BSA-beschichtete Goldnanostäbe ermöglichen Low-Dose NIR-II Photothermische Therapie

Zusammenfassung

Das zweite Nahinfrarot-Fenster (NIR-II, 1000–1300 nm) bietet unvergleichliche Gewebedurchdringung und positioniert es als ideales optisches Regime für Bildgebung und photothermische Therapie. Doch die Herstellung von Goldnanostäben, die in diesem Band absorbieren, bei gleichzeitig niedriger Zytotoxizität, bleibt herausfordernd. Wir entwickelten eine Serie von Goldnanostäben mit hohem Aspektverhältnis, die robuste Oberflächenplasmonenresonanz über das NIR-II-Fenster aufweisen. Die Beschichtung dieser Nanostäbe mit Bovinem Serumalbumin (BSA) verbesserte ihre Biokompatibilität dramatisch, ohne die optische Leistung zu beeinträchtigen. In einem Brustkrebs-Mausmodell erreichten die BSA-beschichteten Nanostäbe vollständige Tumorablation bei einer moderaten NIR-II-Laserintensität von nur 0,75 W cm⁻². Diese Ergebnisse bestätigen, dass Low-Dose NIR-II Photothermische Therapie mit Großaspektverhältnis-Goldnanostäben machbar ist.

Einleitung

Goldnanopartikel (AuNPs) haben sich als vielseitige Agenten in der biomedizinischen Forschung etabliert, aufgrund ihrer außergewöhnlichen Biokompatibilität und niedrigen Zytotoxizität. Ihre hohe Röntgenabsorption macht sie attraktiv für Computertomographie (CT) Tumorimaging [1, 2], während ihre ausgeprägte Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) effiziente Photon-zu-Wärme-Konversion für photothermische Therapie (PTT) ermöglicht [3, 4]. AuNPs mit einstellbarer Größe und Morphologie – Nanostäbe, Nanoschalen, Nanokäfige – wurden für Krebsablation maßgeschneidert, insbesondere Goldnanostäbe (AuNRs), deren Anisotropie starke NIR-Absorption und photothermische Stabilität bietet [5–8]. NIR-Licht dringt tiefer in Gewebe ein als sichtbares Licht, und längere Wellenlängen erfahren reduzierte Streuung [9]. Stäbchenförmige Partikel zeigen auch erhöhte Tumorpermeabilität und verlängerte Zirkulation, was Akkumulation fördert [10, 11]. Konventionelle PTT erfordert jedoch oft Hochleistungslaser, was Kollateralschäden riskiert [12]. Das NIR-II-Fenster bietet tiefere Penetration und geringere Streuung als NIR-I, was effektive Therapie bei niedrigeren Laserintensitäten ermöglicht [13–17]. Doch die Herstellung von AuNRs, die in NIR-II absorbieren und biokompatibel bleiben, ist schwierig. Hier berichten wir über eine samenlose Synthese von AuNRs mit Absorptionspeaks bei 1000–1300 nm, gefolgt von BSA-Beschichtung zur Zytotoxizitätsreduktion. Wir evaluieren ihre photothermische Leistung in vitro und in vivo und demonstrieren Tumorablation in einem Brustkrebs-Mausmodell mit Laserintensität von nur 0,75 W cm⁻².

Materialien und Methoden

Materialien

Goldchlorid-Trihydrat (HAuCl₄·3H₂O, 99,9 %), Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB, 99 %), Salpetersäure (GR 65–68 %), Wasserstoffperoxid (30 %), Natriumborhydrid (NaBH₄, 97 %), Silbernitrat (AgNO₃, 99,8 %), Salzsäure (38 %), Hydrochinon (99 %), Bovines Serumalbumin (BSA, 98 %) wurden von Shanghai Aladdin Biological Technology Co. Ltd. bezogen. RPMI 1640, Penicillin-Streptomycin, PBS, fötales Rindserum (FBS), 4T1-Zellen und Cell Counting Kit-8 (CCK-8) wurden von HyClone, Corning, Gibco und Dojindo bezogen. Ultrareines Wasser (Millipore) wurde durchgängig verwendet.

