Gezielte Krebsbehandlung: Dekorieren von Nanovesikeln mit pHLIP für saures Tumormikroenvironment-Erkennung

Zusammenfassung

Säure an der Oberfläche von Krebszellen ist ein Kennzeichen von Tumormikroenvironments, das nicht von der Tumorperfusion abhängt und somit als allgemeiner Biomarker für die Targeting von Tumorzellen dienen kann. Wir verwendeten das pH (niedrig) Einfügepeptid (pHLIP) zur Dekoration von Liposomen und Niosomen. pHLIP detektiert den pH-Wert an der Oberfläche von Krebszellen und fügt sich in die Membran der Zielzellen ein, wodurch Nanomaterial in die Nähe der Zellmembran gebracht wird. DMPC-Liposomen und Tween 20 oder Span 20 Niosomen mit und ohne pHLIP in ihrer Beschichtung wurden vollständig charakterisiert, um ein fundamentales Verständnis der Nanoträgereigenschaften zu erlangen und das rationale Design säureempfindlicher Nanovektoren zu erleichtern. Die Probenstabilität über Zeit und in Gegenwart von Serum wurde demonstriert. Die Größe, ζ-Potential und Morphologie der Nanovektoren sowie ihre Fähigkeit, einen hydrophilen Sondenstoff einzuschließen und dessen Freisetzung zu modulieren, wurden untersucht. pHLIP-dekorierte Vesikel könnten nützlich sein, um eine verlängerte (modifizierte) Freisetzung biologisch aktiver Substanzen für die Targeting von Tumoren und anderen sauren kranken Geweben zu erzielen.

Einleitung

Vor etwa einem Jahrhundert schwebte Paul Ehrlich die Idee von „Zauberkugeln“ für spezifischere und effektivere Arzneimittelabgabe vor [1]. Die „Zauberkugeln“ sollten in der Lage sein, das verabreichte Arzneimittel vor rauer Umgebung zu schützen, Nebenwirkungen durch Targeting auf krankes Gewebe zu verringern, Pharmakokinetik und Pharmakodynamik zu verbessern und die Arzneimittelfreisetzung zu modulieren [2].

1965 beobachtete Bangham erstmals Phospholipid-basierte Vesikel [3] und in den folgenden Jahren etablierte Gregory Gregoriadis das Konzept, dass Liposomen Arzneimittel einkapseln und als Arzneimittelabgabesysteme verwendet werden können. Insbesondere bestehen sie aus Phospholipid-geschlossenen Doppelschichten (Lamellen), wo die hydrophoben Lipidketten zwischen zwei hydrophilen Kopfgruppen-Schichten eingeschlossen sind. Die geschlossene Doppelschicht umgibt einen wässrigen Kern, was die Lokalisierung lipophiler oder hydrophiler Arzneimittel ermöglicht [4, 5].

Die Liposomengröße ist ein kritischer Parameter, der das Schicksal des Trägers nach Verabreichung beeinflusst, in Bezug auf Plasmaproteinadsorption, Erkennung durch das retikuloendotheliale System (RES), Zirkulationshalbwertszeit und zellulären Transport. Nanoskalige Träger können Zellinternalisierung und Tumortargeting begünstigen, daher haben sich viele Forscher auf „Nanonisierung“ konzentriert [6–9].

Um vielseitigere und ökonomischere Nanoträger zu erhalten, wurden synthetische Tenside zur Herstellung liposomenähnlicher Arzneimittelabgabesysteme eingesetzt. Nicht-ionische Tenside werden hierfür weit verbreitet verwendet und können sich in unilamellare oder multilamellare Vesikel (nicht-ionische Liposome, Niosome oder nicht-ionische Tensidvesikel) selbstassemblieren. Sorbitanester-Tenside (Spans®) sind lipophile Substanzen, die weit in der Niosomherstellung verwendet werden. Um die Vesikelzirkulationszeit zu verlängern und „Stealth“-Nanoträger zu erhalten, ist die Polyethylenglykol (PEG)-Inkorporation der Goldstandard: durch diese Konjugation werden ethoxyethylierte Sorbitanester-Tenside (Tweens®) erhalten. Sowohl Span als auch Tween zeichnen sich durch unterschiedliche hydrophil/lipophil Balance (HLB) Werte aus, und die Wahl des Tensids ermöglicht die Herstellung von Niosomen mit den gewünschten Eigenschaften [10]. Darüber hinaus wird die Zugabe von Cholesterin zur Verbesserung der Doppelschichtstabilität durch Strecken der Tensidschwänze verwendet, was den Gel-Flüssig-Phasenübergang des Tensids beeinflusst und der lipophilen Doppelschicht Steifigkeit verleiht [11, 12]. Der „optimierte“ Nanoträger ist darauf ausgelegt, die Formulierung zu verbessern und/oder das Targeting zu verstärken [10].

