Antitumorwirkung von 131I-markierten anti-VEGFR2 zielgerichteten mesoporösen Silica-Nanopartikeln bei anaplastischem Schilddrüsenkrebs

Hintergrund

Anaplastisches Schilddrüsenkarzinom (ATC) macht nur etwa 2% aller Schilddrüsenkarzinome aus; es handelt sich jedoch um eine lokal aggressive Tumorart mit einer hohen Rate an Fernmetastasen. Im Allgemeinen beträgt die mediane Überlebenszeit von Patienten mit ATC etwa 6 Monate, wobei nur 20 % der Patienten 1 Jahr nach der Diagnose aufgrund einer Gefäßkatastrophe und eines Atemwegskollapses aufgrund einer aggressiven regionalen Erkrankung, die in Halsgewebe und Lymphknoten- und/oder Lungenmetastasen eindringt, überleben [1 , 2]. Radiojod-131 ( ¹³¹ I) spielt eine wichtige Rolle bei der Diagnose und Behandlung von differenzierten Schilddrüsenkrebs-(DTC)-Metastasen [3,4,5]. Die herkömmlichen ¹³¹ I-Behandlungsmodalität ist für ATC wegen seiner nicht-jodkonzentrierenden Eigenschaft nicht geeignet [6].

Angiogenese ist ein wichtiger Faktor, der zum Überleben, Wachstum, Migration und Metastasierung von Krebszellen beiträgt. Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) ist ein entscheidendes regulatorisches Zytokin bei der Angiogenese und spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von ATC. Die etablierte Rolle von VEGF in der Angiogenese bedeutet, dass radioaktiv markierte Liganden wie Bevacizumab, die auf den VEGF-Rezeptor (VEGFR) abzielen, erfolgreich für die frühe und sensitive Läsionserkennung mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie ( SPECT) Bildgebungsverfahren. VEGFR-2 übt die meisten Funktionen von VEGF in Blutgefäß-Endothelzellen aus und ist für die Proliferation durch die Aktivierung des mitogen-aktivierten Proteinkinase-Wegs, die Migration von Endothelgefäßen und die Förderung der Angiogenese und des Gefäßwachstums verantwortlich [7, 8 ]. Die VEGF-Expression ist in ATC-Zellen epithelialen Ursprungs im Vergleich zu der in normalem Schilddrüsengewebe hochreguliert [9,10,11]. Anti-VEGF-Strategien wurden entwickelt, um das Wachstum neuer Blutgefäße zu hemmen und Tumoren den notwendigen Sauerstoff und Nährstoffe zu entziehen. Mehrere präklinische Studien haben Medikamente entwickelt, die auf VEGFR2 bei ATC mit unterschiedlichem Erfolg abzielen [12,13,14,15]. Eine der größten Herausforderungen im Zusammenhang mit diesen Krebsmedikamenten ist jedoch ihre geringe Bioverfügbarkeit und ineffiziente Abgabe an die Zielstelle. Viele Krebsmedikamente sind hydrophob und benötigen biokompatible Arzneimittelabgabesysteme, um ihre Bioverfügbarkeit zu verbessern und eine einfachere intravenöse Verabreichung zu ermöglichen.

Nanopartikel, einschließlich Nanopartikel auf Metall-, Polymer- und Lipidbasis, können verwendet werden, um ein therapeutisches Mittel mit einem bildgebenden Mittel zu kombinieren. Targeting-Liganden/-Einheiten, wie Peptide, Antikörper, Radionuklide oder Antikörperfragmente, können an Nanopartikel angehängt werden, um ihre therapeutische Wirksamkeit zu verbessern. Bei der Krebsbehandlung könnten sich Nanopartikel über eine verbesserte Permeabilität und Retentionswirkung im Tumorbereich ansammeln, mit der Möglichkeit, Therapeutika lokalisierter abzugeben. In den Material- und Ingenieurwissenschaften gilt Kieselsäure seit vielen Jahren aufgrund der Vielzahl verfügbarer physikalischer und chemischer Modifikationen sowie ihrer guten Biokompatibilität als vielseitiges und relativ sicheres Material [16]. Die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) erkennt Kieselsäure als „allgemein sicher“ an [17, 18]. Unter den verschiedenen Materialien auf Siliciumdioxidbasis ragen mesoporöse Siliciumdioxid-Nanopartikel (MSNs) als eine Klasse von Nanomaterialien mit vielen charakteristischen Vorteilen heraus, wie z. und chemisch modifizierbare Oberflächen, die sie alle zu potentiellen Wirten für verschiedene chemische Wirkstoffe und/oder therapeutische Medikamente machen [19]. In ähnlicher Weise haben sich mesoporöse Kohlenstoff-Nanomaterialien als ausgezeichnete Nanoträger bei der Wirkstoffabgabe erwiesen [20,21,22]. In den letzten Jahren konzentrierten sich die Bemühungen auf dem Gebiet der MSNs auf die Kombination von therapeutischen und bildgebenden Fähigkeiten. Die Markierung von Nanopartikeln mit bildgebenden Sonden ist ein wertvolles Werkzeug, um ihre In-vitro- und In-vivo-Nachverfolgung zu ermöglichen. Derzeit stellen gezielte Behandlungsmodalitäten eine ermutigende Strategie für die ATC-Behandlung dar [23, 24].