Herstellung von AuNR@CTAB

AuNRs wurden via samenlosem Protokoll synthetisiert. Kurz: 0,4 mL 10 mM HAuCl₄ und 10 mL 0,1 M CTAB wurden mit 23–33 µL 100 mM AgNO₃ kombiniert. Nachfolgende Zugabe von 10–30 µL 1,2 M HCl und 525 µL 0,1 M Hydrochinon ergab eine hellgelbe Wachstumslösung. Nach 15 Min Rühren wurden 10–40 µL frisch hergestelltes 10 mM eiskaltes NaBH₄ injiziert, gefolgt von 30 s Rühren und 18 h Reifung bei Raumtemperatur. AuNR@CTAB wurde durch zwei PBS-Wäschen gereinigt.

Herstellung von AuNR@BSA

CTAB-Konzentration in AuNR@CTAB wurde auf 1 mM eingestellt und sonifiziert, um vollständig zu lösen. 3 mL AuNR@CTAB wurden mit 3 mL 10 mg mL⁻¹ BSA gemischt und 30 min sonifiziert. Nach Zentrifugation (9500 × g, 40 min) wurde das Pellet in 6 mL 5 mg mL⁻¹ BSA resuspendiert, pH auf 11–12 mit 2 M NaOH eingestellt und ≥18 h gerührt. Finales AuNR@BSA wurde durch zwei PBS-Wäschen gereinigt und in PBS gelagert.

Charakterisierung

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, Talos F200X) bewertete Morphologie; Dynamische Lichtstreuung (DLS, Zetasizer Nano ZS) maß Größe und Zeta-Potenzial; UV-Vis-Spektroskopie (Shimadzu UV-2700) zeichnete Absorption auf. In-vivo-Tumorverteilung wurde durch TEM von exzidierten Tumorabschnitten post-Injektion untersucht. FT-IR und XRD-Analysen (Beijing Zhongke Baice Co.) bestätigten BSA-Beschichtung und kristallines Gold.

Photothermische Leistung

AuNR-Lösungen (OD = 0,5–2 bei 1064 nm) wurden mit 1064 nm Laser (0,35–1 W cm⁻²) für 30 min bestrahlt, und Temperaturänderungen wurden per Infrarot-Thermografie (FLUKE TI25) überwacht. Photostabilität wurde durch wiederholte 10 min an/aus Bestrahlungszyklen bei 0,5 W cm⁻² evaluiert.

In-vitro Zytotoxizität

4T1-Zellen wurden in 96-Well-Platten (5 × 10³ Zellen well⁻¹) gesät und 24 h inkubiert. AuNR@CTAB oder AuNR@BSA (10 µL) wurde bei variierenden Konzentrationen zugegeben, gefolgt von 24 h Inkubation. CCK-8 (10 µL) wurde zugegeben, 40 min inkubiert, und Absorption bei 450 nm gemessen. Phototoxizitätsassays involvierten 1064 nm Bestrahlung (0,75 W cm⁻², 10 min) vor dem CCK-8-Test.

Tierstudien

Weibliche BALB/c-Mäuse (6–8 Wochen) wurden subkutan mit 2 × 10⁶ 4T1-Zellen injiziert. Bei Erreichen von ~100 mm³ Tumoren begannen Experimente. Alle Verfahren folgten institutionellen ethischen Richtlinien.

In-vivo Biodistribution und Zirkulation

AuNR@BSA (200 µL) wurde über den Schwanzvene injiziert. Blutproben wurden bei 0,25, 2, 4, 6, 8, 12, 36 und 48 h entnommen, mit HNO₃ und H₂O₂ verdaut, und Au-Gehalt per ICP-OES quantifiziert. Organe (Herz, Leber, Milz, Lunge, Niere) wurden 24 h post-Injektion entnommen, verdaut und Au-Konzentrationen ähnlich gemessen.

