Chitosan-gekappte, enzym-responsive hohle mesoporöse Silica-Nanoplattformen für gezielte Kolon-Wirkstofffreisetzung

Zusammenfassung

Ein enzym-responsives, kolon-spezifisches Verabreichungssystem wurde auf Basis hohler mesoporöser Silica-Sphären (HMSS) entwickelt, an die biologisch abbaubares Chitosan (CS) über spaltbare Azobindungen gebunden war (HMSS–N=N–CS). Doxorubicin (DOX) wurde in amorpher Form im Hohlraum und den Mesoporen der HMSS mit einer hohen Beladungseffizienz von 35,2 % eingekapselt. In-vitro-Freisetzungsstudien zeigten, dass HMSS–N=N–CS/DOX eine enzym-responsive Freisetzung aufwies. Das aufgebrachte CS erhöhte die Biokompatibilität und Stabilität und verringerte die Proteinadsorption auf den HMSS. Magen-Darm-Schleimhautreizungen und Zellzytotoxizität wiesen auf eine gute Biokompatibilität von HMSS und HMSS–N=N–CS hin. Zellaufnahmestudien ergaben, dass die Aufnahme von DOX nach Vorinkubation von HMSS–N=N–CS/DOX mit einem kolonalen Enzymgemisch deutlich zunahm. HMSS–N=N–CS/DOX, das mit Kolonenzymen inkubiert wurde, zeigte eine erhöhte Zytotoxizität, und sein IC₅₀-Wert war dreimal niedriger als der der Gruppe ohne Kolonenzyme. Diese Arbeit legt den Grundstein für weitere Forschung an mesoporösen Trägern für die orale kolon-spezifische Wirkstofffreisetzung.

Einleitung

In den letzten Jahren haben stimuli-responsive Drug-Delivery-Systeme (DDS) große Aufmerksamkeit für die effiziente Beladung und selektive Freisetzung von Wirkstoffen in kranken Geweben erfahren. Solche Systeme können an erkrankte Stellen transportiert werden und dort bedarfsgerecht Wirkstoffe freisetzen, um therapeutische Effekte zu verbessern und vorzeitige Leckage-bedingte Nebenwirkungen zu vermeiden. Alle internen und externen Stimuli wie Redoxpotenzial, pH-Wert, Enzyme, Temperatur und Licht wurden zur Entwicklung stimuli-responsiver DDS genutzt. Unter diesen haben Enzyme als interne Stimuli aufgrund ihrer unterschiedlichen Konzentrationen in verschiedenen Geweben breite Beachtung gefunden.

Seit über zwei Jahrzehnten haben sich mesoporöse Silica-Sphären (MSS) mit Porengrößen von 2–50 nm als stimuli-responsive Wirkstoffträger etabliert, da sie ein bemerkenswert großes Porenvolumen, eine hohe spezifische Oberfläche für hohe Beladungskapazität, eine gut organisierte Porenstruktur, leicht funktionalisierbare Oberflächen und gute Biokompatibilität aufweisen. Hohle mesoporöse Silica-Sphären (HMSS) mit einer mesoporösen Schalenstruktur und einem Hohlraum sind herkömmlichen MSS überlegen, da die hohle Struktur mehr Wirkstoffe mit höherer Speicherkapazität aufnehmen kann. Verschiedene stimuli-responsive Nanocarrier auf MSS-Basis wurden entwickelt, um Wirkstoffmoleküle mithilfe verschiedenster Gatekeeper wie Polymere, anorganische Nanopartikel, Dendrimere, Biomakromoleküle, makrozyklische Verbindungen, Peptide und Lipide zu beherbergen. Obwohl zahlreiche DDS auf MSS-Basis mit funktionaler Verkappung eine Freisetzung in Reaktion auf diverse externe oder interne Stimuli ermöglichen, wurden nur wenige für die kolon-spezifische gezielte Wirkstofffreisetzung eingesetzt.

Es ist bekannt, dass die orale Verabreichung die bevorzugte und einfachste Art der Medikamentengabe ist. Kolon-spezifische gezielte Wirkstofffreisetzung ist für die Behandlung von Kolonererkrankungen wie Morbus Crohn, kolorektalem Krebs und Colitis ulcerosa äußerst attraktiv. Allerdings kann die kolon-spezifische Freisetzung auf mehrere Hindernisse stoßen, darunter ein geringerer Wassergehalt und eine relativ kleinere Absorptionsfläche im Vergleich zu anderen Abschnitten des Magen-Darm-Trakts (GI-Trakt). Zudem begegnen orale DDS der stark sauren Magenumgebung, die den Abbau der geladenen Wirkstoffe im GI-Trakt beschleunigen und so die kolon-spezifische Freisetzung verhindern kann. Aus diesem Grund wurden verschiedene pH-abhängige DDS entwickelt, um eine pH-getriggerte Freisetzung bei den nahezu neutralen pH-Werten (6–7) des GI-Trakts zu realisieren und den stark sauren Magenbedingungen standzuhalten. Da der Säuregradunterschied zwischen Dünndarm (pH 6,8) und Kolon (pH 7,4) nur gering ist, fällt es solchen pH-responsiven DDS schwer, eine kolon-spezifische Freisetzung zu erreichen.

Chitosan (CS), ein kationisches, biologisch abbaubares, natürlich vorkommendes Polysaccharid, besteht aus β-(1-4)-verknüpften Glucosamin- und N-Acetyl-D-Glucosamin-Einheiten. CS hat in der biomedizinischen Forschung aufgrund seiner faszinierenden Eigenschaften – Biologische Abbaubarkeit, Biokompatibilität, Mucoadhäsivität und antibakterielle Aktivität – große Aufmerksamkeit erfahren. Im Vergleich zu synthetischen Polymeren, Polyelektrolyten und Supramolekülen ist CS relativ kostengünstig und durch vollständige Deacetylierung von Chitin leicht verfügbar. Zudem wurde berichtet, dass CS Tight Junctions zwischen Zellen öffnen und so die Wirkstoffabsorption erhöhen kann. Daher wurde das Polymer CS aufgrund seiner guten Biokompatibilität und geeigneten Größe zur Abdeckung der Mesoporen von HMSS als Kappungsmittel ausgewählt.

In dieser Arbeit wurde erstmals ein kolon-spezifisches, enzym-responsives DDS auf Basis eines HMSS-Materials (HMSS–N=N–CS) entworfen, wie in Schema 1 dargestellt. Die HMSS-Träger wurden via eine selektive Ätzstrategie hergestellt. Das Polymer CS wurde über Azobindungen an die HMSS-Oberfläche gebunden, um als Gatekeeper die Öffnungen der HMSS zu verschließen. Die Azobindungen zwischen HMSS und CS können durch Enzyme im Kolon gespalten werden, was zur Ablösung des CS von den HMSS-Öffnungen führt. DOX diente als Modellwirkstoff, der in den Hohlraum der HMSS eingebettet wurde, und In-vitro-Freisetzungsexperimente wurden durchgeführt, um die enzym-responsive Freisetzung in Gegenwart kolonaler Enzyme zu evaluieren. Konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) und Durchflusszytometrie (FCM) wurden genutzt, um die zelluläre Aufnahme durch Caco-2-Zellen zu untersuchen. Abschließend wurde die Zytotoxizität von HMSS–N=N–CS/DOX gegenüber Caco-2-Zellen gemessen.

Materialien und Methoden

Materialien

Tetraethoxysilan (TEOS), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC), Chitosan (DAc ≥ 95 %), Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES), 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), Azobenzol-3,3′-dicarbonsäure, Kaliumbromid (Spektralreinheit, ≥ 99,5 %), N-Hydroxysuccinimid (NHS) und DOX wurden von Aladdin Chemical Inc. (Shanghai, China) bezogen. Azobenzol-3,3′-dicarbonsäure wurde von Inno-chem Technology Co. Ltd. (Peking, China) geliefert. Zellkulturmedien DMEM, Penicillin-Streptomycin und fetales Kälberserum (FBS) stammten von GIBCO, Invitrogen Co. (Carlsbad, USA). Alle Analysenreagenzien wurden ohne weitere Reinigung verwendet.

Herstellung von HMSS–N=N–CS

Herstellung von HMSS–NH₂

Die HMSS-Nanopartikel wurden basierend auf einer veröffentlichten Arbeit mittels einer selektiven Ätzmethode hergestellt. Zunächst wurden massive Silica-Sphären durch ein modifiziertes Stöber-Verfahren synthetisiert. Kurz gesagt: 6 ml TEOS wurden in ein Gemisch aus 10 ml deionisiertem Wasser, 74 ml Ethanol und 3 ml konzentrierter NH₃·H₂O gegeben. Die Mischung wurde 60 min bei Raumtemperatur gerührt, um kolloidale Silica-Suspensionen zu erhalten. Die festen Sphären wurden zentrifugiert, gewaschen und getrocknet. Anschließend wurde eine mesoporöse Silica-Schale auf die festen Silica-Sphären aufgebracht. 300 mg festes Silica wurde in 50 ml deionisiertem Wasser 45 min ultraschallbehandelt. Die Silica-Suspension wurde in ein Gemisch aus 60 ml Ethanol, 450 mg CTAB, 90 ml Wasser und 1,7 ml NH₃·H₂O gegeben. Nach 60 min Rühren wurde TEOS (0,75 ml) zugegeben. Nach weiterem Rühren für 6 h wurden die Nanopartikel zentrifugiert, gesammelt und in 40 ml Wasser wieder dispersiert. Etwa 1,2 g Na₂CO₃ wurde unter starkem Rühren hinzugefügt. Nach 12 h bei 55 °C wurden die HMSS-Nanopartikel gesammelt und mit anhydrem Ethanol gewaschen. Die Post-Grafting-Methode mit einem Massen-Volumen-Verhältnis von HMSS zu APTES von 4:1 wurde bei 80 °C unter N₂ für 8 h angewendet, um HMSS–NH₂ herzustellen; CTAB wurde durch Reflux entfernt.

Herstellung von HMSS–N=N–COOH

Azobenzol-3,3′-dicarbonsäure (50 mg) wurde in pH 5,8 PBS gelöst. Dann wurden EDC (5 mg/ml) und NHS (3 mg/ml) zur Aktivierung der Azobenzol-3,3′-dicarbonsäure bei 30 °C für 1 h zugegeben. Anschließend wurde 10 ml PBS mit 15 mg/ml HMSS–NH₂ hinzugefügt und die Mischung 24 h gerührt. Das resultierende HMSS–N=N–COOH wurde durch Zentrifugation abgetrennt und mit Ethanol gewaschen.

Herstellung von HMSS–N=N–CS

0,15 g CS und 0,5 ml Essigsäure wurden in 50 ml Wasser gelöst, um eine CS-Lösung herzustellen. 100 mg HMSS–N=N–COOH wurden in 25 ml pH 5,0 PBS dispersiert und 0,5 h mit EDC und NHS aktiviert. Dann wurde die CS-Lösung (10 ml) unter kontinuierlichem Rühren für 1 Tag hinzugefügt. Schließlich wurde das synthetisierte HMSS–N=N–CS zentrifugiert und gewaschen, um die Proben zu erhalten.

Extraktion des kolonalen Enzymgemischs aus der Mikroflora

Die kolonale Mikroflora wurde gemäß einer veröffentlichten Arbeit gesammelt. Die Kultur wurde inkuliert, um das von der kolonalen Mikroflora sezernierte Enzymgemisch bei 37 °C zu erhalten. Das simulierte kolonale Medium mit Enzymgemisch wurde durch einen 0,22-µm-Filter filtriert, um alle zellulären Trümmer aus dem Kulturmedium zu entfernen. Anschließend wurde das Filtrat lyophilisiert, um das Enzymgemisch in Pulverform zu erhalten, das in weiteren Studien verwendet wurde.

Wirkstoffbeladung und enzym-responsive Freisetzung

25 mg DOX wurden in 5 ml pH 3,5 HCl-Lösung gelöst. 100 mg HMSS–N=N–CS wurden der DOX-Lösung zugegeben und 12 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde der pH-Wert der Mischung mit 0,2 M NaOH-Lösung auf 7,0 eingestellt und weitere 12 h gerührt. Das DOX-beladene HMSS–N=N–CS (bezeichnet als HMSS–N=N–CS/DOX) wurde zentrifugiert und gewaschen, um das an der Oberfläche adsorbierte DOX zu entfernen. Der Überstand wurde bei jedem Schritt gesammelt, um die DOX-Beladungseffizienz (LE) bei 480 nm per UV-Vis-Spektrophotometrie zu messen. Die Gesamtmasse des in HMSS–N=N–CS geladenen DOX wurde berechnet, indem die unbeladene DOX-Masse nach dem Beladungsprozess von der initialen DOX-Masse subtrahiert wurde. HMSS/DOX wurde als Kontrolle unter Verwendung von HMSS als initialem Träger hergestellt. Die LE von DOX wurde nach folgender Gleichung berechnet:

LE (%) = (m_A - m_B) / (m_A - m_B + m_C) × 100

Dabei war m_A die zugegebene DOX-Masse, m_B die DOX-Masse im Überstand und m_C die Gesamtmasse von HMSS–N=N–CS.

Die in-vitro enzym-responsive Freisetzung von DOX aus HMSS–N=N–CS/DOX wurde wie folgt bewertet: 2 mg HMSS–N=N–CS/DOX und HMSS/DOX-Nanopartikel wurden in pH 7,4 PBS bei 125 rpm mit unterschiedlichen Konzentrationen des kolonalen Enzymgemischs (0 mg/ml, 0,3 mg/ml und 1 mg/ml) dispersiert. Zu festgelegten Zeitintervallen wurde 1 ml Freisetzungsmedium entnommen, um die Absorption zu messen. Die DOX-Freisetzung wurde bei 480 nm bestimmt. HMSS/DOX diente als Kontrolle.

BSA-Adsorption

Die BSA-Adsorptionsmenge wurde basierend auf veröffentlichten Arbeiten bewertet. BSA wurde in pH 7,4 PBS (0,5 mg/ml) gegeben. 5 mg HMSS, HMSS–NH₂ und HMSS–N=N–CS wurden in 2,5 ml PBS (pH 7,4) gegeben. Ein gleiches Volumen BSA-Lösung wurde zugegeben und die Suspension bei 100 rpm geschüttelt. Nach 6 h wurde die obere Lösung durch Zentrifugation gesammelt. Schließlich wurde die BSA-Konzentration nach Färbung mit Coomassie-Brillantblau-Lösung bei 595 nm gemessen.

Charakterisierung

Die mesoporöse Netzwerkstruktur und Morphologie der HMSS-Nanopartikel wurden durch TEM-Aufnahmen (EM–208S, CSIS, USA) untersucht. Die spezifische Oberfläche und Porengrößenverteilung wurden mittels Stickstoffadsorptionsanalyse (V-Sorb 2800P, Gold APP Instrument Corporation, China) charakterisiert. Das ζ-Potenzial und die Partikelgröße wurden auf einem Nano-z90 Nanosizer (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) bestimmt. TGA-Analysen wurden auf einem TGA-50-Gerät (Shimadzu, Kyoto, Japan) mit einer Heizrate von 10 °C/min unter Stickstoffstrom durchgeführt. Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FT-IR) wurde mit einem FT-IR-Spektrometer (Bruker Tensor27, Schweiz) im Bereich 400–4000 cm⁻¹ mittels KBr-Pressling-Technik gemessen. Röntgenbeugung (XRD) wurde an einem Siemens D5005 Diffraktometer (Karlsruhe, Deutschland) mit Cu-Kα-Strahlung (λ = 1,5418 Å) durchgeführt.

Zellkultur und Zellaufnahme-Experiment

Caco-2-Zellen wurden in einem Medium mit 10 % FBS, 1 % nicht-essenziellen Aminosäuren, 1 % (v/v) Natriumpyruvat und 1 % Streptomycin kultiviert. NIH-3T3-Zellen wurden in DMEM mit 1 % Streptomycin und 10 % FBS kultiviert. Die Aufnahme der Nanocarrier durch Caco-2-Zellen wurde mittels FCM und CLSM charakterisiert. Caco-2-Zellen wurden in 24-Well-Platten ausgesät. Nach Übernachtkultur wurden freies DOX, HMSS–N=N–CS/DOX und HMSS–N=N–CS/DOX, das mit kolonalen Enzym-Nanopartikeln vorinkubiert war (entsprechend 5 µg/ml DOX), in die entsprechenden Wells gegeben. Nach weiterer 2-stündiger Inkubation wurde das Zellmedium entfernt und gründlich mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit 4 % Formaldehyd fixiert und mit Hoechst 33258 für die CLSM-Beobachtung gefärbt. FCM wurde zur quantitativen Bewertung der zellulären Aufnahme verwendet. Caco-2-Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesät und 24 h weiter inkubiert. Nach PBS-Waschung wurden die Zellen mit freiem DOX, HMSS–N=N–CS/DOX und HMSS–N=N–CS/DOX, das mit kolonalen Enzym-Nanopartikeln vorinkubiert war (entsprechend 5 µg/ml DOX), in serumfreiem DMEM 2 h inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit kaltem PBS gespült, trypsinisiert und in 0,5 ml PBS resuspendiert. Die DOX-Fluoreszenz in den Zellen wurde mit einem FACS Canto-Durchflusszytometer (Becton, Dickinson, USA) gemessen.

In-vitro Zellproliferationsassay

Die Zytotoxizität der leeren HMSS- und HMSS–N=N–CS-Träger gegenüber NIH-3T3- und Caco-2-Zellen wurde mittels MTT-Assay geprüft. Kurz gesagt: Caco-2- und NIH-3T3-Zellen wurden separat in 96-Well-Platten ausgesät und über Nacht inkubiert. Das alte Zellmedium wurde durch ein serumfreies Medium mit unterschiedlichen Nanopartikelkonzentrationen ersetzt. Nach 2-tägiger Inkubation wurden 50 µl MTT-Lösung (2 mg ml^–1) zugegeben und 4 h inkubiert, um lebende Zellen zu messen. Die MTT-Lösung wurde entfernt und 150 µl DMSO zum Lösen des Formazans hinzugefügt. Die Absorption wurde bei 570 nm an einem Mikroplattenleser (Tecan, Männedorf, Schweiz) gemessen. Die Zytotoxizität von freiem DOX, HMSS–N=N–CS/DOX und HMSS–N=N–CS/DOX, das mit Enzymgemischen aus kolonaler Mikroflora vorinkubiert war, wurde an Caco-2-Zellen mit entsprechenden DOX-Konzentrationen (0,1, 1, 5, 10 und 20 µg/ml) gemessen. Die Inkubationszeit betrug 48 h, die weiteren Versuchsschritte entsprachen der oben beschriebenen Vorgehensweise.

Toxizitätsstudien

Magen-Darm-Schleimhautreizungstests sind essenziell für die Bewertung der in-vivo-Biosicherheit oraler Wirkstoffträger. Männliche Sprague-Dawley-Ratten (180 ± 10 g) wurden zufällig in drei Gruppen (je drei Ratten) aufgeteilt. Ratten erhielten täglich Kochsalzlösung, HMSS und HMSS–N=N–CS-Nanopartikel in einer Dosis von 100 mg/kg. Nach 7 Tagen wurden alle Ratten getötet, die Gewebe entnommen und histopathologisch (H&E) untersucht. Zur Bewertung der Biosicherheit von HMSS- und HMSS–N=N–CS-Nanopartikeln wurden die Körpergewichte von BALB/c-Mäusen (18–20 g) nach oraler Verabreichung von 100 mg/kg jeden zweiten Tag aufgezeichnet. Alle Versuche erfolgten gemäß den Richtlinien für die Haltung und Verwendung von Labortieren der Qiqihar Medical University und wurden vom Ethikkomitee der Qiqihar Medical University genehmigt.

Statistik

Statistische Daten wurden mit der SPSS-Software mittels zweiseitigem Student's t-Test analysiert. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung und Charakterisierung von HMSS–N=N–CS

HMSS wurden basierend auf Vorarbeiten mit geringfügigen Änderungen hergestellt. Zunächst wurden feste SiO₂-Nanosphären präpariert und eine mesoporöse Schale unter Verwendung des CTAB-Templates auf die Oberfläche der festen Silica-Nanosphären aufgebracht. Anschließend wurde Na₂CO₃ verwendet, um die festen SiO₂-Nanosphären selektiv zu ätzen, während die mesoporöse Schale durch das Template CTAB geschützt wurde. Die Herstellung von HMSS–N=N–CS mit CS als „Gatekeeper“ über eine Azoverknüpfung ist in Abb. 1a dargestellt. Zunächst wurden die Oberflächen der HMSS-Nanopartikel mit APTES als Alkyl-Kupplungsreagenz zu aminofunktionalisierten HMSS (HMSS–NH₂) mittels Post-Modifikationsmethode modifiziert. Anschließend wurde HMSS–N=N–COOH durch eine Amidierungsreaktion zwischen den Aminogruppen von HMSS–NH₂ und den Carboxylgruppen von Azobenzol-3,3′-dicarbonsäure hergestellt. Schließlich wurde CS kovalent an die Oberfläche der HMSS-Nanopartikel durch eine Amidierungsreaktion zwischen den Carboxylgruppen von HMSS–N=N–COOH und den Aminogruppen im CS gebunden.

Wie in der TEM-Aufnahme in Abb. 1a dargestellt, betrug der durchschnittliche Durchmesser der HMSS 280 nm, und die HMSS wiesen eine gleichmäßige hohle Struktur und hochgeordnete mesoporöse Schale auf. Die durchschnittliche Dicke der mesoporösen Schale betrug ca. 90 nm. Im Vergleich zur glatten Oberfläche der HMSS war die Oberfläche des grafteten Polymers HMSS–N=N–CS (Abb. 1b) rau, was darauf hindeutet, dass das CS den HMSS-Träger bedeckte.

Die spezifischen Oberflächen und Porenverteilungen mesoporöser Materialien spielen eine entscheidende Rolle bei der Beladung und Freisetzung von Gastmolekülen für kontrollierte Freisetzung. Porengrößenverteilungskurven und Isothermen wurden durch N₂-Adsorptions- und Desorptionsanalyse gemessen (Abb. 2). Detaillierte Parameter (BET-spezifische Oberfläche (S_BET), Gesamtporenvolumen (V_P) und Porengrößenverteilung (D_P)) sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die S_BET und V_P von reinem HMSS betrugen 810,7 m²/g bzw. 0,969 cm³/g, und die D_P lag bei ca. 3,8 nm. Die D_P von HMSS–NH₂ war nach der Aminierung fast identisch mit der von HMSS, was darauf hindeutet, dass die Mesoporen nach der Aminofunktionalisierung nicht blockiert waren. Die S_BET und V_P von HMSS–N=N–CS nahmen nach Modifikation mit der Azoverbindung und CS-Beschichtung deutlich ab, was belegt, dass CS die Oberfläche der HMSS bedeckte.

Die erfolgreiche Grafting von HMSS–N=N–CS wurde durch verschiedene Methoden verifiziert. Das ζ-Potenzial von HMSS–NH₂ änderte sich nach der Funktionalisierung stark, von −27,9 auf +31,4 mV (Abb. 3a), was auf die Hinzufügung von Aminogruppen an die HMSS-Oberfläche zurückzuführen war. Nach Reaktion von HMSS–NH₂ mit Azobenzol-3,3′-dicarbonsäure zu HMSS–N=N–COOH sank das ζ-Potenzial weiter auf −2,0 mV aufgrund der Carboxylgruppen an der HMSS-Oberfläche. Nach weiterer Grafting des CS-Polymers auf die HMSS-Oberfläche zu HMSS–N=N–CS kehrte das ζ-Potenzial zu +32,4 mV zurück. Dies wurde auf die aminreichen, positiv geladenen CS-Beschichtung auf der HMSS-Oberfläche zurückgeführt. Thermogravimetrische Analysen (TGA) von HMSS, HMSS–NH₂, HMSS–N=N–COOH und HMSS–N=N–CS sind in Abb. 3b dargestellt. Im Vergleich zu HMSS–N=N–COOH verlor HMSS–N=N–CS zusätzlich ca. 19 % Gewicht, was auf den Abbau der CS-Ketten zurückzuführen war. Die Grafting der Azobindungen auf der HMSS-Oberfläche wurde auch durch eine Farbänderung während der Herstellung von HMSS–N=N–COOH bestätigt (Inset in Abb. 3b). Das Edukt HMSS–NH₂ war weiß, während das Produkt HMSS–N=N–COOH nach Reaktion mit Azobenzol-3,3′-dicarbonsäure gelbbraun wurde. Der hydrodynamische Durchmesser (D_H) und der Polydispersitätsindex (PDI) von HMSS, HMSS–NH₂ und HMSS–N=N–CS wurden in destilliertem Wasser bestimmt (Abb. 3c). HMSS wies einen Durchmesser von 309 nm und einen PDI von 0,190 auf. Nach Hinzufügung von Aminogruppen auf den HMSS-Oberflächen zur Bildung von HMSS–NH₂ stieg der D_H auf 324 nm. Der Durchmesser von HMSS–N=N–CS betrug 342 nm, was größer war als der von HMSS–NH₂ aufgrund der grafteten CS-Ketten. Der PDI von HMSS–N=N–CS (0,177) war kleiner als der von HMSS–NH₂, was auf eine gleichmäßigere Partikelgrößenverteilung nach CS-Grafting hindeutete. Im Vergleich zu den TEM-Durchmessern waren die durch DLS gemessenen Durchmesser von HMSS und HMSS–N=N–CS größer, da DLS die Partikel in wässriger Umgebung mit Hydrathülle misst, während TEM trockene Partikel abbildet. FT-IR-Spektren von HMSS–NH₂, HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS und CS sind in Abb. 3d gezeigt. Im Vergleich zu den Peaks von HMSS–NH₂ war ein Anstieg der Absorptionspeaks bei 2853 und 2925 cm⁻¹ auf die Schwingung von –CH₂ bei der Grafting der carboxy-terminalen Azobindungen zurückzuführen. Nach Hinzufügen von CS auf die Oberfläche von HMSS–N=N–COOH traten Zunahmen der Absorptionspeaks bei 1660 cm⁻¹ und 3435 cm⁻¹ auf, die auf υ_(C=O) im Amidband und die Schwingung von N–H im CS zurückzuführen waren. Alle Ergebnisse belegen die erfolgreiche Herstellung von HMSS–N=N–CS.

Wirkstoffzustand und Beladungseffizienz

DOX wurde gewählt, um das Beladungs- und Freisetzungsverhalten von HMSS–N=N–CS zu untersuchen. Wenn der pH-Wert der HMSS–N=N–CS-Nanopartikelsuspension auf pH 3,5 eingestellt wurde, wurde das CS-Biopolymer aufgrund der protonierten Aminogruppen in saurer Umgebung positiv geladen (der pK_a von CS beträgt 6,3). Das CS-Polymer wurde positiv geladen und quoll auf, was zur Öffnung der Mesoporen von HMSS–N=N–CS führte, bedingt durch die abstoßende Wechselwirkung zwischen den CS-Ladungen. Somit konnte DOX durch Diffusion in die Mesoporen von HMSS–N=N–CS gelangen. Nach Einstellung des beladenen Gemischs auf pH 7,4 deprotonierten die CS-Ketten und kollabierten, um die vorzeitige Freisetzung von DOX zu verhindern.

Die LE von HMSS–N=N–CS/DOX betrug 35,2 %, was deutlich höher war als die anderer DOX-beladener mesoporöser Silica-Verabreichungssysteme. Die hohe LE von DOX in HMSS-Nanocarriern wurde dem Hohlraum, der großen spezifischen Oberfläche und dem mesoporösen Netzwerk zugeschrieben, die als Wirkstoffreservoir dienten. Der physikalische Zustand von DOX in HMSS–N=N–CS/DOX wurde durch Röntgenbeugung (XRD) untersucht. Wie in den XRD-Profilen (Abb. 4) gezeigt, wies rohes DOX charakteristische und intensive kristalline Beugungspeaks auf. Das physikalische Gemisch (PM) von HMSS–N=N–CS und DOX zeigte ebenfalls deutliche kristalline Beugungspeaks. HMSS–N=N–CS/DOX hingegen zeigte keine eindeutigen kristallinen Peaks, was bewies, dass der physikalische Zustand von DOX in HMSS–N=N–CS/DOX aufgrund der Beschränkungen der mesoporösen Struktur von HMSS amorph war.

In-vitro enzym-responsive Freisetzung in simulierter kolonaler Umgebung

Um die enzym-responsive Freisetzung von HMSS–N=N–CS zu untersuchen, wurden HMSS–N=N–CS/DOX- und HMSS/DOX-Nanopartikel in pH 7,4 PBS mit unterschiedlichen Konzentrationen des kolonalen Enzymgemischs gegeben. Wie in Abb. 5a dargestellt, zeigte HMSS–N=N–CS/DOX in PBS bei pH 7,4 eine langsame DOX-Freisetzung, und die kumulative Freisetzung betrug innerhalb von 24 h nur ca. 10 %, was auf eine gute Kappungsfähigkeit der CS-Polymere und Azobindungen hindeutete. Wie erwartet verbesserte sich die kumulative DOX-Freisetzung in Gegenwart verdünnter Enzyme in PBS bei pH 7,4 auf über 20 % im gleichen Zeitraum. Zudem stieg die Freisetzungsmenge von DOX in Gegenwart konzentrierter Enzyme drastisch auf fast 40 % an. Im Vergleich zur enzym-responsiven Freisetzung aus HMSS–N=N–CS/DOX zeigte die DOX-Freisetzung aus HMSS/DOX ähnliche Trends in Gegenwart oder Abwesenheit konzentrierter Enzyme. Der relativ niedrige Freisetzungsprozentsatz war auf die elektrostatische Wechselwirkung zwischen negativ geladenen HMSS und positiv geladenem DOX zurückzuführen. Die obigen Ergebnisse bewiesen, dass die Freisetzung von DOX aus HMSS–N=N–CS/DOX durch Enzyme, die aus der Mikroflora in kolonalen Regionen extrahiert wurden, deutlich beschleunigt wurde. Der enzym-responsive Freisetzungsmechanismus könnte darin bestehen, dass die Azobindungen in HMSS–N=N–CS durch die Enzyme abgebaut werden, was zur Ablösung des CS von der HMSS-Oberfläche und zur schnellen Freisetzung aus HMSS führt. Es wurde berichtet, dass Azobindungen durch Enzyme, die von kolonaler Mikroflora sezerniert werden, gespalten werden können.

Zusätzlich wurde die enzym-responsive Freisetzung aus HMSS–N=N–CS/DOX in einer mimischen GI-Umgebung weiter evaluiert: Die HMSS–N=N–CS/DOX-Nanoplattformen wurden zunächst 2 h in simuliertem Magensaft (SGF) dispersiert, dann 6 h in simuliertem Darmsaft (SIF) und schließlich in pH 7,4 PBS mit 1 mg/ml extrahierten Enzymen gegeben. Wie in Abb. 5b gezeigt, war die DOX-Freisetzung in simuliertem Magensaft relativ schnell, und die kumulative Menge erreichte 15 % innerhalb von 2 h. Die relativ schnelle Freisetzung war auf die schwächere Wechselwirkung zwischen HMSS–N=N–CS und DOX unter sauren Bedingungen im Vergleich zu neutralen Bedingungen zurückzuführen. Anschließend verlangsamte sich die DOX-Freisetzung in SIF für 2–8 h. Nachdem HMSS–N=N–CS/DOX jedoch mit extrahierten Enzymen in pH 7,4 PBS inkubiert wurde, stieg die DOX-Freisetzung weiter markant an, und die kumulative Freisetzungsmenge erreichte innerhalb von 24 h über 50 %. Die unvollständige DOX-Freisetzung aus HMSS–N=N–CS/DOX war auf die starke Wechselwirkung zwischen positiv geladenem DOX und negativ geladenen HMSS zurückzuführen.

Proteinadsorption und Stabilität von HMSS–N=N–CS

Bei oraler Verabreichung beeinflussen die Oberflächeneigenschaften von Nanocarriern unvermeidlich die Wirkstofffreisetzung und Bioadsorption. Ein Proteinadsorptionsassay wurde verwendet, um den Effekt des grafteten CS auf der HMSS-Oberfläche zu bewerten. Wie in Abb. 6a dargestellt, zeigten bloße HMSS-Nanocarrier eine dramatische BSA-Adsorption von bis zu 16,5 %, was auf die große spezifische Oberfläche und den Hohlraum der HMSS, die starke Adsorptionsfähigkeit und unspezifische Wechselwirkungen zwischen Silanolgruppen der HMSS und BSA zurückzuführen war. Zudem wies HMSS–NH₂ eine ähnlich hohe adsorptive BSA-Menge von 10,2 % auf. Dagegen sank der Prozentsatz der adsorbierten BSA auf der Oberfläche nach Aufbringen des Polymers CS als Abdeckung deutlich auf 2,5 %, was den Einfluss auf das in-vivo-Verhalten von HMSS–N=N–CS drastisch verringerte. Um die Stabilität von HMSS–N=N–CS und HMSS weiter zu beobachten, wurden 20 mg HMSS–N=N–CS und HMSS in pH 7,4 PBS und deionisiertem Wasser gegeben. Wie in Abb. 6b gezeigt, waren zwar HMSS–N=N–CS und HMSS in Wasser relativ stabil, HMSS flockte jedoch schnell in pH 7,4 PBS aus. Im Gegensatz dazu war die Dispersität von HMSS–N=N–CS nach Grafting des hydrophilen CS-Polymers auf die HMSS-Oberflächen deutlich verbessert. Zudem konnten HMSS–N=N–CS-Träger mehr als 12 h ohne Ausfällung in pH 7,4 PBS stabil bleiben. Diese Ergebnisse belegten, dass die Beschichtung mit dem hydrophilen CS-Polymer die Dispersität verbessern und die Proteinadsorption auf der Oberfläche von HMSS–N=N–CS verringern konnte.

Zelluläre Aufnahme

Caco-2-Zellen, humane epitheliale kolorektale Adenokarzinomzellen, werden häufig als Modellzellen in der oralen Wirkstoffforschung eingesetzt. Wie in Abb. 7a gezeigt, zeigten Caco-2-Zellen, die mit freiem DOX inkubiert waren, ein relativ starkes Fluoreszenzsignal aufgrund von DOX, da positiv geladenes DOX in die Zelle und dann in den Zellkern gelangen konnte. Im Vergleich zur freien DOX-Gruppe zeigte die HMSS–N=N–CS/DOX-Gruppe eine schwächere Fluoreszenzintensität aufgrund der unvollständigen Wirkstofffreisetzung aus HMSS–N=N–CS/DOX. Nachdem HMSS–N=N–CS/DOX jedoch 1 h mit dem kolonalen Enzymgemisch vorinkubiert worden war, zeigte es ein deutlich erhöhtes Fluoreszenzsignal. Dies wurde darauf zurückgeführt, dass die Azobindungen durch das Enzymgemisch gespalten wurden, was zur Entfernung des CS von den HMSS-Oberflächen führte und die DOX-Freisetzung aus HMSS–N=N–CS/DOX signifikant beschleunigte. Zur quantitativen Bewertung der zellulären Aufnahmeunterschiede zwischen HMSS–N=N–CS/DOX und HMSS–N=N–CS/DOX, das mit extrahierten Enzymen inkubiert war, wurde FCM verwendet. Wie in Abb. 7b dargestellt, betrug die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für die HMSS–N=N–CS/DOX-Gruppe 124,7, was schwächer war als die der freien DOX-Gruppe (p < 0,001). Erfreulicherweise stieg die MFI nach Vorinkubation von HMSS–N=N–CS/DOX mit dem kolonalen Enzymgemisch für 1 h markant auf 357 an und übertraf sogar die der freien DOX-Gruppe aufgrund der beschleunigten Wirkstofffreisetzung aus HMSS–N=N–CS/DOX nach Spaltung der Azobindungen. Alle diese Ergebnisse zeigten, dass die Azobindungen in HMSS–N=N–CS/DOX in Gegenwart kolonaler Enzyme gespalten werden konnten, was zur Ablösung des CS von der HMSS-Oberfläche und zur beschleunigten DOX-Freisetzung aus HMSS führte.

In-vitro Zelllebensfähigkeitsbewertung

Um den enzym-responsiven Freisetzungseffekt von HMSS–N=N–CS/DOX in simulierten kolonalen Bedingungen zu belegen, wurde ein in-vitro Zelllebensfähigkeitsassay mit Caco-2-Zellen durchgeführt. Das klassische Antikrebsmittel DOX wurde im Zelllebensfähigkeitsassay verwendet. Vor diesem Assay wurden unterschiedliche Konzentrationen von leeren HMSS und HMSS–N=N–CS eingesetzt, um die Biokompatibilität der Nanoplattform gegenüber Caco-2-Zellen und normalen NIH-3T3-Zellen (mausembryonale Fibroblasten) bei verschiedenen Konzentrationen von 10 bis 250 µg/ml mittels MTT-Assay zu bestimmen. Wie in Abb. 8a, b dargestellt, zeigten HMSS und HMSS–N=N–CS bei unterschiedlichen Konzentrationen nach Inkubation mit Caco-2- oder NIH-3T3-Zellen vernachlässigbare Zytotoxizität, und die Lebensfähigkeit der Caco-2-Zellen betrug bei der hohen Konzentration von 100 µg/ml jeweils 87,9 % und 88,3 %, was für klinische Anwendungen aufgrund der hohen Wirkstoffbeladung der HMSS ausreichend hoch ist. Zudem wiesen NIH-3T3-Zellen, die 48 h mit HMSS und HMSS–N=N–CS inkubiert waren, eine hohe Zelllebensfähigkeit (über 80 %) bei der relativ hohen Konzentration von 100 µg/ml auf. Diese Ergebnisse zeigten, dass HMSS und HMSS–N=N–CS zytokompatibel sind und für die orale Verabreichung eingesetzt werden können.

Der Effekt des DOX-beladenen Nanocarriers HMSS–N=N–CS/DOX auf die Lebensfähigkeit von Caco-2-Zellen ist in Abb. 8c dargestellt. Freies DOX zeigte eine starke und konzentrationsabhängige Zytotoxizität gegenüber 4T1-Zellen, was darauf zurückzuführen war, dass positiv geladenes freies DOX leicht die 4T1-Zellmembranen passieren konnte. Der IC₅₀-Wert für die freie DOX-Gruppe wurde mit der SPSS Statistics-Software auf 10,18 µg/ml bestimmt. Im Vergleich zu freiem DOX wies HMSS–N=N–CS/DOX bei gleicher DOX-Konzentration eine höhere Zelllebensfähigkeit auf, bedingt durch die unvollständige Freisetzung von DOX aus HMSS–N=N–CS, induziert durch die starken elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen negativ geladenen HMSS-Trägern und positiv geladenem DOX. Der IC₅₀-Wert für die HMSS–N=N–CS/DOX-Gruppe betrug 32,22 µg/ml, was deutlich höher war als der für freies DOX. HMSS–N=N–CS/DOX, das mit konzentrierten Kolonenzymen vorinkubiert war, zeigte jedoch eine offensichtliche konzentrationsabhängige Zytotoxizität, und der IC₅₀-Wert wurde auf 9,41 µg/ml berechnet, was viel niedriger war als der von HMSS–N=N–CS/DOX. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Kolonenzyme die Azobindungen in HMSS–N=N–CS abbauen, was zur Ablösung des grafteten CS von der HMSS-Oberfläche führt und die schnelle Freisetzung von DOX aus den HMSS-Trägern bewirkt.

Toxizitätsstudien

Die Gefahren der Verwendung von HMSS–N=N–CS sind ein entscheidender Faktor, der vor zukünftigen klinischen Anwendungen berücksichtigt werden muss. H&E-Färbung der Magen-Darm-Schleimhautreizung ist essenziell, um die in-vivo-Biosicherheit des Verabreichungssystems für orale Applikation zu bewerten (Abb. 9a). Im Vergleich zur Kochsalzlösung-Gruppe wiesen sowohl die HMSS- als auch die HMSS–N=N–CS-Gruppe nach oraler Verabreichung über eine Woche mit einer Dosis von 100 mg/kg keine markanten histopathologischen Veränderungen oder Hyperämien auf. Während des Versuchs wurden keine Todesfälle oder ungewöhnliches Verhalten der Ratten beobachtet. Ein Körpergewichtsverlust wird allgemein als wichtiger und einfacher Index für die in-vivo-systemische Toxizität angesehen. Wie in Abb. 9b gezeigt, stiegen die Körpergewichte der Mäuse in den HMSS- und HMSS–N=N–CS-Gruppen leicht an und waren denen der Kochsalzlösung-Gruppe ähnlich. Die obigen Ergebnisse zeigten, dass HMSS und HMSS–N=N–CS als Wirkstoffträger für orale Verabreichung eine gute Biokompatibilität aufwiesen.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend wurde biologisch abbaubares CS über Azobindungen an die Öffnungen von HMSS gebunden, um eine enzym-responsive kolon-spezifische Wirkstofffreisetzung zu erreichen. DOX wurde im Hohlraum und den Mesoporen von HMSS in amorpher Form mit einer hohen Beladungseffizienz von 35,2 % geladen. Stabilitäts- und BSA-Adsorptionsergebnisse zeigten, dass die CS-Gates die Biokompatibilität und Stabilität der HMSS erhöhen konnten. In-vitro-Freisetzungsergebnisse bewiesen, dass HMSS–N=N–CS/DOX ein enzym-responsives Freisetzungsverhalten in Gegenwart kolonaler Enzyme aufwies. CLSM-Aufnahme- und FCM-Ergebnisse zeigten, dass die zelluläre Aufnahme von DOX nach Inkubation von HMSS–N=N–CS/DOX mit dem kolonalen Enzymgemisch offensichtlich zunahm. Zelllebensfähigkeitsergebnisse zeigten, dass HMSS–N=N–CS/DOX, das mit Kolonenzymen inkubiert war, eine erhöhte Zytotoxizität aufwies, und der IC₅₀-Wert deutlich von 32,22 µg/ml für HMSS–N=N–CS/DOX auf 9,41 µg/ml nach Inkubation sank.