Goldnanopartikel-basierter Nachweis von niedermolekularen AGEs aus in vitro glykierten Hämoglobin A0-Proben

Hintergrund

Diabetes mellitus Typ II (T2DM) ist eine komplexe Stoffwechselerkrankung, die durch hohe Blutzuckerwerte gekennzeichnet ist. Die im Körper persistierende Hyperglykämie löst eine Reihe chemischer und biochemischer Reaktionen aus. Die wichtigste Reaktion, die im Verlauf einer Hyperglykämie auftritt, ist als Maillard-Reaktion bekannt, bei der Zucker und Protein nicht-enzymatisch reagieren, um ein reversibles Aldimin (Schiff-Base) zu bilden. Verknüpfung. Die relativ instabile Schiffsche Base tautomerisiert in ihre stabilere Ketoform, die auch als „Amadori-Produkt“ bekannt ist [1]. Amadori-Produkte, auch als Zwischenprodukte der Glykierung oder frühe Glykierungsprodukte bezeichnet, durchlaufen Gruppenumlagerungen, Cyclisierung, Dehydratisierung und Abbaureaktionen, um eine Reihe chemischer Verbindungen zu bilden. Diese Verbindungen sind als potenzielle Vernetzer von Proteinen und Glykosylierungsmitteln bekannt [2]. Sie sind anfällig für einen weiteren Abbau, der zur Bildung von fortgeschrittenen Glykationsendprodukten (AGEs) führt [3]. Bei hohen endogenen Konzentrationen tragen AGEs zu den Komplikationen von Diabetes bei [4], indem sie entweder Proteinquervernetzungen induzieren oder durch rezeptorvermittelte intrazelluläre Signaltransduktion (RAGE), was zu oxidativem Stress und Entzündungen führt [5, 6]. Es ist auch bekannt, dass es mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen [7, 8], Nephropathien [9, 10], Retinopathien [11, 12], Alterung [13, 14], Arthritis, Krebs [15, 16, 17] und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht wird wie Alzheimer [15] und Entwicklung von Depressionen [18]. Neben der Maillard-Reaktion führen auch mehrere andere Stoffwechselwege, darunter die Oxidation von Glucose, die Lipidperoxidation und der Polyolweg, zur Bildung von AGEs [19, 20] in vivo. Darüber hinaus trägt die Nahrungsaufnahme bestimmter Nahrungsmittel, von denen bekannt ist, dass sie reich an AGEs sind, ebenfalls zur Gesamtzahl der AGEs im Körper bei [6].

Obwohl die meisten AGE-Produkte ein gemeinsames Strukturelement aufweisen [21], müssen die genauen chemischen Strukturen von Hunderten von AGEs noch identifiziert werden [22]. Trotz ihrer Heterogenität sind die Bildung kovalenter Quervernetzungen mit dem Protein und der „Bräunungseffekt“ typisch für alle bekannten AGEs [23]. Die Addukte von Zucker und Protein, die im frühen Stadium der Glykierung gebildet werden, werden als frühe Glykierungsaddukte bezeichnet. Fructosyllysin und Fructosamin sind Beispiele für solche Strukturen und sie sind potenzielle Quervernetzer [24,25,26]. Einige der umfassend untersuchten AGEs umfassen N -Carboxymethyl-Lysin (CML), N -Carboxyethyl-Lysin (CEL) [27], Pentosidin [28], Glucosepan [29], Pyrralin, Argpyramidin, Crossline und Vesperlysin C [30].

Studien zur Rolle von AGEs bei der Progression von Diabetes, Alterung und damit verbundenen Komplikationen nehmen zu und sie wurden als guter Biomarker für die jeweiligen Studien beschrieben [https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02863224][ 31,32,33,34]. Die Komplexität und Heterogenität in der Struktur von AGEs ist jedoch eine große Hürde bei der Entwicklung eines universellen Nachweissystems [35]. Die qualitative Analyse von AGEs erfolgt im Allgemeinen durch spektroskopische und kolorimetrische Techniken [36], bei denen die Entwicklung der Maillard-Reaktionsprodukte entweder durch Messung der Erhöhung der Lichtabsorption bei 280 nm, die den frühen Maillard-Reaktionsprodukten entspricht [37], oder durch Messung die Fluoreszenzemission bei 450 nm [38,39,40,41,42]. Studien zur Identifizierung unterschiedlicher AGE-Produkte sind noch im Gange; es wurden jedoch einige Versuche zur Quantifizierung von Pentosidin [43] und Carboxymethyllysin [44] unternommen. Die meisten AGEs wurden auf Gewebeebene durch Immunhistochemie und ELISA-basierte Quantifizierung mit einer Reihe poly- und monoklonaler Antikörper untersucht [21, 45]. Die bisher beste Analysetechnik für den AGE-Nachweis ist die Flüssigkeits- oder Gaschromatographie, gefolgt von der spektrophotometrischen oder massenspektrometrischen Detektion [12, 46, 47, 48, 49]. Die quantitative Analyse von AGEs ist immer noch eine große technische Herausforderung, und die wenigen dafür verfügbaren Techniken sind teuer und schränken daher ihren Einsatz in Point-of-Care-Anwendungen ein. Die Entwicklung neuer Strategien zur qualitativen und quantitativen Bewertung von AGEs ist aufgrund ihrer Bedeutung für lebensbedrohliche Krankheiten das Gebot der Stunde.

In die Entwicklung kolorimetrischer Sensoren wurden aufgrund ihrer Einfachheit in der Detektion, schnellen Ansprechzeit und Kosteneffizienz insbesondere für biologische Anwendungen große Anstrengungen unternommen [50]. Unter diesen sind Oberflächenplasmonenresonanz(SPR)-basierte Sensoren aufgrund ihrer hohen Nachweisempfindlichkeit von besonderem Interesse [51]. In der vorliegenden Studie haben wir die optischen Eigenschaften von Goldnanopartikeln (GNPs) zur qualitativen Identifizierung von AGE-Produkten untersucht. GNPs sind für ihre einzigartige, einstellbare SPR bekannt und haben sich daher als kolorimetrischer Reporter zum Nachweis verschiedener Biomoleküle entwickelt. Auf GNPs basierende optische Sensoren umfassen solche für kleine chemische Analyten [52], Zucker [53], verschiedene Proteine ​​[54], Proteinaggregate [55] und Konformationsvarianten eines Proteins [56]. Zuvor haben wir gezeigt, dass GNPs, wenn sie auf einem glykierten Protein-Templat ausgesät werden, auf das Fortschreiten der Glykierung reagieren können [57]. Hier haben wir dieses Konzept für den qualitativen Nachweis verschiedener Glykosylierungsprodukte kolorimetrisch erweitert, indem wir die reduzierende Eigenschaft der AGEs nutzen. Kurz gesagt, HbA0 wurde in vitro unter Verwendung von Fructose als reduzierendem Zucker glykiert, die AGE-Bildung und die damit verbundenen strukturellen Veränderungen im Proteinrückgrat wurden mittels Spektroskopie bestätigt. Das glykierte Hb wurde unter Verwendung von Gelfiltrationschromatographie fraktioniert, um die Produkte basierend auf ihrem Molekulargewicht zu trennen, und GNPs wurden unter Verwendung der erhaltenen Fraktionen synthetisiert. Nur die nicht-proteinhaltigen AGE-Produkte steuerten die Synthese von Gold-Nanostrukturen und ermöglichten so deren Identifizierung.

Immer mehr Beweise belegen die Beteiligung verschiedener Glykierungsprodukte an Krankheiten wie Diabetes, Altern, Alzheimer, Nierenerkrankungen, Arteriosklerose und verschiedenen Krebsarten. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Verwendung von GNPs als einfache und hochempfindliche kolorimetrische Sensorplattform zur Identifizierung verschiedener AGE-Produkte, die eine Rolle bei der Prognose von Diabetes-assoziierten Gesundheitskomplikationen spielen könnten.

Methoden

Materialien

Hämoglobin A0 (HbA0) und Sephadex (G25) wurden von Sigma Aldrich India Pvt. Ltd. Wasserstofftetrachloroaurat (III) Trihydrat (HAuCl₄ .3H₂ O) wurde von Loba Chemie bezogen. Fructose, Kaliumdihydrogenorthophosphat, Dikaliumhydrogenorthophosphat, Natriumdihydrogenorthophosphat, Dinatriumhydrogenorthophosphat, Kaliumferricyanid, Trichloressigsäure, Eisenchlorid, Salpetersäure (HNO₃ ), Salzsäure (HCl), Acrylamid, Bisacrylamid, Ammoniumpersulfat, TEMED, Natriumdodecylsulfat, Coomassie Brilliant Blue, Glycerin, Dithiothreitol, TRIS-Base und andere verwendete Chemikalien waren von analytischer Qualität und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. MilliQ Reinstwasser (>18 MΩ) wurde für alle Experimente verwendet.

Methoden

Glykation von HbA0

Stammlösungen von HbA0 und Fructose wurden in autoklaviertem Kaliumphosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4) hergestellt und vor der Verwendung unter Verwendung von 0,2 &mgr;m Spritzenfiltern filtriert. HbA0-Proben wurden mit unterschiedlichen Fructosekonzentrationen für unterschiedliche Zeiträume (1 bis 10 Tage) in einem Brutschrank bei 37 °C inkubiert. Die Endkonzentrationen von Fructose und HbA0 betrugen 0,1 M und 1 mg ml ⁻¹ bzw. Kontrollen von HbA0 und Fructose wurden ebenfalls aufbewahrt, die die gleichen Konzentrationen aufwiesen. Die 10 Tage glykierten Proben werden mit dem Präfix „Tag 10“ und die nicht inkubierten Kontrollproben mit dem Präfix „Tag 0“ gekennzeichnet. Alle Experimente wurden unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Air-Flow-Haube durchgeführt.

Reduktion des Property-Assays

Die reduzierenden Eigenschaften der glykierten Proben wurden nach der von Gu beschriebenen Methode bestimmt. et al. [37] mit geringfügigen Modifikationen. Dann wurden 100 &mgr;l der glykierten Proben und ihre jeweiligen Protein- und Zuckerkontrollen mit 1 ml 0,2 M Natriumphosphatpuffer und 1 ml 1% Kaliumferricyanid vermischt. Die Mischungen wurden 20 min bei 50 °C in einem Wasserbad inkubiert. Nach dem Abkühlen der Mischung auf Raumtemperatur wurde 1 ml 10 % Trichloressigsäure zugegeben. Zu 1 ml dieser Mischung wurden 1 ml MilliQ-Wasser und 200 &mgr;l 0,1% Eisen(III)-chlorid zugegeben. Die Extinktion der resultierenden Mischung wurde bei 700 nm gemessen. Es wurde eine Negativkontrolle aufbewahrt, bei der 0,1 M Phosphatpuffer anstelle der glykosylierten Probe zugegeben wurde und diese als Blindwert für Extinktionsmessungen diente. Je höher die Extinktion bei 700 nm ist, desto stärker ist ihre reduzierende Eigenschaft.

Gelfiltrationschromatographie von Tag 0 Fruc-Hb und Tag 10 Fruc-Hb mit Sephadex (G25)

Kurz gesagt, Sephadex (G25)-Kügelchen wurden über Nacht in MilliQ-Wasser eingeweicht, dann in eine Glassäule von 15 cm Länge, 1 cm Durchmesser und 15 ml Innenvolumen gepackt. Zuerst wurde die Säule mit reichlich MilliQ-Wasser gewaschen, gefolgt von Kaliumphosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4). Ungefähr 600 ul der Fruc-Hb-Probe wurden in die Säule geladen, nachdem dieselbe mit Phosphatpuffer äquilibriert worden war. Die Elution wurde mit dem gleichen Puffer bei einer Flussrate von 7,5 ml pro Stunde durchgeführt. Fraktionen wurden gesammelt, sobald die geladene Probe einen Abstand von ungefähr 10 cm der Säule überquerte. Von jeder der Proben wurden ungefähr 30 Fraktionen gesammelt und danach charakterisiert. Hier dienten Fruc-Hb-Tag 0 und die daraus abgeleiteten Fraktionen als Kontrolle gegenüber der Fruc-Hb-Probe von Tag 10 und ihren jeweiligen Fraktionen.

Gold-Nanopartikel-Synthese

Alle für die GNP-Synthese verwendeten Glaswaren wurden mit Aqua Regia (HCl:HNO₃ im Volumenverhältnis 3:1) und vor Gebrauch mit Ethanol und Reinstwasser gespült (Achtung! Aqua Regia ist ein sehr ätzendes Oxidationsmittel, das mit größter Vorsicht behandelt werden sollte ). Die Synthese von GNPs wurde durchgeführt, wobei die reduzierende Eigenschaft der Glykierungsprodukte von Hb ausgenutzt wurde. In einem typischen Experiment, das bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt wurde, wurden 32 μl wässrige Lösung von HAuCl₄ (1% w /v ) wurde unter ständigem Rühren zu 3,868 ml MilliQ-Wasser gegeben. Bei vollständiger Auflösung des Goldsalzes verfärbt sich die Lösung blassgelb. Als nächstes wurden 50 µl der erforderlichen Fruc-Hb-Probe oder 100 µl der Fraktion zu der Goldsalzlösung gegeben. Nachdem alle Reaktanten gründlich vermischt waren, wurde das Rühren beendet und die Reaktionsmischung ungestört gelassen, um das Wachstum von GNPs zu ermöglichen. In der endgültigen Reaktionsmischung betrug die Konzentration der Fruc-Hb-Probe 12,5 ng μL ^–1 (12,5 μg ml ⁻¹ ) und die Fraktion betrug 1 ng μL ⁻¹ (1 μg ml ⁻¹ ) (Die detaillierten Berechnungen finden Sie in S6). Je nach zugegebener Probe entwickelten sich in den Reaktionsmischungen Farben im Bereich von rosa bis violett. Alle Proben wurden aufbewahrt, bis sich die Farbe der Reaktionsmischung stabilisierte und keine weitere Veränderung beobachtet wurde.

Bradford-Assay

Die aus Fruc-Hb-Proben gesammelten Fraktionen wurden unter Verwendung des Bradford-Assays auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Protein analysiert. Kurz gesagt wurden zu jeder von 20 µl unverdünnten Fraktionen etwa 200 µl Bradford-Reagenz zugegeben und die Extinktion wurde bei 595 nm und 450 nm gemessen [58]. Das Verhältnis von OD bei 595 nm zu 450 nm wurde gegen die Fraktionsnummer aufgetragen und ein höheres Verhältnis zeigte einen relativ höheren Prozentsatz des Proteins an.

Spektroskopie

UV-sichtbare Spektroskopie

UV-Vis-Spektren aller Fruc-Hb-Proben, ihrer jeweiligen Kontrollen und der chromatographischen Fraktionen aus den glykierten Proben wurden in einem Perkin Elmer, Lambda 25 UV-Visible-Spektrometer aufgezeichnet. Spektren wurden aufgenommen, indem ein Scan von 800 bis 200 nm mit einer Scangeschwindigkeit von 240 nm/min und einer Spaltbreite von 1 nm durchgeführt wurde. Alle Messungen wurden mit 1 cm Schichtdicke, 1 ml Quarzküvetten durchgeführt. Auf ähnliche Weise wurden auch die UV-Vis-Spektren von BSP aufgenommen.

Fluoreszenzspektroskopie

Um Proteinstrukturveränderungen und AGE-Bildung zu identifizieren, wurden die Fluoreszenzemissionsprofile von Fruc-Hb-Proben und den Fraktionen von Fruc-Hb-Tag 0 und Fruc-Hb-Tag 10 mit einem Cary Eclipse-Fluoreszenzspektrophotometer von Agilent Technologies durchgeführt. Anregungs- und Emissionsspaltbreiten wurden auf 5 nm eingestellt und Spektren wurden unter Verwendung einer Quarzküvette von 1 cm Weglänge aufgenommen. Proben wurden bei 280 nm und 350 nm angeregt, um die Tryptophan-Fluoreszenz/intrinsische Protein-Fluoreszenz bzw. AGE-Fluoreszenz zu überprüfen [34,35,36,37,38].

Zirkulardichroismus-Spektroskopie

Die Sekundärstrukturveränderungen in den Fruc-Hb-Proben wurden mittels Circulardichroismus-Spektroskopie identifiziert. Die Messungen wurden unter Verwendung eines Circulardichroismus (CD)-Spektrometers mit Stop Flow, Applied PhotoPhysics Chirascan (Applied Photophysics Limited, UK) durchgeführt. Die Spektren wurden im fernen UV aufgenommen, im Bereich von 190 bis 260 nm.

Für alle spektroskopischen Messungen Fruc-Hb-Proben von 0,1 mg mL ⁻¹ Konzentration verwendet und Fraktionen von Tag 0 Fruc-Hb und Tag 10 Fruc-Hb wurden ohne Verdünnung analysiert. Als Blindwert diente in allen Experimenten Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4, 10 mM). Alle Messwerte wurden in dreifacher Ausfertigung bei Raumtemperatur aufgenommen.

Transmissionselektronenmikroskopie

Um die Größe und Struktur der aus den Fruc-Hb-Proben synthetisierten GNPs und ihren jeweiligen Kontrollen zu identifizieren, wurde eine elektronenmikroskopische Analyse mit dem Transmissionselektronenmikroskop (TEM)-JEOL 2100F durchgeführt. Die GNPs wurden durch Zentrifugation bei 6000 U/min konzentriert und auf kupferbeschichtete Kohlenstoffgitter mit einer Maschenweite von 300 tropfengegossen. Die Proben wurden vor der Analyse über Nacht bei Raumtemperatur trocknen gelassen.

Farbintensitätsprofil des BSP

Um die Farbe des BSP in messbaren Werten auszudrücken, wurde (RB)/G ((Rotintensität – Blauintensität)/Grünintensität) berechnet, indem rote, blaue und grüne Farbebenen aus jedem der Goldkolloide unter Verwendung einer digitalen Farbe extrahiert wurden Meter.

SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde durchgeführt, um die Unterschiede im Molekulargewicht von HbA0 nach der Glykierung zu sehen. HbA0-Kontrollen von Tag 0, Tag 10 und Fruc-Hb von Tag 0 und Tag 10 wurden mit 10 % SDS, das 6X Ladepuffer enthielt, gemischt und 5 min gekocht, wonach 30 µl der Proben auf das gegossene Gel aufgetragen wurden (Stapelgel- 5%, auflösendes Gel –  12%). Die Proben wurden zusammen mit der 10-175 kDa PiNK Plus vorgefärbten Proteinleiter (Kat.-Nr. PM005 0500) bei 100 V unter Verwendung des Mini PROTEAN Tetrad-Systems von Bio-Rad laufen gelassen. Die Gele wurden unter der Weißlichtquelle eines Bio-Rad Trans-Illuminators visualisiert.

Ergebnisse

BSP-Synthese aus Fructose, Hämoglobin A0 und glykosyliertem Hämoglobin A0

Es ist bekannt, dass der reduzierende Zucker Glukose in vivo mit HbA0 reagiert, um HbA1c zu produzieren, das bekannte frühe Glykationsaddukt, das ein wichtiger Biomarker für die mit Diabetes assoziierten Hyperglykämien ist [59]. Um eine schnellere Glykierungskinetik und eine hohe AGE-Akkumulation in vitro zu erreichen, wird Fruktose anstelle von Glukose verwendet, die im Vergleich zu letzterem ein potentes Glykierungsmittel ist [55,56,57,58,59,60]. In unserer Studie führten wir die Glykierung von Hämoglobin A0 unter Verwendung von Fruktose als reduzierendem Zucker durch und die Glykierung wurde bis 10 Tage überwacht, was als gut genug für eine wesentliche AGE-Bildung angegeben wurde [57]. 1 veranschaulicht die Bildung von AGEs in den HbA0-Proben nach 10 Tagen Inkubation mit Fructose in vitro. Die AGE-Bildung wurde durch qualitative Messung der Fluoreszenzemission bei 450 nm bei Anregung bei 350 nm bewertet [38,39,40,41,42]. Eine mehr als zehnfache Zunahme der Fluoreszenzemission bei 450 nm bestätigte die Bildung von AGE-Produkten in glykosyliertem HbA0 (Tag 10 Fruc-Hb) im Vergleich zu nicht glykosyliertem HbA0 (Tag 0 Fruc-Hb – Physikalisches Gemisch aus HbA0 und Fructose ohne Inkubation). Die detaillierte biophysikalische Charakterisierung der Proben wird in der Zusatzdatei 1 (S1 &S2) diskutiert.

Bildung von AGEs, gemessen durch Erzeugung von Fluoreszenz bei 450 nm, wenn Hämoglobin mit Fructose für 10 Tage inkubiert wird. Vergleich der 450-nm-Fluoreszenzemission an Tag 0 Fruc-Hb und Tag 10 Fruc-Hb

Um GNPs als kolorimetrischen Sensor für AGEs aus Proteinglykation zu verwenden, war es eine Voraussetzung, die Bildungskinetik von GNPs aus den Zucker- und Proteinreaktanten zu untersuchen. Von Fructose und Hämoglobin A0 wurde bereits berichtet, dass sie allein oder in Kombination mit einem starken Reduktionsmittel die Synthese von Goldnanostrukturen steuern [53, 61, 62, 63]. Um jedoch den Unterschied in der Bildungskinetik zu verstehen, verglichen wir die aus Fruc-Hb, Fructose und HbA0 synthetisierten GNPs, die 0 bzw. 10 Tage in Abwesenheit eines zusätzlichen Reduktionsmittels inkubiert wurden. Die reduzierende Eigenschaft dieser Template wurde biochemisch gemäß dem im Methodenabschnitt beschriebenen Protokoll gemessen. Insgesamt zeigten die Proben von Tag 10 eine höhere Reduktionseigenschaft als die Proben von Tag 0, und Fruc-Hb zeigte die maximale Reduktionseigenschaft, gefolgt von Fructose und HbA0 in beiden Fällen, was auf das Vorhandensein von AGEs in Fruc-Hb-Proben zurückgeführt werden konnte ( Abb. 2a). Von diesen Proben trug bei einer typischen Konzentration nur Tag 10 Fruc-Hb zur Synthese stabiler GNPs (Abb. 2b) am Ende von 4 Tagen bei, während der Rest der Proben dies nur tun konnte, wenn man ihnen erlaubte längere Zeit aufbewahrt werden (typischerweise mehr als 10 Tage) und die Ergebnisse stimmen mit den erhaltenen reduzierenden Eigenschaften der Proben überein (Daten nicht gezeigt). Das Absorptionsspektrum des sichtbaren Lichts der Fruc-Hb_GNPs am Tag 10 erzeugte einen Peak bei etwa 530 nm (Abb. 2c) und die Partikel wurden auch durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) charakterisiert, um die Größe und Morphologie zu untersuchen (Abb. 2d). Die elektronenmikroskopische Aufnahme zeigte das Vorhandensein kugelförmiger Partikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 21.930 ± 2,4 nm (Abb. 2e). Außerdem waren die Partikel polykristalliner Natur mit Gitterpunkten, die 111, 200, 220, 311 Ebenen eines fcc-Gitters entsprachen (Fig. 2f). Eine detaillierte kinetische Analyse der BNP-Bildung aus unterschiedlich glykierten Proben ist in S3 gegeben.

Charakterisierung der AGE-Bildung und GNP-Synthese aus HbA0-, Fructose- und Fruc-Hb-Proben. a Reduzierende Eigenschaften von HbA0, Fructose, Fruc-Hb nach 0 bzw. 10 Tagen Inkubation, gemessen durch den Eisen(III)-Ionen-Reduktionstest. b Fotografien von aus den jeweiligen Proben synthetisierten BSP. c UV-sichtbares Absorptionsspektrum für die Tag10 Fruc-Hb_GNPs. d Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme der day10 Fruc-Hb_GNPs (Skalenbalken:20 nm). e Größenverteilung der Partikel und f SAED für die Partikel

Hier fungiert Fruc-Hb sowohl als Templat als auch als Stabilisator, um die Synthese von Goldnanostrukturen mit Kugelform zu steuern. Da Fruc-Hb am Tag 10 die Partikelsynthese im Vergleich zu den Zucker- und Protein-Gegenstücken in vorgegebener Zeit ermöglicht, kann dieser Mechanismus genutzt werden, um zwischen einem glykierten und einem nicht glykierten Proteintemplate zu unterscheiden.

Fraktionierung von Fruc-Hb löst zwei verschiedene Klassen von Glykosylierungsprodukten auf

Es war interessant zu sehen, ob die AGEs oder die Veränderungen im Proteinrückgrat für die beobachtete unterschiedliche SPR-Antwort in den GNPs verantwortlich sind, die am Tag 10 Fruc-Hb-Templat ausgesät wurden. Zur weiteren Untersuchung fraktionierten wir Fruc-Hb von Tag 10 und Fruc-Hb von Tag 0 unter Verwendung von Gelfiltrationschromatographie, wie im Abschnitt Methoden beschrieben. Die von Tag 0 Fruc-Hb abgeleiteten Fraktionen dienten als Kontrolle gegenüber den Fraktionen von Tag 10 Fruc-Hb. Abbildung 3 fasst die spektroskopische Charakterisierung der Fraktionen zusammen. Abbildung 3a zeigt die Elutionsprofile der Fraktionen, die an Tag 0 Fruc-Hb (rot) und Tag 10 Fruc-Hb (schwarz) gesammelt wurden. Das für die Fraktionierung von Fruc-Hb erhaltene charakteristische Elutionsprofil stimmt mit früheren Berichten überein [37].

Elutionsprofil der Fruc-Hb-Fraktionen von Tag 0 (rot) und Fruc-Hb von Tag 10 (schwarz). UV-Absorptionsprofil gemessen bei 280 nm (a ) und Bradford-Assay auf das Vorhandensein von Proteinen (b ) der Fraktionen von Tag 0 Fruc-Hb und Tag 10 Fruc-Hb

Das Vorhandensein von Protein in den Fraktionen von Tag 0 und Tag 10 wurde durch die Absorption von UV-Licht bei 280 nm durch die im Protein vorhandenen aromatischen Aminosäuren bestätigt. Das Elutionsprofil von Fruc-Hb von Tag 10, gemessen durch Lichtabsorption bei 280 nm, zeigt die Anwesenheit von zwei Populationen von Produkten, die mit I und II gekennzeichnet sind. Population I, bestehend aus Produkten mit hohem Molekulargewicht, reicht von Fraktion Nr. 5 bis 12 und Fraktion Nr. Ab 15, die Produkten mit niedrigem Molekulargewicht entsprechen, fallen in Population II. Zwischen I und II wurde ein kleiner Bereich von 2–3 Fraktionen beobachtet, in dem keine UV-Absorption beobachtet wurde. Andererseits zeigte eine einzelne Population von Fraktionen von Tag 0 Fruc-Hb eine UV-Licht-Absorption (Population I), was bestätigt, dass die Absorption in Region II in Tag 10-Fraktionen von den Produkten stammt, die am Tag 10 Fruc-Hb als Ergebnis erzeugt wurden der Glykation. Es wurde bereits berichtet, dass die Zwischenstufen der Maillard-Reaktion Licht im nahen UV-Bereich absorbieren [64], was die Beobachtung unterstützt. Die verstärkte Absorption von UV-Licht bei 280 nm durch die Fraktionen von Tag 10 im Vergleich zu Fraktionen von Tag 0 könnte auf die umfassende Entfaltung von Protein als Ergebnis der Glykation zurückzuführen sein, was zur Exposition von aromatischen Aminosäuren führt (Abb. 3a).

Die Glykierung verändert die Sekundär- und Quartärstrukturen des Proteins erheblich, wie in S1 diskutiert. Um den strukturellen Status des Proteins in den Fraktionen zu bestätigen, führten wir eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der Fraktionen durch und stellten fest, dass anstelle von monomeren und dimeren Banden fusionierte Banden beobachtet wurden, die die Vernetzung des Proteins in der Fruc-Hb-Probe von Tag 10 bestätigten (Zusätzliche Datei 1:Abbildung S4).

Beim Vergleich der Elutionsprofile von Tag 0 Fruc-Hb und Tag 10 Fruc-Hb erkennen wir, dass die Fraktionen, die in die Population I fallen, proteinhaltiger Natur sind und die zweite Population, die in den Tag 0-Fraktionen (nicht glykiert) vollständig fehlte, aus . besteht nicht proteinhaltige Glykierungsprodukte. Diese Ergebnisse werden durch die Proteinschätzung durch Bradfords Assay gestützt, bei der die proteinartige Natur der Fraktionen in Population I von Tag 0 und Tag 10 Fruc-Hb bestätigt wurde (Fig. 3b). Kurz gesagt ergab die Fraktionierung von Fruc-Hb am Tag 10 durch Gelfiltrationschromatographie zwei verschiedene Populationen von Fraktionen, von denen beide Licht bei 280 nm absorbieren, eine proteinhaltiger Natur und die andere nicht-proteinhaltig ist.

Proteinhaltige Glykationsprodukte und nicht-proteinhaltige Glykationsprodukte sind in der Natur fluoreszierend

Nachdem die Elution von Glykationsprodukten proteinhaltiger und nicht-proteinhaltiger Natur verstanden wurde, wurde die Fluoreszenzemission dieser Fraktionen bei 450 nm gemessen, um die Anwesenheit von AGE-Produkten zu charakterisieren. Ähnlich dem UV-Elutionsprofil werden zwei Populationen von Fluoreszenzemission für Fraktionen von Tag 10 beobachtet, jedoch zeigte keine der Fraktionen von Tag 0 eine Fluoreszenzemission bei 450 nm, da keine AGE-Bildung am Tag 0 Fruc-Hb aufgetreten ist ( 4 ). Die Intensität der Fluoreszenz variierte signifikant zwischen den Fraktionen vom Tag 10, was die unterschiedliche chemische Natur der Glykierungsprodukte anzeigt. Im Fluoreszenzelutionsprofil bestanden die zur Population I gehörenden anfänglichen Eluen aus Glykationsprodukten hoher Fluoreszenzintensität. Dies legt zusammen mit der in Fig. 3 gezeigten Proteinabschätzung die Elution von stark fluoreszierenden Glykierungsprodukten nahe, die in diesen Fraktionen proteinartige Strukturen umfassen. Die zweite Population zeigte im Vergleich zu den Anfangsfraktionen eine Fluoreszenzemission geringerer Intensität. Es wurde festgestellt, dass sie von Natur aus nicht proteinhaltig sind (Abb. 3b), aber in der Lage sind, UV-Licht bei 280 nm zu absorbieren (Abb. 3a).

Vergleich der AGE-Fluoreszenz in Fruc-Hb-Fraktionen von Tag 0 und Fruc-Hb von Tag 10, ausgedrückt als Intensität der Fluoreszenzemission bei 450 nm

Unter Berücksichtigung der UV-Absorption (Abb. 3) und Fluoreszenzemission der Tag-10-Fraktionen (Abb. 4) wird deutlich, dass die Fraktionierung zwei verschiedene Klassen von Glykierungsprodukten des HbA0 unterscheidet. Die Fraktionen, die anfänglich von der G25-Säule eluiert werden, haben ein hohes Molekulargewicht, sind proteinartig und emittieren eine starke Fluoreszenz bei 450 nm. Die zweite Klasse von Produkten sind nicht-proteinartige Strukturen mit niedrigem Molekulargewicht, die bei 450 nm Fluoreszenz emittieren, jedoch von vergleichsweise geringerer Intensität. Da beide Produkte 'AGE'-Fluoreszenz aufweisen, könnten die proteinartigen Strukturen die AGE-Produkte sein, die mit dem Proteinrückgrat vernetzt sind, die anfänglich während der Maillard-Reaktion gebildet werden, und die Fraktionen der zweiten Population könnten die späten Produkte der Glykierung sein, die als Ergebnis gebildet werden des Abbaus von AGE-Protein-Crosslinks.

BSP, das auf Fraktionen einer Fruc-Hb-Probe ausgesät wurde, ermöglicht die Differenzierung zwischen den Glykationsprodukten

Es ist offensichtlich, dass die Synthese von GNPs verwendet werden kann, um zwischen einem glykierten und einem nicht glykierten Templat zu unterscheiden (Abb. 2). Um nun zu untersuchen, ob die GNPs zwischen den proteinhaltigen und nicht-proteinhaltigen Eluen von Tag 10 Fruc-Hb unterscheiden können, synthetisierten wir GNPs unter Verwendung der Fraktionen, die von Tag 10 Fruc-Hb erhalten wurden, wie in den Verfahren beschrieben. Die Farbe der gebildeten GNPs wurde überwacht, bis alle Proben stabil waren.

Wie in Fig. 5 gezeigt, zeigte keine der Fraktionen, die aus proteinartigen Strukturen (Population I) bestanden, eine bemerkenswerte GNP-Bildung, während die Fraktionen, die nicht-proteinöse AGE-Produkte enthielten (Population II), stabile GNPs produzierten, die in kolloidaler Lösung eine Reihe von Farben zeigten. Die Bildung von GNPs wurde mittels UV-Vis-Spektroskopie charakterisiert und die Absorptionsmaxima wurden gegen die Fraktionszahlen aufgetragen. Die Spektroskopiedaten unterstützen das visualisierte GNP-Farbprofil gut. Diese Daten schlussfolgern, dass die Differenzierung von glykierten Protein-Templaten von nicht-glykierten Protein-Templaten basierend auf dem GNP-basierten Sensormechanismus durch die niedermolekularen AGE-Produkte vermittelt wird und der gleiche Mechanismus verwendet werden kann, um zwischen proteinhaltigen und niedermolekularen Nicht- -proteinhaltige Glykationsprodukte.

GNP-Synthese aus Fruc-Hb-Fraktionen von Tag 10. Das kolorimetrische Profil von GNPs, synthetisiert aus Fraktionen von Tag 10 und ihre Absorptionsmaxima, aufgetragen gegen die Fraktionsnummer

Die Kinetik der GNP-basierten kolorimetrischen Sensorik kann durch einfaches Erhöhen der Konzentrationen von Fruc-Hb und Goldsalz noch weiter verbessert werden, wodurch die Reaktionszeit verkürzt wird. When the concentrations of the Fruc-Hb and gold salt was increased four times than the concentrations used initially in this study, GNP formation was completed within 1 day, substantiating the use of the proposed colorimetric sensor for point-of-care applications (Additional file 1:Figure S5).

The linearity of detection for this colorimetric sensor was also confirmed using different concentrations of the day 10 glycosylated HbA0 (day 10 Fruc-Hb) (Fig. 6). Colour formation was not prominent enough for the lower concentrations of day 10 Fruc-Hb used, and as the concentration was increased from 20 to 40 ng/μL, the colour intensity increased linearly. This confirms that the colour intensity profile extracted from the GNPs obtained from differentially glycated haemoglobin samples can be used for qualitative measurement of AGEs in respective samples.

Linearity of detection. The red colour intensity as quantified by (R-G)/B intensity of GNP colloids plotted against the concentration of day 10 Fruc-Hb used for the synthesis. The concentration was varied from 8 to 40 ng/μL

Discussion

The study presented here provides a detailed mechanism of GNP formation from a glycosylated HbA0 template and also discusses how this technique can be expanded for highly sensitive detection of AGE products in a simple manner. Our primary objective for this work was to establish a colorimetric sensing mechanism based on GNPs for the differentiation of glycated and non-glycated samples. The glycated HbA0 was found to be having high reducing property in comparison to the protein and sugar counterparts, enabling formation of stable and mono dispersed GNPs (Fig. 2). Since, among the control samples tested for GNP synthesis, only day 10 Fruc-Hb showed AGE fluorescence, the reactivity can be attributed to the AGE products than a mere structural alterations of the due to glycation (Figs. 1 and 2). To confirm this norm further, the products of glycation obtained from day 10 Fruc-Hb was fractionated to separate the products according to their molecular weights.

Fractionation of glycated Hb segregated two major population of products, high molecular weight proteinaceous (population I) and low molecular weight non-proteinaceous (population II) glycation products (Figs. 3 and 4). When GNPs were synthesised using these fractions of day 10 Fruc-Hb, it was found that only the products belonging to population II, the non-proteinaceous glycation products, were capable of carrying out the synthesis of particles (Fig. 5). This confirmed that the non-proteinaceous AGE products can initiate GNP synthesis by their own and the formation of GNPs from a Fruc-Hb template can be clearly attributed to the AGEs. Also, this opens up the possibility of using this property for the colorimetric detection of AGE products along with the distinction between proteinaceous and non-proteinaceous glycation products of HbA0.

Generally, CARBONYL groups present in the protein and sugar enable the stable synthesis of gold nanostructures in biological syntheses. Here, the generation of AGE products consisting of dicarbonyl functional groups during glycation might be providing the reducing environment for the proposed GNP synthesis [65]. As a matter of fact, the suggested mechanism can be used for the detection of advanced lipid per-oxidation end products (ALEs) as well, since the latter is also characterised by dicarbonyl functional groups and shares structural similarities with AGEs [66]. In short, GNPs synthesised from fractionated glycosylated Hb samples can clearly distinguish between proteinaceous and non-proteinaceous products. Our GNP-based simple colorimetric sensing of glycation products is highly sensitive and can detect nanogram levels of glycation products (S6) in a concentration-dependent manner (Fig. 6). The detection limit using the proposed sensing mechanism for the fractions is 1 ng/μL. The method developed in here can be scaled down to smaller reaction volumes without affecting the reaction kinetics, thus enabling lower sample requirements (data not shown) as well as enhance the reaction kinetics by increasing the concentrations (S5).

Schlussfolgerungen

Concisely, in this study, we have demonstrated a colorimetric sensing mechanism for the non-proteinaceous AGE products which is simple and highly sensitive with a detection limit down to nanogram levels. Conditions like type 2 diabetes requires continuous monitoring of sugar levels at regular time intervals. Currently, levels of HbA1c formed as a result of extensive glycation of haemoglobin is used as a diagnostic means for diabetes. Chromatographic [67], electrophoretic and advanced technologies including high-performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS) [12, 46,47,48,49, 68] are used for HbA1c detection. Early glycation adducts including fructosamines are also indicative of the glycemic control [69] which can be used as a marker for diabetes detection. Monitoring the AGE levels in addition to the HbA1c levels can significantly improve the determination the degree of complexity associated with diabetes, since the advancement of the disease is often associated with AGE formation and is involved in the progression of the disorder as well. Till date, the LC-MS/MS offers the highest selectivity and sensitivity in AGE detection [70]. But when it comes to simple, cost-effective, point-of-care diagnostics, our method can detect few nanograms of the sample compared to other fluorescence emission-based techniques [71, 72]. The method is highly specific for the AGEs, such that sugars and proteins do not develop any colour as such which are the expected interferences in the clinical samples such as blood or serum for the proposed study (Additional file 1 section 7). In this study, we have also segregated the products of glycation to proteinaceous and non-proteinaceous components and proved that non-proteinaceous AGEs are more reactive by the GNP based colorimetric assay. Further research can explore how this idea can be expanded for the distinction between different AGEs and thereby apply it for the diagnosis of organ specific diabetes-related complications.

Abkürzungen

AGEs:

Advanced glycation end products

Fruc-Hb:

Glycated Hb

GNPs:

Goldnanopartikel

HbA0:

Haemoglobin A0

SPR:

Oberflächenplasmonenresonanz