Fortgeschrittene hyperspektrale Bildgebung für multiplexen Nachweis von Kurzwelligen Infrarot-Nanoproben in biologischen Systemen

Zusammenfassung

Die optische Biobildgebung mit exogenen Luminophoren, die im kurzwelligen Infrarot-Spektralbereich (SWIR, ~ 1000–1700 nm) emittieren, ist ein sich rasant entwickelndes Feld. Kürzlich wurde die Entwicklung mehrerer SWIR-photolumineszierender Nanoproben berichtet. In diesem Zusammenhang ist die hyperspektrale Bildgebung (HSI), kombiniert mit Entmischungsalgorithmen, ein vielversprechendes Werkzeug, das ein effizientes Multiplexing der SWIR-emittierenden Nanoagenten durch ihre Photolumineszenz (PL)-Spektralprofile ermöglicht. Die hier vorgestellte SWIR-HSI-Technik wurde entwickelt, um zwei Arten von Nanoproben zu multiplexen: polymere Nanopartikel, die mit organischem Farbstoff dotiert sind (PNPs), und seltene-erd-dotierte Fluorid-Nanopartikel (RENPs). Beide Arten von Nanoproben weisen PL im selben Spektralbereich (~ 900–1200 nm) auf, was eine spektrale Trennung der PL mit optischen Filtern erschwert und die Möglichkeiten für ihre multiplexe Bildgebung in biologischen Geweben begrenzt. Durch die Anwendung von SWIR-HSI nutzten wir Unterschiede in den PL-Spektralprofilen aus und erreichten eine spektral selektive und empfindliche Bildgebung des PL-Signals jeder Nanopartikelart. Die Entmischung der erfassten Daten ermöglichte das Multiplexing der spektral überlappenden Nanoproben anhand ihres PL-Profils. Sowohl quantitative als auch räumliche Verteilungen für jede Nanopartikelart wurden aus ihren gemischten Suspensionen gewonnen. Schließlich wurde die SWIR-HSI-Technik mit dem Entmischungsprotokoll auf die in-vivo-Bildgebung von Mäusen angewendet, die subkutan mit PNPs und RENPs injiziert wurden. Die Anwendbarkeit hyperspektraler Techniken zum Multiplexen von Nanoproben in der in-vivo-Bildgebung wurde erfolgreich demonstriert.

Einleitung

Biomedizinische Bildgebungstechnologien haben sich in den letzten Jahrzehnten rasant entwickelt und ermöglichen die Früherkennung und Beurteilung verschiedener Krankheiten und Pathologien. Unter den verschiedenen Bildgebungsmodalitäten nimmt die optische Bildgebung aufgrund ihrer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung und der relativ geringen Kosten eine einzigartige Stellung ein. Mehrere auf Photolumineszenz (oder spezifischer Fluoreszenz) basierende optische Bildgebungsansätze befinden sich in der Entwicklung und klinischen Translation. Beispielsweise haben die Bildgebung des Lymphsystems und die fluoreszenzgestützte intraoperative Chirurgie vielversprechende Ergebnisse zur Verbesserung der Gesundheitsversorgung gezeigt [1, 2]. Andererseits werden exogene photolumineszente Sonden, die spezifische Interessensregionen (z. B. Tumore) anvisieren, aktiv für in-vivo- und ex-vivo-Bildgebung entwickelt. Neben den üblichen Anforderungen an PL-Sonden (hohe Absorption, Emissionsquantenausbeute und Photostabilität) sind auch die spektrale Position und Form der PL-Emission entscheidende Parameter. Da die Lichtabschwächung durch biologische Gewebe im nahen Infrarot (NIR)-Spektralbereich (~ 700–950 nm) geringer ist als im sichtbaren Bereich, wurde ein NIR-Transparenzfenster für biologische Gewebe (~ 700–950 nm) eingeführt, und es werden große Anstrengungen in die Entwicklung und Anwendung von NIR-emittierenden Sonden investiert [3,4,5,6]. Darüber hinaus führten jüngste Fortschritte zur Einführung der zweiten und dritten NIR-Fenster (NIR-II und NIR-III) im Spektralbereich von ~ 1000–1700 nm, der oft als kurzwelliges Infrarot (SWIR) bezeichnet wird, insbesondere von Herstellern im sich schnell entwickelnden Bereich der Infrarotbildgebung [7,8,9]. Trotz höherer Wasserabsorption im SWIR-Bereich im Vergleich zum konventionellen NIR-Fenster ermöglichen geringere Autofluoreszenz und Streuung biologischer Gewebe eine überlegene Bildgebungsauflösung und größere Bildgebungstiefe in der SWIR-PL-Biobildgebung [10,11,12]. So zeigten sich beispielsweise bei der SWIR-PL-Bildgebung von Lymph- und Hirngefäßen mit dem neuartigen SWIR-Fluoreszenzfarbstoff CH1055-PEG Auflösung und Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis im Vergleich zur konventionellen NIR-PL-Bildgebung mit dem NIR-I-Farbstoff Indocyaningrün als überlegen [13]. Zudem ermöglichte die Verwendung von SWIR-emittierenden Nanoproben (eindimensionalen Kohlenstoffnanoröhren) und einer SWIR-Bildgebungskamera der Gruppe von Dai die Visualisierung von sub-10-µm-Gefäßen in einer Tiefe von > 2 mm bei nicht-invasiver (ohne Kraniotomie) Bildgebung der zerebrovaskulären Strukturen von Mäusen, was für die PL-Bildgebung im sichtbaren oder NIR-I-Bereich unerreichbar ist [8].

Organische Farbstoffe und Farbstoffkomplexe mit intensiver Absorption im ersten NIR-Fenster und Fluoreszenz im NIR-II-Fenster können als vielversprechende NIR-SWIR-Sonden betrachtet werden; sie erwiesen sich als außergewöhnliche Kontrastmittel für Gefäß- und Lymphknotenbildgebung, Tumordelineation und bildgeführte Chirurgie [13,14,15,16]. Es ist erwähnenswert, dass der organische Farbstoff Indocyaningrün (ICG) derzeit das einzige von der US-amerikanischen Food and Drug Administration für die Anwendung am Menschen zugelassene NIR-Fluoreszenz-Kontrastmittel ist [17]. Gleichzeitig weisen molekulare Bildgebungssonden (Farbstoffe oder Farbstoffkomplexe) Einschränkungen auf, die mit der Notwendigkeit verbunden sind, ihre molekulare Struktur zu modifizieren, um ihre Bio-Probe-Eigenschaften (z. B. Wasserlöslichkeit, Zellpermeabilität) zu ändern oder sie mit anderen Bildgebungs- oder Targeting-Modalitäten auszustatten. Im Gegensatz dazu können Nanopartikel (NPs), die PL-Zentren enthalten, ihre Oberfläche kovalent mit verschiedenen Gruppen modifizieren, um verbesserte Wasserdispersibilität und Stabilität, kontrollierte Oberflächenladung oder Targeting-Zwecke zu erreichen. Darüber hinaus ermöglicht die Einführung von NIR-SWIR-PL-Nanoplattformen die Kombination von PL-Bildgebung mit anderen bildgebenden, diagnostischen oder therapeutischen Modalitäten. Jüngste Studien berichten über tiefe Gewebebildgebung, Ganzkörperbildgebung, Tumorbildgebung oder transkranielle Bildgebung mit SWIR-emittierenden Nanoformulierungen zur Überwachung verschiedener Prozesse in vivo [14, 18,19,20,21]. Unter den verschiedenen berichteten NIR-SWIR-emittierenden Nanoproben für die in-vivo-Bildgebung lassen sich zwei Typen unterscheiden: solche mit NIR-SWIR-Fluoreszenz, die von organischen Moieties (z. B. konjugierten Polymeren) oder keramischen (z. B. Fluorid-) Nanokristallen, die mit Seltenen-Erd-Ionen dotiert sind, herrührt. Polymerbasierte Nanopartikel (PNPs) gehören zu den erfolgreichsten Nanomedikamenten in der klinischen Translation, aufgrund der relativen Einfachheit in Synthese und chemischer Funktionalisierung sowie der überlegenen Biokompatibilität und Biologischen Abbaubarkeit [22]. Wenn sie mit NIR-SWIR-Fluorophoren beladen sind, können PNPs als vielversprechende Bildgebungssonden oder bildgeführte Drug-Delivery-Fahrzeuge dienen [23, 24]. Andererseits sind seltene-erd-ionendotierte Nanopartikel (RENPs) eine gut bekannte Klasse von Nanoproben, die einzigartige Photolumineszenzeigenschaften aufweisen, die sowohl durch Upconversion (Anti-Stokes-verschoben) als auch Down-Conversion (Stokes-verschoben) Prozesse zugänglich sind [25,26,27,28,29,30]. Kürzlich wurden RENPs für die NIR-SWIR-Bildgebung übersetzt. Im Gegensatz zu organischen Moieties basierten NIR-SWIR-Sonden besitzen sie hohe Quantenausbeute, außergewöhnliche Photostabilität und schmale Emissionsbänder im gesamten NIR-SWIR-Spektralbereich, die durch Dotierung mit verschiedenen Ionen eingestellt werden können [20, 31, 32]. RENPs wurden für die Bildgebung von Kleintiergefäßen und Organen, Tumordetektion, multiplexe und multispektrale Bildgebung eingesetzt [3, 19, 20, 33,34,35].