Heutzutage ist Krebs eine der Haupttodesursachen weltweit. Aktuelle therapeutische Ansätze haben eine Reihe von Limitationen, einschließlich ineffizienter Arzneimittelabgabe an Tumoren und fehlendem Tumortargeting, verbunden mit unerwünschten und gefährlichen Nebenwirkungen, die nanotechnologische Ansätze überwinden könnten [13].

Derzeit befinden sich verschiedene Targeting-Ansätze in Entwicklung. Die meisten basieren auf dem Targeting particular Biomarker, die auf der Oberfläche von Krebszellen überexprimiert sind. Da menschliche Tumoren jedoch sehr heterogen sind, werden allgemeinere Ansätze des Tumortargetings viel vorteilhafter sein. Säure an der Oberfläche von Krebszellen ist ein Kennzeichen von Tumormikroenvironments und hängt nicht von der Tumorperfusion ab, somit kann sie als allgemeiner Biomarker für das Targeting von Tumorzellen dienen [14]. pH (niedrig) Einfügepeptid (pHLIP) Technologie entwickelt sich rasant für Targeting-Bildgebung und therapeutische kleine Moleküle sowie Nanomaterialien zu Tumoren. pHLIP detektiert pH an der Oberfläche von Krebszellen und fügt sich in die Membran der Zielzellen ein [15, 16]. Der Einfügemechanismus von pHLIP wird durch die Protonierung negativ geladener Reste des Peptids bei niedrigem pH (pH < 7,0) ausgelöst. Dies führt zu einer Erhöhung der Hydrophobizität des Peptids, wodurch das Gleichgewicht in Richtung Partitionierung des Peptids in die Doppelschicht verschoben wird [17]. Mit pHLIPs dekorierte Nanoträger sind biokompatibel, können Tumoren targeten und zeigen verstärkte zelluläre Aufnahme durch Krebszellen. Unter den untersuchten pHLIP-beschichteten Nanopartikeln sind lipid-, polymer- und metallbasierte Nanomaterialien [18–21].

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, neuartige vesikuläre Nanoträger, dekoriert mit pHLIP, vollständig zu charakterisieren, um ein fundamentales Verständnis der Nanoträgereigenschaften zu erlangen und das rationale Design säureempfindlicher Nanovektoren zu erleichtern.

Materialien und Methoden

Materialien

Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Tween 20), Sorbitanmonolaurat (Span 20), Cholesterin (Chol), Hepes-Salz {N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure)}, menschliches Serum, Sephadex G-75, Calcein und Diphenylhexatrien (DPH) wurden von Sigma-Aldrich bezogen. 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) und 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramid] Natriumsalz (DSPE-Maleimid) wurden von Avanti Polar Lipids gekauft und Pyren von Fluka. pHLIP-Peptid (ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT) wurde von CS Bio synthetisiert und gereinigt. Alle anderen Produkte und Reagenzien waren analytischer Qualität.

Synthese von DSPE-pHLIP

pHLIP wurde mit DSPE-Lipiden in Methanol durch kovalente Konjugation von DSPE-Maleimid mit dem einzelnen Cysteinrest am N-Terminus von pHLIP konjugiert, wie zuvor beschrieben [18, 21, 22]. Kurz: 5 mg Peptid gelöst in 250 μL Methanol (mit Argon ausgeblasen) und DSPE-Maleimid (aus 9,9 mM Vorratslösung) gelöst in Chloroform wurden im molaren Verhältnis 1:1 gemischt. Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für ca. 2–6 h gehalten, bis die Konjugation abgeschlossen war. Der Reaktionsfortschritt bei der Konjugation von DSPE-Maleimid mit pHLIP wurde durch RP-HPLC mit einem Gradienten von 25 auf 80 % Acetonitril in Wasser mit 0,05 % TFA überwacht, indem ein Abfall des Peaks entsprechend dem unmarkierten pHLIP im Reaktionsgemisch beobachtet wurde. Das synthetisierte Konstrukt wurde durch SELDI-TOF-Massenspektrometrie charakterisiert. Die Konzentration des DSPE-pHLIP-Konjugats wurde durch Absorption mit dem molaren Extinktionskoeffizienten für pHLIP bestimmt: ε₂₈₀ = 13.940 M⁻¹ cm⁻¹.

Vesikelherstellung und -reinigung

Die Dünnschichtverdampfungsmethode wurde verwendet, um nicht-ionische Tensid- (aus Tween 20 oder Span 20) und Phospholipid- (aus DMPC) Vesikel herzustellen, mit und ohne pHLIP. In jeder Vesikelformulierung wurde Cholesterin in unterschiedlichen molaren Verhältnissen hinzugefügt (Tabelle 1) [23].

