HER2-zielgerichteter magnetischer Nanosensitizer verbessert In-vivo-MRT bei HER2-positiven Krebserkrankungen

Zusammenfassung

Ziel dieser Studie war die Entwicklung eines humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor-2 (HER2)-zielgerichteten Kontrastmittels für Magnetresonanztomographie (MRT) mit hoher magnetischer Sensitivität. Ein anti-HER2-Aptamer-modifizierter magnetischer Nanosensitizer (Apt_HER2-MNS) wurde durch Konjugation von 5'-thiol-modifizierten Aptameren und maleimidfunktionalisierten magnetischen Nanokristallen (MNCs) hergestellt. Die physikochemischen Eigenschaften und Targeting-Fähigkeit von Apt_HER2-MNS wurden bestätigt, und die Bindungsaffinität (K_d) an HER2-Protein betrug 0,57 ± 0,26 nM. Die In-vivo-MRT-Kontrastverstärkung wurde an HER2-positiven Krebszellen (NIH3T6.7)-Xenograft-Mausmodellen (n = 3) an einem 3T-klinischen MRT-Gerät verifiziert. Das Kontrollexperiment verwendete nicht-markierte MNCs. Die Ergebnisse zeigten, dass nach Injektion von Apt_HER2-MNS bei Mäusen mit NIH3T6.7-Zellen eine Kontrastverstärkung von bis zu 150 % im Tumorbereich in T2-gewichteten MRT-Bildern erreicht wurde.

Hintergrund

Der humane epidermale Wachstumsfaktorrezeptor 2 (HER2), der zur EGFR-Familie gehört, spielt eine Schlüsselrolle in menschlichen Malignomen und ist in etwa 30 % der menschlichen Brustkrebse überexprimiert [1] sowie in vielen anderen Krebsarten, einschließlich Magen-, Blasen-, Ovarial- und Lungenkarzinomen [1,2,3,4]. Patienten mit HER2-überexprimierendem Brustkrebs haben deutlich niedrigere Überlebensraten als Patienten mit nicht-überexprimierenden HER2-Krebsen [5]. Zusätzlich führt HER2-Überexpression zu erhöhter Brustkrebsmetastasierung [6,7,8]. Aus diesem Grund dient HER2 als wichtiger Biomarker in der Krebsdiagnostik. Klinisch wird HER2 zusammen mit Östrogenrezeptor (ER) und Progesteronrezeptor (PR) als biologischer Marker zur Diagnose von Brustkrebs verwendet. Patienten erhalten eine definitive Diagnose nach histologischer Verifikation von HER2-, ER- und PR-Expressionsniveaus. Histologische Verifikation ist jedoch invasiv und wird nur an einer begrenzten Anzahl von Läsionen durchgeführt. Daher wurde geforscht, diagnostische Marker nicht-invasiv über radiologische Untersuchungen vor histologischer Verifikation sichtbar zu machen, basierend auf Computertomographie [9, 10], Positronenemissionstomographie [11,12,13], Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie [14,15,16], Magnetresonanztomographie (MRT) [17,18,19,20] und multimodalen Bildgebungsverfahren [21,22,23].

Eisenoxid-Nanopartikel (IONPs) werden in verschiedenen nicht-invasiven radiologischen Untersuchungen zur Beobachtung klinisch relevanter Biomarker eingesetzt [24, 25]. IONPs sind mit molekularer Bildgebung kompatibel, da sie eine höhere magnetische Sensitivität oder Biokompatibilität als andere Schwermetall-basierte MRT-Kontrastmittel wie Gadolinium-basierte Kontrastmittel (GBCAs) oder Nickel- oder Kobalt-haltige Kontrastmittel aufweisen. Insbesondere sind kommerzialisierte MRT-Kontrastmittel und GBCAs mit Problemen bezüglich In-vivo-Toxizität durch Freisetzung von Gd³⁺-Ionen assoziiert, während IONP-basierte MRT-Kontrastmittel eine höhere In-vivo-Sicherheit als GBCAs aufweisen, da sie zu Eisen abgebaut, absorbiert oder eliminiert werden können [26, 27].