Inspiriert von der zentralen Rolle der zielgerichteten Therapie und molekularen Bildgebung gegen VEGFR in der Krebsforschung und den Vorteilen, die MSNs bieten, haben wir in dieser Studie eine Anti-VEGFR2-Targeting-Nanoplattform entwickelt, die auf der Oberflächentechnik von MSNs für die simultane nichtinvasive SPECT-Bildgebung und ein in vivo verbessert ¹³¹ Ich therapeutische Wirkung. Wir wollten herausfinden, ob ¹³¹ I-markierte Anti-VEGFR2-gerichtete MSNs würden in einem ATC-Tumor-tragenden Nacktmausmodell eine Antitumorwirksamkeit aufweisen, gefolgt von umfangreichen In-vivo-, In-vitro- und Ex-vivo-Studien.

Materialien und Methoden

Materialien

Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 0,25% Trypsin-EDTA und fötales Rinderserum (FBS) wurden von Gibco (CA, USA) bezogen. Antibiotika (Penicillin G, Streptomycin und Nystatin) wurden von Dingguo Biotechnology Co. Ltd. (Beijing, China) bezogen. Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB), Tetraethylorthosilikat (TEOS), 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES), Dimethylsulfoxid (DMSO), 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC), N -Hydroxysuccinimid (NHS) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) wurden von Sigma-Aldrich (Deutschland) bezogen. Na ¹³¹ Ich wurde von Atomic Hitech (Beijing, China) gekauft. Anti-VEGFR2-Antikörper wurden von Abcam Co. Ltd. (UK) bezogen.

Charakterisierungen

Die Nanopartikel wurden in Ethanol dispergiert, um eine Suspension zu bilden, auf einem kohlenstoffbeschichteten Kupfergitter abgeschieden und mindestens 24 h getrocknet. Die Morphologie der Nanopartikel wurde mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (JEOL-100CXII, Japan) bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV bestimmt. Die Zetapotentiale und hydrodynamischen Durchmesser der Proben wurden unter Verwendung dynamischer Lichtstreuung (DLS) unter Verwendung eines Zetasizers (Nano ZS90, UK) gemessen. Die Porengrößenverteilungen und Oberflächen von MSNs wurden durch Brunauer-Emmett-Teller (BET)- und Barrett-Joyner-Halenda (BJH)-Analysen (ASAP2020M, USA) charakterisiert.

Zellkultur

Die humane ATC-Zelllinie FRO [25] (erworben vom Cell Resource Center, Institute of Basic Medical Sciences, Peking Union Beijing Medical College in Peking, Volksrepublik China) wurde bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Mischung aus 5 % CO₂ und 95 % Luft und ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin. Das Medium wurde jeden zweiten Tag ersetzt und die Zellen wurden nach Erreichen der Konfluenz mit Trypsin passagiert. Die Zellen wurden vor jedem Experiment vorkultiviert, bis ungefähr 80% Konfluenz erreicht war.

Herstellung und Oberflächenmodifizierung von Silica-Nanopartikeln

Synthese von MSNs und Aminierung

Die MSNs wurden wie zuvor beschrieben synthetisiert [26]. Kurz gesagt, 50 mg CTAB wurden zu einer Mischung aus 25 ml Wasser, 5 ml Ethanol und 100 μL 2 M NaOH-Lösung in einem Rundkolben unter kontinuierlichem Rühren bei 70 °C zugegeben. Dann wurden 200 μL TEOS in die Mischung gegeben und 1 h lang umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde dann zentrifugiert und fünfmal bei 10.000 U/min mit Ethanol gewaschen. Als nächstes wurden die Produkte in 10 ml Ethanol resuspendiert. Nach dem Entfernen der CTAB-Vorlage wurde das Produkt dann in 5 ml DMSO und 100 μl APTES resuspendiert, die tropfenweise in die resultierende Mischung gegeben wurden, um die Kieselsäureoberfläche durch Aminierung zu modifizieren. Nach Rühren über Nacht wurden die Niederschläge durch Zentrifugation abgetrennt, fünfmal mit Ethanol gewaschen und dann die MSNs-NH₂ wurden erhalten.

Synthese von BSA-MSNs-Anti-VEGFR2

Dem obigen Produkt (MSNs-NH₂ .) wurden fünf Milligramm Rinderserumalbumin (BSA) und 50 μl Anti-VEGFR2-Antikörper zugesetzt , 50 mg) und unter Rühren 2 h lang umgesetzt. Die Mischung wurde fünfmal mit Wasser gewaschen, wonach 1,1 mg NHS und 1,6 mg EDC in die Mischung gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur in 5 ml Wasser gerührt wurden. Die Präzipitate wurden durch Zentrifugation abgetrennt, fünfmal mit Wasser gewaschen, wodurch erfolgreich BSA-MSNs-anti-VEGFR2 erhalten wurde.

