter höherer Intensität sowie längerer Dauer der LIFU-Verabreichung signifikant gefördert wurde.

Zelluläre Aufnahme und In-vitro-ROS-Erzeugung der CPDP NPs durch LIFU-Bestrahlung

Wie das CLSM-Ergebnis in Abb. 3 zeigte, wies die zelluläre Aufnahme von CPDP NPs einen verstärkten Trend in verschiedenen Zeitintervallen auf und erreichte die signifikanteste Aggregation nach 8-stündiger Koinkubation.

Die Hauptstrategie der Sonodynamischen Therapie (SDT) ist die Erzeugung von ROS – eine Reihe von Ein-Elektron-Reduktionsprodukten – um Krebszellapoptose zu induzieren und Zellproliferation zu hemmen [44]. Es wird hervorgehoben, dass bei Exposition gegenüber Ultraschall der Sonosensibilisator zur ROS-Produktion neigt; gleichzeitig wird während des gesamten Prozesses eine beträchtliche Energiemenge freigesetzt [45]. Da sowohl Ultraschall als auch Sonosensibilisator unverzichtbare Elemente zur Förderung der SDT sind, wurde die intrazelluläre ROS-Erzeugung entworfen und analysiert, um die Unterschiede zwischen den unterteilten Gruppen zu untersuchen. Gemäß Abb. 4a war die Menge an ROS, die durch die freie Ce6 plus LIFU-Bestrahlungsgruppe erzeugt wurde, vernachlässigbar, was daran liegen mag, dass der schnelle Stoffwechsel von freiem Ce6 zu einer unbefriedigenden ROS-Produktion führt. Im Gegensatz dazu wurde die stärkste Fluoreszenzintensität durch die CPDP NPs + LIFU-Gruppe offenbart. Es wurde angenommen, dass das eingekapselte Ce6 gut geschützt war und somit davor bewahrt wurde, metabolisiert zu werden. Folglich wurde nach LIFU-Stimulation Ce6 freigesetzt, um reichlich ROS zu produzieren. Vergleichsweise wurden in anderen Gruppen keine signifikanten Fluoreszenzsignale gefunden (Abb. 4b).

In-vitro-Zytotoxizität und konzertierte Behandlungsfähigkeit der CPDP NPs

Der Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-Assay wurde eingeführt, um die In-vitro-Zytotoxizität der CPDP NPs zu testen. In dieser Hinsicht wurden verschiedene Gruppen mit oder ohne LIFU-Bestrahlung bei verschiedenen Konzentrationen entworfen. Die Ergebnisse zeigten, dass nach 24-stündiger Koinkubation ohne LIFU-Exposition kein offensichtlicher Effekt auf die Überlebensrate der CPDP NPs selbst bei der höchsten Konzentration (0,8 mg/ml) bestand, was die wünschenswerte Biosicherheit der CPDP NPs demonstrierte (Abb. 5a). Im Gegensatz dazu zeigte sich ein deutlicher Rückgang der Zelllebensfähigkeit nach LIFU-Bestrahlung, was zeigte, dass die Kombination von CPDP NPs und LIFU den 4T1-Zelltod bemerkenswert ausgelöst hat, was mit der In-vitro-ROS-Erzeugung konsistent war.

Zur weiteren Bewertung der SDT-Wirksamkeit wurde ein Fluesszytometrie-Assay eingeführt. Wie die Ergebnisse in Abb. 5b, c zeigen, war der Index der Zellnekrose und -apoptose in der CPDP NPs + LIFU-Gruppe am höchsten, während andere Gruppen keine offensichtlichen Nekrose- und Apoptosezeichen zeigten. Bemerkenswert war, dass die Nekrose- und Apoptoserate der CPDP NPs + LIFU-Gruppe dreimal höher war als die der CPDP-NPs-nur-Gruppe, was die signifikante Tumorszelltod-Effizienz der SDT aus einer anderen Perspektive bestätigte. Interessanterweise war im Vergleich zur PDP NPs + LIFU-Gruppe die Zellnekrose- und Apoptoserate in der CPDP NPs + LIFU-Gruppe signifikant erhöht, was die synergistische Therapieeffizienz von SDT und Chemotherapie zeigte.