Die Probenzusammensetzung wurde optimiert, indem zuvor gut charakterisierte Strukturen [24, 25] gewählt wurden, bei denen die gleiche Menge pHLIP hinzugefügt wurde.

Die lipophilen Komponenten wurden zunächst in CHCl₃:CH₃OH-Gemisch (3:1) gelöst; das organische Lösungsmittel wurde dann unter Vakuum bei unterschiedlichen Temperaturen je nach Probe entfernt. Der erhaltene Film wurde mit 5 mL Hepes-Puffer (0,01 M pH 7,4) oder Natrium-Calcein-Lösung 10⁻² M hydratisiert. Die Suspension wurde ca. 5 min vortex-mischt, gefolgt von Sonikation (siehe Zusatzdatei 1: Tabelle S1, unterstützende Informationen) mit einer Mikrosonde bei 20 kHz (VibraCell-VCX 400-Sonics, Taunton, MA, USA). LipoDMPC-Sonikation wurde unter Inertgasatmosphäre durchgeführt, um Oxidation zu verhindern.

Die Vesikelsuspension wurde dann durch Gelpermeationschromatographie mit Sephadex G-75 (Glas-Säule 50 × 1,2 cm) und Hepes-Puffer als Eluent gereinigt. Anschließend wurde die gereinigte Vesikelsuspension durch Zellulosefilter mit geeignetem Porendurchmesser filtriert.

Dieselbe Herstellungsmethode wurde verwendet, um pHLIP-beschichtete Niosome und Liposome herzustellen.

Dynamische Lichtstreuung Messungen

Die durchschnittliche Größe und Größenverteilung der Vesikel wurden bei T = 25 °C durch dynamische Lichtstreuung (DLS) gemessen, باستخدام einem Malvern NanoZetaSizer ZS90, ausgestattet mit einem 5 mW HeNe-Laser (Wellenlänge λ = 632,8 nm) und einem digitalen Korrelator. Die normierten Autokorrelationsfunktionen der gestreuten Intensität bei 90° Winkel wurden mit dem Contin-Algorithmus analysiert, um die Verteilung der Partikeldiffusionskoeffizienten D zu erhalten, woraus die Verteilung des effektiven hydrodynamischen Radius R_H der Vesikel über die Stokes-Einstein-Beziehung R_H = k_B T / 6πηD berechnet wurde, wobei k_B T die thermische Energie und η die Lösungsmittelviskosität ist. Die Breite der Größenverteilung von Niosomen/Liposomen ist eher klein, aber nicht vernachlässigbar. Die in Tabelle 2 berichteten Werte entsprechen dem intensitätsgewichteten durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser der Partikel [26].

ζ-Potential Messungen

Elektrophoretische Mobilitätsmessungen wurden mit der Laser-Doppler-Elektrophoresetechnik durchgeführt, باستخدام dem Malvern NanoZetaSizer ZS90 Apparat. Die Mobilität u wurde in das ζ-Potential umgerechnet mittels der Smoluchowski-Beziehung ζ = uη/ε, wobei η und ε die Viskosität und Permittivität der Lösungsmittelphase sind [27].

Kleinwinkel-Röntgenstreuung

Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) Experimente wurden an der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble, Frankreich) durchgeführt. Die Nutzung der ID02 Hochbrillanz-Beamline ermöglichte Messungen an verdünnten Lösungen im Impulsübertragungsbereich 0,1 nm⁻¹ ≤ q ≤ 6 nm⁻¹, q = (4π/λ)sin(θ/2), wobei θ der Streuwinkel und λ = 0,1 nm die Röntgenwellenlänge ist. Der entsprechende untersuchte Längenmaßstab liegt zwischen 1 und 60 nm, geeignet für den Zugriff auf die innere Struktur von Niosomalen und Liposomalen Vesikeln in Lösung. Alle Experimente wurden bei T = 25 °C mit kurzer Bestrahlungszeit, 0,1 s, durchgeführt, um Strahlungsschäden zu vermeiden. Für jede Probe wurde die gestreute Intensität bei verschiedenen Streuwinkeln auf einem 2D-Detektor erfasst, dann winkelmäßig regroupiert, für Hintergrund- und Lösungsmittelbeiträge subtrahiert und analysiert, um Informationen über Form und innere Struktur der Vesikel in Lösung zu erhalten.

Im Fall unilamellarer Vesikel wurde die geschlossene Doppelschicht mit drei konzentrischen Schalen modelliert, die den äußeren Kopfgruppen, den hydrophoben Ketten und den inneren Kopfgruppen entsprechen. Eine Schulz-Verteilung für die Vesikelgröße wurde angenommen.