¹³¹ I Radiomarkierung von Nanopartikeln

Die produzierten Nanopartikel wurden mit ¹³¹ . radioaktiv markiert Ich verwende die Chloramin-T-Methode (bezeichnet als ¹³¹ I-BSA-MSNs und ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2) [27]. Kurz gesagt, etwa 100 μg BSA-MSNs oder BSA-MSNs-Anti-VEGFR2 wurden mit 100 μl Phosphatpuffer (PB) und 74 MBq ¹³¹ . verdünnt Ich wurde hinzugefügt. Dann wurde Chloramin-T (100 μL; 5 mg/ml in PB) zu der Mischung gegeben. Nach 60 s langem Schütteln und Inkubation wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 μl Natriummetabisulfit (5 mg/ml in PB) gestoppt. Das Zentrifugenröhrchen wurde verwendet, um markierte BSA-MSNs und BSA-MSNs-anti-VEGFR2 von Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht zu trennen. Die Markierungsrate und die radiochemische Reinheit von ¹³¹ Imarkierte Nanopartikel wurden mittels Dünnschichtchromatographie bestimmt.

Zelluläre In-vitro-Aufnahme:Studie mit konfokaler Mikroskopie

Zunächst wurden die MSNs-Anti-VEGFR2 und MSNs mit FITC gekennzeichnet [28]. Kurz gesagt, MSNs-NH₂ (100 mg) wurden zu 1 ml FITC-Alkohollösung (1 mg/ml) gegeben, während 4 h unter Rühren stehen gelassen wurde. FITC-markierte MSNs (FITC-MSNs) wurden durch Zentrifugation gewonnen und im Vakuum getrocknet. FITC-MSNs-anti-VEGFR2 könnte auch mit der gleichen Methode erhalten werden.

FRO-Zellen wurden über Nacht in 6-Well-Platten ausgesät und dann 5 × 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung wurden mit FITC-MSNs und FITC-MSNs-anti-VEGFR2 für 1 bzw. 6 h bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und dann 20 min mit 70 % Ethanol fixiert. Darüber hinaus wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und die Kerne wurden 45 min mit 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gefärbt und dann mit Paraformaldehyd (4 % in PBS) fixiert. Konfokale Mikroskopiebilder wurden unter Verwendung einer konfokalen Laserscanningmikroskopie (CLSM) (Zeiss LSM 510, USA) aufgenommen.

Zeitabhängige zelluläre Aufnahme

Um die zeitabhängige zelluläre Jod-131-Aufnahme der Nanopartikel zu messen, 1 × 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung wurden mit 3,7 MBq/ml freiem Na ¹³¹ . kultiviert Ich, ¹³¹ I-BSA-MSNs oder ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 bzw. Die Zellen wurden dann so schnell wie möglich mit 1 ml Hanks-Pufferlösung aus balancierter Salzlösung (HBSS) gewaschen, mit Trypsin abgelöst und in 1 ml HBSS für 1, 2, 3, 5, 7 und 9 h resuspendiert. Die Radioaktivität wurde unter Verwendung eines -Zählers (LKB gamma 1261, Australien) gemessen. Alle Experimente wurden dreimal durchgeführt, um genaue Daten zu erhalten.

Tiermodell

Balb/c-Nacktmäuse (weiblich, ungefähr 4 Wochen alt, mit einem Gewicht von 15–20 g) wurden vom Beijing Experimental Animal Research Center am Peking Union Medical College gekauft und unter bestimmten pathogenfreien Bedingungen mit einer relativen Luftfeuchtigkeit (30–70 .) gehalten %) und temperaturkontrollierte (20–24 °C) Umgebung am Laboratory Animal Center, Tianjin Medical University, China. Alle Verfahren zum Umgang mit Tieren entsprachen einem vom Ethikausschuss des Allgemeinen Krankenhauses der Medizinischen Universität Tianjin genehmigten Protokoll. FRO-Tumor-Xenotransplantate wurden durch subkutane Injektion von 5 × 10 ⁶ . induziert FRO-Zellen in 50 μl PBS in die rechte Schulter der Mäuse.

In-Vivo-Bildgebung

Als die tumortragenden Nacktmäuse 1–2 Wochen gefüttert wurden und das Tumorvolumen einen Durchmesser von etwa 10 mm erreicht hatte, wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen (Na ¹³¹ Ich, ¹³¹ I-BSA-MSNs und ¹³¹ I-BSA-MSNs-Anti-VEGFR2). Jede Gruppe erhielt 7,4 MBq ¹³¹ I durch intratumorale Injektion zur Beurteilung der Organlokalisation von ¹³¹ I-markierte Nanopartikel. Die szintigrafische Bildgebung wurde 1, 2, 3, 7, 14 und 21 Tage nach der jeweiligen Medikamenteninjektion durchgeführt. Nackte Mäuse wurden vor jedem Scan mit 4% Chloralhydrat (150 μl) anästhesiert, in Bauchlage platziert und dann mit einem SPECT/CT-Scanner (Discovery NM/CT 670, USA) abgebildet. Um zu vermeiden, dass das Schilddrüsengewebe unerwünschter Strahlung und Bildgebung ausgesetzt wird, wurde dem Trinkwasser für alle Mäuse 1 Tag vor dem Experiment Natriumperchlorat (0,05 mg/ml) zugesetzt und 1 Woche lang aufbewahrt.

Gewebeverteilung

24 und 72 Stunden nach intratumoraler Injektion von 7,4 MBq ¹³¹ I-markierte Nanopartikel, die Mäuse in jeder Gruppe (n = 3/Gruppe) wurden durch zervikale Dislokation getötet und Herz-, Milz-, Nieren-, Leber-, Darm-, Lungen- und Tumorgewebe wurden entfernt und gewogen. Die Radioaktivität in verschiedenen Organen wurde mit einem γ-Zähler (LKB gamma 1261, Australien) gemessen und die Radioaktivität wurde als Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe (%ID/g) ausgedrückt.

In Vivo ¹³¹ I Therapie

Ähnlich wie bei der In-vivo-Bildgebung wurde den Mäusen der drei Gruppen eine Dosis von 74 MBq (50 μl) von ¹³¹ . intratumoral injiziert I-BSA-MSNs-Anti-VEGFR2, ¹³¹ I-BSA-MSNs und Na ¹³¹ I, als das Tumorvolumen einen Durchmesser von etwa 10 mm erreicht hatte. Als Kontrollgruppe wurde das gleiche Volumen normaler Kochsalzlösung verabreicht. Das Tumorvolumen wurde nach folgender Formel geschätzt:Volumen = 4π/3 (1/2 Länge × 1/2 Breite × 1/2 Höhe) [15, 29]. Das Tumorvolumen und das Körpergewicht der Tiere wurden alle 3 Tage gemessen. Mäuse wurden eingeschläfert, wenn sie mehr als 20 % ihres Körpergewichts verloren oder im Sterben waren.

Histologische Untersuchung

Als das Experiment beendet war, wurden die Mäuse getötet und der Tumor und normales Gewebe der vier Gruppen, einschließlich Herz, Leber, Milz, Niere und Lunge, wurden isoliert, um ihre Histopathologie zu untersuchen. Kurz gesagt, 5 mm dicke Paraffinschnitte wurden unter Verwendung von zwei Xylol-Inkubationen (jeweils 30 Minuten bei 56 °C) entwachst und dann in Ethanol rehydratisiert. Die Schnitte wurden dann über Nacht in 10 % Saccharose in destilliertem Wasser eingeweicht. Danach wurden die Schnitte in 0,1 M PBS, pH 7,4, gewaschen, in 1,2% Wasserstoffperoxid in Methanol 30 Minuten inkubiert und in 0,1 M PBS, pH 7,4, 15 Minuten lang gespült. Die Objektträger der Tumoren wurden dann in einer feuchten Kammer über Nacht bei Raumtemperatur mit Anti-VEGFR2-Antikörper-Verdünnung 1:100 inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Objektträger mit dem DAKO-REALTM En-Vision™-Detektionssystem für 60 Minuten inkubiert, dann mit Diaminobenzidin visualisiert und mit Mayer-Hämatoxylin gegengefärbt. Alle Bilder wurden mit einem Olympus-Mikroskop aufgenommen.

Statistische Analyse

Alle Daten werden als mittlere ± ± Standardabweichung (SD) dargestellt, und die statistische Analyse wurde mit SPSS (Statistical Package for Social Sciences) 12.0 für Windows (SPSS, Chicago, IL, USA) durchgeführt. Die Datenanalyse wurde mit Kaplan-Meier-Kurven und dem Log-Rank-Test durchgeführt. Alle statistischen Tests waren zweiseitig und ein P Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Die Eigenschaften von Nanopartikeln

Die Eigenschaften von Nanopartikeln wurden mit TEM und DLS analysiert und bestimmt (Abb. 1a–c). Das TEM-Bild zeigte, dass die MSNs eine einheitliche sphärische Morphologie aufwiesen, und das DLS-Bild zeigte, dass die MSNs einheitlich mit einer Größe von 108 ± 5,9 nm waren. BSA-Modifikation und/oder Anti-VEGFR2-Targeting änderten die Morphologie der Nanopartikel nicht und führten im Vergleich zu unmodifizierten MSNs nur zu einer leichten Aggregationsneigung in Lösung, die möglicherweise durch die vergrößerte Oberfläche der Nanokomplexe verursacht wurde. Der Durchmesser des BSA-MSNs-Anti-VEGFR2 stieg leicht auf 163 ± 4,6 nm an, und das mittlere Zetapotential von MSNs betrug − 23,91 mV, das sich für BSA-MSNs-Anti-VEGFR2 auf 28,45 mV änderte. Die Änderung des Zetapotentials und die Größenzunahme nach der Oberflächenmodifikation deuteten auf die erfolgreiche Zugabe von BSA und Anti-VEGFR2 auf der Oberfläche der MSNs bei jedem Schritt hin (Tabelle 1). Die strukturelle Charakterisierung der MSNs wurde außerdem durch die Stickstoffadsorptions-Desorptions-Isotherme bestätigt. Die MSNs haben eine klar definierte mesoporöse Struktur mit einer Oberfläche von 630,2 m ² /g und einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 2,8 nm (Abb. 1d). Die Stabilität von BSA-MSNs-Anti-VEGFR2-Nanopartikeln wurde über mehrere Wochen hinweg überwacht und es wurde keine offensichtliche Aggregation beobachtet. Der Anteil von ¹³¹ Die I-Kennzeichnung betrug ungefähr 50–75 %.

Die Eigenschaften von Nanopartikeln. Charakterisierungen von MSNs (a ), BSA-MSNs (b ), BSA-MSNs-Anti-VEGFR2 (c ) und Stickstoffadsorptions-Desorptions-Isotherme und Barrett-Joyner-Halenda (BJH)-Porengrößenverteilungskurven von MSNs (d ). Die Transmissionselektronenmikroskopie-Bilder zeigen, dass alle eine regelmäßige (gleichförmige kugelförmige) Morphologie aufwiesen. Die dynamischen Lichtstreuungsbilder zeigen, dass alle gleichförmig waren, mit durchschnittlichen Größen von 108 nm, 139 nm bzw. 163 nm. BET- und BJH-Analysen zeigten typische Typ-IV-Isothermen, die mit einer mesoporösen Struktur übereinstimmen

Aufnahme von konstruierten Nanopartikeln

Die Bindung von BSA-MSNs und BSA-MSNs-anti-VEGFR2 an FRO-Zellen der humanen ATC-Zelllinie wurde mit konfokaler Mikroskopie untersucht (Abb. 2). Immunfluoreszenz zeigte, dass sowohl gezielte als auch nicht gezielte MSNs effizient an FRO-Zellen binden konnten. Nach 1 h Inkubation mit BSA-MSNs oder BSA-MSNs-anti-VEGFR2 war eine sichtbare Fluoreszenz in den Zellen vorhanden, die nach 6 h Inkubation aufrechterhalten und verstärkt wurde. Im Vergleich zu BSA-MSNs-anti-VEGFR2 konnten BSA-MSNs auch an Zellen binden, aber wir fanden, dass die Tumorzellretention minimal und das grüne Fluoreszenzsignal schwach war. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Targeting-Fähigkeit der Nanopartikel durch Modifikation mit dem Anti-VEGFR2-Antikörper verbessert wurde.

Aufnahme von konstruierten Nanopartikeln. Konfokale Laserscanning-Mikroskopbilder zeigten die zelluläre Internalisierung verschiedener Formulierungen nach 1 und 6 h für BSA-MSNs und BSA-MSNs-anti-VEGFR2. Das fluoreszierende Signal um 1 h war für beide Gruppen um 6 h erhöht. Darüber hinaus war die grüne Bindungsfluoreszenz in der Anti-VEGFR2-Zielgruppe zu beiden Zeitpunkten stärker als in der Nicht-Zielgruppe

Zeitabhängige zelluläre Aufnahme

Um die Radiojodaufnahme von Na ¹³¹ . zu bestimmen Ich, ¹³¹ I-BSA-MSN und ¹³¹ I-BSA-MSNs-Anti-VEGFR2 im Laufe der Zeit, ¹³¹ I-zeitgesteuerte Aktivitätsmessungen wurden in FRO-Zellen erhalten. Wie in Abb. 3a gezeigt, ist die ¹³¹ Die I-Aufnahme in dieser Zelllinie erreichte ihr Maximum nach 3 Stunden Inkubation mit ¹³¹ I-BSA-MSNs und nach 5 h mit ¹³¹ I-BSA-MSNs-Anti-VEGFR2. Darüber hinaus ist die Radiojodaufnahme von ¹³¹ I-BSA-MSNs-Anti-VEGFR2 war höher als bei ¹³¹ I-BSA-MSNs.

Zeitabhängige Zellaufnahme und Gewebeverteilung. a Die Daten zur zeitabhängigen zellulären Aufnahme werden als Mittelwert ± SD von drei Gruppen dargestellt. b Vergleich der Daten zur Bioverteilung von ¹³¹ I im Tumor und in den Hauptorganen von ATC-Tumor-tragenden Mäusen 24 und 72 Stunden nach der intratumoralen Injektion von Na ¹³¹ Ich, ¹³¹ I-BSA-MSNs und ¹³¹ I-BSA-MSNs-Anti-VEGFR2. Die Radioaktivität des Tumorgewebes der Anti-VEGFR2-Zielgruppe 24 und 72 h nach der intratumoralen Injektion (32,2 ±   2,8 % ID/g bzw. 23,0 ±   1,8 % ID/g) war signifikant höher als die der Nicht-Zielgruppe (26,1 ± .). 2,5 % ID/g bzw. 12,3 ± 1,2 % ID/g) (alle P < 0,05). Die Daten werden auch als Mittelwert ± SD für die drei Gruppen dargestellt