Um IONPs für molekulare Bildgebung anzuwenden, sind Targeting-Moieties extrem wichtig und können Chemikalien, Kohlenhydrate, Proteine, Antikörper oder Aptamere sein [25, 28, 29]. Unter diesen Molekülen haben Aptamere eine stabile dreidimensionale Struktur einer Einzelstrang-Nukleinsäure, die hohe Bindungsaffinität und Spezifität für spezifische Moleküle aufweist. Die hohe Bindungsaffinität von Aptameren wird durch ihre Entwicklungstechnik und systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) verursacht [30]. SELEX verwendet sehr große Bibliotheken zufälliger Sequenz-Oligonukleotide (~10¹⁵), die durch chemische Synthese bereitgestellt und parallel gescreent werden können, um Aptamere mit hoher Bindungsaffinität zum Zielmolekül zu finden. Als Ergebnis von SELEX können Aptamere mit hoher Bindungsaffinität im Pikomolar-Konzentrationsbereich entwickelt werden, während die anderer Biomoleküle im Mikromol- bis Subnanomol-Bereich liegt [31, 32]. Bei den kürzlich entwickelten Aptameren dritter Generation weisen sie auch In-vitro- und In-vivo-Stabilität aufgrund ihrer verbesserten Resistenz gegen DNase oder RNase durch Verwendung modifizierter Nukleinsäuren auf [33, 34]. Aus diesen Gründen etablieren sich Aptamere als bevorzugte Moieties in der molekularen Bildgebungsforschung [35].

Ziel dieser Studie war die Entwicklung eines Aptamer-modifizierten T2-Kontrastmittels basierend auf magnetischen Nanokristallen (MNCs) mit hoher Spezifität für Krebszellen, die HER2 überexprimieren. Um dies zu erreichen, wurden MNCs mit hoher magnetischer Sensitivität durch eine thermische Zersetzungsmethode hergestellt und ein HER2-spezifischer Aptamer (K_d = 0,42 nM) verwendet. Die synthetisierten Kontrastmittel wurden durch Analyse von Morphologie, Magnetisierungseigenschaft und magnetischer Relaxivität charakterisiert. Ebenso führten wir In-vitro- und In-vivo-Targeting-Assays gegen HER2-Proteine in einem Tumor-Xenograft-Tiermodell durch, implantiert mit einer HER2-exprimierenden Krebszelllinie.

Methoden

Materialien

TWEEN® 80 (T80), 4-(Dimethylamino)pyridin, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, Triethylamin, Dichlormethan wasserfrei, Eisen(III)-acetylacetonat, 1,2-Hexadecandiol, Dodecansäure, Dodecylamin und Benzylether wurden von Sigma-Aldrich (USA) bezogen, und 3-Maleimidpropionsäure (MPA) von TCI America (USA). RPMI-1640, Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, fötales Kälberserum und Gibco® Antibiotikum-Antimykotikum-Lösung wurden von Life Technologies (USA) gekauft. NIH3T6.7 wurde von American Tissue Type Culture (USA) bezogen. Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltes Wasser wurde von Biosesang Inc. (Korea) gekauft. Der thiolierte anti-HER2-Aptamer [Apt_HER2, Sequenz: 5'-6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A-3' (6: NapdU), 5'-SH-Modifikation, 40-mer] wurde von Aptamer Science Inc. (Korea) gekauft.

Synthese der MNCs

Monodisperse magnetische Eisenoxid-Nanopartikel wurden mittels Suns thermischer Zersetzungsmethode [36] synthetisiert. Diese magnetischen Nanopartikel werden aufgrund ihrer Eisen(III)-acetylacetonat- und Ölsäure-Vorläufer MNCs genannt. Kurz gesagt, ein Gemisch aus Eisen(III)-acetylacetonat (2 mmol), Ölsäure (6 mmol), 1-Octadecen (6 mmol), 1,2-Hexadecandiol (10 mmol) und Benzylether (20 ml) wurde in einen dreihalsigen Rundkolben gegeben und mechanisch gerührt. Um Rest-Sauerstoff und Wasser zu entfernen, wurde das Gemisch 30 Minuten auf 100 °C vorgeheizt. Das vorgeheizte Gemisch wurde dann 2 Stunden auf 200 °C erhitzt und 30 Minuten bei 300 °C unter Stickstofffluss refluxiert. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur durch Entfernen der Wärmequelle wurden die Reaktanten mit überschüssigem Ethanol gereinigt. Zentrifugation wurde dreimal durchgeführt, um das Produkt von un dispergierten Rückständen zu trennen. Die Fe₃O₄-Nanopartikel-Produkte wurden dann in 5 ml Hexan redispergiert. Das Endprodukt wurde durch Wiederholung des obigen Verfahrens mit 100 mg Fe₃O₄ und seinen Vorläufern synthetisiert. Die MNC-Morphologien wurden mit einem Hochauflösungs-Transmissionselektronenmikroskop (HR-TEM, JEM-2100, JEOL Ltd., Japan) evaluiert. Die Sättigungsmagnetisierung wurde mit einem Vibrationsprobenmagnetometer (VSM, MODEL-7300, Lakeshore, USA) bei Raumtemperatur bewertet. Die Menge der MNCs im Produkt wurde durch Gewichtsmessung mit einem Thermogravimetrie-Analysator (SDT-Q600, TA Instrument) analysiert, und die MNCs wurden gewaschen, bis der Fe₃O₄-Gehalt etwa 80 % erreichte.

Synthese von Maleimidyl-TWEEN® 80

Zur Herstellung von Maleimidyl-T80 (Tm80) wurden 15,3 mmol MPA und 22,9 mmol N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid jeweils in 10 ml Dichlormethan gelöst und anschließend gemischt. Das Gemisch wurde dann zu 20 ml Dichlormethan gegeben, das 7,6 mmol T80 enthielt, gefolgt von der Zugabe von 3,2 ml Triethylamin. Schließlich wurden 22,9 mmol 4-(Dimethylamino)pyridin in 10 ml Dichlormethan gelöst, und alle Reagenzien wurden in einem 70-ml-Fläschchen gemischt. Das endgültige Gemisch wurde 48 Stunden mit einem Magnetrührer gerührt. Die Farbe änderte sich von apricot zu rotwein. Nach 48 Stunden Reaktion wurde der kristallisierte Harnstoff durch Filtration entfernt. Um Dichlormethan zu eliminieren, wurde die Reaktion durch Verdampfung in einem Rotationsverdampfer (N-1100, EYELA, Japan) gefiltert. Das resultierende Produkt wurde in deionisiertem Wasser suspendiert, und nicht konjugierte Reagenzien wurden durch Dialyse (Spectra/Por®, 1 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., USA) entfernt. Das Endprodukt wurde durch Gefriertrocknung hergestellt. Das synthetisierte Tm80 wurde durch Vergleich mit MPA und T80 mittels UV-Vis-Spektrometer (UV-1800, Shimadzu, Japan), Fourier-Transform-Infrarot (FT-IR)-Spektrometer (PerkinElmer, spectrum two) und ¹H-Kernresonanz (NMR)-Spektrometer (Bruker Biospin, Advance II, siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S1) bestätigt.

Herstellung von Maleimidyl-MNCs

Wasserdispergierbare maleimidyl-MNCs (mWMNCs) wurden mittels Nanoemulsionsmethode [37] hergestellt. Kurz gesagt, 100 mg Tm80 wurden vollständig in 20 ml deionisiertem Wasser gelöst, und 4 ml n-Hexan mit 20 mg MNCs wurden schnell in das Tm80-gelöste Wasser unter Ultraschall (190 W) und Rühren (1200 rpm) injiziert. Der Emulsionsprozess dauerte 10 Minuten in einem eisgekühlten Bad. Das verbleibende organische Lösungsmittel wurde 12 Stunden bei Raumtemperatur verdampft, und die Produkte wurden durch Dialyse (Spectra/Por®, 3,5 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., USA) gereinigt, um überschüssiges Tensid für 3 Tage zu entfernen. Die mWMNCs wurden dann mittels Zentrifugalfilter (NMWL 3000, Amicon® Ultra, Merk Milipore Ltd., Deutschland) auf 1,25 mg_Fe/ml in DEPC-behandeltem Wasser konzentriert. T80-ummantelte MNCs (WMNCs) wurden ebenfalls mit derselben Methode hergestellt.