Kryo-TEM

Vesikellösung (5 μL Tropfen) wurde auf ein Lacey-Formvar/Kohlenstoff-Elektronenmikroskopie-Gitter aufgetragen und in einem vitrifizierten hydratisierten Zustand durch schnelles Einfrieren in flüssigem Ethan erhalten. Der Vitrifizierungsprozess wurde mit dem FEI Vitrobot-System durchgeführt mit der Einstellung eines einzelnen Blots von 3 s, einem Offset von 1 und Ablauf- und Wartezeit von 1 s. Transmissionelektronenmikroskopie (TEM) (JEOL 2100) mit einer Beschleunigungsspannung von 200 kV bei Vergrößerungen im Bereich × 10.000 bis × 150.000 wurde verwendet, um Vesikel zu bildlich darstellen.

Stabilitätsstudien

Physikalische Stabilitätsstudien von Niosomen und Liposomen, hergestellt mit und ohne pHLIP, wurden bei zwei verschiedenen Lagertemperaturen (25 °C und 4 °C) durchgeführt. Ziel war es zu evaluieren, ob signifikante Änderungen in Größe und ζ-Potential der Vesikeldispersion über einen Zeitraum von 90 Tagen auftreten. Proben aus jeder Charge wurden zu bestimmten Zeitintervallen (1, 30, 60 und 90 Tage) entnommen und Vesikelgröße und ζ-Potential wie zuvor beschrieben bestimmt.

Ebenso wurde die Stabilität der Proben auch in Gegenwart biologischer Flüssigkeiten, wie menschlichem Serum, untersucht. Die Suspensionen wurden mit 45 % menschlichem Serum bei 37 °C in Kontakt gebracht. Zu bestimmten Zeitintervallen (0, 30 min, 1 h, 2 h und 3 h) wurden Variationen in Vesikelgröße und ζ-Potential wie beschrieben bestimmt.

Doppelschichtcharakterisierung

Fluidität und Mikroviskosität-Polarität von Niosomalen und Liposomalen Doppelschichten wurden durch Fluoreszenzmessungen zweier fluoreszierender Sonden, Diphenylhexatrien (DPH) und Pyren, ermittelt, die sich in der hydrophoben Region der Doppelschichtmembran befinden. Beide DPH (2 mM) und Pyren (4 mM), 220 μL und 2,5 mg jeweils, wurden vor der Vesikelherstellung dem Tensid- oder Phospholipid/Cholesterin-Gemisch zugesetzt [28]. Anschließend wurden Pyren-beladene Vesikel wie zuvor beschrieben gereinigt, während DPH-beladene Vesikel durch schrittweise kleinere Porengrößen (von 5,0 bis 0,22 μm) filtriert wurden.

Die Fluoreszenzanisotropie-Messungen wurden bei Raumtemperatur mit einem LS55 Spektrofluorometer (PerkinElmer, MA, USA) bei λ_exc = 400 nm und λ_em = 425 nm durchgeführt und die Fluoreszenzanisotropie (A) der Proben wurde nach folgender Gleichung berechnet [29]:

wobei I_vv und I_vh die Intensitäten der emittierten Fluoreszenz (willkürliche Einheiten) sind, jeweils parallel und senkrecht zur Richtung des vertikal polarisierten Anregungslichts. Der Korrekturfaktor G = I_hv / I_hh ist das Verhältnis zwischen den vertikal und horizontal polarisierten Emissionskomponenten, wenn das Anregungslicht horizontal polarisiert ist. Die Fluoreszenzanisotropie-Werte sind umgekehrt proportional zur Membranfluidität. Daher entspricht ein hoher Fluoreszenzanisotropie-Wert einer hohen strukturellen Ordnung und/oder niedriger Membranfluidität [30].

Um die Mikroviskosität und Mikropolarität der Vesikeldoppelschicht zu evaluieren, wurden Fluoreszenzexperimente mit Pyren an einem Perkin-Elmer LS55 Spektrofluorometer bei λ_exc = 330 nm durchgeführt, wobei das Emissionsspektrum im Bereich 350 < λ_em < 550 nm aufgezeichnet wurde [28]. Die Feinstruktur der Pyrenfluoreszenz zeigt fünf Peaks. Das Verhältnis zwischen den Intensitäten des ersten (372 nm) und dritten (382 nm) Schwingungsbanden des Pyrenfluoreszenzspektrums, I₁/I₃, ist mit der Polarität der Pyrenumgebung verbunden [31]. Tatsächlich entsprechen niedrige Werte des I₁/I₃-Verhältnisses einer unpolaren Umgebung. Weiterhin können Pyrenmoleküle, die in die Vesikeldoppelschicht eingebaut sind, intramolekulare Exzimer bilden, und dieser Prozess ist empfindlich gegenüber der Viskosität der Sondenmikroumgebung [32]. Daher ist das Exzimer/Monomer-Fluoreszenzintensitätsverhältnis I_E/I_M mit der Mikroviskosität verbunden.

Diese Studien wurden an den Vesikeln durchgeführt, die sowohl mit als auch ohne pHLIP hergestellt wurden, und die erhaltenen Ergebnisse wurden dann verglichen.

Calcein-Freisetzungsstudien

Nicht-ionische Tensid- oder Phospholipidvesikel wurden mit Calcein bei einer Konzentration von 10⁻² M beladen. Bei dieser Konzentration ist die Calceinfluoreszenz selbst-gequenched [33]. Dequenching-Messungen wurden dann verwendet, um die Calcein-Freisetzung aus dem wässrigen Vesikelkern zu bestimmen. Der fluoreszierende Sondenstoff wurde während der Hydratisierung des Dünnfilms durch Zugabe von 5 mL der wässrigen Calceinlösung in die Vesikel geladen. Die Vesikelsuspensionen wurden durch Gelpermeationschromatographie gereinigt, mit 45 % menschlichem Serum oder Hepes in Kontakt gebracht und dann in einen Zellulosemembran-Dialysebeutel (Cut-off-Molekulargewicht 8.000 Da von Spectra/Por®) geladen. Die Freisetzungsexperimente wurden bei 37 °C unter magnetischem Rühren in Hepes-Puffer (10 mM, pH 7,4) als externes Medium durchgeführt. Aliquots des externen Mediums wurden zu verschiedenen Zeiten über 0–24 h entnommen. Von Zeit zu Zeit wurden die entnommenen Aliquots in das System zurückgeführt [34].

Die Calcein-Freisetzung wurde durch Messungen der Fluoreszenz des Mediums mit einem Perkin-Elmer LS50B Spektrofluorometer bei λ_ex = 492 und λ_em = 520 nm überwacht. Der Referenzwert F_∞ (willkürliche Einheiten), korreliert mit der gesamten in den Vesikeln eingeschlossenen Calcein-Menge [35], wurde nach Zerstörung der Vesikel mit Isopropylalkohol (1:1 v/v) bestimmt. Die Freisetzungsprozente (F %) an jedem Zeitpunkt wurden mit folgender Gleichung erhalten:

wobei F_t (willkürliche Einheiten) die Fluoreszenz ist, die zu einem bestimmten Zeitpunkt t gelesen wird.

Statistische Analyse

Eine einseitige ANOVA wurde für die statistische Analyse verwendet. Ein posteriori Bonferroni t-Test wurde durchgeführt, um die statistische Signifikanz des ANOVA-Tests zu bewerten. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet. Ergebnisse sind der Durchschnitt von drei Experimenten ± Standardabweichung.

Ergebnisse und Diskussion

Tween20-, Span20- und DMPC-Vesikel, hergestellt mit und ohne DSPE-pHLIP, wurden auf Größe und ζ-Potential charakterisiert (Tabelle 2).

Laut den in Tabelle 2 präsentierten Ergebnissen zeigen die analysierten Proben keine signifikanten Variationen in Größe oder ζ-Potential, unabhängig von der pHLIP-Präsenz.

Die oben berichteten Größenbereiche wurden durch eine andere Analysetechnik bestätigt, wie Kryo-TEM (Abb. 1).

Repräsentative Kryo-TEM-Bilder von Niosomen und Liposomen, beschichtet mit pHLIP. Bilder von NioSpan20-pHLIP Niosomen (a) und LipoDMPC-pHLIP Liposomen (b) bei × 10.000 Vergrößerung und LipoDMPC-pHLIP Liposomen (c) bei × 40.000 Vergrößerung

Die innere Struktur von Niosomen/Vesikeln mit und ohne DSPE-pHLIP wurde durch SAXS-Experimente bestimmt. Die SAXS-Intensitätsspektren, in Abb. 2 dargestellt, sind unterschiedlich, was anzeigt, dass jedes System besondere Merkmale hat.

SAXS-Spektren. Intensitätsspektren von Niosomen/Vesikeln ohne (schwarze offene Symbole) und mit DSPE-pHLIP (farbige Symbole)

Tween20-basierte Niosome sind unilamellar, während DMPC-Vesikel einen gewissen Grad an Multilamellarität aufweisen (wie Liposome), wie durch das charakteristische Peak bei q ≅ 1 nm⁻¹ gezeigt, das einem Interlamellarabstand von 6 nm entspricht (etwa 5 nm Lipid-Doppelschicht und 1 nm Wasser). Span20-basierte Vesikel sind definitiv multilamellar, mit einem charakteristischen Peak bei q = 1,6 nm⁻¹, der einem Interlamellarabstand von 3,8 nm entspricht, passend zur doppelten Länge des Span20-Moleküls. Die Ergebnisse zeigen, dass der mehrschichtige Mantel der Span20-Vesikel aus angrenzenden Doppelschichten mit fast keinem Interlamellarwasser besteht.

Die Präsenz von DSPE-pHLIP (weniger als 1 % Molenbruch) beeinflusst die Systeme nicht dramatisch. Die gestreute Intensität im gesamten untersuchten q-Bereich ist recht ähnlich, was vergleichbare Anteile strukturierten Materials und vergleichbare Gesamtgröße der vesikulären Partikel anzeigt.

DMPC-basierte Vesikel zeigen eine leichte Zunahme der Anzahl der Doppelschichten innerhalb des Liposoms, ableitbar durch die Intensitätszunahme des Bragg-Peaks bei q = 1 nm⁻¹. Die Einfügung eines geringen Bruchs von DSPE C18-Ketten, die an jedes Peptidmolekül gekoppelt sind, ändert die Dicke der Lipid-Doppelschicht nicht, die hauptsächlich durch den großen Anteil an Cholesterin im Vergleich zu DMPC (etwa 40–50 %) diktiert wird. Bei dieser Cholesterinkonzentration sind Lipidketten in der flüssig-geordneten (Lo) Phase organisiert, charakterisiert durch die Entkopplung der schwachen lateralen Positionsordnung der Ketten bezüglich der hohen Orientierungsordnung entlang der Ketten und fähig, wenige C18-Ketten ohne strukturelle Änderungen aufzunehmen [36]. Auch Span20-basierte mehrschichtige Vesikel zeigen keine Änderungen in ihrer inneren Struktur.

Im Tween20 + pHLIP-System ist eine kleine Menge Cholesterinkristallite vorhanden, wie durch den typischen scharfen Peak bei q = 1,84 nm⁻¹ (charakteristischer Abstand 3,41 nm) gezeigt, und die Vesikelstruktur ist unbeeinflusst. Das Vorhandensein weniger Mikrokristallite wurde oft mit Tween-basierten Niosomen assoziiert [37] in Mengen abhängig von Zusammensetzung, Herstellungsverfahren und Reinigung. In Abb. 2 werden die zwei experimentellen Spektren von Tween20 und Tween20 + pHLIP Vesikeln zusammen mit den Anpassungskurven gezeigt, die durch Modellierung der kugelförmig geschlossenen Doppelschicht mit drei konzentrischen Schalen erhalten wurden: die äußeren Kopfgruppen, die Ketten und die inneren Kopfgruppen. Die angepasste durchschnittliche Vesikelgröße beträgt in beiden Systemen etwa 168 nm, in Übereinstimmung mit DLS-Ergebnissen. Strukturelle Parameter sind für die zwei geschlossenen Doppelschichten gleich (siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S1 und Tabelle S2) außer für die äußere Schale: in Gegenwart von DSPE-pHLIP wird eine leichte Abnahme (5 %) der Elektronendichte der Kopfgruppen beobachtet (von 0,42 auf 0,40 e/ų), zusammen mit einer Zunahme der Rauheit der Schicht. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Zugabe von DSPE-pHLIP hauptsächlich die äußere Schale der Vesikel beeinflusst. Dies ist konsistent mit einem Bild, wo die DSPE C18-Ketten in die Doppelschicht einfügen und das Peptid an der Vesikeloberfläche verankern, unter den ausgedehnten und verzweigten Polyethylenglykol-Kopfgruppen. Wir bemerken, dass die Fähigkeit des pHLIP-Peptids selbst (nicht an Lipidmoleküle gekoppelt), mit der äußeren Oberfläche von Vesikeln bei hohem pH zu interagieren und bei niedrigem pH in die Doppelschicht einzufügen, kürzlich durch SAXS im Fall ungesättigter Phospholipid-Doppelschichten beobachtet wurde [38]. In der vorliegenden Studie ist der Molenbruch des Peptids signifikant niedriger und das Peptid ist an Lipide gekoppelt, da das Ziel darin besteht, pHLIP-beschichtete pH-sensible Arzneimittel-Nanovektoren zu entwerfen. Die pHLIP-Assoziation wird durch die hydrophobe Wechselwirkung der konjugierten DSPE C18-Ketten getrieben, die in den hydrophoben Bereich des Nanovektors einfügen. Das pHLIP-Peptid ist verankert und liegt im äußeren Kopfgruppenbereich, bereit, bei saurem pH mit Zielmembranen zu interagieren und/oder den Nanovektorinhalt nach Doppelschichtumordnung in saurer Umgebung freizusetzen.

Um zu untersuchen, ob die pHLIP-Präsenz die mikrorheologischen Eigenschaften der Doppelschicht (Fluidität, Mikroviskosität und Polarität) beeinflussen könnte, wurde eine lipophile Schalencharakterisierung durchgeführt. Die Charakterisierungsstudien wurden mit der fluoreszierenden Sonde Pyren durchgeführt, die zu Beginn des Herstellungsverfahrens den Proben zugesetzt wurde. Aufgrund ihrer lipophilen Natur fügt sie sich in die Vesikeldoppelschicht ein und liefert Informationen über Polarität und Mikroviskosität der Membranumgebung.

Wie in Tabelle 3 gezeigt, verringern sich in allen drei Probensets die Polaritätswerte nur leicht in Gegenwart von pHLIP im Vergleich zum Gegenstück ohne pHLIP, während die Mikroviskositätswerte für alle Vesikel eine dreifache Zunahme zeigen.

Die Doppelschicht wurde weiter durch Messungen der Fluoreszenzanisotropie eines weiteren lipophilen fluoreszierenden Sonden, DPH, in Lipide eingebaut, charakterisiert. Diese Messungen reflektieren die Bewegung der Sonde und ihre Orientierung innerhalb der Doppelschicht, was Informationen über die Doppelschichtfluidität gibt, die die Fähigkeit der Vesikel beeinflussen kann, ihren Inhalt freizusetzen [29]. Fluoreszenzanisotropie-Werte sind umgekehrt proportional zur Membranfluidität. Daher entspricht ein hoher Fluoreszenzanisotropie-Wert einer hohen strukturellen Ordnung und/oder niedriger Membranfluidität, wie in der flüssig-geordneten Phase [30].

Die Anisotropiewerte für jede Probe sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Daten deuten darauf hin, dass die Präsenz von DSPE-pHLIP in den Vesikeln die Membranfluidität erhöht, da die Fluoreszenzanisotropie abnahm. Es ist bekannt, dass die Doppelschichtfluidität nicht nur durch Ordnung und laterale Organisation der apolaren Ketten, sondern auch durch die polaren Kopfgruppen beeinflusst wird [31]. SAXS-Ergebnisse an den drei verschiedenen Systemen zeigen, dass DSPE-pHLIP-Moleküle hauptsächlich den Kopfgruppenbereich beeinflussen, was schließlich eine andere Packung der polaren Köpfe verursacht. Strukturielle Ergebnisse scheinen mit mikrorheologischen Eigenschaften der Doppelschichten in Gegenwart assoziierter DSPE-pHLIP übereinzustimmen, wie durch die Einfügung zweier verschiedener Sonden enthüllt. Die Ergebnisse zeigen eine erhöhte Mikroviskosität, wie durch Pyren enthüllt, eine Sonde, die sich nahe der äußeren Region einfügen könnte (Pyren log P ist 4,88). Andererseits wird angenommen, dass DPH in den Kern der Doppelschichten eingebettet ist, orientiert parallel zur Lipid-Acylkettenachse oder im Zentrum der Doppelschicht, parallel zur Oberfläche eingeschränkt. Es ist weitgehend empfindlich gegenüber der winkligen Reorientierung der amphiphilen Acylketten [39]. Die erhöhte Fluidität, wie durch DPH enthüllt, könnte sowohl mit dem Effekt der Einfügung von DSPE-Ketten unter den anderen Acylketten als auch mit dem Effekt der pHLIP-Partition in den polaren Kopfgruppenbereich zusammenhängen, der die Packungseigenschaften der Tenside ändert. (Abb. 3).

Darstellung der pHLIP-Wechselwirkungen mit Vesikelmembran

Weitere Charakterisierungsstudien wurden an den untersuchten Präparationen durchgeführt. Alle Proben, hergestellt mit und ohne pHLIP, wurden 90 Tage bei 4 °C gelagert, um die Stabilität der Vesikel über die Zeit zu evaluieren, indem ihre Größen- und ζ-Potential-Variationen gemessen wurden (Zusatzdatei 1: Abbildung S2). Keine signifikanten Variationen in Größe und ζ-Potential wurden entlang des Experiments beobachtet; daher resultierten alle untersuchten Präparationen als stabil, wenn sie bei 4 °C gelagert wurden.

Zusätzlich wurde die Stabilität der Proben in Gegenwart von 90 % (v/v) menschlichem Serum untersucht und bei 37 °C für 3 h gelagert (Zusatzdatei 1: Abbildung S3).

In Kontakt mit menschlichem Serum zeigten Tween20-Vesikel eine Größenzunahme, blieben jedoch unter 300 nm. Die Größe und PDI-Werte wurden als konstant entlang des 3-h-Experiments gemessen, was suggeriert, dass die Vesikel in Suspension während des gesamten Experiments intakt blieben.

Beide Span20-Proben in Kontakt mit menschlichem Serum zeigten eine Größenzunahme, besonders in der Präparation mit pHLIP, während PDI-Werte eine homogene Größenverteilung suggerieren (Daten nicht gezeigt). Dieses Ereignis kann auf die Absorption von Plasmaproteinen auf der Niosom-Oberfläche zurückzuführen sein, als Ergebnis elektrostatischer Wechselwirkungen, jedoch ohne Vesikelstörung. Diese Hypothese wird durch die ζ-Potential-Abnahme nach Vesikelkontakt mit menschlichem Serum gestützt. Dieses Phänomen tritt auf, wenn das ζ-Potential leicht negative Werte erreicht, um den Neutralitätsbereich, was das System instabil macht und Vesikel anfangen zu aggregieren.

Wie auch Tween20 zeigen DMPC-Vesikel eine Größenzunahme im Vergleich zur Vorkontakt-Probe. Diese Variation erwies sich jedoch als nicht signifikant und die Größenwerte blieben unter 280 nm (DMPC) bzw. unter 240 nm (DMPC + pHLIP).

Die Freisetzungsfähigkeit wurde für die Proben evaluiert, die mit und ohne pHLIP hergestellt wurden, indem die Menge an Calcein (hydrophiler Sonde) gemessen wurde, die über die Zeit aus den Vesikeln freigesetzt wurde.

Die Studien wurden bei 37 °C für einen Zeitraum von 24 h durchgeführt, indem die gereinigten Proben entweder mit HEPES-Puffer oder menschlichem Serum in Kontakt gebracht wurden. Wie in Abb. 4 gezeigt, erweisen sich die Calcein-Freisetzungsprofile als sehr ähnlich für sowohl Tween20 als auch Tween20-pHLIP in HEPES-Puffer oder menschlichem Serum.

Calcein-Freisetzungsprofil. NioTween20 und NioTween20-pHLIP in Kontakt mit HEPES-Puffer (a) oder menschlichem Serum (b)

Die freigesetzte Calcein-Menge lag zwischen 30 und 50 %, was keine Unterschiede in den Freisetzungsfähigkeiten zwischen den mit und ohne pHLIP hergestellten Proben anzeigt.

Gleiche Ergebnisse wurden für Span- und DMPC-Proben erhalten (Daten nicht gezeigt).

Vergleichbare Freisetzungsprofile wurden für verschiedene stimuliresponsive Nanoträger berichtet, wie thermosensitive Kubosome [40] oder polymere selbstassemblierte Nanoträger (SANs) [41, 42].

Zusammenfassend beeinflussen die physikochemischen Unterschiede, die in Bezug auf Mikroviskosität und Fluidität für die mit und ohne pHLIP hergestellten Proben beobachtet wurden (Tabelle 3), nicht ihre Freisetzungsfähigkeiten (Abb. 4), gemäß dem Beweis, dass die Einfügung von DSPE-pHLIP-Molekülen hauptsächlich den Kopfgruppenbereich beeinflusst. Diese Daten stimmen mit zuvor berichteten Ergebnissen überein, die zeigen, dass bei neutralen und hohen pH-Werten pHLIP an der Oberfläche von Liposomen aus 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) gebunden ist und keine Fusion oder Membranleckage induziert.

Schlussfolgerung

Diese Studie bestätigt die Möglichkeit der Herstellung pHLIP-dekorierter Vesikel. Proben sind stabil, wenn sie bei 4 °C für mindestens 3 Monate und in Gegenwart von Serum gelagert werden. Darüber hinaus sind die vorgeschlagenen Nanovektoren in der Lage, einen hydrophilen Sondenstoff einzuschließen und dessen Freisetzung zu modulieren.

pHLIP-Vesikel wurden vollständig charakterisiert, um ein fundamentales Verständnis der Nanoträgereigenschaften zu erlangen und das rationale Design säureempfindlicher Nanovektoren zu erleichtern.

Die pHLIP-Assoziation wird durch die hydrophobe Wechselwirkung der konjugierten DSPE C18-Ketten getrieben, die in den hydrophoben Bereich des Nanovektors einfügen. Das pHLIP-Peptid ist verankert und liegt im äußeren Kopfgruppenbereich, bereit, bei saurem pH mit Zielmembranen zu interagieren und/oder den Nanovektorinhalt nach Doppelschichtumordnung in saurer Umgebung freizusetzen.

Gemäß diesen Ergebnissen könnten die vorgeschlagenen pHLIP-dekorierten Vesikel nützlich sein, um eine verlängerte (modifizierte) Freisetzung biologisch aktiver Substanzen für das Targeting von Tumoren und anderen sauren kranken Geweben zu erzielen.

Abkürzungen

Chol:

Cholesterin

Kryo-TEM:

Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

DMPC:

1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin

DPH:

Diphenylhexatrien

pHLIP:

pH (niedrig) Einfügepeptid

SAXS:

Kleinwinkel-Röntgenstreuung

Span20:

Sorbitanmonolaurat

Tween20:

Polyoxyethylensorbitanmonolaurat