In-vitro-Hemmung der Zellmetastasierung

Die invasive und migratorische Fähigkeit von Tumorzellen sind unverzichtbar für den Tumorfortschritt [46, 47]. Wie in Abb. 6a gezeigt, war der Verschluss zwischen der physischen Lücke der CPDP NPs + LIFU-Gruppe signifikant breiter als bei anderen Gruppen, was auf eine relativ langsamere Migrationsgeschwindigkeit hindeutete. Gemäß der ImageJ-Software-Analyse (Abb. 6c) war die Migrationsrate der CPDP NPs + LIFU-Gruppe im Vergleich zu anderen Gruppen ebenfalls bemerkenswert reduziert.

Ähnlich im Transwell-Assay zeigte die CPDP NPs + LIFU-Gruppe im Vergleich zur schnellen Migrationsgeschwindigkeit anderer Gruppen eine signifikante Reduktion der Zellzahl (Abb. 6b), was eine ausgezeichnete Anti-Migrationsfähigkeit der synergistischen Therapie demonstrierte. Speziell zeigte bei Abwesenheit von SDT (CPDP NPs nur und LIFU nur Gruppe) die Anzahl der Tumorzellen eine leichte Abnahme (Abb. 6d). Insgesamt wurde die Metastasierung von 4T1-Zellen aufgrund der Kombination von SDT sowie Chemotherapie in vitro bemerkenswert inhibiert.

In-vivo-Ultraschallbildgebung

Da PFP in CPDP NPs eingekapselt war, ist es auch notwendig, die charakteristische Ultraschallbildgebungsfähigkeit in vivo zu bewerten. Nach der Injektion über den Schwanz von CPDP NPs wurde LIFU dann an der Tumorstelle angewendet, um sowohl 2D- als auch CEUS-Bildgebung zu erhalten (Abb. 7a). Der klare grafische Unterschied zwischen den beiden Gruppen zeigte, dass nach LIFU-Bestrahlung die entsprechende Intensität der CPDP NPs im Vergleich zur Vor-Bestrahlungsgruppe offensichtlich erhöht war. Weitere Daten der durchschnittlichen Echointensität bestätigten dieses Ergebnis ebenfalls, was auch mit dem zuvor erwähnten In-vitro-Bildgebungsergebnis konsistent war (Abb. 7b, c).

In-vivo-Synergistische Therapeutische Effizienz der CPDP NPs

Wie aus Abb. 8a, b ersichtlich, war das Tumorvolumen der CPDP NPs + LIFU-Gruppe nach 18-tägiger Behandlung signifikant kleiner als das der anderen Gruppen, was auf die Wirksamkeit von ROS zurückzuführen sein mag, die aus der SDT-Behandlung stammen, sowie Chemotherapie, um eine gültige synergistische Therapieeffizienz auszuüben. Ebenso zeigten Fotografien von tumor-tragenden Mäusen (Abb. 8a) den gleichen Trend, was die kooperative Behandlungseffizienz der CPDP NPs, ausgelöst durch LIFU-Exposition, verifizierte. Darüber hinaus gab es keine offensichtliche Gewichtsreduktion der Mäuse zwischen den verschiedenen Gruppen (Abb. 8c). Die obigen Ergebnisse zeigten alle eine viel höhere Inhibitionsrate der CPDP NPs + LIFU-Gruppe, was enthüllte, dass die synergistische Therapie das Tumorwachstum signifikant verhindern konnte.

Um die therapeutischen Ergebnisse aller Gruppen weiter zu bezeugen, wurden sowohl H&E-, PCNA- als auch TUNEL-Färbungen genutzt (Abb. 8d). Der Proliferationsindex von PCNA in der CPDP NPs + LIFU-Gruppe betrug nur 20,50 %, was viermal niedriger war als die Kontrollgruppe, dreimal niedriger als die LIFU- und CPDP-NPs-nur-Gruppe und zweimal niedriger als die PDP + LIFU-Gruppe, was eine signifikante Anti-Tumor-Proliferationsrate demonstrierte (Abb. 8e). Wie in Abb. 8d, f gezeigt, zeigten die TUNEL-Ergebnisse, dass die CPDP NPs + LIFU-Gruppe einen offensichtlichen Apoptoseindex von 72,86 % aufwies, der viel höher war als Kontrolle (9,66 %), LIFU (12,86 %), CPDP NPs (19,59 %) und PDP NPs + LIFU (37,06 %) Gruppe. Die obigen Ergebnisse demonstrierten alle die Wirksamkeit der synergistischen Therapie, die in vivo ausgeübt wurde, was auch mit den vorherigen In-vitro-Ergebnissen konsistent bewiesen wurde.

Biosicherheit der CPDP NPs In Vivo

Trotz des effektiven therapeutischen Ergebnisses ist es von großer Bedeutung, die Biosicherheit der neu etablierten Nanopartikel zu erforschen. Im Namen der sicheren Verteilung der CPDP NPs in vivo wurde die metabolische Sicherheit durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass anstelle eines offensichtlichen Körpergewichtsverlusts das Körpergewicht der Mäuse in allen Gruppen allmählich anstieg (Abb. 9a), was auf einen vernachlässigbaren negativen Einfluss der CPDP NPs hindeutete. Zusätzlich zeigten verschiedene Organe und Blutproben in Abb. 9b keine signifikanten Veränderungen in Blutzellen, Biochemie-Analyse-Indizes und H&E-Färbung (Abb. 9c) zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen, was die ausgezeichnete Biosicherheit der CPDP NPs in vivo anzeigte.

In-vivo-Hemmung der Lungenmetastasierung

Es ist gut etabliert, dass die Lunge das Hauptzielorgan für die Fernmetastasierung von Brustkrebs ist [48]. Um die unterdrückende Effizienz der Metastasierung zu bewerten, wurden Lungengewebe von Mäusen für die Anti-Metastasen-Untersuchung genutzt. Wie aus Abb. 10a, b ersichtlich, zeigte die CPDP NPs + LIFU-Gruppe im Vergleich zu Kontrolle, LIFU, CPDP NPs und PDP + LIFU-Gruppe die bemerkenswerteste Abnahme der Lungenknötchen, was auf ihre wünschenswerte Lungenmetastasen-Hemmungseffizienz hindeutete. Ein ähnlicher abnehmender Trend wurde auch durch H&E-Färbung weiter angezeigt (Abb. 10c), was insgesamt demonstrierte, dass diese synergistische Therapiestrategie effektive Anstrengungen in der Eliminierung von Lungenmetastasen bei Mäusen ausüben konnte.

Diskussion

Es wurde allgemein anerkannt, dass die Metastasierung von Brustkrebs die schlechte Prognose umfangreich beeinflusst [3, 49]. Als wünschenswerter therapeutischer Ansatz darf SDT aufgrund seiner hohen Effizienz und tiefen Penetrationsfähigkeit umfassend überzeugt sein [11, 50]. Zweifellos gibt es seit bestimmten Einschränkungen in der Einzelanwendung von Sonosensibilisatoren, dass die alleinige Verwendung von SDT in der weiteren Krebsforschung möglicherweise noch weniger ausreichend ist. Die Entwicklung der Nanotechnologie in Kombination mit der klinischen Medizin wurde in den letzten Jahren signifikant gefördert, aufgrund der inspirierenden Vorteile wie vernachlässigbarer Toxizität, Nicht-Invasivität und ausgezeichneter Biokompatibilität. Mit diesem neuartigen Ansatz haben Forscher viele Anstrengungen unternommen, multifunktionale therapeutische Strategien zu erforschen, um die antitumorelle Effizienz zu steigern.

Die Biosicherheit hat Priorität bei Nano-Agenten. Als weithin akzeptiertes Material, das von der Food and Drug Administration (FDA) zertifiziert ist, wird hervorgehoben, dass PLGA als wünschenswerter Träger in der Anwendung fungieren kann [51, 52]. Basierend auf seinen Vorteilen etablierten wir ein Nanosystem, um multifunktionale Therapieeffizienz zu realisieren, indem wir PLGA als äußere Struktur nutzten, um Sonosensibilisator Ce6, Phasenwechselmaterial PFP und chemotherapeutisches Mittel DTX einzukapseln. Die CPDP-Nanopartikel (CPDP NPs) wurden primär durch die Kern-Schale-Struktur und angemessene Größe beobachtet, sodass eine wünschenswerte Anreicherung durch den EPR-Effekt erreicht werden konnte. Die Zelllebensfähigkeit der CPDP NPs wurde als über 80 % nach 24-stündiger Koinkubation bewiesen, was die gute Sicherheit dieser Nanoplattform anzeigt. Außerdem hat der Phasenwechsel des eingekapselten PFP auch garantiert, dass CPDP NPs als kontrastverstärkendes Mittel fungieren, wenn sie durch LIFU aktiviert werden. Die verbesserte Ultraschallbildgebungsfähigkeit wird nicht nur das ideale therapeutische Fenster sicherstellen, sondern auch die vielversprechende Zukunft für CPDP NPs fördern, um eine Integration von präziser Diagnose und präziser Behandlung zu realisieren.

Die Schlüsselstrategie in SDT ist die Erzeugung von ROS. Im Vergleich zur Einzelanwendung von Ce6 übte das in PLGA eingekapselte Ce6 einen wünschenswerten Schutz aus, was durch das ROS-Ergebnis verifiziert werden konnte. In unserer Studie wurde nur eine vernachlässigbare Menge an ROS durch die Einzelanwendung von Ce6 erzeugt, während nanopartikel-eingekapseltes Ce6 eine beträchtliche Menge an ROS produzierte, was durch die SDT-Effizienz weiter bewiesen wurde. Das Ergebnis zeigte, dass die ROS-Erzeugung durch das in CPDP NPs eingekapselte Ce6 erhalten blieb, was eine feste Grundlage für die spätere Tumoreinhibition legen konnte. Außerdem zeigte die Medikamentenfreisetzungsrate, dass sogar bei pH 5,5 wenig Ce6 aus den Nanopartikeln freigesetzt wurde, was einen guten Schutz des Sonosensibilisators durch PLGA demonstrierte, was durch die ROS-Produktion und SDT-Ergebnisse mit hoher Effizienz weiter bewiesen wurde. Interessanterweise war die Medikamentenfreisetzungseffizienz von DTX und Ce6 bei pH 5,5 laut den Ergebnissen ziemlich unterschiedlich (mehr als 40 % bzw. ca. 20 %), was möglicherweise durch die unterschiedlichen Einkapselungseffizienzen der beiden Medikamente verursacht wird. Die geringe Freisetzungsrate von Ce6 demonstrierte, dass es effektiv in PLGA geschützt werden konnte, sodass eine substantielle ROS-Erzeugung durch LIFU-Stimulation erreicht werden konnte, um eine überzeugendere SDT-Effizienz zu erhalten. Ein weiterer Grund für diesen Unterschied könnte auf die unterschiedlichen Lösungsmittel der beiden Medikamente während des Herstellungsprozesses zurückzuführen sein. Speziell wurden DTX und PLGA direkt in Dichlormethan gelöst, während Ce6 zunächst in Methanol gelöst und dann tropfenweise zu Dichlormethan hinzugefügt werden musste, aufgrund seiner schlechten Löslichkeit in Letzterem [53]. Da die Medikamentenfreisetzung in Nanopartikeln direkt mit der Effektivität der nachfolgenden Kombinationstherapie zusammenhängt, haben die Bewertung der Medikamentenfreisetzungsrate sowie das ROS-Erzeugungsergebnis diesen Punkt gegenseitig bewiesen. Aktuelle Forschungen haben nahegelegt, dass die alleinige Verwendung von Chemotherapie den Tumorfortschritt möglicherweise nicht signifikant umkehren kann [41]. In dieser Studie zeigte die von uns designte Nanoplattform starke Beweise dafür, dass die synergistische Behandlung im Vergleich zur Einzelanwendung von Chemotherapie die therapeutische Effizienz sowohl in vitro als auch in vivo bemerkenswert erhöht hat. Da die LIFU-Stimulation die therapeutische Strategie optimierte, wurde eine erhöhte Zellapoptoserate bemerkenswert erhöht. Es ist erwähnenswert, dass aufgrund dieser synergistischen Strategie die Lungenmetastasierung sowohl auf Tumorzellebene als auch im inokulierten Mäusemodell signifikant inhibiert werden konnte, was mit früheren Berichten konsistent ist [16, 52].

Fazit

Zusammenfassend konnten die von uns designeten und hergestellten sicheren und stabilen CPDP NPs plus LIFU-Bestrahlung Brusttumorfortschritt und dessen Lungenmetastasierung bemerkenswert eliminieren. Mit einer verbesserten Bildgebungsfähigkeit wurde diese Nanoplattform auch als vielversprechender kontrastverstärkender Agent in der Klinik betrachtet. Daher könnte die neuartige synergistische Strategie in Kombination mit LIFU als effektive Behandlungsanwendung betrachtet werden, um das schlechte Ergebnis von metastasiertem Brustkrebs umzukehren.

Abkürzungen

LIFU:

Niedrigintensiver fokussierter Ultraschall

SDT:

Sonodynamische Therapie

PFP:

Perfluorpentan

EPR:

Enhanced Permeability and Retention Effekt

DCFH-DA:

Dichlordihydrofluorescein-diacetat

PI:

Propidiumiodid

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

Ce6:

Chlorin e6

DTX:

Docetaxel

FBS:

Fetales Kälberserum

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CPDP NPs:

Ce6/PFP/DTX/PLGA-Nanopartikel

PDP NPs:

PFP/DTX/PLGA-Nanopartikel