Hyperspektrale Multiplex-Biologische Bildgebung von Nanosonden, die im kurzwelligen Infrarotbereich emittieren

Einführung

Biomedizinische Bildgebungstechnologien haben sich in den letzten Jahrzehnten rasant entwickelt und ermöglichen die Früherkennung und Beurteilung verschiedener Krankheiten und Pathologien. Unter den verschiedenen Bildgebungsmodalitäten nimmt die optische Bildgebung aufgrund ihrer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung und ihrer relativ geringen Kosten eine einzigartige Stellung ein. Mehrere optische Bildgebungsansätze basierend auf Photolumineszenz (oder genauer gesagt Fluoreszenz) befinden sich in der Entwicklung und werden klinisch umgesetzt. Zum Beispiel haben die Bildgebung des Lymphsystems und die intraoperative fluoreszenzbildgeführte Chirurgie vielversprechende Ergebnisse gezeigt, um die Gesundheitsversorgung voranzubringen [1, 2]. Andererseits werden exogene photolumineszierende Sonden, die auf spezifische interessierende Regionen (z. B. Tumor) abzielen, aktiv für die in-vivo- und ex-vivo-Bildgebung entwickelt. Zusätzlich zu den üblichen Anforderungen an Photolumineszenz(PL)-Sonden (d. h. hohe Extinktion, Emissionsquantenausbeute und Photostabilität) sind auch die spektrale Position und Form der PL-Emission wichtige Parameter, die berücksichtigt werden müssen. Da bekannt ist, dass die Lichtschwächung durch biologisches Gewebe im Nahinfrarot (NIR)-Spektralbereich (~ 700–950 nm) geringer ist als im sichtbaren Spektralbereich, ist die Existenz des NIR-Transparenzfensters für biologisches Gewebe (~ 700– 950  nm) wurde eingeführt, und es werden viele Anstrengungen in die Entwicklung und Anwendung der NIR-emittierenden Sonden investiert [3,4,5,6]. Darüber hinaus führten jüngste Fortschritte zur Einführung des zweiten und dritten NIR-Fensters (NIR-II und NIR-III) im Spektralbereich von ~ 1000–1700 nm, der oft als kurzwelliges Infrarot (SWIR) bezeichnet wird, insbesondere von Hersteller im sich schnell entwickelnden Bereich der Infrarot-Bildgebung [7,8,9]. Trotz höherer Wasserabsorption im SWIR-Bereich im Vergleich zum herkömmlichen NIR-Fenster ermöglichen eine geringere Autofluoreszenz und Streuung von biologischem Gewebe eine überlegene Bildauflösung und eine höhere Bildtiefe bei der SWIR-PL-Biobildgebung [10,11,12]. Bei der SWIR-PL-Bildgebung von Lymph- und Hirngefäßen mit dem neuartigen SWIR-Fluoreszenzfarbstoff CH1055-PEG beispielsweise zeigten sich Auflösung und Signal-Hintergrund-Verhältnis im Vergleich zur konventionellen NIR-PL-Bildgebung mit dem NIR-I-Fluoreszenzfarbstoff Indocyaningrün . als überlegen [13]. Darüber hinaus ermöglichte die Verwendung der SWIR-emittierenden Nanosonden (einwandige Kohlenstoff-Nanoröhrchen) und der SWIR-Bildgebungskamera der Gruppe von Dai die Visualisierung von Gefäßen unter 10 µm in einer Tiefe von>   2 mm in der nicht-invasiven (ohne Kraniotomie) Bildgebung des Gehirns von Mäusen. die für die PL-Bildgebung im sichtbaren oder NIR-I-Bereich nicht zugänglich ist [8].

Organische Farbstoffe und Farbstoffkomplexe mit intensiver Absorption im ersten NIR-Fenster und Fluoreszenz im NIR-II-Fenster könnten als vielversprechende NIR-SWIR-Sonden angesehen werden; es wurde gezeigt, dass sie als außergewöhnliches Kontrastmittel für die Gefäß- und Lymphknotenbildgebung, die Tumorabgrenzung und die bildgeführte Chirurgie dienen [13,14,15,16]. Es ist erwähnenswert, dass der organische Farbstoff Indocyaningrün (ICG) das einzige NIR-Fluoreszenzkontrastmittel ist, das derzeit von der US-amerikanischen Food and Drugs Administration für die Anwendung beim Menschen zugelassen ist [17]. Gleichzeitig weisen molekulare Bildgebungssonden (dh Farbstoffe oder Farbstoffkomplexe) Beschränkungen auf, die mit der Notwendigkeit verbunden sind, ihre molekulare Struktur zu modifizieren, um ihre Biosondeneigenschaften (zB Wasserlöslichkeit, Zellpermeabilität usw.) zu ändern oder sie mit anderen Bildgebungs- oder gezielte Modalitäten. Im Gegensatz dazu kann die Oberfläche von Nanopartikeln (NPs) mit PL-Zentren kovalent mit verschiedenen Einheiten modifiziert werden, um eine verbesserte Wasserdispergierbarkeit und -stabilität, kontrollierte Oberflächenladung oder Targeting-Zwecke zu erreichen. Darüber hinaus ermöglicht die Einführung von NIR-SWIR PL-Nanoplattformen die Kombination der PL-Bildgebung mit anderen bildgebenden, diagnostischen oder therapeutischen Modalitäten. Jüngste Studien berichten von tiefen Gewebe-, Ganzkörper-, Tumor- oder transkraniellen Bildgebungen mit SWIR-emittierenden Nanoformulierungen, die zur Überwachung verschiedener Prozesse in vivo verwendet werden [14, 18, 19, 20, 21]. Unter verschiedenen berichteten NIR-SWIR-emittierenden Nanosonden für die In-vivo-Bildgebung können zwei Typen unterschieden werden:NIR-SWIR-Fluoreszenz, die von organischen Einheiten (d. h. konjugiertem Polymer) oder keramischen (z. B. Fluorid) Nanokristallen, die mit Seltenerdionen dotiert sind, stammt. Polymerbasierte Nanopartikel (PNPs) gehören aufgrund ihrer relativ einfachen Synthese und chemischen Funktionalisierung sowie ihrer überlegenen Biokompatibilität und biologischen Abbaubarkeit zu den erfolgreichsten Nanomedikamenten in der klinischen Translation [22]. Wenn sie mit NIR-SWIR-Fluorophoren beladen sind, können PNPs als vielversprechende Bildgebungssonden oder bildgebungsgesteuerte Wirkstofftransportvehikel dienen [23, 24]. Auf der anderen Seite sind ionendotierte Seltenerd-Nanopartikel (RENPs) eine bekannte Klasse von Nanosonden, die einzigartige Photolumineszenzeigenschaften aufweisen, die sowohl durch Aufwärtskonversion (anti-Stokes-verschoben) als auch durch Abwärtskonvertierung (Stokes-verschoben) zugänglich sind [25,26,27,28,29,30]. Kürzlich wurden RENPs für die Verwendung in der NIR-SWIR-Bildgebung übersetzt. Im Gegensatz zu NIR-SWIR-Sonden auf Basis organischer Einheiten besitzen sie eine hohe Quantenausbeute, außergewöhnliche Photostabilität und schmale Emissionsbanden im gesamten NIR-SWIR-Spektralbereich, die durch Dotierung mit verschiedenen Ionen eingestellt werden können [20, 31, 32]. RENPs wurden auf die Gefäß- und Organbildgebung bei Kleintieren, die Tumorerkennung, Multiplex- und Multispektralbildgebung angewendet [3, 19, 20, 33, 34, 35].

Mit der aufkommenden Entwicklung der PL-Biobildgebung kann eine Fähigkeit zur gleichzeitigen Verfolgung mehrerer PL-Einheiten in vivo für verschiedene Zwecke erforderlich sein (z. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wurden Multiplex-Bildgebungsverfahren entwickelt. Multiplexed Imaging bezieht sich auf die Komplementarität von anatomischen und funktionellen Informationen im abgebildeten biologischen System; seine Anwendung kann die Kombination von bildgebenden Biomarkern, Kontrasten und Modalitäten ermöglichen, um den Nutzen der Bildgebung in Forschung und Klinik zu erhöhen [36]. Multiplex-PL-Bildgebung kann die theranostische Dimension der Nanomedizin verbessern und bietet die Möglichkeit, mehrere PL-Bildgebungskontraste zusammen mit therapeutischen Modalitäten einzuführen. Die am häufigsten verwendeten Multiplex-Bildgebungsverfahren unterscheiden PL-Sonden durch die spektrale Position ihrer PL-Emission unter Verwendung geeigneter optischer Filter [37,38,39]. Allerdings erfordert ein geeignetes Multiplexing in einem solchen Ansatz die Verwendung von Nanosonden mit spektral schmalen, nicht überlappenden PL-Spektren. In dieser Hinsicht ist die Hyperspektralbildgebung (HSI) in Kombination mit spektralen Mischanalysealgorithmen ein vielversprechendes Werkzeug für das PL-Multiplexing. Biomedizinische Anwendungen von PL HSI sind jedoch meist auf die Fluoreszenzmikroskopie beschränkt, um verschiedene Arten von Nanosonden zu multiplexen und Hintergrund und Autofluoreszenz zu eliminieren [40, 41]. In Bezug auf In-vivo-HSI wird es am häufigsten im Reflexions-Bildgebungsmodus durch Aufnahme und sequentielle Analyse der Gewebereflexionsspektren verwendet [42], obwohl über HSI-Bildgebung in vivo (auch als multispektrale Bildgebung bezeichnet) auch für PL im sichtbaren Bereich berichtet wurde und NIR-Bereiche [3, 5]. In der Literatur konnten jedoch keine Berichte über HSI von SWIR-emittierenden Nanosonden gefunden werden.

Vor kurzem haben wir über die Entwicklung eines bandsequentiellen HSI-Systems in Kombination mit einer Software zur spektralen Entmischung für die SWIR-PL-Bildgebung berichtet [43]. Das bandsequentielle HSI-Verfahren basierte auf der konsekutiven Erfassung von 2D-Bildern durch ein Element mit spektral variierter Durchlässigkeit (d. h. abstimmbares Flüssigkristallfilter, LCTF). Die aus RENPs-Suspensionen gewonnenen SWIR-PL-Daten wurden als dreidimensionaler Spektraldatenwürfel (Hypercube) mit zwei räumlichen und einer spektralen Dimension präsentiert. Eine weitere Anwendung des spektralen Entmischungsverfahrens auf jedes räumliche Pixel des erfassten Hyperwürfels ermöglichte die Berechnung der Häufigkeiten in einer PL-Mischungskomponente. Hier haben wir HSI angewendet, um das Multiplexen von Nanosonden für die in-vivo-SWIR-PL-Biobildgebung zu adressieren. Wir verwendeten zwei Arten von SWIR-emittierenden Nanopartikeln mit Emissionen, die sich spektral überlappen und trotz ihres unterschiedlichen Spektralprofils in einer konventionellen PL-Bildgebung mit optischen Filtern nicht leicht zu unterscheiden sind. Abbildung 1 veranschaulicht das Problem der spektralen Mischung von PL aus diesen Nanopartikeln und den Weg, es durch bandsequentielles Unmixing mit HSI zu überwinden.

Schema zur Veranschaulichung der Anwendung von HSI zum Multiplexen photolumineszenter Nanosonden

Die HSI wurde verwendet, um die spektral selektive und empfindliche PL-Bildgebung für beide Arten von Nanopartikeln zu erhalten. Um die Spektralprofile von SWIR PL zu entmischen, wurde das Entmischungsprotokoll entwickelt, das es uns ermöglicht, eine quantitative und räumliche Abbildung von Komponenten in der Mischung zu erhalten, mit Bestimmung von Intensitätsverteilungen zusätzlich zu Häufigkeiten. Die SWIR HSI-Techniken und das entwickelte Entmischungsprotokoll wurden weiter auf die In-vivo-Bildgebung von Mäusen angewendet, denen subkutan Nanopartikel injiziert wurden, um die Anwendbarkeit von HSI auf die Multiplex-SWIR-PL-Nanosonden in der In-vivo-Bildgebung zu demonstrieren.

Methoden

Vorbereitung und Charakterisierung von Nanoformulierungen

Synthese polymerer Kern-Schale-Nanopartikel, beladen mit organischem fluoreszierendem NIR-SWIR-Farbstoff

Polystyrol (PS)-Poly-N -Isopropylacrylamid (PNIPAM) Kern-Schale-Nanopartikel wurden durch Mikroemulsionspolymerisation synthetisiert, wobei die zuvor beschriebene Methode modifiziert wurde [44, 45]. Zuerst wurden PS-co-PNIPAM (10 Gew.-% PNIPAM) Kern-Nanopartikel wie folgt hergestellt. NIPAM (0,1 µg), Natriumdodecylsulfat SDS (0,1 µg) und 0,005 µg NaH₂ PO₄ × H₂ O wurden in 45 ml H₂ . gelöst O. Styrol (1 µg) wurde tropfenweise unter kräftigem Rühren zugegeben, als die Temperatur auf 60ºC erhöht wurde. Als nächster Schritt wurde Ar 30 min lang in die Mischung gesprudelt, die Temperatur wurde auf 70 °C erhöht und 0,08 g K 2 S₂ O₈ gelöst in 1 ml H₂ O wurde injiziert, um die Polymerisation zu starten. Zweitens wurde die PNIPAM-Schale auf den PS-co-PNIPAM-Kern geschichtet. Zu diesem Zweck wurde dem Reaktor eine wässrige Lösung von Monomer NIPAM (1,8 g) und Vernetzer N . zugegeben ,N ′-Methylenbisacrylamid (BIS) (0,18 g) in 4 ml H₂ O mit einer Spritze. Die Reaktion wurde 4 Stunden lang bei 70 °C weiterlaufen gelassen. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und 74 h unter Verwendung einer Cellulosemembran mit MWCO 3500   Da dialysiert. Als Ergebnis wurde eine Suspension der PS-PNIPAM-Nanopartikel hergestellt; eine Kern-Schale-Struktur der Nanopartikel wird durch die Transmissionselektronenmikroskopie(TEM)-Bilder deutlich sichtbar (Abb. 3a). Um NIR-SWIR-fluoreszierende PNPs zu erhalten, wurde 2-Butyl-6-[5-(2-butyl-1,3-dimethylcyclohepta[c]pyrrol-6(2H)-yliden)penta-1,3-dien -1-yl]-1,3-dimethylcyclohepta[c]pyrroliumtetrafluoroborat (markiert als JB9-08) fluoreszierender Farbstoff [46] wurde nachbeladen [47] auf PS-PNIPAM-Nanopartikel. Acht Mikroliter 1 mM JB9-08 Farbstofflösung in DMF wurden zu 2 ml einer 0,25 Gew.-% PNPs-Wassersuspension gegeben und vor der Verwendung 24 h aufbewahrt.

Synthese von Core-Shell-RENPs

RENPs wurden nach dem anderswo berichteten modifizierten Protokoll synthetisiert [48]. Zuerst das α-NaYF₄ :10 %Yb ³⁺ , 30 % Nd ³⁺ Kern-Nanopartikel wurden durch Zersetzung des Metalltrifluoracetats bei hoher Temperatur hergestellt. In einem typischen Verfahren sind 0,05 mmol Yb₂ O₃ , 0,15 mmol Nd₂ O_3, und 0,25 mmol Y₂ O₃ wurden in einen 250 ml-Kolben gefüllt, der 5 ml entionisiertes Wasser und 5 ml TFA enthielt, und 1 h auf 90 °C erhitzt, um eine klare Lösung zu ergeben. Die resultierende klare Lösung wurde bei dieser Temperatur unter Argonspülung verdampft, um schlammiges pulverisiertes RE(TFA)₃ . zu erhalten . Anschließend wurden 8 ml OA, 8 ml OM, 12 ml ODE und 2 mmol NaTFA in den Kolben gegeben. Die Lösung wurde auf 120°C erhitzt und 30 Minuten bei dieser Temperatur gehalten, gefolgt von einem Erhitzen auf 300°C für 30 Minuten, bevor sie natürlich auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Während des gesamten Syntheseprozesses wurde eine Argonumgebung verwendet. Die resultierenden Nanopartikel wurden durch Zugabe von 20 ml Ethanol in den gekühlten Reaktionskolben ausgefällt. Nach dreimaligem Waschen mit Ethanol in der Zentrifuge wurde das gesammelte weiße Pulver schließlich zur weiteren Verwendung in 10 ml Hexan dispergiert

Zweitens, das α-NaYF₄ :10 %Yb ³⁺ , 30 % Nd ³⁺ @CaF₂ Kern-Schale-RENPs wurden über einen keimvermittelten epitaktischen Wachstumsprozess unter Verwendung von α-NaYF₄ . hergestellt :10 % Yb ³⁺ , x% Nd ³⁺ Kern als Keim und das entsprechende Wachstum in der Schalenvorläuferlösung. Um den Schalenvorläufer herzustellen, wurden zunächst 2 ml CaO mit 5 ml entionisiertem Wasser und 5 ml TFA in einen 250 ml-Kolben gegeben und 1 Stunde auf 90 °C erhitzt, um eine klare Lösung zu erzeugen. Diese Lösung wurde dann bei dieser Temperatur eingedampft, um den Schalenvorläufer von Calciumtrifluoracetat (Ca(TFA)₂ . zu ergeben ). Als nächstes 0,5 mmol NaYF₄ :10 % Yb ³⁺ , 30 % Nd ³⁺ Kern-Nanopartikel, 7 ml OA und 7 ml ODE wurden alle in den Kolben gegeben. Die Lösung wurde dann 30 Minuten lang auf 120°C erhitzt, gefolgt von einem Erhitzen auf 300°C für 60 Minuten, bevor sie auf natürliche Weise abgekühlt wurde. Der gesamte Prozess wurde unter einer Argonumgebung durchgeführt. Die resultierenden Kern-Schale-Nanopartikel wurden durch Zugabe von 20 ml Ethanol in den gekühlten Reaktionskolben ausgefällt. Nach dreimaligem Waschen mit Ethanol in der Zentrifuge wurden die gesammelten Kern-Schale-NPs schließlich in 10 ml Hexan für weitere Verwendungen dispergiert. Zur Herstellung der wässrigen Dispersion wird das vorbereitete α-NaYF₄ :10 %Yb ³⁺ , 30 % Nd ³⁺ @CaF₂ Core-Shell RENPs (5 mL Hexandispersion) wurden zunächst mit 5 mL N . gemischt ,N -Dimethylformamid (DMF)-Lösung von Nitrosoniumtetrafluoroborat (NOBF₄ .) ) (0,1 µM) bei Raumtemperatur. Die Mischung wurde leicht geschüttelt, bis eine RENP-Präzipitation beobachtet wurde. Anschließend wurden Toluol und Hexan (1:1, Volumen) in die Mischung gegeben, die dann bei 10000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert wurde. Der Niederschlag wurde gesammelt und in 5 ml DMF dispergiert. Zweitens wurden 250 mg Poly(acrylsäure) (PAA, MW = 18.000) zu der 5 ml DMF-Lösung von NOBF₄ . gegeben -behandelte RENPs, die auf 80 °C erhitzt und 30 min bei dieser Temperatur unter kräftigem Rühren gehalten wurden. Danach wurden die NPs durch Zugabe von Aceton ausgefällt, mit Ethanol gewaschen und schließlich in destilliertem Wasser dispergiert.

Transmissionselektronenmikroskopie

Die Morphologien von PNPs und RENPs wurden mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bewertet. Um mit TEM abgebildet zu werden, wurden 10 μL Nanopartikelsuspension auf die mit Formvar stabilisierten Kohlenstoffträgerfilme getropft. Um die Kern-Schale-Struktur von PNPs sichtbar zu machen, wurden sie vor dem Auftropfen auf die Trägerfolien mit einer 1%igen wässrigen Lösung von Phosphorwolframsäure negativ gefärbt. Die Kohlenstoffträgerfilme wurden luftgetrocknet und mit 5 µl reinem Wasser gewaschen. Die Bilder wurden durch Betrieb mit einer Beschleunigungsspannung von 100 kV auf einem TEM (JEM-1230, JEOL) erhalten.

Photolumineszenz-Spektroskopie

PL-Spektren für beide Arten von Nanopartikeln wurden im NIR- und SWIR-Bereich unter Verwendung eines Fluorolog-3-Spektrofluorometers, ausgestattet mit einem iHR320-Spektrometer für den NIR-SWIR-Bereich (Horiba); eine bei 808 nm emittierende fasergekoppelte Laserdiode (QSP-808-4, QPhotonics) wurde verwendet, um PL aus PNPs und RENPs anzuregen.

Hyperspektrales Bildgebungssystem

Das selbstgebaute SWIR HSI-System nutzt die bandsequentielle Erfassungsmethode (Abb. 2) und umfasst eine NIR-Kamera (Xeva-1.7-320, Xenics, Belgien), eine Fokussieroptik (TEC-M55MPW, Computar, USA) und einen abstimmbaren Flüssigkristallfilter (Varispec LNIR .). 20-HC-20, PerkinElmer, USA) als dispersives Element. Das System hat eine Auflösung von 340 × 258 Pixel und arbeitet im Spektralbereich von 900–1700 nm. Zu den Beleuchtungsquellen im System gehören eine Glühlampe (zur Bildausrichtung, Fokussierung und Hellfeldabbildung) und eine fasergekoppelte 808-nm-Laserdiode (QSP-808-4, QPhotonics, USA), die mit einer Laserstromquelle (Laser Source 4308 .) betrieben wird , Arroyo Instruments, USA), zur PL-Anregung bei der PL-Bildgebung. Die spektrale Datenwürfelerfassung wurde durch sequentielles Abstimmen der LCTF-Durchlässigkeit einer spektralen Breite von 20 nm im Bereich von 900 bis 1200 nm mit 10-nm-Schritten und Erfassen entsprechender Bilder durchgeführt. Die Belichtungszeit der NIR-Kamera während der HSI-Erfassung wurde auf 200 µms eingestellt. Die Laserleistungsdichte auf der Probe wurde auf ~ 100 mW/cm ² . festgelegt . Für die Aufnahme von PL-Bildern im gesamten NIR-SWIR-Bereich wurde LCTF durch einen 850-nm-Langpassfilter (Edmund Optics, USA) ersetzt.

Schematische Darstellung des hyperspektralen NIR-SWIR-Bildgebungssystems

Spectral Unmixing-Software

Für die Analyse des erhaltenen Spektraldatenwürfels haben wir einen spektralen Unmixing-Algorithmus unter Verwendung der MATLAB-Umgebung entwickelt. Das Spektrum jedes Pixels wird als lineare Mischung bekannter Endelemente betrachtet:\( F\left(\lambda\right)=\sum \limits_i{a}_i{G}_i\left(\lambda\right)\), wo F (λ ) – Pixelspektrum, G _ich — Endgliedspektren und a _ich sind eine Fülle von Endgliedern. Der Zweck der Entmischungssoftware besteht darin, die Häufigkeiten bekannter Endelemente zu schätzen, indem das Problem der linearen Spektralmischungsanalyse (LSMA) in jedem Pixel des erfassten Spektraldatenwürfels gelöst wird. Angenommen, L ist die Anzahl der Spektralbänder und p ist die Anzahl der Endglieder, die in einer Mischung vorhanden sind. Dann kann das LSMA-Problem als F . angegeben werden = Ga + n , wobei F ist L × 1 Vektor der Pixelintensitäten, G ist L × p Matrix mit allen Endmember-Vektoren, a ist p × 1 Vektor unbekannter Häufigkeit und n ist L × 1 Fehlervektor. Die Methode der kleinsten Fehlerquadrate (LSE) zur Lösung des LSMA-Problems kann als folgende Optimierungsaufgabe gebildet werden:min_a {(F − Ga ) ^T (F − Ga )}, und die klassische Lösung ist a (r ) = (G ^T G ) ⁻¹ G ^T F . Eine solche Lösung kann jedoch negative Werte für Häufigkeiten enthalten, die keine physikalische Bedeutung haben. Um dieses Hindernis zu beheben, muss die LSE-Optimierungsaufgabe geändert werden:min_a {(F − Ga ) ^T (F − Ga )}, vorbehaltlich a ≥  0. Um diese Aufgabe zu lösen, verwenden wir einen iterativen Algorithmus, der auf der nicht-negativitätsbeschränkten linearen spektralen Mischungsanalyse (NC-LSMA) basiert und detailliert in [49, 50] beschrieben ist. Nach der Berechnung der Häufigkeiten für jede Komponente werden diese als 2D-Colormap-Graphen abgebildet. Schließlich liefert die Entmischungssoftware Intensitätsbilder der entsprechenden Komponenten, basierend auf den erhaltenen Häufigkeiten:\( {I}_i\left(x,y\right)={a}_i\left(x,y\right)\sum \limits_ {\lambda }{G}_i\left(\lambda\right)\), wobei I _ich (x , y ) – ganzzahlige Intensität von i -th Endmember in Pixel und a _ich (x , y )—ich -th Überfluss.

Tierversuche

Die BALB/c Nacktmäuse (Quelle:The Jackson Laboratory, USA) wurden unter dunklen und aseptischen Bedingungen in einer Kleintieranlage gezüchtet. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Kriterien der National Regulation of China for Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt. Vor der Bildgebung wurden männliche Nacktmäuse (6  Wochen alt, 20 ± 2 g) mit 5% Chloralhydrat (0,06 ml pro Gramm Mäusegewicht) durch intraperitoneale Injektion anästhesiert. Für die SWIR-PL-Bildgebung in vivo wurden Nanopartikel in 10x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendiert und 100 µl jeder PBS-Suspension von PNPs, RENPs oder deren Mischung wurden den Mäusen subkutan injiziert.

Ergebnisse und Diskussion

Zwei Arten von SWIR-photolumineszenten NPs wurden für die Verwendung in HSI hergestellt:(1) PNPs, die mit JB9-08-Farbstoff nachbeladen wurden, der in wässrigen Lösungen praktisch nicht fluoresziert [46], aber, wie von uns gezeigt [51], wiederherstellt seine Fluoreszenz in Wasser durch Nachladung in die Polymermatrix von PNPs (Abb. 3a und b) und (2) PAA-beschichtetes NaYF₄ :10%Yb ³⁺ ,30 %Nd ³⁺ @CaF₂ Kern-Schale-Seltenerd-Ionen-dotierte Nanopartikel (RENPs, Abb. 3c und d). Nd ³⁺ Ionen im Kern von RENPs können mit ~ 808 nm Licht ( ⁴ I_9/2 →  ⁴ F_5/2 Übergang) und übertragen Energie auf Yb ³⁺ Ionen, die im Bereich von 950–1100 nm emittieren mit einem Peak bei ~ 975 nm ( ² F_5/2 →  ² F_7/2 Überleitung). RENPs Kern wurde mit inertem CaF₂ . beschichtet Schale, um nichtstrahlende Verluste durch Oberflächendefekte und Wechselwirkung mit der Umgebung zu reduzieren [48]. Beide Nanoformulierungen zeigen Photolumineszenz im 900–1200-Bereich bei 808 nm Anregung (Abb. 3e).

Charakterisierung von PNPs und RENPs. TEM-Bild (a ) und schematische Struktur (b ) von mit JB9-08-Farbstoff beladenen PNPs. TEM-Bild (c ) und schematische Struktur (d ) von RENPs. e Normalisierte PL-Emissionsspektren von PNPs-JB9-08- und RENPs-Suspensionen unter 808 nm-Anregung. Maßstabsbalken, 100 nm

Es sollte beachtet werden, dass PL-Emissionsspektren der Nanopartikel, die mit einem Spektrofluorometer erhalten wurden, aus zwei Gründen nicht als Endelemente in einer Software zur spektralen Entmischung verwendet werden können. Erstens wird die Empfindlichkeit des HSI-Systems im Gegensatz zu herkömmlichen Spektrofluorometern nicht spektral korrigiert, so dass das erfasste Emissionsspektralprofil für zwei Erfassungsverfahren unterschiedlich ist. Zweitens werden HSI-Frames mit 10 nm-Schritten gesammelt, obwohl die spektrale Bandbreite von LCTF 20 nm beträgt. Dies führt dazu, dass das Signal in benachbarten Frames überlappt, was eine Verzerrung des erhaltenen Spektralprofils im Vergleich zu dem mit einem Spektrofluorometer gemessenen verursacht. Um diese Hindernisse zu überwinden, wurden Endelemente (spektrale Profile von PNPs und RENPs Proben) mit dem HSI-System erfasst. Zu diesem Zweck wurden beide Arten von Nanosonden in PBS suspendiert und ihre PBS-Suspensionen wurden in Mikrozentrifugenröhrchen gegeben (Abb. 4a). Mit konventioneller PL-Bildgebung ist es kaum möglich, zwei Proben zu unterscheiden, da sich deren PL-Emissionsspektren überlappen (Abb. 4b und 3e). Unter Verwendung des HSI-Systems wurden 31 PL-Bilder in einem Spektralbereich von 900 bis 1200 nm mit 10-nm-Schritten aufgenommen (Abb. 4c). Spektralprofile von PNPs, RENPs und Hintergrund (BG) wurden durch die spektrale Dimension des Spektraldatenwürfels berechnet, indem das Signal in den durch rote, blaue und grüne Quadrate markierten Bereichen entsprechend gemittelt wurde (Abb. 4b). Die erhaltenen Spektralprofile für PNPs und RENPs (Abb. 4d) waren ähnlich denen, die mit einem Spektrofluorometer gemessen wurden, und wurden später als Endelemente für die spektrale Entmischung verwendet. Danach werden mit PNPs, RENPs und BG-Spektralprofilen als Endelemente die entsprechenden Komponentenhäufigkeiten berechnet und als 2D-Colormap-Plots kartiert (Abb. 4e). Die Häufigkeiten wurden für jedes räumliche Pixel des Hyperwürfels berechnet und als Wert von 0 bis 1 dargestellt, wobei 0 und 1 die vollständige Abwesenheit bzw. die vollständige Häufigkeit der Komponente anzeigen. Die Summe der Häufigkeiten aller Komponenten in jedem Pixel ist gleich 1. Es sollte beachtet werden, dass die Entmischungssoftware die Schwellenwertbildung nach der Intensität des Signals verwendet, um Fehler zu beseitigen, die durch Pixel geringer Intensität verursacht werden. Wenn die maximale Intensität eines Pixels entlang der spektralen Dimension weniger als 5% des Maximums des gesamten Hyperwürfels betrug, wurde ein solches Pixel als vollständig mit Rauschkomponenten gefüllt betrachtet. Darüber hinaus wurden integrale Intensitätsbilder von PNPs und RENPs unter Berücksichtigung entsprechender Häufigkeiten und unter Eliminierung der Hintergrundkomponente berechnet (Abb. 4f). Erwartungsgemäß zeigen sowohl die Häufigkeitskartierung als auch die integralen Intensitätsbilder die volle Häufigkeit von PNPs in der rechten Röhre und RENPs in der linken Röhre, mit leichten Fehlern, die durch die PL-Emissionsstreuung und Unvollkommenheit des Entmischungsalgorithmus verursacht werden.

HSI von Mikrozentrifugenröhrchen mit RENPs und PNPs. a Hellfeldaufnahme von Mikrozentrifugenröhrchen mit in PBS suspendierten PNPs und RENPs. b PL-Bild von PNPs- und RENPs-Proben, die mit 808 nm angeregt wurden (für die Bildaufnahme wurde ein 850-nm-Langpassfilter verwendet). c Schema zur Veranschaulichung eines Hyperwürfels bestehend aus HSI-Frames. d Spektralprofile von PNPs, RENPs und Hintergrund (BG), gemittelt aus ROI, gezeigt in b entsprechend als rote, blaue und grüne Quadrate. e Farbkarten von Komponentenhäufigkeiten. f Rekonstruierte Intensitätsbilder der PL-Komponenten und PL/Hellfeld-zusammengeführtes Bild

Die spektrale Entmischung ist auch in der Lage, die Mischung von PNPs, RENPs zu unterscheiden. Um dies zu demonstrieren, wurden drei Mikrozentrifugenröhrchen mit Lösungen von PNPs, RENPs und deren Mischung gefüllt. Nach der Erfassung des Hyperwürfels und des spektralen Entmischungsverfahrens zeigt die Häufigkeitskartierung das vollständige Vorhandensein von PNPs im ersten Mikrozentrifugenröhrchen, RENPs im zweiten und einer Mischung der beiden im dritten (Abb. 5a). Weiterhin wurde eine Rekonstruktion von Intensitätsbildern durchgeführt, um die Intensitätsverteilung der PNPs- und RENPs-PL-Signale in der Probe aufzuzeigen (Abb. 5b).

HSI von Mikrozentrifugenröhrchen mit (von links nach rechts) RENPs, PNPs und einer Mischung aus beiden. a Fülle von PNPs, RENPs und Hintergrund (BG). b Rekonstruierte PL-Intensitätsbilder und PL/Hellfeld-zusammengeführtes Bild

Wir haben weiterhin die Anwendbarkeit unserer HIS-Methode demonstriert, um die spektral überlappten Nanosonden in der SWIR-PL-Bildgebung in vivo zu multiplexen. Nackte Mäuse wurden anästhesiert und ihnen wurden PNPs, RENPs und eine Mischung der beiden subkutan injiziert. Die NIR-Bildgebung mit einem 850-nm-Langpassfilter zeigt drei nicht unterscheidbare photolumineszierende Flecken (Abb. 6a). Nach Durchführung von HSI und Analyse zeigt die Häufigkeitskartierung die vollständigen Häufigkeiten von PNPs und RENPs an der oberen bzw. unteren Injektionsstelle, während eine Mischung von zwei an der linken Injektionsstelle identifiziert wurde ( 6b ). Außerdem wurde zur Erfassung der PL-Intensitätsverteilung eine Intensitätsrekonstruktion durchgeführt (Abb. 6c). Durch Einstellen des Schwellenwerts in der Entmischungssoftware auf 15% (empirisch geschätzt) wurde es möglich, Rauschen in Bereichen neben Emissionspunkten zu entfernen (Abb. 6d). Diese Ergebnisse zeigen, dass HSI im Gegensatz zur herkömmlichen PL-Bildgebungsmodalität, die optische Lang- oder Bandpassfilter verwendet, nicht nur die Intensitätsverteilung in der Probe abbilden kann, sondern auch die in der Mischung vorhandenen Komponenten multiplexen kann, indem das spektrale Intensitätsprofil in identifiziert wird jedes Pixel des Bildes.

HSI von Mäusen, denen PNPs (oben rechts Injektionsstelle), RENPs (unten rechts) und RENPs/PNPs-Gemisch (links) subkutan injiziert wurden. a Hellfeld (SWIR), SWIR PL und zusammengeführte Bilder, die mit einem 850-nm-Langpass-Emissionsfilter aufgenommen wurden. b Fülle von PNPs, RENPs und Hintergrund (BG). c Entsprechende rekonstruierte Intensitätsbilder. d PL-Intensitätsbilder, rekonstruiert aus Häufigkeiten mit einem Schwellenwert von 15% und PL/Hellfeld-zusammengeführtes Bild.

Daher wurde in dieser Arbeit die Kombination aus HSI-Erfassung und spektraler Entmischungsverarbeitung angewendet, um eine Multiplex-Abbildung der spektral überlappenden SWIR-PL-Nanosonden zu erhalten. Im Hinblick auf die Anwendbarkeit der HSI-Modalität sollten jedoch einige Aspekte berücksichtigt werden. First, due to the spectrally narrow acquisition, every HSI frame deals with relatively low signal intensity (especially in the case of the spectrally broad PL emission form the organic moieties). In addition, an increase in the PL exciting laser power in biological imaging is limited by danger of tissue damage (or phototoxicity). This results in higher requirements for the brightness of the PL probes and their photostability, as HSI can require order of magnitude longer acquisition time in comparison with conventional PL imaging. It should also be noted that the linear mixture analysis and spectral unmixing algorithm can work satisfactorily for multiplexed PL imaging of biological tissues in the spectral range where tissue transmittance does not change much. In contrast, if tissue transmittance has distinctive features in the spectral range of HSI, linear spectral mixture model may be hardly applicable (especially in case of deeper tissues) and nonlinear models can be considered.

Schlussfolgerungen

In conclusion, we developed a hyperspectral SWIR bioimaging technique and applied it for multiplexing of nanoparticles emitting in SWIR spectral range. Two types of nanoparticles with overlapping PL spectra, which are undistinguishable in conventional imaging, were successfully multiplexed by their PL spectral profiles using hyperspectral acquisition along with the linear spectral mixture analysis algorithm. The developed method was successfully employed for multiplexed imaging of SWIR PL nanoparticles both in sample suspensions and injected in small animals. With SWIR bioimaging having superior resolution at higher imaging depth, SWIR HSI approach holds a great potential for use in various applications requiring multiplexed imaging with NIR-SWIR PL nanoprobes. Furthermore, as SWIR bioimaging is at a very early stage, there is plenty of room for the development of biomedical applications of PL probes in a combination with HSI.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

Abkürzungen

BG:

Background

HSI:

Hyperspectral imaging

LCTF:

Liquid crystal tunable filter

NIR:

Near-infrared

NPs:

Nanopartikel

PL:

Photolumineszenz

PNIPAM:

Poly-N -isopropylacrylamide

PNPs:

Polymeric nanoparticles

PS:

Polystyrol

RENPs:

Rare-earth doped fluoride nanoparticles

SWIR:

Short-wave infrared

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie