Enzym-responsive hohle mesoporöse Siliciumdioxid-Nanoplattformen mit Chitosan-Kappe für die kolonspezifische Wirkstoffabgabe

Einführung

In letzter Zeit haben stimuli-responsive Drug-Delivery-Systeme (DDSs) große Aufmerksamkeit für die effiziente Beladung und selektive Freisetzung von Wirkstoffen in gezielt erkrankten Geweben auf sich gezogen [1]. Die entworfenen stimuliresponsiven Systeme können an erkrankte Stellen abgegeben werden und eine bedarfsgesteuerte Wirkstofffreisetzung realisieren, um die therapeutischen Wirkungen zu verbessern und vorzeitige durch Leckage induzierte Nebenwirkungen zu verhindern. Alle internen und externen Reize, wie Redoxpotential [2], pH [1], Enzyme [3] sowie Temperatur und Licht [4, 5], wurden verwendet, um stimuliresponsive DDSs zu entwickeln. Unter diesen Reizen haben Enzyme als interne Reize aufgrund ihrer unterschiedlichen Konzentrationen in verschiedenen Geweben große Aufmerksamkeit erlangt [6].

In den letzten zwei Jahrzehnten haben sich mesoporöse Silica-Kugeln (MSSs) mit Mesoporen im Bereich von 2–50 nm als stimuliresponsive Wirkstoffträger etabliert [7, 8], da MSSs ein bemerkenswert großes Porenvolumen und eine große Oberfläche für hoch Wirkstoffbeladungskapazität, gut organisierte Porenstruktur, eine leicht funktionalisierbare Oberfläche und gute Biokompatibilität [9]. Darüber hinaus sind hohle mesoporöse Silicasphären (HMSS)-Nanopartikel mit einer mesoporösen Schalenstruktur und einer hohlen Kavität herkömmlichen MSSs überlegen, da die Hohlstruktur mehr Wirkstoffe mit einer höheren Speicherkapazität effizient aufnehmen kann als MSSs-Träger [10, 11]. Alle Arten von stimuliresponsiven Nanocarriern auf der Basis von MSSs wurden entwickelt, um Wirkstoffmoleküle unter Verwendung verschiedener Gatekeeper zu beherbergen, wie Polymere [12], anorganische Nanopartikel [13], Dendrimere, Biomakromoleküle [14], makrozyklische Peptide [15] und Lipide [ 16]. Obwohl zahlreiche auf MSSs basierende DDS mit funktionellem Capping eine Freisetzung als Reaktion auf verschiedene externe oder interne Stimuli realisieren können, wurden nur wenige von ihnen zur gezielten Wirkstoffabgabe im Dickdarm verwendet.

Es ist allgemein bekannt, dass die orale Verabreichung von Arzneimitteln die beliebteste und einfachste Art der Verabreichung von Arzneimitteln ist. Die kolonspezifische zielgerichtete Arzneimittelabgabe ist für die Behandlung von Dickdarmerkrankungen wie Morbus Crohn, Dickdarmkrebs und Colitis ulcerosa sehr faszinierend. Die kolonspezifische Arzneimittelabgabe kann jedoch auf mehrere Probleme stoßen, einschließlich eines geringeren Wassergehalts und einer relativ geringeren Oberfläche für die orale Adsorption als an anderen Stellen im Gastrointestinaltrakt (GI) [17,18,19]. Darüber hinaus treffen orale DDSs auch auf eine stark saure Umgebung im Magen, die den Abbau beladener Medikamente im GI-Trakt beschleunigen könnte, wodurch die Fähigkeit zur gezielten Verabreichung im Dickdarm beseitigt wird [19]. Aus diesem Grund wurden mehrere pH-abhängige DDS entwickelt, um eine pH-getriggerte Wirkstofffreisetzung bei nahezu neutralen pH-Werten (6–7) des GI-Trakts zu realisieren und den stark sauren Bedingungen in der Magenregion standzuhalten [20,21,22 ,23]. Zwischen den Darm- (pH 6,8) und Dickdarmregionen (pH 7,4) besteht nur ein geringer Unterschied im Säuregehalt; daher haben solche pH-responsiven DDSs Schwierigkeiten, eine Dickdarm-spezifische Freisetzung zu realisieren.

Chitosan (CS), ein kationisches und biologisch abbaubares natürlich vorkommendes Polysaccharid, besteht aus β-(1-4)-verknüpften Glucosamin- und N-Acetyl-D-Glucosamin-Einheiten [24]. CS hat aufgrund seiner faszinierenden Eigenschaften, einschließlich biologischer Abbaubarkeit, Biokompatibilität, Mukoadhäsivität und antibakterieller Aktivität, große Aufmerksamkeit in der biologischen Medizin erhalten [25,26,27,28,29]. Verglichen mit Polymeren, Polyelektrolyten und Supramolekülen, die durch komplizierte Verfahren synthetisiert werden, ist CS relativ billig und durch die umfassende Deacetylierung von Chitin leicht verfügbar [30,31,32]. Darüber hinaus wurde berichtet, dass CS Tight Junctions zwischen Zellen öffnen und so die Wirkstoffresorption erhöhen kann [33]. Daher wurde das Polymer CS aufgrund seiner guten Biokompatibilität und geeigneten Größe als Verkappungsmittel ausgewählt, um die Mesoporen von HMSS abzudecken und die Wirkstofffreisetzung zu blockieren.

In unserer Arbeit wurde erstmals ein Dickdarm-spezifisches enzymresponsives DDS basierend auf einem HMSS-Material (HMSS-N=N-CS) entwickelt, wie in Schema 1 gezeigt. In diesem System wurden die HMSS-Träger über eine selektive Ätzstrategie. Das Polymer CS wurde durch Azobindungen an die Oberfläche von HMSS gebunden, um als Gatekeeper zu wirken, um die Öffnungen von HMSS zu blockieren. Die Azobindungen zwischen HMSS und CS können durch Enzyme in Kolonstellen gespalten werden [34, 35], was zur Trennung von CS von den Öffnungen von HMSS führt. DOX wurde als Modellarzneimittel verwendet, das in die Kavität von HMSS eingebettet werden sollte, und in vitro-Arzneimittelfreisetzungsexperimente wurden durchgeführt, um die enzymatische Freisetzung in Gegenwart von Dickdarmenzymen zu bewerten. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) und Durchflusszytometrie (FCM) wurden verwendet, um die zelluläre Aufnahme durch Caco-2-Zellen zu untersuchen. Schließlich wurde die Zytotoxizität von HMSS–N=N–CS/DOX gegenüber Caco-2-Zellen gemessen.

Schematische Darstellung von a Vorbereitungsprozess von HMSS–N=N–CS und b die Wirkstoffbeladung und enzymatische Freisetzung von HMSS–N=N–CS/DOX als Reaktion auf das Dickdarmenzym

Materialien und Methoden

Materialien

Tetraethoxysilan (TEOS); N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC); Chitosan (DAC 95%); Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB); 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES); 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT); Azobenzol-3,3'-dicarbonsäure; Kaliumbromid (spektrale Reinheit, ≥ 99,5%); N-Hydroxysuccinimid (NHS) und DOX wurden von Aladdin Chemical Inc. (Shanghai, China) bezogen. Azobenzol-3,3'-dicarbonsäure wurde von Inno-chem Technology Co. Ltd. (Beijing, China) geliefert. Zellkulturmedien DMEM, Penicillin-Streptomycin und fötales Rinderserum (FBS) wurden von GIBCO, Invitrogen Co. (Carlsbad, USA) geliefert. Alle analytischen Reagenzien wurden vor der Verwendung nicht weiter gereinigt.

Vorbereitung von HMSS–N=N–CS

Vorbereitung von HMSS–NH₂

Die HMSS-Nanopartikel wurden basierend auf der veröffentlichten Arbeit mit einem selektiven Ätzverfahren hergestellt [36]. Die festen Silica-Kugeln wurden zunächst nach einem modifizierten Stober-Verfahren synthetisiert. Kurz gesagt wurden 6 ml TEOS in die Mischung aus 10 ml entionisiertem Wasser, 74 ml Ethanol und 3 ml konzentriertem NH₃ . gegossen ·H₂ O. Anschließend wurde die Mischung 60 min gerührt, um kolloidale Siliciumdioxidsuspensionen bei Umgebungstemperatur zu erhalten. Die festen Kugeln wurden zentrifugiert, gewaschen und zur weiteren Verwendung getrocknet. Dann wurde die mesoporöse Silicahülle mit festen Silicakugeln bedeckt. 300 mg festes Siliciumdioxid wurden in 50 ml entionisiertem Wasser durch Ultraschall für 45 min dispergiert. Und die Kieselsäuresuspensionen wurden in eine Mischung aus 60 ml Ethanol, 450 mg CTAB, 90 ml Wasser und 1,7 ml NH₃ . gegossen ·H₂ O. Nachdem die Mischung 60 min gerührt worden war, wurde TEOS (0,75 ml) zugegeben. Anschließend wurden die Nanopartikel nach 6-stündigem Rühren zentrifugiert, um Proben zu sammeln, und dann in 40 ml Wasser redispergiert. Ungefähr 1,2 g Na₂ CO₃ wurde unter kräftigem Rühren in die Wassersuspension gegeben. Nachdem die Mischung 12 h bei 55 °C gehalten wurde, wurden die Produkte der HMSS-Nanopartikel gesammelt und mit wasserfreiem Ethanol gewaschen. Die Nachpfropfungsmethode mit einem Verhältnis von HMSS und APTES von 4:1 (m/v) zur Herstellung von HMSS-NH₂ bei 80 °C unter N₂ Bedingung für 8 h, bis CTAB durch Rückfluss entfernt wurde [3].

Vorbereitung von HMSS–N=N–COOH

Die Azobenzol-3,3'-dicarbonsäure (50 mg) wurde in pH 5,8 PBS zugegeben. Dann wurden (5 µg/ml), EDC und (3 µg/ml) NHS zugegeben, um Azobenzol-3,3′-dicarbonsäure bei 30 °C für 1 Stunde zu aktivieren. Und 10 ml PBS mit 15 mg/ml HMSS–NH₂ zugegeben und die Mischung wurde 24 h gerührt. Und das resultierende HMSS–N=N–COOH wurde durch Zentrifugation abgetrennt und mit Ethanol gewaschen.

Vorbereitung von HMSS–N=N–CS

0,15 g CS und 0,5 ml Essigsäure wurden in 50 ml Wasser zugegeben, um eine CS-Lösung herzustellen. Und 100 mg HMSS-N=N-COOH wurden in 25 ml pH 5,0 PBS dispergiert und durch EDC und NHS für 0,5 h aktiviert. Dann wurde CS-Lösung (10 ml) unter kontinuierlichem Rühren für 1 Tag in die Suspension gegossen. Schließlich wurde das synthetisierte HMSS-N=N-CS zentrifugiert und gewaschen, um die Proben zu sammeln.

Extraktion der Dickdarmenzymmischung aus der Mikroflora

Die Mikroflora des Dickdarms wurde gemäß einer veröffentlichten Arbeit gesammelt [37]. Dann wurde die Kultur angeimpft, um eine Enzymmischung zu erhalten, die von der Kolonmikroflora bei 37 °C sezerniert wurde. Das simulierte Dickdarmmedium, das eine Enzymmischung enthielt, wurde durch einen 0,22-μm-Filter filtriert, um alle Zelltrümmer aus der Kulturflüssigkeit zu entfernen. Anschließend wurde das Filtrat lyophilisiert, um die Enzymmischung in Pulverform zu erhalten, die in der weiteren Untersuchung verwendet wurde.

Drug Loading-Prozess und enzymatische Freisetzung

25 mg DOX wurden in 5 &mgr;l pH 3,5 HCl-Lösung gelöst. 100 mg HMSS-N=N-CS wurden in die DOX-Lösung gegeben und 12 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde mit 0,2 µM NaOH-Lösung der pH-Wert der Mischung auf 7,0 eingestellt und die Suspension weitere 12 Stunden gerührt. Dann wurde das DOX-beladene HMSS-N=N-CS (als HMSS-N=N-CS/DOX bezeichnet) zentrifugiert und gewaschen, um das adsorbierte DOX auf der Oberfläche von HMSS-N=N-CS zu entfernen. Der Überstand wurde bei jedem Schritt gesammelt, um die DOX-Beladungseffizienz (LE) bei 480 nm durch UV-Vis-Spektrophotometrie zu messen. Die Gesamtmasse des in HMSS–N=N–CS beladenen DOX wurde durch Subtrahieren des unbeladenen DOX nach den Prozessen der Wirkstoffbeladung von der anfänglich zugegebenen DOX-Masse berechnet. Das HMSS/DOX wurde als Kontrolle unter Verwendung von HMSS als anfänglichem Träger hergestellt. Der LE von DOX wurde nach folgender Gleichung berechnet:

In denen m _A war die zusätzliche Masse von DOX, m _B war die Masse von DOX im Überstand und m _C war die Gesamtmasse von HMSS–N=N–CS.

Die in vitro enzymatische Freisetzung von DOX aus HMSS–N=N–CS/DOX wurde wie folgt bewertet. Zwei Milligramm HMSS-N=N-CS/DOX- und HMSS/DOX-Nanopartikel wurden in PBS mit einem pH-Wert von 7,4 unter Schütteln bei 125 U/min mit unterschiedlichen Konzentrationen der Dickdarmenzymmischung (0 mg/ml, 0,3 mg/ml und 1 mg/ml) dispergiert. . In bestimmten Zeitintervallen wurde 1 µl Freisetzungsmedium entnommen, um die Extinktion zu messen. Die Freisetzung von DOX wurde bei 480 nm gemessen. Als Kontrolle wurde HMSS/DOX verwendet.

BSA-Adsorption

Die BSA-Adsorptionsmenge wurde anhand der veröffentlichten Arbeiten bewertet [38, 39]. BSA wurde in pH 7,4 PBS (0,5 mg/ml) zugegeben. Fünf Milligramm HMSS und HMSS–NH₂ und HMSS–N=N–CS wurden in 2.5 mL PBS (pH 7.4) gegeben. Und die BSA-Lösung mit gleichem Volumen wurde zugeführt, und die Suspension wurde bei 100 U/min in einen Schüttler gegeben. Nach 6 h wurde Zentrifugation verwendet, um die obere Lösung zu sammeln. Schließlich wurde die BSA-Konzentration bei 595 nm gemessen, nachdem sie mit einer Coomassie-Brillantblaulösung gefärbt worden war.

Charakterisierung

Die mesoporöse Netzwerkstruktur und Morphologie der HMSS-Nanopartikel wurden durch TEM-Bilder (EM–208S, CSIS, USA) bewertet. Die Oberfläche und die Porengrößenverteilung der Nanopartikel wurden unter Verwendung eines Stickstoffadsorptionsanalyse-Analysators (V-Sorb 2800P, Gold APP Instrument Corporation, China) charakterisiert. Die ξ-Potentiale und Partikelgrößen wurden auf einem Nano-z90 Nanosizer (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) charakterisiert. Die TGA-Analyse wurde an einem TGA-50-Gerät (Shimadzu, Kyoto, Japan) mit einer Heizrate von 10 °C/min unter einem Stickstoffstrom gemessen. Fourier-Transformations-Infrarotspektrophotometrie (FT-IR)-Spektren wurden unter Verwendung eines FT-IR-Spektrometers (Bruker Tensor27, Schweiz) gemessen. Der Bereich wurde von 400 bis 4000 cm ⁻¹ . durchgeführt mit KBr-Pellet-Technik. Power XRD wurde auf einem Siemens D5005 Röntgendiffraktometer (Karlsruhe, Deutschland) mit Cu-Kα-Strahlung (λ =1,5418 Å).

Zellkultur- und Zellaufnahmeexperiment

Caco-2-Zellen wurden in einem Medium kultiviert, das mit 10 % FBS, 1 % nicht-essentielle Aminosäure, 1 % (Vol./Vol.) Brenztraubensäure-Natrium und 1 % Streptomycin ergänzt war. NIH-3T3-Zellen wurden in DMEM mit 1 % Streptomycin und 10 % FBS kultiviert. Die Caco-2-Zellen-Aufnahme der Nanocarrier wurde unter Verwendung von FCM und CLSM charakterisiert. Caco-2-Zellen wurden in 24-Well-Platten ausgesät. Nach Kultivierung über Nacht wurden freies DOX, HMSS–N=N–CS/DOX und HMSS–N=N–CS/DOX, vorinkubiert mit Colon-Enzym-Nanopartikeln (entsprechend der Konzentration von 5 µg/ml DOX) in die entsprechenden Vertiefungen gegeben . Nach fortgesetzter Inkubation für 2 h wurde das Zellmedium entfernt und gründlich mit PBS gewaschen. Dann wurden die Zellen mit 4% Formaldehyd fixiert und mit Hoechst 33258 zur CLSM-Beobachtung gefärbt. FCM wurde verwendet, um eine quantitative Bewertung der zellulären Aufnahme zu erhalten. Caco-2-Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesät und weitere 24 h inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Caco-2-Zellen mit freiem DOX, HMSS–N=N–CS/DOX inkubiert und HMSS–N=N–CS/DOX vorinkubiert mit Kolonenzym-Nanopartikeln (entsprechend einer Konzentration von 5 µg/ mL DOX) in serumfreiem DMEM für 2 h. Dann wurden die Caco-2-Zellen mit kaltem PBS gespült, trypsiniert und in 0,5 ml PBS resuspendiert. Die DOX-Fluoreszenz in Zellen wurde mit einem FACS Canto Durchflusszytometer (Becton, Dickinson, USA) gemessen.

In-vitro-Zellproliferationsassay

Die Zytotoxizität von HMSS- und HMSS-N=N-CS-Blank-Trägern gegenüber NIH-3T3- und Caco-2-Zellen wurde durch den MTT-Assay nachgewiesen [40, 41]. Kurz gesagt wurden Caco-2-Zellen und NIH-3T3-Zellen getrennt in 96-Well-Platten ausgesät und über Nacht weiter inkubiert. Das alte Zellmedium wurde durch ein serumfreies Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen an Nanopartikeln ersetzt. Nach 2 tägiger Inkubation 50 μl MTT-Lösung (2 mg ml ^–1 ) wurde zugegeben und 4 h lang inkubiert, um die lebenden Zellen zu messen. Dann wurde die MTT-Lösung entfernt und 150 &mgr;l DMSO wurden zugegeben, um Formazan aufzulösen. Anschließend wurde die Extinktion auf einem Mikroplatten-Lesegerät (Tecan, Männedorf, Schweiz) bei 570 nm gemessen. Die Zytotoxizität von freiem DOX, HMSS–N=N–CS/DOX und HMSS–N=N–CS/DOX, vorinkubiert mit Enzymgemischen, die aus der Mikroflora des Dickdarms extrahiert wurden, wurde unter Verwendung von Caco-2-Zellen mit den entsprechenden DOX-Konzentrationen von (0.1, 1, 5, 10 und 20 µg/ml). Die Inkubationszeit betrug 48 Stunden, und die anderen Versuchsabläufe waren die gleichen wie oben beschrieben.

Toxizitätsstudien

Die Tests zur Reizung der Magen-Darm-Schleimhaut sind für die Bewertung der in vivo-Biosicherheit der oralen Arzneimittelverabreichung von entscheidender Bedeutung. Männliche Sprague-Dawley-Ratten (180 ± 10 g) wurden nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen (drei Ratten für jede Gruppe) eingeteilt. Ratten wurden Kochsalzlösung, HMSS und HMSS-N=N-CS-Nanopartikel mit einer Dosis von 100 mg/kg pro Tag verabreicht. Nach 7 Tagen wurden alle Ratten getötet und die Gewebe wurden gesammelt und durch histopathologische Untersuchung (H&E) untersucht. Um die Biosicherheit von HMSS- und HMSS-N=N-CS-Nanopartikeln zu bewerten, wurde das Körpergewicht von BALB/c-Mäusen (18–20 µg) nach oraler Verabreichung einer Dosis von 100 µmg/kg an jedem zweiten Tag aufgezeichnet. Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren der Qiqihar Medical University durchgeführt und wurden von der Ethikkommission der Qiqihar Medical University genehmigt.

Statistik

Statistische Daten wurden mit einer SPSS-Software unter Verwendung von zweischwänzigen Student's t . analysiert -Prüfung. Die in dieser Studie vorgestellten Fehlerbalken sind SD. Ein p <0,05 gilt als statistisch signifikant.

Ergebnisse und Diskussion

Vorbereitung und Charakterisierung von HMSS–N=N–CS

HMSS wurden basierend auf früheren Arbeiten mit geringfügigen Änderungen erstellt [36]. Zuerst festes SiO₂ Nanokugeln wurden hergestellt, und eine mesoporöse Hülle wurde auf die Oberfläche der festen Siliciumdioxid-Nanokugeln aufgetragen, die das CTAB-Templat enthielten. Dann Na₂ CO₃ wurde verwendet, um das feste SiO₂ . selektiv zu ätzen Nanokügelchen, während die mesoporöse Hülle durch CTAB-Templat geschützt war. Die Herstellung von HMSS–N=N–CS mit CS als „Gatekeeper“ durch eine Azo-Verknüpfung ist in Abb. 1a beschrieben. Zunächst wurden die Oberflächen von HMSS-Nanopartikeln mit APTES als Alkylkupplungsreagenz modifiziert, um aminofunktionalisiertes HMSS (HMSS-NH₂ ) durch ein Nachmodifizierungsverfahren. Anschließend wurde HMSS–N=N–COOH durch eine Amidierungsreaktion zwischen den Aminogruppen von HMSS–NH₂ . hergestellt und die Carboxylgruppen von Azobenzol-3,3'-dicarbonsäure. Anschließend wurde CS durch eine Amidierungsreaktion zwischen den Carboxylgruppen von HMSS–N=N–COOH und den Aminogruppen in CS kovalent auf der Oberfläche von HMSS-Nanopartikeln modifiziert.

TEM von a HMSS und b HMSS–N=N–CS

Wie in der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Abbildung in 1a gezeigt, betrug der durchschnittliche Durchmesser von HMSS 280 nm, und die HMSSs hatten eine einheitliche hohle Struktur und eine hochgeordnete mesoporöse Schale. Die durchschnittliche Dicke der mesoporösen Hülle betrug ungefähr 90 nm. Im Vergleich zur glatten Oberfläche von HMSS war die Oberfläche des gepfropften Polymers HMSS-N=N-CS (Abb. 1b) rau, was darauf hindeutet, dass das CS den HMSS-Träger bedeckte.

Die Oberflächen und Porenverteilungen mesoporöser Materialien spielten eine entscheidende Rolle bei der Beladung und Abgabe von Wirtsmolekülen zur kontrollierten Freisetzung. Porengrößenverteilungskurven und Isothermen wurden mit N₂ . gemessen Adsorptions- und Desorptionsanalyse (Abb. 2). Detaillierte Parameter (die Brunauer-Emmett-Teller (BET)-Oberfläche (S .) _WETTEN ), Gesamtporenvolumen (V _P ) und Porengrößenverteilung (D _P )) sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die S _WETTEN und V _P von reinem HMSS waren 810,7 m ² /g und 0,969 cm ³ /g bzw. das D _P betrug ungefähr 3,8 nm. Das D _P von HMSS–NH₂ war nach der Aminierung fast gleich der von HMSS, was darauf hindeutet, dass die Mesoporen nach der Aminofunktionalisierung nicht blockiert wurden. Das S _WETTEN und V _P von HMSS–N=N–CS wurden nach der Modifikation durch die Azoverbindung und die CS-Beschichtung deutlich verringert, was darauf hindeutet, dass CS die Oberfläche des HMSS beschichtet hatte [1].

a Die Stickstoffadsorptions-/Desorptionsisothermen und b Porengrößenverteilungen von HMSS, HMSS-NH₂ , und HMSS–N=N–CS

Die erfolgreiche Pfropfung von HMSS–N=N–CS wurde mit verschiedenen Methoden verifiziert. Das ξ-Potenzial von HMSS–NH₂ erfuhr nach der Funktionalisierung eine große Veränderung von − 27.9 bis + 31.4 mV, wie in Abb. 3a gezeigt, was auf die Addition der Amingruppen an die HMSS-Oberfläche zurückgeführt wurde. Nach HMSS–NH₂ reagierte mit Azobenzol-3,3′-dicarbonsäure zu HMSS–N=N–COOH, das ξ-Potential nahm aufgrund der Carboxylgruppen an der Oberfläche des HMSS weiter auf −2.0 mV ab. Nachdem das CS-Polymer weiter auf die Oberfläche des HMSS gepfropft wurde, um HMSS-N=N-CS zu bilden, kehrte das ξ-Potential auf +32.4 mV zurück. Das Ergebnis wurde der Amino-reichen positiv geladenen CS-Beschichtung auf der Oberfläche des HMSS zugeschrieben [1]. Thermogravimetrische Analyse (TGA)-Kurven von HMSS, HMSS-NH₂ , HMSS–N=N–COOH und HMSS–N=N–CS-Spezies sind in Abb. 3b gezeigt. Im Vergleich zu HMSS–N=N–COOH verlor HMSS–N=N–CS einen zusätzlichen Gewichtsverlust von ca. 19%, was auf die Entfernung von CS-Ketten zurückzuführen war. Das Pfropfen von Azo-Bindungen auf der Oberfläche von HMSS wurde auch durch einen Farbumschlag während der Herstellung von HMSS-N=N-COOH bestätigt, wie im Einschub in Abb. 3b gezeigt. Der Reaktant HMSS–NH₂ ist weiß, während das Produkt HMSS-N=N-COOH gelblich-braun war, nachdem die Azobenzol-3,3′-dicarbonsäure mit den Aminogruppen von HMSS reagiert. Der hydrodynamische Durchmesser (D _H ) und Polydispersitätsindex (PDI) von HMSS, HMSS–NH₂ , und HMSS–N=N–CS wurden in destilliertem Wasser bestimmt, wie in Abb. 3c gezeigt. Das HMSS hatte einen Durchmesser von 309 nm und einen PDI von 0,190. Nach der Addition von Amingruppen an die Oberflächen von HMSS zu HMSS–NH₂ , das D _H auf 324 nm erhöht. Der Durchmesser von HMSS-N=N-CS betrug 342 nm, was größer war als der von HMSS-NH₂ aufgrund der gepfropften CS-Ketten. Der PDI von HMSS–N=N–CS (0,177) war kleiner als der von HMSS–NH₂ , was darauf hinweist, dass die durchschnittlichen Partikelgrößen nach dem Pfropfen von CS noch größer geworden waren. Im Vergleich zu den mit TEM erhaltenen Durchmessern waren die mit DLS gemessenen Durchmesser von HMSS und HMSS-N=N-CS größer. Das D _H der Nanopartikel wurde in einer Wasserumgebung mit einer Hydratationsschicht gemessen, während die Größe der durch TEM bereitgestellten Nanopartikel aus trockenen Nanopartikeln ermittelt wurde [3]. FT-IR-Spektren von HMSS–NH₂ , HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS und CS sind in Abb. 4d dargestellt. Verglichen mit den Peaks für HMSN–NH₂ , ein Anstieg der Adsorptionspeaks bei 2853 und 2925 cm ⁻¹ wurde der Schwingung von − CH₂ . zugeschrieben beim Pfropfen von carboxyterminalen Azobindungen. Nachdem CS der Oberfläche von HMSS–N=N–COOH hinzugefügt wurde, gab es einen Anstieg der Adsorptionspeaks bei 1660 cm ⁻¹ und 3435 cm ⁻¹ , die υ_(C=O) . zugeschrieben wurden in der Amidbande und die Schwingung von N–H in der CS. Alle Ergebnisse belegen die erfolgreiche Herstellung von HMSS–N=N–CS.

a Die entsprechenden ξ-Potentiale von HMSS, HMSS–NH₂ , HMSS–N=N–COOH und HMSS–N=N–CS; b Die TGA-Kurven von HMSS–NH₂ , HMSS–N=N–COOH und HMSS–N=N–CS (Einschub:das Foto von (a ) HMSS–N=N–COOH und (b ) HMSS–NH₂ ); c Größenverteilung von HMSS, HMSS–NH₂ , und HMSS–N=N–CS-Einschub:die entsprechenden PDI-Werte von Nanopartikeln; und d FT-IR-Spektren von HMSS–NH₂ , HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS und CS

XRD-Muster von DOX, HMSS–N=N–CS, HMSS–N=N–CS/DOX und PM

Drogenstatus und Ladeeffizienz

DOX wurde ausgewählt, um das Lade- und Freisetzungsverhalten von HMSS–N=N–CS zu untersuchen. Wenn der pH-Wert der HMSS-N=N-CS-Nanopartikelsuspension auf pH 3,5 eingestellt wurde, wurde das CS-Biopolymer positiv geladen (der pK_a von CS betrug 6,3) aufgrund der protonierten Aminogruppen in der sauren Umgebung [24]. Das CS-Polymer wurde positiv geladen und quoll auf, was zur Öffnung der Mesoporen von HMSS führte, was auf die abstoßende Wechselwirkung zwischen den CS-Ladungen zurückgeführt wurde. Somit erhielt DOX durch Diffusion Zugang zu den Mesoporen von HMSS–N=N–CS. Nachdem die arzneimittelbeladene Mischung jedoch auf 7,4 eingestellt wurde, deprotonierten die CS-Ketten und kollabierten, um die vorzeitige Freisetzung von DOX zu verhindern.

Der LE von HMSS-N=N-CS/DOX betrug 35,2 % und war damit viel größer als der anderer DOX-beladener mesoporöser Silica-Liefersysteme [3, 16]. Der hohe LE von DOX in HMSS-Nanocarriern wurde dem Hohlraum, der großen Oberfläche und dem mesoporösen Netzwerk zugeschrieben, das als Wirkstoffreservoir verwendet werden könnte. Der physikalische Zustand von DOX in HMSS–N=N–CS/DOX wurde durch Leistungsröntgenbeugung (XRD) bestimmt. Wie in den XRD-Profilen (Fig. 4) gezeigt, zeigte das Roh-DOX charakteristische und intensive kristalline Beugungspeaks des Arzneimittels. Die physikalische Mischung (PM) von HMSS–N=N–CS und DOX zeigte ebenfalls deutliche kristalline Beugungspeaks. HMSS–N=N–CS/DOX zeigte jedoch keine ausgeprägten kristallinen Peaks, was bewies, dass der physikalische Zustand von DOX in HMSS–N=N–CS/DOX aufgrund der Beschränkungen der mesoporösen Struktur von HMSS nichtkristallin war.

In vitro enzymatische Freisetzung in simulierter Kolonumgebung

Um die enzymatische Freisetzung von HMSS–N=N–CS zu untersuchen, wurden HMSS–N=N–CS/DOX- und HMSS/DOX-Nanopartikel zu pH 7.4 PBS mit unterschiedlichen Konzentrationen der Kolonenzymmischung zugegeben. Wie in Abb. 5a dargestellt, zeigte HMSS-N=N-CS/DOX die langsame Freisetzung von DOX in PBS bei pH 7,4, und der kumulative Freisetzungsprozentsatz betrug nur etwa 10 % innerhalb von 24 h, was auf eine gute Capping-Fähigkeit des CS . hinweist Polymere und Azobindungen. Wie erwartet, verbesserte sich bei verdünntem Enzym in PBS bei pH 7,4 die kumulative Freisetzung von DOX im gleichen Zeitraum auf über 20 %. Außerdem wurde die Freisetzungsmenge von DOX in Gegenwart von konzentriertem Enzym dramatisch auf fast 40 % erhöht. Verglichen mit der enzymresponsiven Freisetzung aus HMSS-N=N-CS/DOX zeigte die Freisetzung von DOX aus HMSS/DOX in Gegenwart oder Abwesenheit von konzentriertem Enzym ähnliche Trends. Der relativ niedrige Prozentsatz der Wirkstofffreisetzung war auf die elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem negativ geladenen HMSS und dem positiv geladenen DOX zurückzuführen [42]. Die obigen Ergebnisse bewiesen, dass die Freisetzung von DOX aus HMSS–N=N–CS/DOX durch Enzyme, die aus der Mikroflora in Dickdarmregionen extrahiert wurden, deutlich beschleunigt wurde. Der enzymresponsive Freisetzungsmechanismus könnte darin bestehen, dass die Azobindungen in HMSS-N=N-CS durch das Enzym abgebaut werden, was die Ablösung von CS von der Oberfläche von HMSS und die schnelle Freisetzung von HMSS verursacht. Es wurde berichtet, dass Azo-Bindungen durch Enzyme gespalten werden, die von der Mikroflora des Dickdarms sezerniert werden [34, 35].

a Kumulative Freisetzungsprofile von HMSS/DOX und HMSS–N=N–CS/DOX in pH 7,4 PBS in Gegenwart einer konzentrierten und verdünnten Kolonenzymmischung; und b in vitro pH-responsives Freisetzungsverhalten von DOX aus HMSS–N=N–CS in Freisetzungsmedien mit unterschiedlichen pH-Werten

Um die enzymatische Freisetzung von HMSS-N=N-CS/DOX in der mimetischen GIT-Umgebung weiter zu bewerten, wurden die HMSS-N=N-CS/DOX-Nanoplattformen zusätzlich zunächst 2 h in SGF dispergiert und dann weiter in . dispergiert SIF für 6 h, und schließlich wurden die Träger zu pH 7,4 PBS, enthaltend 1 mg/ml extrahiertes Enzym, zugegeben. Wie in Fig. 5b gezeigt, war die Freisetzung von DOX in simuliertem Magensaft relativ schnell, und die kumulative Menge erreichte innerhalb von 2 h 15 %. Die relativ schnelle Freisetzung war auf die schwächere Wechselwirkung zwischen HMSS–N=N–CS und DOX unter sauren Bedingungen zurückzuführen als unter neutralen Bedingungen [1]. Dann wurde die Freisetzung von DOX in SIF für 2–8 h verlangsamt. Nachdem HMSS–N=N–CS/DOX jedoch mit extrahierten Enzymen in PBS mit pH 7.4 inkubiert wurde, nahm die Freisetzung von DOX weiter deutlich zu und die kumulative Freisetzungsmenge erreichte innerhalb von 24 h mehr als 50%. Die unvollständige DOX-Freisetzung aus HMSS–N=N–CS/DOX war auf die starke Wechselwirkung zwischen dem positiv geladenen DOX und dem negativ geladenen HMSS zurückzuführen.

Die Proteinadsorption durch und die Stabilität von HMSS–N=N–CS

Bei oraler Verabreichung beeinflussen die Oberflächeneigenschaften von Nanoträgern unvermeidlich das Freisetzungsverhalten und die Bioadsorption [43]. Ein Assay der Proteinadsorption an der Oberfläche wurde verwendet, um die Wirkung von gepfropftem CS auf die Oberfläche von HMSS zu bewerten. Wie in Abb. 6a gezeigt, hatten nackte HMSS-Nanocarrier eine dramatische BSA-Adsorption von bis zu 16,5%, was auf die große Oberfläche und den Hohlraum von HMSS, die starke Adsorptionsfähigkeit und unspezifische Wechselwirkungen zwischen Silanolgruppen von HMSS und BSA zurückgeführt wurde [ 38, 39]. Außerdem HMSS–NH₂ hatte in ähnlicher Weise eine relativ hohe adsorbierte BSA-Menge von 10,2 %. Dennoch nahm der Anteil an adsorbiertem BSA an der Oberfläche deutlich auf 2.5 % ab, nachdem das Polymer CS als Abdeckung hinzugefügt wurde, wodurch die Wirkung auf das in-vivo-Verhalten von HMSS-N=N-CS drastisch verringert wurde. Um die Stabilität der HMSS-N=N-CS- und HMSS-Proben weiter zu beobachten, wurden 20 mg HMSS-N=N-CS und HMSS zu pH 7.4 PBS und entionisiertem Wasser gegeben. As displayed in Fig. 6b, although HMSS–N=N–CS and HMSS were relatively stable in water, HMSS quickly flocculated in pH 7.4 PBS. By contrast, the dispersity of HMSS–N=N–CS was obviously enhanced after the polymer CS was grafted onto the surfaces of HMSS. Additionally, HMSS–N=N–CS carriers can remain stable for more than 12 h without precipitation in pH 7.4 PBS. These results proved that covering with the hydrophilic CS polymer could improve the dispersity and decrease protein adsorption on the surface of HMSS–N=N–CS.

a BSA adsorbance amounts of HMSS and HMSS–NH₂ and HMSS–N=N–CS (n =3, *p <0,05). b Photograph images of HMSS–N=N–CS and HMSS dispersed in water and PBS with a concentration of 4 mg/mL

Cellular Uptake

Caco–2 cells, as human epithelial colorectal adenocarcinoma cells, are widely used as model cells in oral drug delivery. As shown in Fig. 7a, Caco–2 cells incubated with free DOX showed a relatively strong fluorescence signal resulting from DOX because positively charged DOX could enter the cell and then the nucleus. Compared with the free DOX group, the HMSS–N=N–CS/DOX group showed a weaker fluorescence signal intensity due to incomplete drug release from HMSS–N=N–CS/DOX. However, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, it showed a markedly increased fluorescence signal. This was attributed to the azo bonds being cleaved by the enzyme mixture, which led to the removal of the CS from the surfaces of HMSS, thus significantly accelerating the DOX release from HMSS–N=N–CS/DOX. To quantitatively evaluate the cellular uptake differences for HMSS–N=N–CS/DOX and HMSS–N=N–CS/DOX incubated with extracted enzymes, FCM was used. As shown in Fig. 7b, the mean fluorescence intensity (MFI) for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 124.7, which was weaker than that of the free DOX group, with a p value less than 0.001. Excitingly, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, the MFI markedly increased to 357 and even exceeded that of the free DOX group owing to the accelerated drug release from HMSS–N=N–CS/DOX after the breakage of azo bonds. All these results indicated that the azo bonds in HMSS–N=N–CS/DOX could be cleaved in the presence of colonic enzymes, which led to the shedding of CS from the surface of HMSS and accelerated the DOX release from HMSS.

a CLSM of Caco-2 cells incubated with different samples. b The MFI of DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, and HMSS–N=N–CS/DOX treated by enzyme measured by FCM in Caco-2 cells (n =3, ***p <0.001)

In Vitro Cell Viability Evaluation

To prove the enzyme-responsive release effect of HMSS–N=N–CS/DOX in simulated colonic conditions, an in vitro cell viability assay was carried out using Caco-2 cells. The classic anticancer drug DOX was used in the cell viability assay. Prior to this assay, different concentrations of blank HMSS and HMSS–N=N–CS were employed to ascertain the biocompatibility of the nanoplatform towards Caco-2 cells and normal NIH-3T3 (mouse embryo fibroblast) cells at various concentrations from 10 to 250 μg/mL by MTT assay [44, 45]. As displayed in Fig. 8a, b, HMSS and HMSS–N=N–CS at different concentrations showed negligible cytotoxicity after incubation with Caco–2 cells or NIH-3T3 cells, and the viability of Caco–2 cells was 87.9% and 88.3% at the high concentration of 100 μg/mL, respectively, which is sufficiently high for clinical applications due to the high drug loading of HMSS. In addition, NIH-3T3 cells incubated with HMSS and HMSS–N=N–CS for 48 h had high cell viability (above 80%) at the relatively high concentration of 100 μg/mL. These results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS are cytocompatible and could be employed for oral delivery.

Effect of HMSS and HMSS–N=N–CS on cell proliferation of a Caco–2 cells and b NIH-3T3 cells for 48 h by MTT assay. c Cytotoxicity of free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, and HMSS–N=N–CS/DOX with enzyme against Caco-2 cells with different concentrations for 48 h

The effect of the DOX-loaded nanocarrier HMSS–N=N–CS/DOX on the viability of Caco–2 cells is displayed in Fig. 8c. Free DOX showed strong and concentration-dependent cytotoxicity towards 4T1 cells, which was attributed to the fact that positively charged free DOX could pass through 4T1 cell membranes easily. Der IC₅₀ value for the free DOX group was determined to be 10.18 μg/mL using the SPSS Statistics software. Compared with free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX exhibited a higher cell viability at the same DOX concentration owing to the incomplete release of DOX from HMSS–N=N–CS induced by the strong electrostatic interactions between negatively changed HMSS carriers and positively changed DOX. Der IC₅₀ value for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 32.22 μg/mL, which was much higher than that for free DOX. However, HMSS–N=N–CS/DOX preincubated with concentrated colon enzymes showed an obvious concentration-dependent cytotoxicity, and the IC₅₀ value was calculated to be 9.41 μg/mL, which was much lower than that of HMSS–N=N–CS/DOX. This reason could be ascribed to the colon enzymes degrading the azo bonds in HMSS–N=N–CS, which would lead to the detachment of grafted CS from the surface of HMSS, causing the fast release of DOX from HMSS carriers.

Toxicity Studies

The hazards of using HMSS–N=N–CS are a vital factor to be considered before its clinical applications in the future. H&E staining of gastrointestinal mucosa irritation is essential to evaluate the in vivo biosafety of the delivery system for oral administration (Fig. 9a). Compared to a saline group, both the HMSS and HMSS–N=N–CS groups exhibited no marked histopathological changes or hyperemia after oral administration for a week with an administration dose of 100 mg/kg. No death or unusual behaviors of rats was observed during the experimental process. A decrease in body weight is widely regarded as an important and simple index for in vivo systemic toxicity [46]. As shown in Fig. 9b, the body weights of mice in the HMSS and HMSS–N=N–CS groups increased slightly and were similar to those of the saline group. The above results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS showed good biocompatibility as drug carriers for oral administration.

a Gastrointestinal mucosa irritation assay after oral administration of HMSS and HMSS–N=N–CS with the dose of 50 mg/kg for 7 days. b The weight changes of mice after oral administration for a week. Data were means ± SD (n =3)

Schlussfolgerungen

In summary, biodegradable CS was attached through azo bonds to gate the openings of HMSS to achieve enzyme-responsive colon-specific drug delivery. DOX was loaded in the hollow cavity and mesopores of HMSS in a noncrystalline state with a high loading efficiency of 35.2%. Stability and BSA adsorption results illustrated that the CS gates could increase the biocompatibility and stability of HMSS. In vitro release results proved that HMSS–N=N–CS/DOX exhibited enzyme-responsive drug release behavior in the presence of colonic enzymes. CLSM uptake and FCM results indicated that the cellular uptake of DOX was obviously increased after HMSS–N=N–CS/DOX was incubated with the colonic enzyme mixture. Cell viability results indicated that HMSS–N=N–CS/DOX incubated with colonic enzymes showed increased cytotoxicity, and the IC₅₀ value obviously decreased from 32.22 μg/mL for HMSS–N=N–CS/DOX to 9.41 μg/mL upon incubation.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten sind uneingeschränkt verfügbar.

Abkürzungen

HMSS:

Hollow mesoporous silica spheres

CS:

Chitosan

DOX:

Doxorubicin

DDSs:

Drug delivery systems

MSSs:

Mesoporous silica spheres

CLSM:

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

FCM:

Durchflusszytometrie

FBS:

Fötales Rinderserum

LE:

Loading efficiency