Mit der aufkommenden Entwicklung der PL-Biobildgebung kann die Fähigkeit erforderlich sein, mehrere PL-Moieties gleichzeitig in vivo zu verfolgen, für verschiedene Zwecke (z. B. gezielte Bildgebung ausgewählter Zellen oder Organe zusammen mit bildgeführter Medikamentenabgabe). Um dieser Herausforderung zu begegnen, wurden multiplexe Bildgebungsmethoden entwickelt. Multiplexe Bildgebung bezieht sich auf die Komplementarität anatomischer und funktionaler Informationen im abgebildeten biologischen System; ihre Anwendung kann die Kombination von Bildgebungs-Biomarkern, Kontrasten und Modalitäten ermöglichen, um den Nutzen der Bildgebung in Forschung und klinischen Anwendungen zu erhöhen [36]. Multiplexe PL-Bildgebung kann die theranostische Dimension der Nanomedizin erweitern, indem sie die Fähigkeit bietet, mehrere PL-Bildgebungskontraste zusammen mit therapeutischer Modalität einzuführen. Die am häufigsten verwendeten multiplexen Bildgebungsmethoden unterscheiden PL-Sonden anhand der spektralen Position ihrer PL-Emission, wobei geeignete optische Filter eingesetzt werden [37,38,39]. Ein ordnungsgemäßes Multiplexing in einem solchen Ansatz erfordert jedoch die Verwendung von Nanoproben mit spektral schmalen, nicht überlappenden PL-Spektren. In diesem Zusammenhang ist die hyperspektrale Bildgebung (HSI) in Kombination mit spektralen Mischungsanalyse-Algorithmen ein vielversprechendes Werkzeug für das PL-Multiplexing. Biomedizinische Anwendungen von PL-HSI sind jedoch größtenteils auf Fluoreszenzmikroskopie beschränkt, um verschiedene Arten von Nanoproben zu multiplexen und Hintergrund und Autofluoreszenz zu eliminieren [40, 41]. Bezüglich in-vivo-HSI wird diese am häufigsten im Reflexionsbildgebungsmodus durch Erfassung und sequenzielle Analyse der Gewebereflexionsspektren verwendet [42], obwohl HSI-Bildgebung in vivo (auch als multispektrale Bildgebung bezeichnet) auch für PL im sichtbaren und NIR-Bereich berichtet wurde [3, 5]. In der Literatur konnten jedoch keine Berichte über HSI von SWIR-emittierenden Nanoproben gefunden werden.

Kürzlich haben wir die Entwicklung eines bandsequentiellen HSI-Systems in Kombination mit spektraler Entmischungssoftware für SWIR-PL-Bildgebung berichtet [43]. Das bandsequenzielle HSI-Verfahren basierte auf der aufeinanderfolgenden Erfassung von 2D-Bildern durch ein Element mit spektral variabler Transmission (d. h. einem flüssigkristallinen abstimmbaren Filter, LCTF). Die SWIR-PL-Daten, die von RENP-Suspensionen gewonnen wurden, wurden als dreidimensionaler spektraler Datenwürfel (Hyperwürfel) dargestellt, der zwei räumliche und eine spektrale Dimension umfasst. Die weitere Anwendung eines spektralen Entmischungsverfahrens auf jeden räumlichen Pixel des erfassten Hyperwürfels ermöglichte die Berechnung der Anteile in einer PL-Mischungskomponente. Hier wendeten wir HSI an, um das Multiplexing von Nanoproben für die in-vivo-SWIR-PL-Biobildgebung zu adressieren. Wir verwendeten zwei Arten von SWIR-emittierenden Nanopartikeln mit Emissionen, die spektral überlappen und in der konventionellen PL-Bildgebung mit optischen Filtern nicht leicht unterschieden werden können, obwohl sie unterschiedliche spektrale Profile aufweisen. Abbildung 1 veranschaulicht das Problem der spektralen Mischung der PL dieser Nanopartikel und den Weg, es durch bandsequenzielle Entmischung mit HSI zu überwinden.

Schema zur Veranschaulichung der Anwendung von HSI zum Multiplexing photolumineszierender Nanoproben

Die HSI wurde angewendet, um die spektral selektive und empfindliche PL-Bildgebung für beide Nanopartikelarten zu erhalten. Zum Entmischen der SWIR-PL-Spektralprofile wurde ein Entmischungsprotokoll entwickelt, das es uns ermöglichte, quantitative und räumliche Abbildungen der Komponenten in der Mischung zu erhalten, einschließlich der Bestimmung von Intensitätsverteilungen zusätzlich zu den Anteilen. Die SWIR-HSI-Techniken und das entwickelte Entmischungsprotokoll wurden weiter auf die in-vivo-Bildgebung von Mäusen angewendet, die subkutan mit Nanopartikeln injiziert wurden, um die Anwendbarkeit von HSI zum Multiplexen von SWIR-PL-Nanoproben in der in-vivo-Bildgebung zu demonstrieren.

Methoden

Nanoformulierungspräparation und Charakterisierung

Synthese von Polymeren Kern-Schale-Nanopartikeln, beladen mit organischem fluoreszierendem NIR-SWIR-Farbstoff