Gewebeverteilung

Die Gewebeverteilung von ¹³¹ I bei Nacktmäusen wurde mit einem γ . gemessen Zähler 24 und 72 h nach intratumoraler Injektion mit den entsprechenden Medikamenten (Abb. 3b). Die Ergebnisse zeigten, dass die drei Gruppen nach 24 und 72 Stunden eine ähnliche Strahlungsakkumulation im normalen Gewebe aufwiesen. Die Radioaktivität nahm bei allen Gruppen mit der Zeit allmählich ab und wurde größtenteils im Tumor akkumuliert. Zusätzlich die Akkumulation im Tumorgewebe 24 und 72 h nach der Injektion in den beiden Gruppen mit ¹³¹ I-markierte Nanopartikel waren viel höher als in Na ¹³¹ I-Gruppe, die nach 24 Stunden 11,6 ± 0,9 % ID/g betrug und nach 72 Stunden dramatisch auf 2,1 ± 0,08% ID/g abnahm. Allerdings betrug die Konzentration im Tumor der Anti-VEGFR2-Zielgruppe 24 bzw. 72 h nach der Injektion 32,2 ± 2,8 % ID/g bzw. 23,0 ±   1,8 % ID/g, was signifikant höher war als bei Nicht- Zielgruppe (26,1 ± 2,5 % ID/g bzw. 12,3 ± 1,2 % ID/g, alle P < 0.05).

In-Vivo-Bildgebung

Um die ¹³¹ . zu bestimmen I Aufnahme und Verteilung von Nanopartikeln und beobachte die Verweilzeit von ¹³¹ I im Tumorgewebe in vivo wurden repräsentative SPECT/CT-Bilder von FRO-Tumor-tragenden Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach intratumoraler Injektion der jeweiligen Medikamente aufgenommen (Abb. 4a). Die Ergebnisse zeigten, dass die radioaktive Anreicherung im Na ¹³¹ Die Gruppe I wurde 2 Tage nach der Injektion schnell aus dem Tumor ausgeschieden und wurde 3 Tage nach der Injektion nicht mehr gesehen. Im Gegensatz dazu sind die beiden Gruppen mit ¹³¹ I-markierte Nanopartikel wiesen sogar 2 Wochen nach der Injektion eine langsamere Blutclearance und eine höhere Akkumulation im Tumorgewebe auf, insbesondere in der Anti-VEGFR2-Zielgruppe. Bemerkenswert ist, dass 3 Wochen nach der Injektion die Radioaktivität in der Zielgruppe offensichtlich stärker war als in der Nicht-Zielgruppe.

In-vivo-Bildgebung, in-vivo ¹³¹ Ich Therapie und Überlebensanalyse. a SPECT/CT-fusionierte und dreidimensionale Bilder von ATC-Tumor-tragenden Mäusen, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach intratumoraler Injektion der jeweiligen Medikamente aufgenommen wurden. Die radioaktive Anreicherung im Na ¹³¹ I-Gruppe wurde 3 Tage nach der Injektion nicht gesehen, war jedoch auch 3 Wochen nach der Injektion in der Anti-VEGFR2-Zielgruppe offensichtlich. Tumorvolumen (b ), Körpergewicht (c ) Veränderungen und Kaplan-Meier-Überlebenskurven (d ) in den FRO ATC Xenograft-Modellen (n = 6/Gruppe). Tumorwachstum und Körpergewichtsverlust in der Zielgruppe wurden im Vergleich zu denen in der Nicht-Zielgruppe, Na ¹³¹ ., signifikant gehemmt I bzw. Kochsalzgruppe. Die Daten sind als Mittelwert ± SD von drei Gruppen dargestellt und alle waren P  0,05. Darüber hinaus war die mediane Überlebenszeit in der Zielgruppe (41 Tage) im Vergleich zur Nicht-Zielgruppe (34 Tage) oder Na ¹³¹ . signifikant verlängert Ich (25 Tage) Gruppe (alle P  0,01)

In Vivo ¹³¹ I Therapie

Abbildung 4b zeigt das durchschnittliche Tumorvolumen über die Zeit in den vier Gruppen. Als anfängliche Referenz wurde das Tumorvolumen vor der Injektion verwendet. Außer in den ¹³¹ I-BSA-MSNs-Anti-VEGFR2-Gruppe wuchsen die Tumoren allmählich in allen Gruppen, insbesondere in der Na ¹³¹ Ich und Kochsalzlösung Gruppen. An Tag 24 das mittlere Tumorvolumen im Na ¹³¹ I und Kochsalzlösung betrug 296,6 ± 24,2 % bzw. 278,3 ± 19,3 %, verglichen mit 198,7 ± 13,2 % in den ¹³¹ .-Gruppen I-BSA-MSNs-Gruppe an Tag 30. Interessanterweise beobachteten wir, dass das Volumen in der Anti-VEGFR2-Zielgruppe nach Tag 9 nach der Injektion langsam abnahm und am Ende der Beobachtung fast auf den anfänglichen Referenzwert zurückging.

Abbildung 4c zeigt die Veränderungen des Körpergewichts der vier Gruppen. Das Körpergewicht nahm im Na ¹³¹ .-Bereich allmählich ab I und Kochsalzlösungsgruppen während des Beobachtungszeitraums. Die anderen beiden Gruppen verloren jedoch nur in der ersten Woche an Gewicht, das zu späteren Zeitpunkten wiedererlangt wurde, insbesondere bei der Anti-VEGFR2-Zielgruppe.

Überlebensanalyse

In dieser Studie haben wir die Überlebenswahrscheinlichkeit als weitere Kennzahl verwendet, um die therapeutischen Wirkungen von ¹³¹ . zu bewerten I-markierte Nanopartikel. Abbildung 4d zeigt die Kaplan-Meier-Überlebenskurven nach Behandlungen mit Kochsalzlösung Na ¹³¹ Ich, ¹³¹ I-BSA-MSNs oder ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 im ATC-Tumor-tragenden Nacktmaus-Modell. Tumore schritten in Kochsalzlösung und Na ¹³¹ . schnell voran I-Gruppen und die mediane Überlebenszeit betrug 27 bzw. 25 Tage. Die Analyse mit einem Log-Rank-Test ergab, dass die mediane Überlebenszeit im ¹³¹ Die I-BSA-MSNs-Gruppe (34 Tage) war im Vergleich zur Na ¹³¹ .-Gruppe signifikant verlängert Ich gruppe (P  0,001). Darüber hinaus fanden wir, dass die Behandlung in der Anti-VEGFR2-Zielgruppe (mediane Überlebenszeit 41 Tage) zu signifikant besseren Überlebensergebnissen führte als die Behandlung in der Nicht-Zielgruppe (P < 0.01).

Histopathologische Analyse

Um die Antitumorwirkung von ¹³¹ . zu bewerten I-markierte Nanopartikel und Test der potentiellen Toxizität von MSNs in Mäusen, die wichtigsten Organe und Tumoren wurden nach der Strahlentherapie auf Hämatoxylin- und Eosin-Färbung gesammelt. Bei den tumortragenden Mäusen wurden nach Behandlung mit ¹³¹ . keine signifikanten pathologischen Veränderungen der lebenswichtigen Organe beobachtet I-markierte Nanopartikel (Abb. 5a). Dies zeigte, dass innerhalb des Beobachtungszeitraums keine offensichtliche systemische Toxizität aufgetreten war. Darüber hinaus wurden die mit ¹³¹ . behandelten Tumoren I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 zeigte Degeneration und massive Nekrose von Tumorzellen, was deutlicher war als bei der ¹³¹ I-BSA-MSNs-Gruppe. Der mit Na ¹³¹ . behandelte Tumor Ich oder die Kochsalzlösungsgruppe war mit lebensfähigen Tumorzellen gefüllt. Die immunhistochemische Analyse des Tumors ergab eine sichtbare Expression von VEGFR (Abb. 5b).

Histopathologische Analyse. a Histopathologische Analyse wichtiger Organe von FRO ATC-Tumor-tragenden Mäusen nach Behandlung mit ¹³¹ I-markierte Nanopartikel. Es wurden keine signifikanten pathologischen Veränderungen an Herz, Leber, Lunge und Niere beobachtet. b Pathologische Untersuchungen (H &E-Färbung) und immunhistochemische Analyse von Tumoren bei Mäusen. Große Fragmente aus der Degeneration und Nekrose von Tumorzellen in der Anti-VEGFR2-Zielgruppe und kleine Stücke von Nekrose geringer Dichte in der ¹³¹ Die Gruppe I-BSA-MSNs wird angezeigt. Im Gegensatz dazu wurden im Na ¹³¹ . nur lebensfähige Tumorzellen beobachtet Ich und Kochsalzlösung Gruppen. Mikrophotographie aus immunhistochemischer Analyse zeigte eine sichtbare Expression von VEGFR. Bar = 200 μm

Diskussion

Die Prognose der ATC ist nach wie vor schlecht und es gibt bisher keine wirksamen Therapieoptionen [1, 2, 6]. Die gezielte molekulare Therapie hat als neuartige Therapie die Morbidität und Mortalität vieler Krebsarten verbessert [23, 24]. VEGFR is crucial to microvascular formation, which facilitates the growth of most malignancies, and allows continued tumor expansion [9, 10]. In this study, we evaluated the efficacies of Na ¹³¹ I, ¹³¹ I-BSA-MSNs, and ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 for the treatment of ATC in tumor-bearing nude mouse models. The results demonstrated that both anti-VEGFR2 targeted and non-targeted nanoparticles labeled with ¹³¹ I were effective in delaying the tumor growth of ATC and that the ¹³¹ I-labeling anti-VEGFR2 targeted MSNs was the most effective agent to inhibit the tumor growth in nude mice and prolonging median survival. This treatment modality might represent a novel therapeutic option for ATC.

VEGFR targeting with nanoparticles is rarely reported in the literature. Goel S et al. [19] confirmed that VEGFR targeting using VEGF₁₂₁ conjugated, anti-VEGFR therapeutics-loaded MSNs represented a major advance for angiogenesis imaging and inhibition in human glioblastoma. A study performed by Gule indicated that inhibition of epidermal growth factor receptor (EGFR) and VEGFR2 in ATC using vandetanib causes significant tumor growth inhibition in vivo in an orthotopic xenograft model [15]. In the present study, using confocal microscopy, we found that both targeted and non-targeted nanoparticles could efficiently bind to the cytoplasm and cytoplast of FRO cells, and further confirmed that the targeting ability of the nanoparticles was enhanced via modification with the anti-VEGFR2 antibody, which result was consistent with that of the time-dependent cellular uptake experiment. Additionally, after intratumoral injection with the respective drugs, we compared data on the tissue distribution of ¹³¹ I in the tumor-bearing nude mice at 24 and 72 h for the different groups. The radioactivity for all groups was mostly accumulated in the tumor and gradually decreased with time. Moreover, we found that the radioactivity in anti-VEGFR2 targeted group could be retained for longer time in the tumor in comparison with non-targeted group, which was also consistent with the results observed by confocal microscopy.

SPECT/CT is a powerful tool to provide both structural and functional imaging information for diseases, and can monitor the metabolism of radioactive drugs at different times post injection [30,31,32]. In the present study, we compared data on the tissue distribution of ¹³¹ I using SPECT/CT. The results showed that radioactive accumulation in the Na ¹³¹ I group was not seen at 3 day post-injection. However, higher accumulation in the tumor tissue was observed at 2 weeks post-injection for the two groups with ¹³¹ I-labeled nanoparticles, and at 3 weeks the radioactive signal in the anti-VEGFR2 targeted group was apparently stronger than that in the non-targeted group. We hypothesized that the passive tumor targeting of MSNs, which relies on unpredictable tumor extravasation and enhanced permeability retention effect, and positive targeting linked with anti-VEGFR-2, associated with VEGFR2 overexpression in ATC, played a key role in enhancing the retention of the nanoparticles in the tumors. This finding revealed that anti-VEGFR2 modification prolonged the retention time of ¹³¹ I in the tumor tissue compared with that of free Na ¹³¹ I and ¹³¹ I-BSA-MSN, which was also similar to the tissue biodistribution of ¹³¹ I measured by γ counter.

In the present study, we monitored the body weight change of nude mice after intratumoral injection with a single dose of 2 mCi ¹³¹ I, which showed that the body weight in the ¹³¹ I-labeled nanoparticle groups gradually increased at 1 week post-injection, especially for the anti-VEGFR2 targeted group. Similarly, we also observed the changes in tumor volume and found that the tumors in the Na ¹³¹ I or saline group grew rapidly, while the volume in ¹³¹ I-BSA-MSNs group increased slowly. Interestingly, the tumors in anti-VEGFR2 targeted group gradually decreased after 1 week post-injection, which was contrary to the body weight change. These results indicated that the anti-VEGFR2 modification could effectively inhibit the increase in tumor volume and thereby enhanced the efficiency of ¹³¹ I therapy. We considered that the tumor necrosis was caused by the beta rays emitted from ¹³¹ I, which resulted in tumor shrinkage and indirectly led to an increase in body weight. This effect, we speculated, began to appear mainly 1 week after injection of ¹³¹ I.

Our findings indicated that the treatment mediated by intratumorally injected ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 resulted in significant tumor growth delay, which was confirmed increased structural damage and massive necrosis in tumor tissue compared with that in the ¹³¹ I-BSA-MSNs group. Significantly, this higher antitumor activity was achieved without causing apparent systemic toxic effects, as indicated by the lack of significant pathological changes in the vital organs observed in tumor-bearing nude mice. Although further studies are needed to document both the acute and chronic toxicological effects, ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 exhibited several properties that made them a promising candidate for minimally invasive therapy for ATC.

In our pre-experiment, injection into the tail vein was performed and the results showed that the radioactivity was mainly distributed in the phagocytosis system. Intratumoral injection was used in some studies [29, 33, 34], and the operation is more convenient. Therefore, we used intratumoral injection as the injection method and also achieved better results. MSNs offer a promising approach to overcome the insolubility issue and deliver large payloads of hydrophobic small molecule drugs. Currently, we are investigating the potential for loading targeted anti-cancer drugs using MSNs. We will provide the results in the future publication.

Conclusions

In the present study, we successfully synthesized BSA-MSNs-anti-VEGFR2, with uniform spherical morphology, and which were radiolabeled with ¹³¹ I using the Chloramine-T method. The results showed that both targeted and non-targeted MSNs could efficiently bind to the cytoplasm and cytoplast of FRO cells. The radioactivity in ATC tumor-bearing nude mouse model was mostly accumulated in the tumor and could be retained a longer time in the ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 group. Additionally, the tissue distribution of ¹³¹ I could be also imaged and validated using SPECT/CT. Moreover, tumor growth in the ATC tumor-bearing nude mouse model was significantly inhibited by the anti-VEGFR2 targeted MSNs compared with that achieved using non-targeted MSNs and the ¹³¹ I treatment with anti-VEGFR2 targeting MSNs significantly prolonged the survival of ATC tumor-bearing mice. Our data supported the view that such an approach may represent a more effective means to treat ATC.

Abkürzungen

APTES:

Aminopropyltriethoxysilane

ATC:

anaplastic thyroid cancer

BSA:

Rinderserumalbumin

CLSM:

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

CTAB:

Hexadecyltrimethylammonium bromide

DAPI:

4,6-Diamidino-2-phenylindole

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle medium

DMSO:

Dimethylsulfoxid

EDC:

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid

FBS:

Fötales Rinderserum

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

HBSS:

Hanks’ balanced salt solution

MSNs:

Mesoporous silica nanoparticles

NHS:

N -hydroxysuccinimide

PBS:

Phosphate buffer saline

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop

TEOS:

Tetraethylorthosilikat

VEGFR:

Vascular endothelial growth factor receptor