Phothermische Behandlungs-Effizienz

Mäuse wurden in vier Gruppen aufgeteilt: (1) AuNR@BSA, (2) AuNR@BSA + Laser, (3) nur Laser, (4) Kontrolle. AuNR@BSA (200 µL) wurde intratumoral injiziert, gefolgt 10 min später von 1064 nm Bestrahlung (0,75 W cm⁻², 10 min). Tumortemperatur, Volumen und Körpergewicht wurden 14 Tage überwacht. Tumoren wurden am Studienende exzidiert.

Datenanalyse

Statistische Analysen wurden mit SPSS 16.0 durchgeführt. Daten sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt; Signifikanz wurde bei p < 0,05 angesetzt.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung von AuNR@CTAB

Optimierung von NaBH₄, HCl und Ag⁺ Konzentrationen ermöglichte Kontrolle über Aspektverhältnis und SPR-Peakposition. Erhöhung von NaBH₄ blau-verschob den Peak von 1223 auf 865 nm, während höheres HCl rot-verschob ihn von 871 auf 1070 nm. Reduzierung der Ag⁺ Konzentration verlängerte den SPR-Peak weiter. Finale AuNRs zeigten weinrote Farbe und Absorptionsmaximum bei 1064 nm (Abb. 1). Diese Wellenlänge aligniert mit dem NIR-II-Fenster und matcht verfügbare Laserquellen.

Abbildung 1. Photophysikalische Eigenschaften von AuNR@CTAB unter variierenden Synthesebedingungen: (a) Herstellungsschema; (b) TEM-Bild; (c) UV-Vis-Spektren vs. NaBH₄; (d) vs. HCl; (e) vs. AgNO₃.

Synthese und Charakterisierung von AuNR@BSA

CTAB, obwohl effektiv für Nanostabwachstum, ist zytotoxisch über 1–10 µM und kann bei niedrigen Temperaturen ausfällen. Ersetzen von CTAB durch BSA mildert Toxizität und verbessert kolloidale Stabilität. AuNR@BSA behielt ähnliches Aspektverhältnis, zeigte aber ~30 nm rotverschobenen SPR-Peak bei 1064 nm (Abb. 2). Zeta-Potenzial wechselte von positiv (CTAB) zu negativ (BSA), was Oberflächenwechsel bestätigt. FT-IR-Spektren zeigten charakteristische BSA-Amide-Banden (1649 und 1539 cm⁻¹). DLS zeigte hydrodynamische Durchmesser von 8,6 nm und 89 nm für zwei Populationen, was leichte Größenvergrößerung bei BSA-Beschichtung anzeigt. TEM bestätigte stäbchenförmige Morphologie mit leicht abgerundeten Enden (Abb. 2). Alle Dimensionen blieben unter 100 nm, was Tumorpenetration begünstigt.

Abbildung 2. Charakterisierung von AuNR@BSA und AuNR@CTAB: (a) Synthese; (b) UV-Vis-Spektren; (c) DLS-Größenverteilung; (d) TEM-Bilder.

In-vitro Photothermischer Effekt

AuNR@BSA (OD ≈ 1) erreichte Temperaturanstieg von ~25 °C auf 80 °C innerhalb 5 min unter 0,35 W cm⁻², plateaute danach (Abb. 3A). Temperatur skalierte linear mit Laserleistung (Abb. 3B). Erhöhung von OD steigerte Spitzen temperaturen weiter. Photothermische Stabilität wurde über drei 10-min Bestrahlungszyklen bei 0,5 W cm⁻² bestätigt (Abb. 3D). Thermische Bilder zeigten Spitzen temperaturen von 85,5 °C für AuNRs vs. 44,5 °C für PBS (Abb. 3E). Diese Ergebnisse unterstreichen die überlegene photothermische Konversion und Stabilität von BSA-beschichteten Nanostäben im NIR-II-Bereich.

Abbildung 3. In-vitro photothermische Leistung: (a) Temperatur vs. Zeit; (b) Temperatur vs. Laserleistung; (c) Temperatur vs. Absorbance; (d) Drei-Zyklus-Stabilität; (e) Thermische Bilder.

In-vitro Zytotoxizität und Photothermische Toxizität

AuNR@CTAB zeigte signifikante Zytotoxizität selbst bei niedrigen Konzentrationen (OD ≈ 0,05), während AuNR@BSA >80 % Zellvitalität bis OD ≈ 1 aufrechterhielt (Abb. 4A). Photothermische Behandlung (0,75 W cm⁻², 10 min) reduzierte 4T1-Zellvitalität auf ~20 % bei OD ≈ 1, während Kontrollzellen ~100 % vital blieben (Abb. 4B). Somit erhält BSA-Beschichtung Biokompatibilität bei Ermöglichung effektiver photothermischer Abtötung.

Abbildung 4. Zytotoxizität und photothermische Toxizität: (a) Zellvitalität vs. Konzentration; (b) Vitalität mit/ohne Laser.

In-vivo Biodistribution und Zirkulation

AuNR@BSA zeigte Halbwertszeit von ~1,5 h in Zirkulation (Abb. 5A). Nach 24 h war vorwiegende Akkumulation in Leber und Milz beobachtet, konsistent mit retikuloendothelialer System-Aufnahme (Abb. 5B). Diese Ergebnisse deuten auf Potenzial für leber-milz-gerichtete Anwendungen hin.

Abbildung 5. Biodistribution: (a) Au-Konzentration im Blut über Zeit; (b) Organverteilung bei 24 h.

In-vivo Photothermische Behandlung

Intratumorale Injektion von AuNR@BSA gefolgt von 1064 nm Bestrahlung (0,75 W cm⁻², 10 min) erhöhte Tumortemperatur auf ~64 °C, während Kontrollgruppen nahe Körpertemperatur blieben (Abb. 6D). Über 14 Tage zeigte die AuNR@BSA + Laser-Gruppe vollständige Tumorablation ohne Rezidiv; Tumoren in Kontrollgruppen progredierten rapide (Abb. 6A, B). Postmortem-Analyse bestätigte Abwesenheit residualen Tumorgewebes (Abb. 6C). TEM behandelter Tumoren zeigte intakte AuNRs, was in-vivo Photostabilität belegt (Abb. 7).

Abbildung 6. In-vivo Behandlungsergebnisse: (a) Tumorvolumen; (b) Körpergewicht; (c) Tumor-Fotografien; (d) Infrarot-Thermografie; (e) Post-Behandlungs-Bilder.

Abbildung 7. TEM von AuNR@BSA in Tumorgewebe: (a) behandelt; (b) unbehandelt.

Schlussfolgerung

Wir haben BSA-beschichtete Goldnanostäbe mit 1064 nm SPR-Peak synthetisiert, die hohe photothermische Effizienz mit verbesserter Biokompatibilität kombinieren. In-vivo-Studien demonstrierten schnelle Tumorablation in einem Brustkrebs-Mausmodell mittels Low-Dose NIR-II Laserbestrahlung. Die Nanostäbe zeigen günstige Biodistribution mit signifikanter Leber- und Milzaufnahme und bewahren Photostabilität in der Tumormikroumgebung. Diese Attribute positionieren AuNR@BSA als vielversprechende Plattform für NIR-II Photothermische Therapie, potenziell in Kombination mit Immuntherapie oder Chemotherapie für personalisierte, sichere und effektive Krebsbehandlung.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Der Datensatz dieser Studie ist auf vernünftige Anfrage beim korrespondierenden Autor verfügbar. Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.