Polystyrol (PS)-poly-N-isopropylacrylamid (PNIPAM) Kern-Schale-Nanopartikel wurden durch Mikroemulsionspolymerisation synthetisiert, mit Modifikation der zuvor beschriebenen Methode [44, 45]. Zunächst wurden PS-co-PNIPAM (10 Gew.-% PNIPAM) Kernnanopartikel wie folgt hergestellt. NIPAM (0,1 g), Natriumdodecylsulfat SDS (0,1 g) und 0,005 g NaH₂PO₄ × H₂O wurden in 45 ml H₂O gelöst. Styrol (1 g) wurde bei starkem Rühren tropfenweise zugesetzt, als die Temperatur auf 60 °C erhöht wurde. Als nächster Schritt wurde Ar 30 Min in das Gemisch eingeleitet, die Temperatur auf 70 °C erhöht und 0,08 g K₂S₂O₈, gelöst in 1 ml H₂O, injiziert, um die Polymerisation zu initiieren. Zweitens wurde die PNIPAM-Schale auf den PS-co-PNIPAM-Kern aufgeschichtet. Dazu wurde dem Reaktor eine wässrige Lösung des Monomers NIPAM (1,8 g) und des Vernetzers N,N′-methylenbisacrylamid (BIS) (0,18 g) in 4 ml H₂O mittels einer Spritze zugegeben. Die Reaktion wurde 4 h bei 70 °C fortgesetzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und 74 h mit einer Zellulosemembran (MWCO 3500 Da) dialysiert. Als Ergebnis wurde eine Suspension der PS-PNIPAM-Nanopartikel hergestellt; eine Kern-Schale-Struktur der Nanopartikel wird durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) eindeutig sichtbar (Abb. 3a). Um NIR-SWIR-fluoreszierende PNPs zu erhalten, wurde 2-butyl-6-[5-(2-butyl-1,3-dimethylcyclo-hepta[c]pyrrol-6(2H)-yliden)penta-1,3-dien-1-yl]-1,3-dimethylcyclohepta[c]pyrrolium tetrafluoroborat (bezeichnet als JB9-08) Fluoreszenzfarbstoff [46] nachträglich [47] in die PS-PNIPAM-Nanopartikel eingebracht. Acht Mikroliter einer 1 mM JB9-08-Farbstofflösung in DMF wurden zu 2 ml einer 0,25 Gew.-% PNP-Wassersuspension gegeben und 24 h vor Gebrauch belassen.

Synthese von Kern-Schale-RENPs

RENPs wurden gemäß einem modifizierten Protokoll synthetisiert, das an anderer Stelle berichtet wurde [48]. Zunächst wurden α-NaYF₄: 10% Yb³⁺, 30% Nd³⁺ Kernnanopartikel durch Zersetzung von Metalltrifluoracetat bei hoher Temperatur hergestellt. In einem typischen Verfahren wurden 0,05 mmol Yb₂O₃, 0,15 mmol Nd₂O₃ und 0,25 mmol Y₂O₃ in einen 250-ml-Kolben mit 5 ml deionisiertem Wasser und 5 ml TFA geladen und 1 h auf 90 °C erhitzt, um eine klare Lösung zu erhalten. Die resultierende klare Lösung wurde bei dieser Temperatur unter Argon-Spülung eingedampft, um ein schlammiges Pulver RE(TFA)₃ zu erhalten. Anschließend wurden 8 ml OA, 8 ml OM, 12 ml ODE und 2 mmol NaTFA in den Kolben gegeben. Die Lösung wurde auf 120 °C erhitzt und 30 min bei dieser Temperatur gehalten, gefolgt von Erhitzen auf 300 °C für 30 min vor natürlichem Abkühlen auf Raumtemperatur. Eine Argon-Umgebung wurde während des gesamten Syntheseprozesses angewendet. Die resultierenden Nanopartikel wurden durch Zugabe von 20 ml Ethanol zum abgekühlten Reaktionskolben gefällt. Nach zentrifugalem Waschen mit Ethanol für drei Mal wurde das gesammelte weiße Pulver schließlich in 10 ml Hexan zur weiteren Verwendung dispergiert.

Zweitens wurden α-NaYF₄: 10% Yb³⁺, 30% Nd³⁺@CaF₂ Kern-Schale-RENPs über einen keimvermittelten epitaktischen Wachstumsprozess hergestellt, der die Verwendung von α-NaYF₄: 10% Yb³⁺, x% Nd³⁺ Kern als Keim und das entsprechende Wachstum in der Schalen-Vorläuferlösung beinhaltet. Zur Herstellung des Schalen-Vorläufers wurden zunächst 2 mmol CaO mit 5 ml deionisiertem Wasser und 5 ml TFA in einen 250-ml-Kolben gegeben und 1 h auf 90 °C erhitzt, um eine klare Lösung zu produzieren. Diese Lösung wurde dann bei dieser Temperatur eingedampft, um den Schalen-Vorläufer Calciumtrifluoracetat (Ca(TFA)₂) zu erhalten. Als Nächstes wurden 0,5 mmol NaYF₄: 10% Yb³⁺, 30% Nd³⁺ Kernnanopartikel, 7 ml OA und 7 ml ODE alle in den Kolben gegeben. Die Lösung wurde dann auf 120 °C für 30 min erhitzt, gefolgt von Erhitzen auf 300 °C für 60 min vor natürlichem Abkühlen. Der gesamte Prozess wurde unter einer Argon-Umgebung durchgeführt. Die resultierenden Kern-Schale-Nanopartikel wurden durch Zugabe von 20 ml Ethanol zum abgekühlten Reaktionskolben gefällt. Nach zentrifugalem Waschen mit Ethanol für drei Mal wurden die gesammelten Kern-Schale-NPs schließlich in 10 ml Hexan zur weiteren Verwendung dispergiert. Zur Herstellung der wässrigen Dispersion wurden die hergestellten α-NaYF₄: 10% Yb³⁺, 30% Nd³⁺@CaF₂ Kern-Schale-RENPs (5 ml Hexan-Dispersion) zunächst mit 5 ml N,N-Dimethylformamid (DMF)-Lösung von Nitrosoniumtetrafluoroborat (NOBF₄) (0,1 M) bei Raumtemperatur gemischt. Ein sanftes Schütteln wurde auf das Gemisch angewendet, bis eine Fällung der RENPs beobachtet wurde. Anschließend wurden Toluol und Hexan (1:1, Volumen) in das Gemisch gegeben, welches dann 10 min bei 10000 U/min zentrifugiert wurde. Der Niederschlag wurde gesammelt und in 5 ml DMF dispergiert. Zweitens wurden 250 mg Poly(acrylsäure) (PAA, MW = 18.000) zu der 5 ml DMF-Lösung der NOBF₄-behandelten RENPs gegeben, welche auf 80 °C erhitzt und 30 min unter starkem Rühren bei dieser Temperatur gehalten wurde. Danach wurden die NPs durch Zugabe von Aceton gefällt, mit Ethanol gewaschen und schließlich in destilliertem Wasser dispergiert.