Herstellung von Apt_HER2-MNS

Vor der Konjugation zwischen mWMNCs und anti-HER2-Aptameren wurde der Reduktionsschritt thiol-modifizierter Aptamere durchgeführt. Kurz gesagt, 1 nmol Aptamer wurde in 0,3 ml deionisiertem Wasser gelöst, und Triethylaminacetat und 1,4-Dithiothreitol-Lösung wurden zugegeben, sodass die Endkonzentrationen 50 und 25 mM betrugen. Dieses Gemisch wurde 1,5 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und durch Ethanol-Fällung gereinigt und desalziert. Zur Herstellung von Apt_HER2-MNS, der HER2-spezifischen MRT-Sonde, wurde das Molekulargewicht der MNCs theoretisch berechnet (siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S2) und das Mischverhältnis von mWMNCs und Aptamer auf 1:7 festgelegt. Daher wurden 100 µg (Fe) mWMNCs (als Fe₃O₄, 45 pmol) in PBS (1 ml) gelöst und 5 µg (0,35 nmol) Aptamer zugegeben. Das Gemisch wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und 2 Stunden bei 4 °C inkubiert. Die Verteilung des hydrodynamischen Durchmessers von Apt_HER2-MNS wurde dann mit einem dynamischen Lichtstreuungsanalysator (ELS-Z, Otsuka Electronics, Japan) analysiert. Um die Fähigkeit von Apt_HER2-MNS als MRT-Kontrastmittel zu bestätigen, wurde T2-Relaxivität (R2) mit einem 1,5 T klinischen MRT-Gerät mit einer Micro-47-Oberflächenspule (Intera, Philips Medical System, Niederlande) an verschiedenen konzentrierten Phantomen von Apt_HER2-MNS durchgeführt. Die R2 von Apt_HER2-MNS wurde mit der Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)-Sequenz bei Raumtemperatur gemessen: TR = 10 s, 32 Echos mit 12 ms geradem Echoraum, Anzahl der Akquisitionen = 1, Punktauflösung = 156 µm × 156 µm, und Schichtdicke = 0,6 mm. R2 wurde als 1/T2 mit s⁻¹-Einheiten definiert.

Apt_HER2-MNS Bindungsaffinitäts-Assay

Zur Validierung der HER2-Spezifität von Apt_HER2-MNS wurde die Nitrozellulosefilter-Bindemethode verwendet [38]. Der nackte Apt_HER2 und Apt_HER2-MNS wurden mit alkalischer Phosphatase (New England Biolabs, MA, USA) dephosphoryliert. Das 5'- oder 3'-Ende der Aptamere wurde mit T4-Polynukleotidkinase und [³²P]-ATP (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA) markiert [39]. Die Bindungsassays wurden durchgeführt, indem die ³²P-markierten Aptamere bei einer Konzentration von 10 pM mit HER2-Protein bei Konzentrationen von 100 bis 10 pM in Selektionspuffer (20 mM Tris·HCl, pH 7,5 bei 4 °C, 6 mM NaCl, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM Na₃EDTA, 10 % v/v Glycerol) bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert wurden. Das Gemisch der ³²P-markierten Aptamere und des HER2-Proteins wurde durch eine G-50-Säule (GE Healthcare Life Science, UK) gefiltert, um freie Radioisotope zu entfernen. Die gefilterten Gemische wurden auf wiederverwendbarem Film entwickelt, und die Anteile der HER2-Protein-gebundenen Aptamere wurden mit einem Phosphorimager (Fuji FLA-5100 Image Analyzer, Tokyo, Japan) quantifiziert. Um den Effekt der unspezifischen Hintergrundbindung des radioaktiv markierten Aptamers an den Nitrozellulosefilter zu eliminieren, wurden die Rohbindungsdaten korrigiert, indem das Experiment nur mit ³²P-markierten Aptameren durchgeführt wurde.

In-vivo MRT

Alle Tierversuche wurden unter der Genehmigung der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International durchgeführt. Die In-vivo-MRT-Scans wurden an einem syngenen Maus-Tumormodell durchgeführt, das durch Implantation von NIH3T6.7-Zellen (1,0 × 10⁷ Zellen) in die Oberschenkel 5-wöchiger weiblicher BALB/c-Nacktmäuse erzeugt wurde. Nach 2 Wochen wurde die Tumorgröße per MRT evaluiert. Als die Tumorgröße etwa 500 mm³ erreichte, wurden 100 µg (5 mg/kg) Apt_HER2-MNS in die Schwanzvene injiziert. In-vivo-MRT-Experimente wurden mit einem 3,0 T klinischen MRT-Gerät und einer 8-Kanal-menschlichen Handgelenkspule durchgeführt. Für T2-gewichtete MRT bei 3,0 T wurden folgende Parameter verwendet: TR/TE = 1054/70 ms, Anzahl der Akquisitionen = 2, Punktauflösung = 400 × 319 mm, Schichtdicke = 1 mm, TSE-Faktor = 8. Die Kontrollexperimente wurden mit WMNCs nach derselben Methode durchgeführt. Alle T2-Signalintensitäten wurden durch Durchschnitt von etwa fünf Regions of Interest (ROIs), die auf den T2-gewichteten MRT-Bildern jedes Mausmodells (n = 3) gezeichnet wurden, berechnet, und der R2- (oder R2*)-Wert, der Kehrwert von T2, wurde in der Signalintensitätsanalyse verwendet. Die zeitlichen Änderungen der relativen Signalintensität wurden durch die initiale Signalintensität (vor Injektion) normiert. Eine Histogrammanalyse wurde ebenfalls an der R2-Signalintensität der Voxel im ROI durchgeführt.

Histologische Analyse

Preußisch-blau-Färbung, die zum Nachweis von Fe-Ionen in Tumorgewebe verwendet werden kann, wurde durchgeführt, um das Targeting von HER2-exprimierendem Krebs durch Apt_HER2-MNS nach Entnahme des Tumorgewebes von jedem Tumormodell nach der In-vivo-MRT zu bestätigen. Die entnommenen Tumorgewebe wurden 24 Stunden in 10 % Formalinlösung fixiert und nach Dehydrierung in steigenden Ethanolkonzentrationen und Klärung in Histo-Clear® (National Diagnotics, USA) in Paraffin eingebettet. Preußisch-blau-Färbung wurde durchgeführt, indem die Gewebeschnitte (Dicke = 5 µm) auf Glasscheiben aufgebracht, mit Histo-Clear® und konzentrierten Ethanolen entparaffiniert und hydratisiert wurden. Anschließend wurden die Scheiben 1 Stunde in die Preußisch-blau-Arbeitslösung (10 % Kaliumferrocyanid und 20 % Salzsäurelösung = 1:1) gelegt. Die Kerne wurden mit Nuclear Fast Red-Färbung (Sigma Aldrich, USA) gefärbt. Nach dreimaligem Waschen der Gewebeproben für 30 Minuten gaben wir 2–3 Tropfen der Eindecklösung auf die Scheiben und deckten sie mit Deckgläsern ab. Die gefärbten Gewebeschnitte wurden mit einem Olympus BX51 und Olyvia-Software (Olympus, Japan) beobachtet.

Ergebnisse und Diskussion

Apt_HER2-MNS wurde als Einzelmolekül-Targeting-Agent basierend auf IONPs für die molekulare Bildgebung HER2-exprimierender Tumoren mittels MRT entwickelt. Daher benötigte Apt_HER2-MNS eine hohe Spezifität für das Zielmolekül und eine große magnetische Suszeptibilität. Um hohe magnetische Sensitivität zu erhalten, wurden zunächst die MNCs, monodisperse Fe₃O₄-Nanopartikel, mittels thermischer Zersetzung und Keimwachstumsmethode [36] synthetisiert. Das experimentelle Verfahren der Herstellung und In-vivo-Anwendung von Apt_HER2-MNS ist in Abb. 1 beschrieben. Zunächst wurden Größe und Form der MNCs durch HR-TEM bestätigt (Abb. 2a, b). In Abb. 2c wurde die durchschnittliche Größe der MNCs durch zufällige Auswahl von 130 MNCs aus dem TEM-Bild gemessen, und eine sehr enge Größenverteilung (10,49 ± 1,74 nm) und kugelförmige Form wurden beobachtet. Die superparamagnetische Eigenschaft der MNCs wurde ebenfalls durch VSM evaluiert, was einen MNC-Sättigungsmagnetisierungswert von 98,8 emu/g_Fe ergab (Abb. 2d). Der T2-Kontrastmittel, der derzeit durch intravenöse Injektion verfügbar ist, basierte auf superparamagnetischen Eisenoxiden (SPIO) oder ultrasmall superparamagnetischen Eisenoxiden (USPIO) [40]. SPIO oder USPIO haben ebenfalls superparamagnetische Eigenschaften, aber sie haben einen Sättigungsmagnetisierungswert unter 70 emu/g_Fe [40,41,42,43]. Die superparamagnetische Eigenschaft ist notwendig für die Verwendung von IONPs als intravenöses Kontrastmittel, da sie bewirkt, dass IONPs nur im Magnetfeld magnetische Eigenschaften haben und verhindert, dass IONPs aggregieren. Darüber hinaus könnte der höhere Sättigungsmagnetisierungswert der MNCs hilfreich sein, die Injektionsdosis im Vergleich zu SPIO- oder USPIO-basierten Kontrastmitteln zu reduzieren.

Um MNCs für In-vivo-Experimente zu verwenden, wurden WMNCs und mWMNCs durch eine Nanoemulsionsmethode mit T80 bzw. Tm80 hergestellt. Die physikochemischen Eigenschaften von hergestelltem Tm80 und seinen Vorläufern MPA und T80 wurden durch Absorbanz, FT-IR, ¹H-NMR-Spektralanalyse bestätigt (siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S1). Wie zuvor veröffentlicht [44], sind mWMNCs, hergestellt durch die Nanoemulsionsmethode mit Tm80, stabil in Wasser dispergiert. Darüber hinaus können die Maleimidyl-Gruppen der mWMNCs leicht mit einem Molekül konjugiert werden, das neutrale pH-Thiolgruppen hat, und diese Konjugation erzeugt keine Nebenprodukte. Zudem wurde NapdU-modifizierter Aptamer verwendet, um die In-vivo-Halbwertszeit zu erhöhen, und seine Halbwertszeit betrug 151 h in humanem Serum (siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S3). Apt_HER2-MNS wurde durch Konjugation zwischen mWMNCs und Apt_HER2-SH hergestellt, und die hydrodynamischen Eigenschaften von Apt_HER2-MNS wurden mittels dynamischer Lichtstreuung und MR-Relaxivitätsanalyse evaluiert (Abb. 3). Die Durchmesser von WMNCs und Apt_HER2-MNS betrugen 28,8 ± 7,2 und 34,1 ± 8,2 nm (Abb. 3a). Da Apt_HER2 aus 40-mer Oligonukleotiden bestand und etwa 5–10 nm lang war, könnte das Vorhandensein von Apt_HER2 den Unterschied im hydrodynamischen Durchmesser verursachen. Die Relaxivität von WMNCs und Apt_HER2-MNS betrug 265,7 und 257,2 mM⁻¹_Fe s⁻¹ (Abb. 3b), was evaluiert wurde, um ihre magnetische Sensitivität als MRT-Kontrastmittel zu bestätigen. Im Fall von T2-Kontrastmitteln basierend auf SPIO oder USPIO, die FDA-zugelassen sind, wurden sie fast durch die Co-Precipitationsmethode synthetisiert. Aus diesem Grund war ihre Kristallinität verringert, was eine niedrige Relaxivität (unter 190 mM⁻¹_Fe s⁻¹) im Magnetfeld verursachte [40]. Durch Verwendung von MNCs in dieser Studie hatte Apt_HER2-MNS eine 35–500 %-erhöhte magnetische Relaxivität als SPIO- oder USPIO-basierte T2-Kontrastmittel.

Die Bindungsaffinität von Apt_HER2-MNS für HER2-Protein wurde mittels Filterbindungsassay evaluiert (Abb. 4a), und die resultierenden K_d-Werte von Apt_HER2-SH und Apt_HER2-MNS wurden als 26,88 ± 8,24 und 0,57 ± 0,26 nM gemessen (Abb. 4b, c). Apt_HER2-OH hat eine sehr hohe Spezifität für HER2-Proteine mit einem K_d-Wert von 0,42 ± 0,05 nM, und diese Bindungsaffinität ist etwa 10-fach höher als 5 nM von Herceptin® [45]. Allerdings kann die Bindungsaffinität des nackten Apt_HER2 durch Konjugation mit Chemikalien, Molekülen oder Nanopartikeln verändert werden. Daher sollte die Bindungsaffinität von Apt_HER2 für HER2-Proteine nach Konjugation mit mWMNCs evaluiert werden. Die Bindungsaffinität von Apt_HER2-SH für HER2 wurde durch das Vorhandensein einer Thiolgruppe verringert, nicht durch den nackten Apt_HER2, weil Thiolgruppen an andere Thiolreste in Proteinen oder anderen thiol-modifizierten Aptameren binden können. Die Bindungsaffinität von Apt_HER2-MNS wurde jedoch als ähnlich wie die von Apt_HER2 gemessen, was bedeutet, dass weder genügend ungebundenes Apt_HER2-SH vorhanden ist, das die Interaktion zwischen Aptamer und HER2-Protein stören könnte, noch mWMNCs keinen oder sehr geringen Einfluss auf die Bindungsaffinität der Aptamere haben.

In-vivo-MRT-Experimente wurden an syngenen Maus-Tumormodellen durchgeführt, um die Fähigkeit von Apt_HER2-MNS zu evaluieren, HER2-überexprimierende Tumoren zu targeten. Mit einem Tumormodell, das durch Implantation von NIH3T6.7-Zellen in den Oberschenkel erzeugt wurde, wurde ein MRT-Experiment von vor der Injektion bis 120 Minuten nach Injektion von WMNCs oder Apt_HER2-MNS durchgeführt (Abb. 5, siehe auch Zusatzdatei 1: Abbildung S4). Der T2-Kontrastverstärkungseffekt durch IONP-basierte Kontrastmittel wird als Verdunkelung des Bildes beobachtet, da sie einen T2-Verkürzungseffekt der umgebenden Protonen induzieren. Daher wurden in den Signalintensitätsanalysen T2- oder T2*-Werte durch R2 oder R2* dargestellt. R2, der Kehrwert von T2, wird verwendet, um die Signalintensität mit positivem Wert zu vergleichen. Im Fall von WMNCs wurde die höchste R2-Signalintensität 30 Minuten nach Injektion von WMNCs beobachtet, woraufhin sie allmählich abnahm (Abb. 5a, b). 120 Minuten nach Injektion von WMNCs ähnelte die T2-Signalintensität dem Vor-Injektionszustand. Die Änderungsrate des durchschnittlichen R2-Signalintensitätswertes betrug weniger als 10 %; somit war es schwer, dies im T2-gewichteten MRT mit bloßem Auge zu erkennen. In einer früheren Studie wurde demonstriert, dass T80-ummantelte Eisenoxid-Nanopartikel sich trotz Fehlen von Targeting-Moieties um Tumorgewebe anreicherten [46]. In jener Studie wurde jedoch eine Kontrastmitteldosis von 1,4 mg_Fe pro Maus im T2-gewichteten MRT verwendet, was 14-fach höher war als die in dieser Studie verwendete Dosis. Dies bedeutet, dass WMNCs bei einer Dosis von 0,1 mg_Fe pro Maus (5 mg_Fe/kg) keine effektive Kontrastverstärkung zeigen konnten. Die zeitliche Änderung der R2*-Signalintensität betrug ebenfalls weniger als 10 %, und es gab keine statistische Signifikanz. Im Gegensatz dazu verursachte Apt_HER2-MNS 120 Minuten nach Injektion eine 130 % höhere Signalintensitätsverstärkung als vor der Injektion, obwohl dieselbe Injektionsdosis wie bei WMNCs verwendet wurde (Abb. 5c, d). Diese Injektionsdosis war 2- bis 30-fach niedriger als in anderen Studien zu aptamer-modifizierten magnetischen Nanopartikel-basierten Kontrastmitteln [44, 47, 48]. Dieses Ergebnis zeigte, dass Apt_HER2-MNS eine höhere Targeting-Fähigkeit hat als entweder WMNCs oder andere aptamer-modifizierte Kontrastmittel, und legte auch nahe, dass der hohe Kontrastverstärkungseffekt von Apt_HER2-MNS trotz niedrigerer Dosis als WMNCs erwartet werden könnte. Die Kontrastverstärkung erschien hauptsächlich in peripheren Gefäßen und im Zentrum des Tumorgewebes. Obwohl die peripheren Gefäße kurz nach Injektion von Apt_HER2-MNS verdunkelt wurden, erschien die Kontrastverstärkung im Zentrum der Tumorläsion erstmals nach 60 Minuten und tendierte bis 120 Minuten zu steigen.

Um die sichtbare Änderung der Kontrastverstärkungseffekte vor und nach Injektion von Apt_HER2-MNS zu betonen, wurde eine Histogrammanalyse der R2-Signalintensität in den ROIs an den T2-gewichteten MRT-Bildern durchgeführt (Abb. 5e). Da das T2-Signal als negative Verstärkung in T2-gewichteten MRT-Bildern erscheint, wurde es durch R2 dargestellt. Nach Injektion von Apt_HER2-MNS verschob sich das Zentrum des Histogramms nach rechts. Eine etwa 10 % Erhöhung der Kontrastverstärkung wurde beobachtet, als der Unterschied der Histogrammzentren berechnet wurde.

Um das Vorhandensein von Apt_HER2-MNS im Tumor histologisch zu bestätigen, wurde Preußisch-blau-Färbung durchgeführt (Abb. 5f). In preußisch-blau gefärbtem Gewebe wurden Kern und Zytoplasma als tiefes oder helles Rosa gefärbt, und mehrere blau gefärbte Punkte wurden um Tumorzellen beobachtet. Wir gingen davon aus, dass Tumorgewebe blau gefärbt würden, wenn Apt_HER2-MNS den Tumor targetierten. In den Ergebnissen der Preußisch-blau-Färbung wurden blaue Punkte in den Tumorgeweben beobachtet, und die Gewebescheiben von Apt_HER2-MNS hatten etwa 3-fach so viele blaue Punkte wie die von WMNCs. Preußisch-blau-Färbung kann Fe-Ionen in Geweben nachweisen; somit wurde sie verwendet, um die Anreicherung des auf IONPs basierenden Kontrastmittels in Tumorgeweben zu bestätigen [44, 49, 50].

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend bestätigten wir, dass Apt_HER2-MNS als In-vivo HER2-zielgerichtetes MRT-Kontrastmittel durch physikochemische Charakterisierung und In-vivo-MRT-Experimente in HER2-exprimierenden Maus-Tumormodellen funktioniert. Apt_HER2-MNS hat eine hohe Relaxivität und Spezifität für HER2 und demonstrierte deutliche Kontrastverstärkungseffekte trotz niedrigerer Verabreichungsdosis als andere T2-Kontrastmittel, aufgrund der Eisenoxid-Nanopartikel. Dieses Kontrastmittel wird voraussichtlich Informationen über die Expression von HER2-Krebs bei Krebspatienten liefern und könnte zur Überwachung von HER2+-Krebspatienten während Chemotherapie mit HER2-Zielmedikamenten genutzt werden. Wir erwarten, dass die Ergebnisse dieser Arbeit eine vielversprechende Strategie für die Diagnose von HER2-überexprimierendem Krebs und für die Patientenbehandlung bieten werden.