BSA-beschichtete Gold-Nanostäbe für die photothermische NIR-II-Therapie

Einführung

Gold-Nanopartikel haben aufgrund der hervorragenden Biokompatibilität und der geringen Zytotoxizität in der biomedizinischen Forschung großes Interesse auf sich gezogen. Beispielsweise erwiesen sich die Goldnanopartikel mit hoher Röntgendämpfungseffizienz als vielversprechend für die Computertomographie (CT)-basierte Tumordiagnostik [1, 2]. Darüber hinaus weisen Goldnanopartikel hervorragende optische Eigenschaften auf, die als Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Effekt bekannt sind. Die Goldnanopartikel könnten die Photonenenergie effizient in thermische Energie für die Krebstherapie in Gegenwart von Oberflächenplasmonenresonanzlicht umwandeln [3, 4]. Daher wurden verschiedene Goldnanopartikel mit einstellbarer Größe und Morphologie für die photothermische Ablation von Tumoren entwickelt, beispielsweise Goldnanostäbchen, Goldnanoschalen und Goldnanokäfige [5,6,7]. Insbesondere Goldnanostäbchen (AuNR) mit einstellbarer anisotroper Form und Größe wurden aufgrund ihrer ausgezeichneten photothermischen Stabilität, Biokompatibilität und starken Absorption im NIR-Bereich umfassend untersucht [8]. Es ist allgemein bekannt, dass Nahinfrarotlicht effektiver in biologisches Gewebe eindringen kann als sichtbares Licht, da der Lichtstreuverlust umso geringer ist, je länger die Lichtwellenlänge ist [9]. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die stäbchenförmigen Nanopartikel eine dramatisch verbesserte Tumorpermeabilität und eine längere Blutzirkulationszeit aufweisen, was zu einer höheren Tumorakkumulation führt [10, 11]. Der wesentliche Nachteil bei der Anwendung von Goldnanostäbchen in der photothermischen Therapie (PTT) ist jedoch die Hochleistungslaserbestrahlung, die eine starke Schädigung des normalen Gewebes verursachen würde (maximal zulässige Lichtintensität) [12]. Es wurde nachgewiesen, dass die PTT im zweiten Nahinfrarotfenster (NIR-II, 1000–1700 nm) eine viel größere Gewebeeindringtiefe hat als die in NIR-I (700–1000 nm), da die viel geringere Lichtstreuung in NIR -II [13,14,15,16,17]. Daher wird erwartet, dass die PTT-Nanoplattform im NIR-II eine effektivere PTT-Behandlung von Tumoren ermöglicht und ein großes klinisches Anwendungspotenzial für eine komplexere Tumortherapie besitzt. Allerdings ist die Herstellung der Goldnanostäbchen mit langwelliger Absorption und geringer Zytotoxizität noch immer eine große Herausforderung. Hier berichten wir über die Synthese von Goldnanostäbchen nach der kernlosen Methode mit Absorptionspeaks im zweiten Fenster des Nahinfrarotfensters (1000–1300 nm). Durch Beschichtung mit BSA wurde eine Oberflächenmodifikation eingeführt, um die Zytotoxizität zu reduzieren. Das Aspektverhältnis von präparierten Goldnanostäbchen (AuNR@BSA) wurde durch Transmissionselektronenmikroskop (TEM) und dynamische Lichtstreuung (DLS) charakterisiert. Das Brustkrebs-Tumor-tragende Mausmodell wurde verwendet, um die photothermische therapeutische Wirkung von AuNR@BSA zu testen. Wir haben festgestellt, dass der Tumor mit einer Lichtintensität von nur 0,75 W/cm ² . gut behandelt werden kann .

Materialien und Methoden

Materialien

Goldchlorid-Trihydrat (HAuCl₄ ·3H₂ O) (99,9%), Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) (99%), Salpetersäure (GR, 65–68%), und Wasserstoffperoxidlösung (GR, 30%) wurden von Shanghai Aladdin Biological Technology Co. Ltd . Natriumborhydrid (NaBH₄ ) (97%) und Silbernitrat (AgNO₃ ) (99,8%) wurden von Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co. Ltd. bezogen. Salzsäure (HCl) (38%) wurde von Dongguan Dongjiang Chemical Reagent Co. Ltd. bezogen. Hydrochinon (99%) wurde von Energy Chemical bezogen. Rinderserumalbumin (98%) wurde von Sigma-Aldrich bezogen. Natriumhydroxid (AR,96 %) wurde von Greagent erhalten.

RPMI 1640 Medium und Penicillin-Streptomycin wurden von HyClone bezogen. Phosphatgepufferte Lösung (PBS) wurde von Corning bezogen. Pankreatin wurde von Coolaber bezogen. Fötales Rinderserum (FBS) wurde von Gibco bezogen. 4T1-Zellen wurden vom Forschungszentrum für Biomedizinische Optik und Molekulare Bildgebung des Shenzhen Institute of Advanced Technology der Chinesischen Akademie der Wissenschaften bereitgestellt. Dojindo Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd lieferte das Cell Counting Kit-8 (CCK-8) für den Zellproliferations- und Toxizitätstest. Während des gesamten Experiments wurde Millipore Reinstwasser verwendet.

Herstellung von AuNR@CTAB-Nanopartikeln

Die Synthese von Gold-Nanostäbchen wird wie folgt durchgeführt:0,4 ml HAuCl₄ (aq) (10 mM) und 10 ml CTAB(aq) (0,1 M) wurden zu 23–33 µl AgNO₃ . gegeben (wässrig) (100 mM). Dann wurden 10–30 µL HCl (1,2 M) und 525 µL wässriges Hydrochinon (0,1 M) unter vorsichtigem Mischen zu der Wachstumslösung gegeben. Die Farbe der Wachstumslösung wechselte von Orange zu einem sehr hellen Gelb. Nach 15 Minuten Rühren 10–40 µL frisch zubereitetes eiskaltes NaBH₄ (aq) (10 mM) Lösung wurde in die Wachstumslösung injiziert. Die Mischung wurde 30 s lang gerührt und 18 h bei Raumtemperatur gealtert. Das AuNR@CTAB wurde dann zweimal mit PBS gewaschen.

Vorbereitung von AuNR@BSA

Zuerst fügen wir eine bestimmte Menge CTAB hinzu, um seine Konzentration in der AuNR@CTAB-Lösung auf 1 mM einzustellen, und dann löst Ultraschall CTAB vollständig auf. 3 ml AuNR@CTAB werden langsam zu 3 ml BSA-Lösung (10 mg/ml) gegeben und die gemischte Lösung wird 30 Minuten lang beschallt. Nach Zentrifugation bei 9500×r für 40 Minuten wurde der Überstand durch 6 ml BSA-Lösung (5 mg/ml) ersetzt und dann wurde der pH-Wert mit Natriumhydroxid (2 M) auf 11–12 eingestellt und mindestens 18 . gerührt h. Danach wurde das synthetisierte AuNR@BSA bei 9500 × 40 Minuten lang zentrifugiert, dann zweimal mit PBS gewaschen und zur weiteren Verwendung in PBS gelöst.

Charakterisierungen von AuNR@CTAB- und AuNR@BSA-Nanopartikeln

Die Morphologieanalyse der Goldnanostäbchen wurde von Beijing Zhongke Baice Co., Ltd. durch das Talos F200X Elektronenmikroskop durchgeführt, um TEM-Bilder zu erhalten. Zetasizer Nano ZS (Malvern, UK) wurde verwendet, um die Größenverteilung und das Zetapotential verschiedener Nanopartikel mittels DLS zu untersuchen. Das UV-Vis-Absorptionsspektrum wurde mit dem UV-2700 Ultraviolet-Visible Spectrophotometer (SHIMADZU, Japan) bestimmt.

Zur morphologischen Charakterisierung von AuNR@BSA im Inneren des Tumors wurden 100 µL AuNR@BSA (OD = 25 bei 1064 nm) mit einer Bestrahlung von etwa 10 Minuten in Tumorstellen injiziert, danach wurden die behandelten Tumoren gesammelt. Nicht behandelter Tumor wurde als Kontrolle gesammelt. Die gesammelten Tumoren wurden in 2,5% Glutaraldehydlösung (Coolaber.co., Peking, China) für die Transmissionselektronenmikroskopie (Beijing Zhongke Baice Co., Ltd.) inkubiert. Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie-(FT-IR)-Muster und Röntgenbeugungs-(XRD)-Muster von AuNR-Proben wurden von Beijing Zhongke Baice Co., Ltd. erhalten.

Messung der photothermischen Leistung von AuNR@CTAB und AuNR@BSA

Die Goldnanostäbchenlösung wurde auf eine unterschiedliche OD bei 1064 nm (0,5, 1, 1,5 und 2) verdünnt, und die PBS wurde als Blindwertkontrolle verwendet. Die Goldnanostäbchen (500 µL) wurden mit einem 1064 nm-Laser (Haoliangtech, Shanghai, China) mit einer Leistungsintensität von 0,35–1 W/cm ² . bestrahlt 30 Minuten lang Die Temperatur wurde mit einer Infrarot-Wärmebildkamera (FLUKE TI25) aufgezeichnet.

Photostabilität von AuNR@BSA

Zur Prüfung der Photostabilität wurden die Absorptionsspektren von AuNR@BSA in Abhängigkeit von der Bestrahlungszeit gemessen. Die AuNR@BSA (OD = 1) wurden mit einem NIR-Laser (1064 nm, 0,5 w/cm ² .) bestrahlt ). Von 0 bis 10 Minuten wurde das Spektrum jede Minute aufgezeichnet. Der photothermische Zyklustest wurde auch durchgeführt, als die AuNR@BSA-Lösung (0,5 ml) mit jeder 10 min ein- und ausgeschalteten Laserbestrahlung (1064 nm, 0,5 W/cm ² .) bestrahlt wurde ) und die Temperaturänderung wurde aufgezeichnet.

Zelluläre Kultur

Murine Brustkrebszelllinie (4T1-Zellen) wurde in RPMI 1640 kultiviert, das 10 % FBS und 100 E/ml Penicillin oder 100 µg/ml Streptomycin enthielt. Die Kulturumgebung beträgt 37 °C und die Befeuchtungsbedingung beträgt 5 % CO₂ .

In-vitro Zytotoxizitätsbewertung von Goldnanopartikeln

Der CCK-8-Assay wurde verwendet, um die Zytotoxizität von Gold-Nanostäbchen zu identifizieren. 4T1-Zellen wurden in 96-Well-Platten (5 × 10 ³ pro Well) und 24 h inkubiert. Anschließend wurden 10 μL verschiedener Konzentrationen von AuNR@CTAB und AuNR@BSA zugegeben und weitere 24 h inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden 10 μl CCK-8-Lösung in jede Vertiefung gegeben und 40 Minuten inkubiert, gefolgt von einer Messung der Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät.

Für Phototoxizität wurden 4T1-Zellen vorab in eine 96-Well-Platte ausgesät (5 × 10 ³ pro Well) und 24 h inkubiert, dann wurden die Zellen mit einem NIR-Laser (1064 nm, 0,75 W/cm ² .) bestrahlt , 10 min) und weitere 24 h inkubiert. Danach wurden 10 μL CCK-8-Lösung in jede Vertiefung gegeben und weitere 40 min bei 37 °C inkubiert. Dann wurde ein Mikroplatten-Lesegerät verwendet, um die Absorption jeder Vertiefung bei 450 nm zu erkennen.

Tumor tragendes Mausmodell

Alle BALB/c-Mäuse wurden von Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. gekauft. Alle Tierversuchsverfahren wurden gemäß den vom Shenzhen Institute of Advanced Technology Committee der Chinesischen Akademie der Wissenschaften genehmigten Standardverfahren durchgeführt. Das Tumormodell wurde durch subkutane Injektion von 4T1-Zellen (2 × 10 ⁶ ) in den Rücken von Mäusen. Tierstudien wurden durchgeführt, wenn das Tumorvolumen etwa 100 mm ³ . erreicht .

In vivoBlutzirkulation und Bioverteilung

Zur Messung der Zirkulationszeit wurden zunächst 200 μl AuNR@BSA intravenös in die Schwanzvene von BALB/c-Mäusen injiziert, und dann wurden 20 μl Blut bei 0,25, 2, 4, 6, 8, 12, 36 und entnommen 48 h und verdünnt mit 30 μl PBS, um eine Blutprobe von 50 μl zu erhalten. Etwa 400 μl konzentriertes HNO₃ (chromatographische Qualität) wurde zugegeben, der Deckel wurde festgezogen und 2 h bei 90 °C aufgeschlossen. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur 150 μl H₂ O₂ (chromatographische Qualität) wurde langsam zugetropft und dann 1 h ohne Abdeckung auf 90 °C erhitzt. Am Ende wurde die Lösung mit Reinstwasser auf 5 ml verdünnt. Die Konzentration der Au-Ionen wurde durch optische Emissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES) gemessen, nachdem sie durch einen 0,44 mm-Nylon-Spritzenfilter geleitet wurde.

Zur Bioverteilungsmessung wurden BALB/c-Mäusen etwa 200 μL AuNR@BSA intravenös in die Schwanzvene injiziert. Nach 24 h wurde die Maus getötet und Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere wurden entnommen und in einem Ofen bei 80 °C getrocknet. Vor der Verdauung wurde jedes Organ gewogen, 800 μL konzentrierte HNO₃ (GR) wurde zugegeben und 2 h auf 90 °C erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur 200 μL H₂ O₂ (GR) wurde langsam tropfenweise zugegeben, 1 h auf 90 °C erhitzt und dann wurde die Lösung mit ultrareinem Wasser auf 10 ml verdünnt. Schließlich wurde die Konzentration der Au-Ionen durch ICP-OES gemessen, nachdem sie durch einen 0,44 mm-Nylon-Spritzenfilter geleitet wurde.

Effizienz der photothermischen Behandlung

Um die thermotherapeutische Wirkung von AuNR@BSA zu bewerten, wurden die tumortragenden Mäuse mit 4T1-Tumoren zufällig in vier Gruppen mit einem Tumorvolumen von etwa 100 mm ³ . eingeteilt :(1) AuNR@BSA, (2) AuNR@BSA + Laser; (3) Nur Laser (4) Leerkontrolle. Eine Infrarot-Wärmebildkamera wurde verwendet, um das Infrarot-Wärmebild der Tumorstelle aufzunehmen. Das Tumorvolumen und das Körpergewicht der Mäuse wurden vor bzw. nach der Behandlung aufgezeichnet. Das Tumorvolumen kann nach der Normalgleichung berechnet werden (volume = width ² × Länge/2). Zwei Wochen später wurden die Mäuse getötet und die Tumoren isoliert.

Datenanalyse

Zur Datenanalyse wurde die Statistiksoftware SPSS 16.0 verwendet. Die Messdaten wurden als Mittelwert   ± d ausgedrückt, der Vergleich zwischen den Gruppen erfolgte durch Varianzanalyse und der Vergleich der Zähldaten wurde durch den Chi-Quadrat-Test durchgeführt. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung von AuNR@CTAB

Es wurde festgestellt, dass die kleineren Goldnanostäbchen eine bessere Pharmakokinetik und eine geringere Zytotoxizität aufweisen [18]. Der SPR-Absorptionspeak von Goldnanostäbchen hängt jedoch stark mit dem Aspektverhältnis zusammen, je größer das Aspektverhältnis ist, desto niedriger ist die Energie des SPR-Peaks. Um AuNR mit großem Aspektverhältnis zu synthetisieren und dabei die Größe möglichst klein zu halten, wurden die Syntheseparameter wie Tensidkonzentration, pH-Wert der Wachstumslösung und Reduktionsmittelkonzentration optimiert. Die NaBH₄ (aq) ist eine Art starkes Reduktionsmittel, das über LaMer-Burst-Keimbildung einen Au-Kern bildet, gefolgt von einer schnellen zufälligen Anlagerung von Au-Ionen und einer Intra-Partikel-Reifung [19]. Als Molmenge von NaBH₄ mit zunehmender Zunahme erfährt der maximale Absorptionspeak von Goldnanostäbchen eine Blauverschiebung von 1223 auf 865 nm (Abb. 1C). Der pH-Wert der Wachstumslösung ist auch ein wichtiger Parameter zur Kontrolle des Wachstums von Gold-Nanostäbchen, der über die Salzsäuremenge eingestellt wird [20]. Es wurde festgestellt, dass der maximale Absorptionspeak von Goldnanostäbchen allmählich von 871 auf 1070 nm rotverschoben wird, während die Menge an Salzsäure erhöht wird (Abb. 1D). Außerdem Ag ⁺ gilt als in der Lage, die Wachstumsrichtung von Goldnanostäbchen zu kontrollieren, und je niedriger der Ag ⁺ Konzentration konnte die längere Absorptionswellenlänge des SPR-Peaks realisiert werden (Abb. 1E). Am Ende sind die synthetisierten Goldnanostäbchen weinrot, wie in Abb. 1B gezeigt. Angesichts der Syntheseeffizienz von Gold-Nanostäben und der Verfügbarkeit von Laserlichtquellen haben wir uns daher für Gold-Nanostäbe mit einem maximalen Absorptionspeak bei 1064 nm für die photothermische Behandlung von Tumoren entschieden.

Die Photoeigenschaften von AuNR@CTAB bei verschiedenen Synthesebedingungen. a Die Vorbereitung von AuNR@CTAB. b Das Bild von CTAB-beschichteten Goldnanostäbchen (AuNR@CTAB), c UV-Vis-Spektren von präpariertem AuNR@CTAB mit variierendem NaBH₄ Konzentration, d UV-Vis-Spektren von präpariertem AuNR@CTAB mit variierender HCl-Konzentration e UV-Vis-Spektren von präpariertem AuNR@CTAB mit variierendem AgNO₃ Konzentration

Synthese und Charakterisierung von AuNR@BSA

Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) ist die am häufigsten verwendete Verbindung für die Synthese von Goldnanostäbchen mit präzisen Längen und Aspektverhältnissen. CTAB weist jedoch eine signifikante Zytotoxizität auf, wenn die Konzentration höher als 1–10 μM ist. Die Anwendung der CTAB-beschichteten Goldnanostäbchen (AuNR@CTAB) in der Biomedizin ist stark eingeschränkt [21]. Darüber hinaus wird die kolloidale Stabilität von CTAB-beschichteten Goldnanostäbchen in wässriger Lösung dramatisch von der Temperatur beeinflusst, die bei niedrigen Temperaturen leicht kristallisiert werden kann [22]. Angesichts der Verringerung der Zytotoxizität von CTAB und der Verbesserung seiner Stabilität wurden mehrere Ansätze vorgeschlagen, um CTAB während des Syntheseprozesses der Goldnanostäbchen zu ersetzen oder die CTAB-beschichteten Goldnanostäbchen zu funktionalisieren. Unter Verwendung von Polymeren, Peptiden, Tensiden und Lipiden zur Modifizierung der Nanopartikeloberfläche verwenden die meisten dieser Strategien thiolierte Moleküle oder elektrostatische Wechselwirkungskräfte, um an die Goldoberfläche zu binden [23]. Proteine ​​sind die vielversprechendsten Optionen als Vorteile der kolloidalen Stabilität, Biokompatibilität und weiteren Funktionalisierung. [26]

Die CTAB- und BSA-umhüllten Goldnanostäbchen sind in Abb. 2A dargestellt. Der maximale Absorptionspeak von AuNR@BSA liegt bei etwa 1064 nm, was im Vergleich zu AuNR@CTAB um etwa 30 nm rotverschoben ist (Abb. 2B). Das Zetapotential der Goldnanostäbchen änderte sich von positiv zu negativ durch den Austausch der CTAB-Beschichtung durch BSA (Zusatzdatei 1:Abb. S1). Aus den FTIR-Spektren von AuNR@BSA und AuNR@CTAB (Zusatzdatei 1:Abb. S2) konnten wir feststellen, dass zwei charakteristische Peaks bei 1649 cm ⁻¹ und 1539 cm ⁻¹ im Fall von AuNR@BSA, die auf die Amid-I- und Amid-II-Schwingungsbanden von BSA zurückgeführt wurden. Die dynamische Lichtstreuung (DLS) wurde auch angewendet, um die hydrodynamische Größe von AuNR@CTAB und AuNR@BSA zu analysieren; außerdem wurde die Morphologie von AuNR@BSA und AuNR@CTAB durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) charakterisiert, wie in Abb. 2C, D gezeigt. Zwei Peaks konnten bei der Streuintensitätsmessung von DLS eindeutig gefunden werden, einer mit einer hydrodynamischen Größe von etwa 3,10 ( ± 0.85) nm und der andere etwa 57.45 (± 24.22) nm für AuNR@CTAB. Im Fall von AuNR@BSA verschieben sich die Peaks jedoch zu 8.64 (± 3.80) nm und 89.24 (± 42.24) nm. Wir konnten feststellen, dass die Form von AuNR nach der Beschichtung mit BSA ähnlich bleibt, außer dass die Enden leicht abgerundet werden (Abb. 2C, D). Für In-vivo-Therapieanwendungen ist die kritische Größe von Nanopartikeln auf unter 100 nm begrenzt [25]. Jenseits dieser Größe ist die Fähigkeit von Nanopartikeln, Tumore zu durchdringen, begrenzt; daher wären die vorgestellten Goldnanostäbchen ein idealer Kandidat für die Tumortherapie [24]. Wie in Zusatzdatei 1:Abb. S3 gezeigt, können die charakteristischen Peaks von Au im XRD-Muster aus den (111)-, (200), (220)- und (311)-Ebenen der Au-Nanopartikel deutlich beobachtet werden.

Charakterisierung von AuNR@BSA und AuNR@CTAB. a Vorbereitung von AuNR@BSA. b UV-Vis-Spektren von AuNR@CTAB (L) und AuNR@BSA (R). c Die DLS-Intensitätsmessung von AuNR@CTAB und AuNR@BSA. d Die TEM-Bilder von AuNR@CTAB und AuNR@BSA

In-vitro Photothermische Wirkung von Gold-Nanostäbchen

Der 1064 nm Diodenlaser als wirtschaftlichste NIR-II-Lichtquelle gilt als optimale Wellenlänge für die photothermische Therapie. Daher wird die ideale NIR-II-Gold-Nanoplattform für eine effiziente photothermische Therapie als starke SPR-Absorption bei 1064 nm, hohe photothermische Effizienz und ausgezeichnete photothermische Stabilität angesehen. Um den photothermischen Effekt des präparierten AuNR@BSA zu untersuchen, wurden PBS und verschiedene OD (= 0.5, 1, 1.5, 2) von AuNR@BSA bei 1064 nm mit einer Lichtintensität von 0.35 bis 1 W/cm ^{2<. angeregt /sup> 30 Minuten lang Ein Temperatur-Imager wurde verwendet, um die Temperaturänderungen alle 5 Minuten aufzuzeichnen, wie in Abb. 3A gezeigt. Der photothermische Effekt von AuNR@BSA und AuNR@CTAB ist bei gleicher Extinktion (OD = 1) deutlich höher als der von PBS. Wir konnten feststellen, dass die Temperatur in den ersten 5 Minuten schnell anstieg und dann für den Rest der Zeit bei etwa 80 °C blieb, wie in Abb. 3A dargestellt. Der photothermisch induzierte Temperaturanstieg bei PBS wird hauptsächlich durch die Obertonabsorption von Wasser bei 1064 nm verursacht. Die maximale Temperatur als Funktion der Lichtintensität ist in Fig. 3B veranschaulicht. Es wurde festgestellt, dass die photoinduzierte thermische Temperatur von AuNR@CTAB und AuNR@BSA bei einer Absorption von etwa 1 proportional zur Lichtintensität ist. Der Temperaturanstieg ist bei AuNR@CTAB und AuNR@BSA viel schneller als bei PBS, da die Laserintensität höher wird. Darüber hinaus zeigt Abb. 3C, dass unter den gleichen Bestrahlungsbedingungen (1064 nm, 0,75 W/cm 2 ) wird die maximale photothermische Temperatur dramatisch erhöht, wenn die Absorption beider AuNRs zunimmt. Die photothermischen Eigenschaften von BSA-beschichtetem AuNR sind etwas besser als die von CTAB-beschichteten. Die maximale photothermische Temperatur von AuNR@BSA (OD = 1, 61,1 °C) ändert sich innerhalb von drei Bestrahlungszyklen (0,5 W/cm 2 .) nicht signifikant , 10 min), was auf die ausgezeichnete photothermische Stabilität des präparierten AuNR@BSA hinweist (Abb. 3D). Abbildung 3E zeigt das photothermische Temperaturbild von AuNR@CTAB (OD = 1), AuNR@BSA (OD = 1) und PBS unter Laserbestrahlung für 10 Minuten. Die maximale Temperatur von PBS beträgt 44,5 °C, während die maximale Temperatur von AuNR bis zu 85,5 °C beträgt. Die obigen Ergebnisse zeigten, dass das synthetisierte AuNR@BSA als ausgezeichnetes photothermisches therapeutisches Mittel geeignete Absorptionseigenschaften, photothermische Umwandlungseffizienz und Photostabilität im NIR-II-Bereich besitzt.}

In-vitro-Bewertung der photothermischen Wirkung von AuNR@BSA. a Die photothermische Temperatur von AuNR@BSA und AuNR@CTAB als Funktion der Laserbestrahlungszeit (SPR-Absorption etwa 1.1064 nm, 1 W/cm ² ). b NIR-getriggerter Temperaturanstieg von PBS, AuNR@CTAB (OD = 1) und AuNR@BSA (OD = 1) als Funktion der Laserbestrahlungsintensität (1064 nm, 0,35 bis 1 W/cm ² ). c NIR-getriggerte Temperaturerhöhung von AuNR@BSA und AuNR@CTAB mit unterschiedlicher Extinktion für 10 min Laserbestrahlung (1064 nm, 1 W/cm ² ). d Photothermische Umwandlung von AuNR@BSA (OD = 1) unter drei Bestrahlungszyklen (1064 nm, 0,5 W/cm ² ). e Wärmebild von PBS, AuNR@CTAB (OD = 1), AuNR@BSA (OD = 1) unter Bestrahlung mit NIR-Laser (1064 nm, 1 W/cm ² ) in einem Zeitintervall von 5 und 10 Minuten. (Mittelwert ± SD, n = 3)

In-vitro Zytotoxizität und photothermische Toxizität von Gold-Nanostäbchen

Die CCK-8-Analyse wurde durchgeführt, um die Zytotoxizität von AuNR@CTAB und AuNR@BSA auf 4T1-Zellen bei unterschiedlichen Konzentrationen zu quantifizieren. Auch ohne Laserbestrahlung zeigt das AuNR@CTAB bereits bei sehr geringer Konzentration (Absorption ca. 0,05) eine signifikante Zytotoxizität, wodurch die biologische Anwendung stark eingeschränkt ist. Allerdings zeigt AuNR@BSA hervorragende biologische Anwendungsaussichten, beispielsweise liegt die Zelllebensfähigkeit noch im akzeptablen Bereich, da die AuNR@BSA-Absorption etwa 1 erreicht (Abb. 4A). Ermutigt durch die vielversprechende Stabilität und hohe photothermische Umwandlungseffizienz von AuNR@BSA wurde die photothermische Toxizität an 4T1-Tumorzellen in vitro mit einer Lichtintensität von etwa 0,75 W/cm ² . durchgeführt für 10 min. Eine signifikante photothermische Toxizität wurde bei einer Absorption von etwa 1 mit einer Zellüberlebensrate von etwa 20 % gefunden; bei strahlungsfreien Experimenten wurde jedoch eine Zellüberlebensrate von etwa 100 % gefunden (Abb. 4B, zusätzliche Datei 1:Abb. S4). Diese In-vitro-Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine photothermische Behandlung mit AuNR@BSA in der NIR-II-Region Krebszellen bei relativer Strahlungsintensität effektiv abtöten könnte.

In-vitro-Zytotoxizität und photothermische Toxizität von Goldnanostäbchen. a Zelllebensfähigkeit von 4T1-Zellen, die mit verschiedenen Konzentrationen von AuNR@CTAB und AuNR@BSA inkubiert wurden. b Zelllebensfähigkeit von 4T1-Zellen, die mit verschiedenen Konzentrationen von AuNR@BSA ohne und mit NIR-Laserbestrahlung (1064 nm, 0,75 W/cm ² .) inkubiert wurden , 10 Minuten). (Mittelwert ± SD, n = 3)

In VivoBiodistributionsstudien

Die Blutzirkulationszeit ist für die erfolgreiche Verabreichung der Nanopartikel-basierten Medikamente unerlässlich [24]. Die Blutzirkulationszeit von AuNR@BSA wurde anhand der Au-Konzentration mittels ICP-OES überwacht und betrug etwa 1,5 h (Halbwertszeit) (Abb. 5A). Die In-vivo-Bioverteilung von AuNR@BSA wurde auch anhand der Au-Konzentration in verschiedenen Organen gemessen (Zusatzdatei 1:Abb. S5). Wie in Abb. 5B gezeigt, wurde AuNR@BSA aufgrund ihrer starken Phagozytose als Organ des retikuloendothelialen Systems (RES) nach 24 h intravenöser Injektion in Leber und Milz stark akkumuliert [27, 28]. Diese Ergebnisse zeigen, dass AuNR@BSA effektiv in Leber und Milz akkumulieren kann. AuNR@BSA hat potenzielle Anwendungen bei Leber- und Milzerkrankungen.

Die Bioverteilung von AuNR@BSA in Blut und Organen. a Die Au-Konzentration im Blut als Funktion der Zeit durch intravenöse Injektion von AuNR@BSA. b Die Bioverteilung von AuNR@BSA in verschiedenen Organen

In Vivo Nahinfrarot-Photothermie-Behandlung von Gold-Nanostäben

Die ausgezeichnete photothermische Leistung von AuNR@BSA ermutigt uns, die photothermische In-vivo-Therapie bei tumortragenden BALB/c-Mäusen fortzusetzen. AuNR@BSA wurde in situ in den Tumor injiziert, und 10 Minuten später (1064 nm, 0,75 W/cm ² .) wurde das Licht für die photothermische Therapie eingeführt ). Die in-vivo-Temperaturvariation wurde durch eine Wärmebildkamera überwacht. Die Temperaturänderungen vor und nach der Behandlung sind in Fig. 6D dargestellt. Die Temperatur der Tumorstelle betrug innerhalb von 10 Minuten nach der Bestrahlung etwa 63,9 °C und blieb bei dieser Temperatur nur geringfügig schwanken (Abb. 6D). Im Gegensatz dazu gibt es für die Kontrollgruppe unter den gleichen Bestrahlungsbedingungen (AuNR@BSA-Gruppe, PBS-Gruppe, Lasergruppe) keine beobachtbare Temperaturänderung. Nach der photothermischen Therapie wurden das Tumorvolumen und das Körpergewicht der Mäuse 14 Tage lang alle zwei Tage überwacht. Wie in Abb. 6A, B dargestellt, wurde der Tumor der AuNR@BSA_Laser-Gruppe vollständig gehemmt und blieb als verbrannter Schorf an der ursprünglichen Tumorstelle zurück, während der der Kontrollgruppen relativ schnell und außer Kontrolle wuchs (AuNR@BSA-Gruppe, PBS-Gruppe, Lasergruppe). Der Schorf ist die verbrannte Haut, was direkt beweist, dass der PPT-Prozess mit injiziertem AuNR@BSA eine übermäßige lokale Hitze an der Tumorstelle verursachen könnte. Der photothermische Effekt ist sehr effizient, da wir beobachteten, dass die soliden Tumoren in der AuNR@BSA + -Lasergruppe zwei Tage nach der Behandlung schnell abnahmen. Um die Tumorveränderungen nach der Behandlung weiter zu erfassen, wurden die Mäuse am Ende der Beobachtung nach 14 Tagen getötet und die Tumoren isoliert. Wie in Fig. 6C gezeigt, wurde die Tumorgröße der AuNR@BSA_laser-Behandlungsgruppe vollständig unterdrückt, während bei allen anderen Gruppen unkontrolliertes Wachstum festgestellt wurde. Bilder von Mäusen aus der Gruppe (AuNR@BSA + laser) zeigten, dass die Tumore nach 14-tägiger Behandlung nicht weiter wuchsen (Fig. 6E). Daher ist AuNR@BSA für die Nahinfrarot-Laserbestrahlungstherapie mit dem zweiten Fenster ein idealer Kandidat für die lichtgetriggerte PTT in vivo, wenn man die ideale therapeutische Fähigkeit und keine offensichtliche Zytotoxizität berücksichtigt. Dies zeigt deutlich, dass eine einfache Hyperthermie mit der aktuellen NR-II-Therapie das Tumorwachstum wirksam hemmen kann (Zusatzdatei 1).

Photothermische Behandlung von tumortragenden Mäusen. a Tumorvolumen als Funktion der Zeit unter verschiedenen Behandlungsbedingungen. b Körpergewichtsänderungen von Mäusen mit Tumoren als Funktion der Zeit, Nachbehandlung. c Fotografien von Tumorgeweben in verschiedenen Gruppen nach 14-tägiger Behandlung. d Infrarot-Thermografiebilder von tumortragenden Mäusen, die einem 1064-nm-Laser ausgesetzt wurden (0,75 W/cm ² .) , 10 min) 10 min nach der intratumoralen Injektion von AuNR@BSA. e Bilder von Mäusen der AuNR@BSA_laser-Gruppe nach der Behandlung. (Mittelwert ± SD, n = 2)

Außerdem wurde TEM für den isolierten Tumor nach photothermischer Behandlung und den unbehandelten Tumor genommen. Die AuNR konnte nach photothermischer Behandlung im Tumorgewebe beobachtet werden. Es lieferte weitere Beweise dafür, dass Gold-Nanostäbe immer noch eine ausgezeichnete Photostabilität in der Umgebung von Tumorgewebe aufweisen (Abb. 7).

Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von AuNR@BSA in Tumorgewebe a Behandelter Tumor. b Unbehandelter Tumor

Schlussfolgerung

Hier synthetisierten wir die AuNR@BSA mit dem SPR-Absorptionsmaximum im zweiten Nahinfrarotfenster für die photothermische Therapie, da ihre hervorragenden photothermischen Eigenschaften und Biokompatibilität. Die Biokompatibilität des berichteten AuNR wurde durch die Beschichtung mit Rinderserumalbumin signifikant verbessert, und die photothermischen Eigenschaften wurden nicht beeinflusst. The biodistribution of the intravenously injected AuNR@BSA indicates that large amounts of AuNR accumulated in the liver and spleen. The TEM image of AuNR@BSA inside tumor reveals that the high in vivo photostability of the AuNR and suggests that once upon injection, several phototreatment might be applied to reach the desired therapy outcomes. The excellent photothermal conversion of the reported AuNR was able to sufficiently inhibit tumor growth even under low light irradiation. The PTT of AuNR@BSA combined with other treatment strategies, such as immunotherapy and chemotherapy, would be promising for developing a useful tool for personalized, safe, and effective tumor treatment.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

The data set used and/or analyzed in this study can be obtained from the corresponding author upon reasonable request. All data generated or analyzed during this study is included in this published article.