Transmissionselektronenmikroskopie

Die Morphologien von PNPs und RENPs wurden mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht. Für die TEM-Bildgebung wurden 10 µl der Nanopartikelsuspension auf Kohlenstoffträgerfilme, stabilisiert mit Formvar, aufgetropft. Um die Kern-Schale-Struktur der PNPs sichtbar zu machen, wurden diese vor dem Aufbringen auf die Trägerfilme mit 1%iger wässriger Phosphowolfram säure negativ kontrastiert. Die Kohlenstoffträgerfilme wurden an der Luft getrocknet und mit 5 µl reinem Wasser gewaschen. Die Bilder wurden bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV an einem TEM (JEM-1230, JEOL) aufgenommen.

Photolumineszenzspektroskopie

PL-Spektren für beide Nanopartikelarten wurden im NIR- und SWIR-Bereich mit einem Fluorolog-3-Spektrofluorometer, ausgestattet mit einem iHR320-Spektrometer für den NIR-SWIR-Bereich (Horiba), gemessen; eine fasergekoppelte Laserdiode, die bei 808 nm emittiert (QSP-808-4, QPhotonics), wurde zur Anregung der PL von PNPs und RENPs verwendet.

Hyperspektrales Bildgebungssystem

Das eigens entwickelte SWIR-HSI-System nutzt eine bandsequenzielle Erfassungsmethode (Abb. 2) und umfasst eine NIR-Kamera (Xeva-1.7-320, Xenics, Belgien), Fokussieroptik (TEC-M55MPW, Computar, USA) und ein flüssigkristallines abstimmbares Filter (Varispec LNIR 20-HC-20, PerkinElmer, USA) als dispersives Element. Das System hat eine Auflösung von 340 × 258 Pixeln und arbeitet im Spektralbereich von 900–1700 nm. Beleuchtungsquellen im System umfassen eine Glühlampe (für Bildausrichtung, Fokussierung und Hellfeldbildgebung) und eine 808-nm-fasergekoppelte Laserdiode (QSP-808-4, QPhotonics, USA), betrieben mit einer Laserleistungsquelle (Laser Source 4308, Arroyo Instruments, USA), für PL-Anregung in der PL-Bildgebung. Die Erfassung des spektralen Datenwürfels erfolgte durch sequenzielle Abstimmung der LCTF-Transmission von 20 nm spektraler Breite im Bereich von 900 bis 1200 nm mit 10-nm-Schritten und Erfassung der entsprechenden Bilder. Die Belichtungszeit der NIR-Kamera während der HSI-Erfassung wurde auf 200 ms eingestellt. Die Laserleistungsdichte auf der Probe wurde auf ~ 100 mW/cm² festgelegt. Für die Erfassung von PL-Bildern im gesamten NIR-SWIR-Bereich wurde das LCTF durch einen 850-nm-Langpassfilter (Edmund Optics, USA) ersetzt.

Schematisches Diagramm des NIR-SWIR-Hyperspektralen Bildgebungssystems

Spektrale Entmischungssoftware

Zur Analyse des erhaltenen spektralen Datenwürfels entwickelten wir einen spektralen Entmischungsalgorithmus in der MATLAB-Umgebung. Das Spektrum jedes Pixels wird als lineare Mischung bekannter Endmitglieder betrachtet: \( F\left(\lambda \right)=\sum \limits_i{a}_i{G}_i\left(\lambda \right) \), wobei F(λ) das Pixel-Spektrum, G_i die Endmitglieder-Spektren und a_i die Anteile der Endmitglieder sind. Ziel der Entmischungssoftware ist es, die Anteile bekannter Endmitglieder durch Lösung des Problems der linearen spektralen Mischungsanalyse (LSMA) in jedem Pixel des erfassten spektralen Datenwürfels zu schätzen. Angenommen, L ist die Anzahl der spektralen Bänder und p die Anzahl der in einer Mischung vorhandenen Endmitglieder. Dann kann das LSMA-Problem als F = Ga + n formuliert werden, wobei F ein L × 1 Vektor der Pixelintensitäten ist, G eine L × p Matrix, die alle Endmitglieder-Vektoren enthält, a ein p × 1 Vektor der unbekannten Anteile und n ein L × 1 Fehlervektor. Eine auf dem kleinsten-Quadrate-Fehler (LSE) basierende Methode zur Lösung des LSMA-Problems kann als folgende Optimierungsaufgabe formuliert werden: min_a{(F − Ga)^T(F − Ga)}, und die klassische Lösung ist a(r) = (G^TG)⁻¹G^TF. Eine solche Lösung kann jedoch negative Werte für Anteile enthalten, die keine physikalische Bedeutung haben. Um dieses Hindernis zu überwinden, muss die LSE-Optimierungsaufgabe modifiziert werden: min_a{(F − Ga)^T(F − Ga)}, unter der Bedingung a ≥ 0. Zur Lösung dieser Aufgabe nutzen wir einen iterativen Algorithmus, basierend auf der nicht-negativitätsbeschränkten linearen spektralen Mischungsanalyse (NC-LSMA), der in [49, 50] detailliert beschrieben ist. Nach Berechnung der Anteile für jede Komponente werden diese als 2D-Farbmappen graphisch dargestellt. Schließlich liefert die Entmischungssoftware Intensitätsbilder der entsprechenden Komponenten, basierend auf den erhaltenen Anteilen: \( {I}_i\left(x,y\right)={a}_i\left(x,y\right)\sum \limits_{\lambda }{G}_i\left(\lambda \right) \), wobei I_i(x, y) die integrierte Intensität des i-ten Endmitglieds im Pixel und a_i(x, y) der i-te Anteil ist.

Tierexperimente

BALB/c-Nacktmäuse (Quelle: The Jackson Laboratory, USA) wurden unter dunklen und aseptischen Bedingungen in einer Kleintieranlage gezüchtet. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Kriterien der Nationalen Verordnung Chinas für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Vor der Bildgebung wurden männliche Nacktmäuse (6 Wochen alt, 20 ± 2 g) mit 5% Chloralhydrat (0,06 ml pro Gramm Mausgewicht) durch intraperitoneale Injektion betäubt. Für die SWIR-PL-Bildgebung in vivo wurden Nanopartikel in 10x phosphatgepuffertem Salzwasser (PBS) suspendiert und 100 µl jeder PBS-Suspension von PNPs, RENPs oder deren Mischung subkutan in die Mäuse injiziert.

Ergebnisse und Diskussion

Zwei Arten von SWIR-photolumineszierenden NPs wurden für die Verwendung in HSI hergestellt: (1) PNPs, nachträglich mit JB9-08-Farbstoff beladen, der in wässrigen Lösungen praktisch nicht fluoreszierend ist [46], aber, wie von uns gezeigt [51], seine Fluoreszenz in Wasser durch nachträgliches Einladen in die polymere Matrix der PNPs wiedererlangt (Abb. 3a und b) und (2) PAA-beschichtete NaYF₄:10% Yb³⁺, 30% Nd³⁺@CaF₂ Kern-Schale-Seltene-Erd-Ionen-dotierte Nanopartikel (RENPs, Abb. 3c und d). Nd³⁺-Ionen im Kern der RENPs können mit ~ 808 nm Licht angeregt werden (⁴I_9/2 → ⁴F_5/2 Übergang) und Energie an Yb³⁺-Ionen übertragen, die im Bereich 950–1100 nm mit Peak bei ~ 975 nm emittieren (²F_5/2 → ²F_7/2 Übergang). Der RENP-Kern wurde mit einer inerten CaF₂-Schale beschichtet, um nicht-strahlende Verluste durch Oberflächendefekte und Wechselwirkung mit der Umgebung zu reduzieren [48]. Beide Nanoformulierungen zeigen Photolumineszenz im 900–1200-Bereich unter 808 nm Anregung (Abb. 3e).

Charakterisierung von PNPs und RENPs. TEM-Bild (a) und schematische Struktur (b) von PNPs, beladen mit JB9-08-Farbstoff. TEM-Bild (c) und schematische Struktur (d) von RENPs. e Normierte PL-Emissionsspektren von PNPs-JB9-08- und RENP-Suspensionen unter 808 nm Anregung. Maßstäbe: 100 nm

Es sei angemerkt, dass die mit dem Spektrofluorometer erhaltenen PL-Emissionsspektren der Nanopartikel nicht als Endmitglieder in der spektralen Entmischungssoftware verwendet werden können, aus zwei Gründen. Erstens ist die Empfindlichkeit des HSI-Systems nicht spektral korrigiert, im Gegensatz zum konventionellen Spektrofluorometer, sodass das erfasste Emissionsspektralprofil für die beiden Erfassungsmethoden unterschiedlich ist. Zweitens werden HSI-Frames mit 10-nm-Schritten erfasst, obwohl die spektrale Bandbreite des LCTF 20 nm beträgt. Dies führt zu Signalüberlappung in benachbarten Frames und verursacht eine Verzerrung des erhaltenen Spektralprofils im Vergleich zu dem mit dem Spektrofluorometer gemessenen. Um diese Hindernisse zu überwinden, wurden Endmitglieder (Spektralprofile von PNP- und RENP-Proben) mit dem HSI-System erfasst. Zu diesem Zweck wurden beide Arten von Nanoproben in PBS suspendiert und ihre PBS-Suspensionen in Mikrozentrifugenröhrchen platziert (Abb. 4a). Mit konventioneller PL-Bildgebung ist es kaum möglich, die beiden Proben zu unterscheiden, da sich ihre PL-Emissionsspektren überlappen (Abb. 4b und 3e). Mit dem HSI-System wurden 31 PL-Bilder in einem Spektralbereich von 900 bis 1200 nm mit 10-nm-Schritten erfasst (Abb. 4c). Spektralprofile von PNPs, RENPs und Hintergrund (BG) wurden durch die spektrale Dimension des spektralen Datenwürfels berechnet, indem das Signal in den durch rote, blaue und grüne Quadrate markierten Bereichen gemittelt wurde (Abb. 4b). Die erhaltenen Spektralprofile für PNPs und RENPs (Abb. 4d) wiesen Ähnlichkeiten zu denen auf, die mit dem Spektrofluorometer gemessen wurden, und wurden später als Endmitglieder für die spektrale Entmischung verwendet. Anschließend wurden mit PNP-, RENP- und BG-Spektralprofilen als Endmitglieder die entsprechenden Komponentenanhalte berechnet und als 2D-Farbmappen dargestellt (Abb. 4e). Anteile wurden für jeden räumlichen Pixel des Hyperwürfels berechnet und als Werte von 0 bis 1 dargestellt, wobei 0 und 1 das vollständige Fehlen bzw. die vollständige Präsenz der Komponente anzeigen. Die Summe der Anteile aller Komponenten in jedem Pixel beträgt 1. Es sei angemerkt, dass die Entmischungssoftware eine Schwellenwertbildung basierend auf der Signalintensität verwendete, um Fehler durch niedrigintensive Pixel zu eliminieren. Wenn die maximale Intensität eines Pixels entlang der spektralen Dimension weniger als 5% des Maximums des gesamten Hyperwürfels betrug, wurde ein solches Pixel als vollständig mit Rauschen belegt betrachtet. Darüber hinaus wurden Integralintensitätsbilder von PNPs und RENPs unter Berücksichtigung der entsprechenden Anteile und Eliminierung der Hintergrundkomponente berechnet (Abb. 4f). Wie erwartet zeigen sowohl die Anteile-Mapping als auch die Integralintensitätsbilder die vollständige Präsenz von PNPs im rechten Röhrchen und RENPs im linken Röhrchen, mit geringfügigen Fehlern, verursacht durch PL-Emissionsstreuung und Unvollkommenheiten des Entmischungsalgorithmus.

HSI von Mikrozentrifugenröhrchen mit RENPs und PNPs. a Hellfeldbild von Mikrozentrifugenröhrchen mit PNPs und RENPs in PBS suspendiert. b PL-Bild von PNP- und RENP-Proben, angeregt mit 808 nm (850-nm-Langpassfilter wurde für die Bildaufnahme verwendet). c Schema zur Veranschaulichung des aus HSI-Frames zusammengesetzten Hyperwürfels. d Spektralprofile von PNPs, RENPs und Hintergrund (BG), gemittelt aus den in b als rote, blaue und grüne Quadrate markierten ROIs. e Farbmappen der Komponentenanhalte. f Rekonstruierte Intensitätsbilder der PL-Komponenten und PL/Hellfeld-überlagertes Bild

Die spektrale Entmischung kann auch das Gemisch von PNPs und RENPs unterscheiden. Um dies zu demonstrieren, wurden drei Mikrozentrifugenröhrchen mit Lösungen von PNPs, RENPs und deren Gemisch gefüllt. Nach Erfassung des Hyperwürfels und dem spektralen Entmischungsverfahren zeigt das Anteile-Mapping die vollständige Präsenz von PNPs im ersten Mikrozentrifugenröhrchen, RENPs im zweiten und ein Gemisch beider im dritten (Abb. 5a). Die Rekonstruktion von Intensitätsbildern wurde weiter durchgeführt, um die Intensitätsverteilung der PNP- und RENP-PL-Signale im Präparat aufzuzeigen (Abb. 5b).

HSI von Mikrozentrifugenröhrchen mit (links nach rechts) RENPs, PNPs und Gemisch beider. a Anteile von PNPs, RENPs und Hintergrund (BG). b Rekonstruierte PL-Intensitätsbilder und PL/Hellfeld-überlagertes Bild

Wir haben weiterhin die Anwendbarkeit unserer HSI-Methode zum Multiplexen der spektral überlappenden Nanoproben in der SWIR-PL-Bildgebung in vivo demonstriert. Eine Nacktmaus wurde betäubt und subkutan mit PNPs, RENPs und einem Gemisch beider injiziert. Die NIR-Bildgebung mit 850-nm-Langpassfilter zeigt drei nicht unterscheidbare photolumineszente Flecken (Abb. 6a). Nach Durchführung von HSI und Analyse zeigt das Anteile-Mapping die vollständigen Anteile von PNPs und RENPs in der oberen und unteren Injektionsstelle, während ein Gemisch beider in der linken Injektionsstelle identifiziert wurde (Abb. 6b). Zusätzlich wurde zur Erlangung der PL-Intensitätsverteilung eine Intensitätsrekonstruktion durchgeführt (Abb. 6c). Durch Anpassung des Schwellenwerts in der Entmischungssoftware auf 15% (empirisch bestimmt) wurde es möglich, Rauschen in Bereichen adjacent zu den Emissionsflecken zu entfernen (Abb. 6d). Solche Ergebnisse zeigen, dass HSI im Gegensatz zur konventionellen PL-Bildgebungsmodalität, die Langpass- oder Bandpassoptische Filter einsetzt, nicht nur in der Lage ist, die Intensitätsverteilung im Präparat abzubilden, sondern auch die im Gemisch vorhandenen Komponenten durch Identifizierung des spektralen Profils der Intensität in jedem Pixel des Bildes zu multiplexen.

HSI einer subkutan mit PNPs (obere rechte Injektionsstelle), RENPs (untere rechte) und RENP/PNP-Gemisch (links) injizierten Maus. a Hellfeld (SWIR), SWIR-PL und überlagertes Bild, aufgenommen mit 850-nm-Langpass-Emissionsfilter. b Anteile von PNPs, RENPs und Hintergrund (BG). c Entsprechende rekonstruierte Intensitätsbilder. d PL-Intensitätsbilder, rekonstruiert aus Anteilen mit Schwellenwert von 15% und PL/Hellfeld-überlagertes Bild.

Somit wurde die Kombination aus HSI-Erfassung und spektraler Entmischungsverarbeitung in dieser Arbeit angewendet, um eine multiplexe Bildgebung der spektral überlappenden SWIR-PL-Nanoproben zu erhalten. Einige Aspekte sollten jedoch hinsichtlich der Anwendbarkeit der HSI-Modalität berücksichtigt werden. Erstens führt die spektral schmale Erfassung dazu, dass jeder HSI-Frame mit relativ niedriger Signalintensität umgeht (insbesondere bei spektral breiter PL-Emission aus organischen Moieties). Zudem ist eine Erhöhung der PL-anregenden Laserleistung in der biologischen Bildgebung durch die Gefahr von Gewebeschäden (oder Phototoxizität) begrenzt. Dies führt zu höheren Anforderungen an die Helligkeit der PL-Sonden und ihre Photostabilität, da HSI im Vergleich zur konventionellen PL-Bildgebung um Größenordnungen längere Erfassungszeiten erfordern kann. Es sollte auch angemerkt werden, dass die lineare Mischungsanalyse und der spektrale Entmischungsalgorithmus für multiplexe PL-Bildgebung biologischer Gewebe im Spektralbereich, in dem die Gewebetransmission sich nicht stark ändert, zufriedenstellend funktionieren können. Im Gegensatz dazu, wenn die Gewebetransmission im Spektralbereich der HSI ausgeprägte Merkmale aufweist, kann das lineare spektrale Mischungsmodell schwer anwendbar sein (insbesondere bei tieferen Geweben) und nichtlineare Modelle können in Betracht gezogen werden.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend haben wir eine hyperspektrale SWIR-Biobildgebungstechnik entwickelt und sie zum Multiplexing von Nanopartikeln angewendet, die im SWIR-Spektralbereich emittieren. Zwei Arten von Nanopartikeln mit überlappenden PL-Spektren, die in der konventionellen Bildgebung nicht unterscheidbar sind, wurden erfolgreich durch ihre PL-Spektralprofile mittels hyperspektraler Erfassung in Kombination mit dem Algorithmus der linearen spektralen Mischungsanalyse multiplexed. Die entwickelte Methode wurde erfolgreich für die multiplexe Bildgebung von SWIR-PL-Nanopartikeln sowohl in Proben-Suspensionen als auch in Kleintieren injiziert eingesetzt. Da die SWIR-Biobildgebung eine überlegene Auflösung bei größerer Bildgebungstiefe aufweist, birgt der SWIR-HSI-Ansatz großes Potenzial für den Einsatz in verschiedenen Anwendungen, die multiplexe Bildgebung mit NIR-SWIR-PL-Nanoproben erfordern. Darüber hinaus, da sich die SWIR-Biobildgebung in einem sehr frühen Stadium befindet, gibt es reichlich Raum für die Entwicklung biomedizinischer Anwendungen von PL-Sonden in Kombination mit HSI.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

Abkürzungen

BG:

Hintergrund

HSI:

Hyperspektrale Bildgebung

LCTF:

Flüssigkristallines abstimmbares Filter

NIR:

Nahes Infrarot

NPs:

Nanopartikel

PL:

Photolumineszenz

PNIPAM:

Poly-N-isopropylacrylamid

PNPs:

Polymere Nanopartikel

PS:

Polystyrol

RENPs:

Seltene-Erd-dotierte Fluorid-Nanopartikel

SWIR:

Kurzwelliges Infrarot

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie