Verbesserte antitumorale Wirksamkeit von Cisplatin-Tetrandrin-Therapie durch biokompatible Nanopartikel-Abgabe

Zusammenfassung

Kombinationstherapie ist eine Standardstrategie in der klinischen Tumorbehandlung. Wir haben gezeigt, dass die Kombination von Tetrandrin (Tet) und Cisplatin (CDDP) eine deutliche synergistische antikrebswirksame Aktivität aufweist, aber unvermeidbare Nebenwirkungen ihre therapeutische Konzentration begrenzen. In Anbetracht der unterschiedlichen physikochemischen und pharmakokinetischen Eigenschaften der beiden Medikamente luden wir sie gemeinsam in ein Nanofahrzeug mittels verbesserter Doppel-Emulsionsmethode. Die Nanopartikel (NPs) wurden aus einer Mischung von Poly(ethylenglycol)-Polycaprolacton (PEG-PCL) und Polycaprolacton (HO-PCL) hergestellt, sodass CDDP und Tet gleichzeitig in die NPs eingebracht werden konnten, was zu geringen Interferenzeffekten und hoher Stabilität führte. Fluoreszenzmikroskopie-Bilder zeigten die zelluläre Aufnahme sowohl hydrophiler als auch hydrophober Wirkstoffe, die von den NPs geliefert wurden. In-vitro-Studien an verschiedenen Tumorzelllinien und Tumorgewebe zeigten erhöhte Tumorbeschränkung und Apoptoseraten. Bei den In-vivo-Studien wurden überlegene antitumorale Wirksamkeit und reduzierte Nebenwirkungen in der NPs-Gruppe beobachtet. Darüber hinaus demonstrierte ¹⁸FDG-PET/CT-Bildgebung, dass NPs die metabolischen Aktivitäten von Tumoren stärker reduzierten. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass PEG-PCL Blockcopolymer-NPs ein vielversprechender Träger für kombinierte Chemotherapie mit solider Wirksamkeit und geringen Nebenwirkungen sein könnten.

Einleitung

Mit der Entwicklung der umfassenden Tumortherapie spielen Platinverbindungen eine wichtige Rolle bei der Behandlung verschiedener Krebsarten, wobei Cisplatin (CDDP) in der Klinik weit verbreitet ist [1, 2]. Heutzutage ist CDDP immer noch signifikant, wenn es mit Tumorimmuntherapie kombiniert wird, und zeigt einen günstigen Effekt auf maligne Tumoren wie nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC) [3]. Diese Chemotherapeutika erreichen jedoch immer antitumorale Aktivität auf Kosten unerwünschter Toxizität [4], weshalb therapeutische Wirkstoffe, die Toxizität reduzieren und die Wirksamkeit der Chemotherapie steigern, unaufhörlich erforscht wurden [5, 6]. Tetrandrin (Tet) ist ein Mitglied der Bis-Benzylisoquinolin-Alkaloide [7] und zeigt zufriedenstellende Wirkung bei der Sensibilisierung für Chemotherapie. Unsere frühere Arbeit hat gezeigt, dass die Kombination von Tet und CDDP eine deutliche synergistische antikrebswirksame Aktivität durch Hemmung der Expression chemotherapeutika-assoziierter Gene aufweist, einschließlich Exzisionsreparatur-Kreuzkomplementationsgruppe 1 (ERCC1), Thymidylat-Synthase (TS), β-Tubulin III usw. [8]. Die klinische Anwendung von Tet leidet jedoch unter seiner schlechten Wasserlöslichkeit und niedrigen oralen Bioverfügbarkeit [7]. Zudem verteilt sich hydrophiles CDDP am ehesten in der extrazellulären Matrix (ECM), während hydrophobes Tet Lipidmembranen durchdringen und durch Zellen transportiert werden kann, sodass die beiden Medikamente nicht wirklich zusammenwirken können. Daher ist es essenziell, einen Weg zu finden, der beide Medikamente simultan effektiv abgeben kann, um den antineoplastischen Effekt mit reduzierten Nebenwirkungen zu verbessern.

Jüngste Fortschritte im Bereich der Nanotechnologie eröffnen neuartige Ansätze für Diagnose und Behandlung von Krebs [9, 10]. Nanopartikel (NPs), die mit amphiphilen Copolymeren, insbesondere Polyethylenglykol (PEG), konstruiert werden, sind bekannt für ihre Fähigkeit, die Anhaftung von Serumproteinen zu reduzieren und die Aufnahme durch das retikuloendotheliale System (RES) zu verhindern [11]. Wenn sie zum Transport hydrophober Medikamente verwendet werden, erhöhen Nanoträger die Löslichkeit taktvoll und verlängern sowie erhöhen die Verweildauer des Medikaments in der Blutzirkulation und im Tumor [12]. Mit der klinischen Anwendung von Copolymer-NPs gewinnt die Biokompatibilität der NPs immer mehr Aufmerksamkeit. Beispielsweise zeigten jüngste Erkenntnisse, dass einige injizierte Titandioxid-, Siliziumdioxid- und Goldnanopartikel die Intravasation und Extravasation von Krebszellen in Tiermodellen beschleunigen [13]. NPs, die aus Nanomaterialien mit guter Biokompatibilität und Sicherheit hergestellt werden, insbesondere solche, die von der FDA zugelassen sind, sind bessere Kandidaten für Medikamententräger.

Vorläufig haben wir es geschafft, CDDP-beladene NPs [14, 15] und Tet-beladene NPs mittels Polyethylenglycol-Poly(caprolacton) (PCL-PEG) [16] herzustellen, deren in-vivo-antitumorale Effekte beide demonstriert wurden. In dieser Studie verwendeten wir PEG-PCL für die Ko-Abgabe von CDDP und Tet. Mit einer nahezu neutralen Ladung bildet PEG die hydrophile Hülle eines Nanopartikels, die antigene Epitope verbirgt und immunologische Reaktionen verhindert [14]. Fluoreszenzmikroskopie-Bilder demonstrierten, dass Zellen sowohl hydrophile als auch hydrophobe Wirkstoffe, die von den NPs geliefert wurden, aufnehmen können. Die Ergebnisse der In-vitro-Studien, nicht nur an verschiedenen Tumorzelllinien, sondern auch an Tumorgeweben, zeigten, dass CDDP-Tet-NPs das Tumorwachstum effektiver hemmen als die freien Medikamente. Bei In-vivo-Untersuchungen wurden erhöhte antitumorale Wirksamkeit und verringerte Nebenwirkungen in der NPs-Gruppe beobachtet. Zudem zeigte ¹⁸FDG-PET/CT-Bildgebung die niedrigste Stoffwechselrate des Tumors in der NPs-Gruppe, was die Fähigkeit von CDDP-Tet-NPs anzeigt, das Tumorwachstum zu verzögern.

Methoden

Materialien

Reagenzien und Zellen

CDDP (Molekülformel PtCl₂(NH₃)₂) wurde von Shandong Boyuan Pharmaceutical Co. Ltd. (Jinan, China) [15] gekauft. Tetrandrin (Molekülformel C₃₈H₄₂N₂O₆) wurde als Pulver mit einer Reinheit von > 98% von Jiangxi Yibo Pharmaceutical Development Company (Jiangxi, China) [16] bezogen. Methoxy-polyethylenglykol [MePEG; gewichtsmittleres Molekulargewicht (Mw = 4 kDa; Nanjing Well Chemical Co. Ltd. China] wurde durch azeotrope Destillation mit Toluol dehydriert und dann 12 h bei 50 °C vakuumgetrocknet vor der Verwendung. ε-Caprolacton (ε-CL; Aldrich, USA) wurde durch Trocknen über CaH₂ bei Raumtemperatur gefolgt von Destillation unter reduziertem Druck gereinigt. Polyvinylalkohol (PVA; Polymerisationsgrad = 500, Verseifungsgrad = 88%; Shanghai Dongcang International Trading Co. Ltd., China) und Zinn(II)-octoat (Molekülformel SnCl₂) (Sigma) wurden unverändert verwendet. RPMI 1640 Medium (Gibco, USA), Kälberserum (Lanzhou Minhai Bioengineering, China) und Dimethylthiazol-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT; Amersco, USA) wurden unverändert verwendet.

Humane gut differenzierte Magenkrebszelllinie MKN₂₈, humane kolorektale Adenokarzinomzelllinie LoVo, humane Zervixkarzinomzelllinie Hela und murines Hepatomzelllinie H₂₂ wurden vom Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, China) erhalten. Alle Zelllinien wurden in RPMI 1640 Medium, supplementiert mit 10% Rindserum, Penicillin (100 U/mL)-Streptomycin (100 g/mL), Pyruvat, Glutamin und Insulin bei 37 °C in einer wassergesättigten Atmosphäre mit 5% CO₂ vermehrt.

Synthese der Copolymeren

Wie wir zuvor beschrieben haben [16, 17], wurden mPEG-PCL und HO-PCL Copolymeren durch Ringöffnungs-Copolymerisation synthetisiert. Kurz gesagt, eine vorher bestimmte Menge ε-CL wurde in ein Polymerisationsröhrchen gegeben, das PEG und eine kleine Menge Zinn(II)-octoat (0,1% Gew./Gew.) enthielt. Das Röhrchen wurde dann an ein Vakuumsystem angeschlossen, versiegelt und 48 h bei 130 °C in einem Ölbad platziert. Für die Synthese von HO-PCL Copolymeren wurden vorher bestimmte Mengen ε-CL und Zinn(II)-octoat in ein Polymerisationsröhrchen ohne Trocknung gegeben. Nach Abschluss der Polymerisation wurden die rohen Copolymeren mit Chloroform gelöst und in ein Überschuss an kaltem Methanol gefällt, um unbehandeltes Monomer und Oligomer zu entfernen. Die Niederschläge wurden dann gefiltert und mehrmals mit Wasser gewaschen, bevor sie gründlich unter reduziertem Druck getrocknet wurden.

Herstellung von CDDP-Tet-beladenen Nanopartikeln

Vorher bestimmte Mengen CDDP und Tet-beladene Nanopartikel wurden durch Doppel-Emulsions-Methode (DE) [14, 18] hergestellt. CDDP und Tet wurden mit 1 mL Dichlormethan (DCM) Lösung, die 5 mg mPEG-PCL und 15 mg HO-PCL enthielt, durch Sonikation für 15 s (15 W) in einem Eisbad emulgiert (Lösung W1). Dann wurden 4 mL 3% (w/v) PVA-Lösung W2 hinzugefügt und 30 s soniziert, um eine W1/O/W2-Emulsion herzustellen. Die Doppel-Emulsion wurde in 50 mL 0,3% (w/v) PVA-wässrige Lösung verdünnt und DCM wurde unter Vakuum verdampft. Die erhaltenen Nanopartikel wurden gesammelt, gewaschen und gefriertrocknet (Abb. 1).

Wirkstoffgehalt und Einkapselungseffizienz

Zur Bestimmung des Wirkstoffgehalts wurde das gefriergetrocknete CDDP-Tet-beladene NP-Pulver in Dimethylformamid (DMF) gelöst, und 30 L dieser Lösung wurden mit 30 L 2 mmol/L HCl gemischt, gefolgt von der Zugabe von 2,94 mL 0,2 mmol/L SnCl₂-Lösung in 2 mmol/L HCl. Die Absorption bei 403 nm wurde nach 1 h mit Bezug auf eine Kalibrierkurve mit einem Shimadzu UV-1205 Spektrophotometer (Kyoto, Japan) gemessen. Die Gesamtmenge des Wirkstoffs in den NPs konnte dann berechnet werden. Der Wirkstoffgehalt und die Einkapselungseffizienz wurden jeweils durch Gleichungen (1) und (2) ermittelt:

Wirkstoffgehalt (%) = (Gewicht des Wirkstoffs in Nanopartikeln) / (Gewicht der Nanopartikel) × 100% (1)

Einkapselungseffizienz (%) = (Gewicht des Wirkstoffs in Nanopartikeln) / (Gewicht des zugeführten Wirkstoffs) × 100% (2)

In-vitro-Zytotoxizität der Nanopartikel und Biokompatibilitätsstudie

Zelluläre Aufnahme-Studien

Auf Basis unserer früheren Arbeit [15] wurden LoVo-Zellen auf den Deckel einer 6-Well-Platte mit ca. 5 × 10⁵ Zellen pro Well platziert und 24 h inkubiert (37 °C, 5% CO₂). NPs mit Rhodamin B (21 µg/mL) wurden in die Wells gegeben. Nach 2 h Inkubation wurde die Platte mit 4 °C und 37 °C PBS für 3–4 Mal jeweils gewaschen. LoVo-Zellen auf Deckgläsern wurden dann dem Fluoreszenzmikroskop unterzogen.

Zytotoxizitäts-Assay

Die in-vitro-Zytotoxizität der Medikamente wurde durch Standard-MTT-Assays an MKN28 und H₂₂ Zelllinien bestimmt. Kurz gesagt, Zellen wurden in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 5000 Zellen pro Well 24 h vor dem Assay ausgesät. Dann wurden Zellen einer Reihe von Dosen freiem CDDP, freiem Tet, freiem CDDP plus Tet und CDDP-Tet-beladenen Nanopartikeln ausgesetzt. Nach Inkubation wurden 20 µL 5 mg/mL MTT-Lösung zu jedem Well gegeben und die Platte 4 h inkubiert, sodass lebensfähige Zellen das gelbe MTT in dunkelblaue Formazan-Kristalle umwandeln konnten, die in 200 µL Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst wurden. Die optische Dichte (OD) jedes Wells wurde mit einem ELISA-Reader (ELX800 Biotek, USA) bei Test- und Referenzwellenlängen von 490 und 630 nm gemessen. Die Zellvitalität wurde durch folgende Formel bestimmt:

Zellvitalität (%) = OD (Test-Well) / OD (Referenz-Well) × 100% (3)

Die in-vitro-Verträglichkeit der leeren Nanopartikel wurde ebenfalls durch MTT-Assays an MKN₂₈ und H₂₂ Zelllinien bestimmt. Alle aus MTT-Assays erhaltenen Ergebnisse wurden durch Wiederholung des Experiments an mindestens drei unabhängigen Gelegenheiten und Testen in Triplikaten bestätigt.

Apoptose-Assay

Annexin V-FITC Kit (Bender MedSystem, USA) wurde verwendet, um die Veränderung der Zellapoptoseraten zu untersuchen. MKN₂₈ Zellen wurden für 24 h in einer 6-cm-Kultursschale ausgesät. Kulturmmedien wurden mit 1 µg/mL freiem CDDP, 1 µg/mL CDDP-beladenen NPs und 200 µg/mL leeren NPs ersetzt. Die Kontrollgruppe wurde mit Kulturmmedium ohne Medikamente ersetzt. Nach 48 h Kultur wurde Enzym hinzugefügt. Die Zellen wurden dann gesammelt, 2 Mal mit PBS gewaschen und in 100 µL Puffer resuspendiert. Annexin V 5 µL und PI 1 µL wurden nacheinander hinzugefügt, gemischt und 15 Min bei Raumtemperatur ohne Lichteinwirkung stehen gelassen. 400 mL Puffer wurden hinzugefügt und der FCM (BD FACS CantoTM, USA) Prozess für die Zellapoptoseraten-Analyse durchgeführt.

Histokultur-Medikamentenantwort-Assay (HDRA)

Der HDRA wurde gemäß unseren früheren Studien [14, 19] durchgeführt. Kurz gesagt, männliche ICR-Mäuse wurden subkutan an beiden Axillarbereichen mit 4–6 × 10⁶ H₂₂ Zellen in Kochsalzlösung injiziert. Als die Tumoren 400–600 mm³ Volumen erreichten, wurden die Mäuse durch Zervikaldislokation geopfert, und frische Proben wurden entnommen, zweimal in Kochsalzlösung gewaschen, in Hank's Lösung eingetaucht und in Stücke von ca. 15 mg Gewicht geteilt. Die Gewebeproben wurden in eine 24-Well-Platte gelegt, in die quadratische Gelatinschwämme mit 1 cm Abmessungen in RPMI 1640 Medium, supplementiert mit 20% fötalem Kälberserum und Amikacin-Sulfat (100 IE/mL), das freies CDDP oder CDDP-beladene NPs in zwei verschiedenen Konzentrationen enthielt, eingetaucht waren. Vier Tumorgewebeproben wurden ohne Medikamente als Kontrolle inkubiert. Die Gewebe wurden dann 7 Tage bei 37 °C, 5% CO₂ kultiviert. Eine gemischte Lösung aus Typ I Kollagenase (100 L, 0,6 mg/mL) und MTT (100 L, 5 mg/mL) in 100 mg/mL Natriumsuccinat wurde hinzugefügt. Nach weiterer 24 h Inkubation wurde MTT-Formazan durch 1 mL DMSO extrahiert, und 100 L Lösung aus jedem Well wurden in die Wells einer 96-Well-Mikroplatte übertragen. Der OD jedes Wells in der Mikroplatte wurde mit dem ELISA-Reader bei Test- und Referenzwellenlängen von 490 und 630 nm gemessen. Die Vitalitäten der Gewebe wurden gemäß folgender Formel (4) berechnet:

Gewebevitalität (%) = (OD (Test) / Gewicht (Test)/mg) / (OD (Kontrolle) / Gewicht (Kontrolle)/mg) × 100% (4)

In-vivo-Antitumorale Wirksamkeit

Tumorvolumenmessung

Männliche ICR-Mäuse mit einem Gewicht zwischen 18 und 20 g wurden mit muriner Hepatomzelllinie H₂₂ implantiert und verwendet, um die relative Wirksamkeit von CDDP-Tet-beladenen NPs zu qualifizieren. Unter spezifisch pathogenfreien (SPF) Bedingungen aufgezogen, wurden die Mäuse in Übereinstimmung mit Richtlinien durchgeführt, die vom Tierpflegeausschuss am Drum Tower Hospital genehmigt wurden. 0,2 mL Zellsuspension mit 4–6 × 10⁶ H₂₂ Zellen wurden subkutan in den linken Axillarbereich der Mäuse injiziert. Die Mäuse wurden in 6 Gruppen eingeteilt: Kontrollgruppe (Kochsalzlösung), leere NPs-Gruppe, freies CDDP (3 mg/kg) Gruppe, freies CDDP plus Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg) Gruppe und CDDP-Tet-beladene NPs (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg) Gruppe. Jede Gruppe bestand aus 6 Mäusen. Behandlungen begannen nach 7–8 Tagen Implantation, und der Tag wurde als "Tag 0" bezeichnet. Jedes Tier wurde zum Behandlungszeitpunkt gewogen, damit Dosierungen angepasst werden konnten, um die angegebenen mg/kg Dosen zu erreichen. Tiere wurden auch alle zwei Tage während des Experiments gewogen.

Immunfluoreszenz-Assay

Die Tumorgewebe von Mäusen in der Kontrollgruppe und denen, die freies CDDP plus Tet und CDDP-Tet NPs erhielten, wurden für die Histologie-Beobachtung am 21. Tag nach Behandlung ausgewählt. Die Tumoren wurden disseziert und in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert, routinemäßig in Paraffin verarbeitet, in 5 mm Dicke geschnitten. Die Gewebeschnitte wurden unter einem Zeiss LSM510 Meta Konfokalmikroskop beobachtet, nachdem die Proben mit (40,6-Diamidino-2-phenylindol) (DAPI, blau) und terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase dUTP Nick-End-Markierung (TUNEL, grün) [20] gefärbt wurden.

¹⁸FDG-PET/CT-Bildgebung

Mäuse der freien CDDP plus Tet Gruppe und CDDP-Tet-beladenen NPs Gruppe erhielten dann PET/CT-Bildgebung am Tag 6 nach Behandlung. 4 h Fasten wurden vor Tracer-Injektion durchgeführt. 14,8 MBq (400 µCi) ¹⁸F-FDG wurde über die Schwanzvene als Radiotracer injiziert. Die Bilder wurden mit einem kombinierten PET/CT-Scanner (Jemini JXL, Philips, USA) erzeugt. Hochauflösende PET-Bilder und das gleiche CT-Sichtfeld wurden 45 Min nach Verabreichung von ¹⁸F-FDG aufgenommen. PET-Bilder wurden auf Basis der CT-Daten für Absorption und Streuung korrigiert. Die Bildfusion wurde durch ein automatisches Bildfusionssystem durchgeführt, unter Verwendung von herstellerspezifischer Software. Maximale FDG-Aufnahmewerte im Tumor wurden für die Standardaufnahmewert (SUV) Berechnungen ermittelt, wobei Korrekturen für Körpergewicht und injizierte Aktivität angewendet wurden.

Statistische Methoden

Statistische Analysen der Daten wurden mit Student's t-Test durchgeführt. Die Daten sind als Mittelwert ± SD aufgeführt, und Werte von P < 0,05 wurden als statistisch signifikanter Unterschied akzeptiert.

Ergebnisse

Copolymersynthese und Charakterisierung

Gemäß unserer früheren Studie synthetisierten wir die NPs mit PEG-PCL und HO-PCL (das optimale Verhältnis war 1:3) [14]. Der Durchmesser, die Polydispersität, das zahlenmittlere Molekulargewicht (Mn) und das gewichtsmittlere Molekulargewicht (Mw) der optimalen PEG-PCL Copolymer-NPs sind in Zusatzdatei 1: Tabelle S1 dargestellt. Als sie mit CDDP und Tet beladen waren, wurden auch Wirkstoffgehalt und Einkapselungseffizienz gemessen (Zusatzdatei 1: Tabelle S2), die ähnlich wie bei CDDP-beladenen PEG-PCL Copolymer-NPs sind. Allerdings sind der Wirkstoffgehalt und die Beladungseffizienz von Tet geringer als bei Tet-beladenen PEG-PCL Copolymer-NPs, was etwas mit HO-PCL-Komponenten zu tun haben könnte.

Durch dynamische Lichtstreuung (DLS) betrug der Durchmesser der CDDP-Tet-beladenen PEG-PCL Copolymer-NPs 359,1 ± 5,3 nm mit einer Polydispersität von ca. 0,231. Bei Beobachtung mit TEM und AFM (Zusatzdatei 1: Abb. S1a und S1b) wiesen die NPs regelmäßige kugelförmige Form und ähnliche Größen auf, die mit den DLS-Daten übereinstimmten. Auch waren kleine Tröpfchen in den Nanopartikeln dispergiert, was bestätigt, dass Nanopartikel tatsächlich die Struktur der Doppel-Emulsion sind.

Zelluläre Aufnahme von CDDP-Tet-beladenen NPs

Partikel, die mit fluoreszierenden Farbstoffen beladen sind, wurden als gängige Methode angewendet, um zelluläre Aufnahme zu erforschen, was visuelle und Echtzeit-Detektion ermöglicht. Wir haben gezeigt, dass die farbstoffbeladenen NPs über Endozytose in die Zellen gelangen können. In dieser Studie ist Rhodamin-B hydrophil und kann im PI-Fluoreszenzkanal detektiert werden, was zur Simulation von CDDP verwendet wird. Als Simulation von Tet ist Cumarin-6 hydrophob, dessen Signal im FITC-Fluoreszenzkanal empfangen werden kann. Nach 2 h Ko-Inkubation mit NPs, beladen mit Cumarin-6 und Rhodamin-B, wurden LoVo-Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie und Optisches Objektiv (200×) detektiert. Wie in Abb. 2 zu sehen, können Fluoreszenzsignale im PI-Fluoreszenzkanal, dem FITC-Fluoreszenzkanal sowie dem PI/FITC Dual-Fluoreszenzkanal detektiert werden. Die Ergebnisse bestätigten, dass die NPs sowohl Cumarin-6 als auch Rhodamin-B gleichzeitig zu Tumorzellen transportieren können, woraus wir ableiten können, dass CDDP und Tet in den NPs beladen und von Tumorzellen gleichzeitig absorbiert werden können.

In-vitro-Zytotoxizität der Nanopartikel

Die Zytotoxizität von freiem CDDP, freiem Tet, freiem CDDP plus Tet und CDDP-Tet-beladenen NPs wurde in der Magenzelllinie MKN28 verglichen. Die Konzentration von Tet war 2,4-mal so hoch wie die Konzentration von CDDP. Wie in Abb. 3 gezeigt, war die Zytotoxizität der CDDP-Tet-beladenen NPs unter den vier Gruppen am stärksten. Der Unterschied der Zytotoxizität zwischen freiem Tet und der NPs-Gruppe und den drei anderen Freimedikamenten-Gruppen wurde mit steigender Konzentration deutlich. Ähnliche Ergebnisse wurden in humanen Zervixkarzinomzellen Hela und hepatozellulären Karzinomzellen H₂₂ beobachtet (Zusatzdatei 1: Abb. S2a, S2b).

Toxizitätsstudie leerer NPs wurde in unserer früheren Arbeit durchgeführt. In der früheren Studie zeigten die leeren NPs geringe Toxizität auf Tumorzelllinien, was anzeigte, dass leere NPs eine zufriedenstellende Biokompatibilität aufweisen [14, 16].

In-vitro-Apoptose-Analyse von CDDP-Tet-beladenen NPs

Wir maßen den Einfluss von 1 µg/mL freiem CDDP, 2,4 µg/mL freiem Tet, freiem CDDP plus Tet (1 µg/mL + 2,4 µg/mL) und CDDP-Tet-beladenen NPs (1 µg/mL + 2,4 µg/mL) auf die apoptotische Rate von MKN28-Zellen nach 48 h Ko-Kultur. Die apoptotische Rate wurde als Q2 + Q4 berechnet (in Abb. 4 dargestellt). Die Veränderung der zellulären Apoptoseraten war zwischen freiem CDDP plus Tet, freiem CDDP und freiem Tet ähnlich (Abb. 4a–c). Die Apoptoserate von MKN28-Zellen, induziert durch CDDP-Tet-beladene NPs, war jedoch signifikant höher als in den drei anderen Gruppen (Abb. 4d).

Histokultur-Medikamentenantwort-Assay (HDRA)

Um die antitumorale Wirksamkeit der NPs umfassender zu bewerten, evaluierten wir antitumorale Effekte von freiem CDDP, freiem CDDP plus Tet und CDDP-Tet-beladenen NPs an H₂₂ Zelllinien mittels HDRA. Als klinische Methode zur Vorhersage der Chemosensitivität simuliert HDRA praktische Bedingungen von Tumorgeweben authentischer als zytologische Experimente [19], deren Ergebnisse durch Mikroumgebung und Mikrostruktur des Tumorgewebes beeinflusst werden können, wie Medikamentenpenetration, extrazelluläre pH-Werte, interstitieller Flüssigkeitsdruck etc.

Die Konzentration von Tet ist 2,4-mal so hoch wie die Konzentration von CDDP. Wie in Abb. 5 gezeigt, war bei der niedrigsten Konzentration der antitumorale Effekt der freien CDDP- und Tet-Gruppe besser als der von CDDP, doch die Effekte waren ähnlich mit steigender Medikamentenkonzentration. In Übereinstimmung mit der Apoptose-Analyse hatten CDDP-Tet-beladene NPs einen beträchtlich besseren antitumoralen Effekt unter den drei Gruppen bei allen getesteten Konzentrationen.

In-vivo-Antitumorale Wirksamkeitsanalyse

Wirksamkeits- und Nebenwirkungs-Evaluation

Murine Modelle, gebildet durch H₂₂ Zelllinien-Engraftment, wurden mit 3 mg/kg freiem CDDP, freiem CDDP zusammen mit Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg), CDDP-Tet-beladenen NPs (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg) behandelt. Tumoren wurden 12 Tage nach Medikamentenbehandlung entnommen. Tumorgrößen wurden alle 2 Tage detektiert, um den optimalsten Gehalt der Medikamentenabgabe zu bestimmen. Wie in der Tumorwachstumskurve (Abb. 6) gezeigt, waren der Tumorwachstumstrend der Kontrollgruppe sowie der leeren Nanopartikel-Gruppe ähnlich, aber es bestand eine prominente Hemmung des Tumors in den anderen drei Gruppen mit Medikamentenabgabe. Im Vergleich zur freien CDDP-Gruppe zeigte die freie CDDP plus Tet-Gruppe während der ersten 6 Tage bessere antitumorale Wirksamkeit. Nach 6 Tagen begann sich der Unterschied der Tumorbeschränkungsrate zwischen den beiden Gruppen zu verringern, und nach 10 Tagen hatte freies CDDP plus Tet sogar einen schlechteren antitumoralen Effekt.

Während der ersten 6 Tage waren die antitumoralen Effekte der freien CDDP plus Tet und CDDP-Tet-beladenen NPs Gruppen ähnlich. Daher zeigten Mäuse, die CDDP-Tet-beladene NPs erhielten, seit Tag 6 nach Behandlung bessere antitumorale Wirksamkeit. Zusatzdatei 1: Abb. S3a zeigt unterschiedliche Tumorgrößen jeder Gruppe. Das Tumorvolumen der CDDP-Tet-beladenen NPs-Gruppe war am kleinsten, was als direkte Reflexion der prominenten antitumoralen Wirkung angesehen werden konnte. Zusätzlich zur Tumorbeschränkungskapazität gab es im Vergleich zur freien CDDP- oder freien CDDP plus Tet-Gruppe weniger Blutgefäße auf der Tumoroberfläche. Ebenso zeigte Zusatzdatei 1: Abb. S3b, dass die Gefäßdichte in der NPs-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe und freien CDDP plus Tet-Gruppe am niedrigsten war.

Um das Verhältnis apoptotischer Zellen im Tumorgewebe in vivo weiter zu untersuchen, wurde TUNEL-Assay zur Detektion apoptotischer Zellen durchgeführt. Wie in Abb. 7 gezeigt, können apoptotische Zellen in Tumoren mit grüner Fluoreszenz gefärbt werden, um Apoptose anzuzeigen. Die überlagerten Bilder zeigen weniger grün fluoreszierende Bereiche in der Kontrollgruppe und der freien CDDP plus Tet-Gruppe, was auf das Vorhandensein weniger apoptotischer Zellen hinweist. Zudem wurden in der mit CDDP-Tet NPs behandelten Gruppe große Mengen grün fluoreszierender Bereiche beobachtet, was auf eine große Anzahl apoptotischer Zellen hindeutet. Die Ergebnisse bestätigten, dass CDDP-Tet NPs die Tumorapoptose in vivo fördern können.

Zusätzlich zu besserer antitumoraler Wirksamkeit als freie CDDP und freie CDDP plus Tet Gruppe zeigten die CDDP-Tet-beladenen NPs auch weniger Nebenwirkungen. Wie in Abb. 8a gezeigt, verursachten freies CDDP und freies CDDP plus Tet signifikanten Gewichtsverlust im Vergleich zur Kontrollgruppe, was die Toxizität bei direkter Medikamentenabgabe anzeigt. Die Gewichtsverlaufskurve der leeren NPs-Gruppe war ähnlich der der Kontrollgruppe, was suggeriert, dass die Toxizität der leeren NPs vernachlässigbar sein könnte. Der durch CDDP-Tet-beladene NPs und Kontrollgruppen verursachte Gewichtsverlust war während der ersten 6 Tage vergleichbar. Von Tag 6 bis Tag 12 waren die Mäusengewichte in der NPs-Gruppe leicht niedriger als in der Kontrollgruppe, aber höher als in der freien CDDP- oder freien CDDP plus Tet-Gruppe. Bemerkenswert ist, dass die freie CDDP plus Tet-Gruppe während der ersten 4 Tage offensichtlichen Gewichtsverlust und Appetitverlust der Mäuse verursachte, was anzeigt, dass die Aufnahme der Medikamente dem gesamten Körper schadete. Im Gegensatz dazu können CDDP-Tet-beladene NPs langsam in Geweben freigesetzt werden und die Konzentration auf einem stabilen Niveau halten; daher waren die Nebenwirkungen im Vergleich zur direkten Medikamentenabgabe offensichtlich reduziert. Dann wurden Nebenwirkungen der Behandlung auch durch Leberbiopsie evaluiert (Abb. 8b). Im Vergleich zur Kontrollgruppe war die Grenze zwischen den Leberzellen der Doppel-Medikament-Nacktmedikament-Gruppe verschwommen, einige Leberzellen zeigten ballonartige Veränderungen, Zellkörper schrumpften, Kernpyknose und erhöhte Eosinophilie (gelber Pfeil), während die Doppel-Medikament-Nanopartikel-Gruppe eine normale Stammzellstruktur, klare Interzellulärräume und keine offensichtlichen pathologischen Veränderungen aufwies. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass durch NPs-Abgabe wenig Beeinträchtigung verursacht wurde.

PET-CT

Um die in-vivo-therapeutische Wirkung jeder Gruppe besser zu vergleichen, unterzogen sich Mäuse am Tag 6 nach Behandlung CT, PET/CT-Scan. Die Fusionsbilder von CT und PET-Scan sind in Abb. 9 dargestellt. PET/CT ist eine effiziente Methode zur Reflexion metabolischer Veränderungen durch ¹⁸FDG-Aufnahme-Detektion [21]. Wie im CT-Scan gezeigt (Abb. 9), waren die Tumorvolumen der freien CDDP plus Tet-Gruppe und der CDDP-Tet-beladenen NPs-Gruppe vergleichbar (Abb. 9a), aber die Tumormetabolische Rate in der freien CDDP plus Tet-Gruppe war signifikant höher als in der NPs-Gruppe (Abb. 9b). Die verringerte Intensität an der Tumorstelle der Mäuse, die CDDP-Tet-beladene NPs erhielten, symbolisierte die schlechte Stoffwechselrate des Tumors und zeigte damit die Fähigkeit der NPs, das Tumorwachstum zu verzögern.

Diskussion

In Anbetracht der Heterogenität und Komplexität von Tumoren ist Kombinationstherapie zu einer Standardstrategie in der klinischen Tumorbehandlung geworden [22]. Dennoch kann die einfache Kombination zweier einzelner Therapeutika nicht unbedingt den erwarteten Effekt erreichen, aufgrund der unterschiedlichen physikochemischen und pharmakokinetischen Eigenschaften der beiden Medikamente [23]. Um verschiedene Medikamente in einem synergistischen Verhältnis zu Tumorzellen zu liefern, wurde in dieser Studie ein Kombinationstherapie-Fahrzeug entworfen. CDDP ist hydrophil, während Tet hydrophob ist, was Probleme für die Belademethode verursacht. In dieser Studie verwendeten wir den amphiphilen Copolymer mit PCL als hydrophoben Kern und PEG als hydrophile Korona [14]. Durch die verbesserte Doppel-Emulsionsmethode befand sich Tet in der Ölphase und CDDP in der Wasserphase, die einzigartige Struktur verleiht den NPs die Kapazität zur simultanen Einkapselung von Tet und CDDP zu NPs. CDDP und Tet befinden sich in verschiedenen Schichten der NPs, was zu geringen Interferenzeffekten und hoher Stabilität führt [24].

Das Kombinationstherapie-Fahrzeug, beladen mit CDDP und Tet, kann die Wirksamkeit der CDDP-Tet-Kombination steigern. Nicht nur in Zellexperimenten hemmen CDDP-Tet NPs auch signifikant die Tumorgewebevitalität in HDRA-Assays, was den Anti-Tumor-Effekt der NPs in dem Modell validiert, das die Tumormikroumgebung berücksichtigt [19]. Bei der In-vivo-Studie wurde antitumorale Wirksamkeit in der Tumorvolumenveränderung beobachtet, was demonstrierte, dass CDDP-Tet NPs das Tumorwachstum mit niedrigerem Proliferationsniveau effektiv unterdrückten. ¹⁸FDG-PET/CT-Bildgebung zeigte, dass der Glukosestoffwechsel der Tumoren in der CDDP-Tet-Gruppe stärker und früher durch Induktion höherer Apoptose des Tumors inhibiert wurde, was in Immunfluoreszenz-Assays bestätigt wurde [21]. Im Vergleich zu freiem CDDP plus Tet sind CDDP-Tet NPs schneller und sicherer wirksam, was durch drei Mechanismen erklärt werden kann:

Erstens kann Tet als lipophiles Medikament kaum in der ECM verteilen und daher selten um Tumorzellen diffundieren [9]. In der Ölphase der NPs lokalisiert, ist Tet mit besserer Löslichkeit und Bioverfügbarkeit ausgestattet und erreicht die Tumorstellen im gleichen synergistischen Verhältnis wie CDDP. Darüber hinaus kann CDDP, das früher systemische Nebenwirkungen hatte, einmal vom Nanopartikel getragen, leicht das Interstitium des Tumorgewebes aus undichten Tumorblutgefäßen erreichen und aufgrund des Drucks, der durch unzureichende lymphatische Drainage entsteht, im Tumor gehalten werden [25]. Je mehr CDDP Tumorgewebe halten, desto weniger Schaden wird an normalen Organen angerichtet. Als Ergebnis passiver Targeting-Strategien sind CDDP-Tet NPs viel sicherer als freies CDDP plus Tet, was in den Mäusekörpergewichtsveränderungen und Leberbiopsien beobachtet werden kann.

Medikamentenresistenz wird als eine der größten Herausforderungen in der Krebsbehandlung angesehen, nicht nur wegen genetischer Veränderungen auf der Ebene einer einzelnen Zelle, sondern auch aufgrund von Tumorgeweben und Mikroumgebung [26]. Einerseits ist Tet alkalisch, sodass es im sauren Tumormikromilieu protoniert wird und daher die elektronegativen Tumorzytomembranen nicht überwinden kann, was als pH-induzierte physiologische Medikamentenresistenz bezeichnet wird [27]. Andererseits tragen große Entfernungen zwischen Blutgefäßen in soliden Tumoren und hoher interstitieller Flüssigkeitsdruck zur begrenzten Verteilung von CDDP und Tet bei [28]. Vom Nanofahrzeug getragen, kann Tet über Endozytose in Tumorzellen gelangen, ohne Einfluss der Tumormikroumgebung, und überwindet so die pH-induzierte physiologische Medikamentenresistenz. Die kleine Größe der Nanoträger ermöglicht es ihnen, in die Tumorvasculatur einzudringen und sich in vivo präferenziell am Tumorort anzureichern [29, 30].

Zusammenfassend stellt diese Studie ein Beispiel für die gleichzeitige Abgabe eines chemotherapeutischen Medikaments zusammen mit einem Chemosensibilisator dar. Durch die NPs getragen, werden beide Medikamente passiv an den Tumorort gerichtet, was systemische Toxizität reduziert. Außerdem bieten NPs eine Lösung für physiologische Medikamentenresistenz, indem sie dem Chemosensibilisator helfen, schneller und mehr in Tumorzellen einzudringen, was eine wichtige Rolle bei der Verbesserung der Wirksamkeit der Tumorchemotherapie spielt. Daher glauben wir, dass diese PEG-PCL Blockcopolymer-NPs ein vielversprechender Träger für kombinierte Chemotherapie sein könnten.

Schlussfolgerungen

Basierend auf unseren früheren Studien [8, 14, 16] untersuchte dieser Artikel die Anwendung von PEG-PCL/HO-PCL NPs für die Abgabe der Kombination zweier Medikamente mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften. Für In-vitro-Studien zeigten NPs überlegene antitumorale Wirkung mit großer Biokompatibilität. Erhöhte antitumorale Wirksamkeit wurde in Tumorvolumenveränderung und ¹⁸FDG-PET/CT-Bildgebung bei In-vivo-Studie im murinen Modell beobachtet. Die Mäuse in der NPs-Gruppe zeigten auch reduzierte Nebenwirkungen. Zudem wurde die Apoptoserate von Tumorzellen durch NPs in sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Studien gefördert. Zusammenfassend könnten diese Blockcopolymer-NPs ein vielversprechender Träger für die Abgabe von Cisplatin-Tetrandrin-Kombinationen und anderen Kombinationen sein, mit verbesserter antitumoraler Wirkung und reduzierter Toxizität für die Krebsbehandlung.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf vernünftige Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Abkürzungen

Tet:

Tetrandrin

CDDP:

Cisplatin

NP:

Nanopartikel

PEG-PCL:

Poly(ethylenglycol)-Polycaprolacton

HO-PCL:

Polycaprolacton

ECM:

Extrazelluläre Matrix

PEG:

Polyethylenglykol

RES:

Retikuloendotheliales System

DMF:

Dimethylformamid

SPF:

Spezifisch pathogenfrei

Mn:

Zahlenmittleres Molekulargewicht

Mw:

Gewichtsmittleres Molekulargewicht

DLS:

Dynamische Lichtstreuung