Ein pH-induziertes reversibles Montagesystem mit Resveratrol-kontrollierbarem Laden und Freisetzen für eine verbesserte Tumor-Targeting-Chemotherapie

Einführung

Lungenkrebs ist eine der tödlichsten soliden bösartigen Erkrankungen des Menschen. Mit der zunehmenden Verschlechterung der Umwelt und anderen Faktoren ist die Inzidenz von Lungenkrebs von Jahr zu Jahr gestiegen und seine 5-Jahres-Überlebensrate beträgt nur 17,4 % [1, 2]. Obwohl derzeit traditionelle klinische Behandlungen wie chirurgische Resektion, Strahlentherapie und standardmäßige Erstlinien-Chemotherapie verfügbar sind, muss die mediane Gesamtüberlebensrate von Lungenkrebspatienten noch verbessert werden [3, 4]. Daher müssen dringend wirksamere und sicherere Behandlungen entwickelt werden, um diese tödliche Krankheit zu heilen. Obwohl geringe Zielwirkungen und hohe Nebenwirkungen vieler Chemotherapeutika ihren Nutzen in der Chemotherapie eingeschränkt haben [5, 6], werden derzeit ständig neue Chemotherapeutika entwickelt, insbesondere auf dem aufstrebenden Gebiet der Nanoarzneimittel [7,8, 9,10]. Resveratrol (RV) ist ein Extrakt aus natürlichen Pflanzen wie Weintrauben und Sojabohnen, der in klinischen Umgebungen häufig verwendet wird, um die Thrombozytenaggregation, die Hemmung der Vasodilatation, die Verringerung der Blutviskosität und dergleichen zu fördern [11,12,13,14,15 ]. In den letzten Jahren wurde auch eine starke krebshemmende Wirkung festgestellt [16,17,18]. Als potenzielles niedermolekulares Medikament hat RV jedoch auch einige Nachteile als andere Chemotherapeutika der ersten Wahl – wie schlechte Löslichkeit, kurze Halbwertszeit der Blutzirkulation und fehlende Tumorselektivität [19, 20]. RV-basierte Nano-Arzneimittel wurden in den letzten Jahren entwickelt, um diese Mängel zu überwinden und ihre therapeutischen Wirkungen zu verstärken [21]. Zur Beladung von RV wurden verschiedene Arten von Nanoträgern verwendet, darunter Liposomen, Serumalbumin, Kohlenstoffmaterialien, zweidimensionale Übergangsmetall-Dichalkogenide (2D-TMDs) und andere [21,22,23,24,25]. Obwohl berichtet wurde, dass diese Nanoträger die therapeutischen Wirkungen von RV effizient verstärken, weisen sie dennoch einige Mängel auf – wie die hocheffiziente aktive Trigger-Freisetzungskapazität für Liposomen und Serumalbumin und potenzielle systemische Langzeittoxizität für Kohlenstoffmaterialien und 2D- CMDs [26, 27]. Daher besteht weiterhin Bedarf an qualifizierteren Nanoträgern.

Ferritin ist ein natürliches Nanokäfig-Protein mit einem Lumen von etwa 8 nm, das durch die Wechselwirkung und den Zusammenbau von 24 Untereinheiten von schweren und leichten Ketten gebildet wird [28, 29]. Da es sich um ein körpereigenes Protein handelt, weist Ferritin eine ausgezeichnete Biokompatibilität und Sicherheit auf. Darüber hinaus gibt es einen Bericht, dass Ferritin ein von Natur aus pH-empfindliches Protein ist, das reversibel denaturiert und wieder zusammengesetzt werden kann, wenn sich seine Umgebung vom sauren in den alkalischen Zustand ändert [30]. Wenn der pH-Wert sauer war, bildeten sich die zerlegten stabförmigen Oligomere nur zur kopfhörerförmigen Struktur und die zerlegten kopfhörerförmigen Zwischenprodukte nur zur hohlkugelförmigen Struktur zurück [28,29,30]. Dieses einzigartige pH-getriggerte Montage- und Demontageverhalten macht Ferritin zu einem idealen System zur Wirkstoffabgabe. Vor kurzem haben Zhang et al. berichteten, dass Doxorubicin (DOX)-Moleküle in Ferritin eingekapselt und durch die pH-Regulierung für die Tumortherapie erfolgreich freigesetzt werden können [28].

In dieser Studie zielten wir darauf ab, ein pH-induziertes reversibles Montagesystem (PIRAS) auf Ferritin-Basis zu entwickeln, um die RV-Beladung und -Freisetzung für eine verbesserte Tumor-Targeting-Chemotherapie zu kontrollieren. Die Oberfläche der Ferritinkugel wurde mit dem Tumor-Targeting-Peptid RGD verknüpft. Der resultierende Nanowirkstoff RV@Ft-RGD erwies sich als stabil in neutralen und alkalischen Umgebungen (pH> 7,4) und setzt RV nur in sauren Umgebungen (pH <7,4) frei. Bei weiterer Charakterisierung zeigte RV@Ft-RGD die folgenden Vorteile in vitro und in vivo:(1) RV@Ft-RGD zielte auf Tumorzellen ab und reicherte sich im Lysosom (saure Umgebung) an, wo die Freisetzung von mehr RV in das Zytoplasma erleichtert wurde; (2) der Ferritin-Träger verbesserte die Bluthalbwertszeit von freiem RV signifikant, wodurch die Arzneistoffretention im systemischen Kreislauf verbessert wurde, um die Akkumulation von Arzneistoffen an Tumorstellen zu erleichtern; (3) die architektonische Stabilität des Ferritins verhinderte eine RV-Burst-Leckage während des Abgabevorgangs; (4) RV@Ft-RGD zeigte eine hervorragende in vitro- und in vivo-Biokompatibilität. Aufgrund dieser Vorzüge zeigte RV@Ft-RGD daher hervorragende therapeutische Antitumoreigenschaften, die ein großes Potenzial für zukünftige klinische Übersetzungen zeigen.

Materialien und Methoden

Materialien

Ferritin, Resveratrol (RV, ≥  99%) stammten von Sigma-Aldrich. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), N-Hydroxysuccinimid (NHS) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) wurden von Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD (Shanghai, China) bezogen. NH₂ -PEG₂₀₀₀ -RGD wurde von Hunan Huateng Pharmaceutical Co., Ltd (Hunan, China) bezogen. DMEM-Zellmedien, fötales Rinderserum (FBS) und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) bezogen. Das Zellzählkit-8 (CCK-8) wurde von Dojindo Laboratories (Japan) geliefert.

Synthese von RV@Ft-RGD

Die RV-Belastung wurde wie im Vorbericht beschrieben [21, 28] mit Modifikationen erstellt. Erstens NH₂ -PEG₂₀₀₀ -RGD (10 mg) wurde in der Ft-Lösung (1,5 mg/ml) in Gegenwart von 20 &mgr;l EDC (5 mg/ml) und 20 &mgr;l NHS (20 mg/ml) dispergiert. Die Mischung wurde 2 h bei 4 °C unter leichtem Rühren umgesetzt und durch Dialyse gegen destilliertes Wasser (MW-Grenzwert =5 kDa) über Nacht gereinigt, was zu Ft-RGD-Nanopartikeln führte. Dann wurde wasserunlösliches RV in DMSO zu 2 mg/ml gelöst und mit einer Endkonzentration von 1,5 mg/ml in die Ft-RGD-Lösung gegeben. Der pH-Wert der Mischung wurde auf pH =5 eingestellt, um die Polypeptid-Untereinheiten zu zerlegen. Danach wurde der pH-Wert der Mischung langsam mit Natriumhydroxid (1 M) auf 7,4 eingestellt, um den Polypeptid-Untereinheiten zu ähneln. Die resultierende Lösung wurde über Nacht in destilliertem Wasser dialysiert, um freie RV-Moleküle als Endprodukt (RV@Ft-RGD) zu entfernen. Die Menge an beladenem RV wurde durch ein UV-Vis-Spektrophotometer (UV3100, Shimadzu, Japan) durch Überwachung des Absorptionspeaks bei 306 nm nachgewiesen. RV-Belastungsverhältnis war (A _a − A _b )/A _c , wobei A _a , A _b , und A _c repräsentieren das Gewicht des anfänglichen, unbelasteten RV bzw. Ft-RGD.

Charakterisierungen

Die Methode der dynamischen Lichtstreuung (DLS) (BI-9000AT, Brookhaven, USA) wurde verwendet, um die Größe und das Zeta-Potential der Nanopartikel zu bestimmen. Die Morphologie der Nanopartikel wurde mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM, JEM-100S, JEOL, Japan) beobachtet. Fluoreszenzspektren wurden mit einem Perkin-Elmer LS50B Lumineszenzspektrophotometer nachgewiesen. Das zelluläre Fluoreszenzsignal wurde mit dem kommerziellen Laserscanning-Mikroskop (LSM 510, Zeiss, Deutschland) und Durchflusszytometrie (FCM, EPICS XL, Beckman, USA) aufgezeichnet.

RV-Freigabestudie

500 Mikroliter RV@Ft-RGD-Lösung wurden in ein D-Röhrchen (MWCO 6–8 kDa, Novagen) gegeben und die Lösung über verschiedene Puffer auf unterschiedliche pH-Werte eingestellt. Die Lösung wurde dann bei 37 ^o . dialysiert C. Nach einer anderen Inkubationszeit wurden 1 ml Aliquote Dialysat entnommen und durch 1 ml frisches Medium ersetzt. Das bei verschiedenen Inkubationszeiten freigesetzte RV wurde mit einem UV-Vis-Spektrophotometer bestimmt. Außerdem wurde RV@Ft-RGD in einer Spüllösung mit unterschiedlichen pH-Bedingungen, einschließlich pH 5, 6,5, 7,4 und 8,5, gelöst. Nach 24 h Inkubation bei 37 °C wurde die Größe der Nanopartikel durch DLS charakterisiert.

Zellkultur

Die menschlichen Lungenkrebszellen A549 und NCI-H358 wurden von der Cell Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) erhalten und in DMEM-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (PS) in a . kultiviert befeuchtete Atmosphäre mit 5 % CO₂ mit 37 ^o C.

Zelluläre Aufnahme und Lokalisierung von RV@Ft-RGD

Als gängige Methode wurde FITC zur Markierung der Nanopartikel verwendet. FITC wurde in Ethanollösung (2,0 mg/ml) gelöst und mit wässriger RV@Ft- und RV@Ft-RGD-Lösung (1,0 mg/ml) unter 4-stündigem Rühren in dunkler Umgebung bei Raumtemperatur gemischt. Die Mischung wurde über Nacht in destilliertem Wasser dialysiert, um das überflüssige FITC und Ethanol zu entfernen, was zu einer FITC-markierten RV@Ft- und RV@Ft-RGD-Lösung führte. Um die Organellen-Lokalisierung von Nanopartikeln in vitro zu bestätigen, wurden die Zellen mit FITC-markiertem RV@Ft und RV@Ft-RGD für 5 h behandelt und mit dem lysosomspezifischen Farbstoff Lyso Tracker Red (Invitrogen) gefärbt. Danach wurde die zelluläre Internalisierung von RV@Ft und RV@Ft-RGD mit einem CLSM beobachtet. Kurz gesagt wurden A549-Zellen mit FITC-markiertem RV@Ft und RV@Ft-RGD (mit derselben FITC-Konzentration) für 5 h inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit Lyso Tracker Red-Lösungen (100 nM) bei 37 °C für 30 Minuten behandelt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit einem kommerziellen Laser-Scanning-Mikroskop beobachtet. Die ImageJ-Software wurde verwendet, um die Fluoreszenzintensität von Zellen zu analysieren.

In-vitro-Tumor-Chemotherapie- und Apoptose-Studie

Zunächst wurde die Zytotoxizität des Trägers Ft-RGD durch einen Standard-CCK-8-Assay (Bestbio, China) bewertet. A549- und NCI-H358-Zellen (1 × 10 ⁵ Zellen/ml, 0,5 ml) wurden in 96-Well-Platten ausgesät und für 24 h kultiviert. Nach dem Verwerfen der alten Medien wurden frische Medien mit 0, 0,01, 0,1, 0,5 und 1 mg/ml Ft-RGD 24 h mit A549- und NCI-H358-Zellen inkubiert. Die Zellen wurden dreimal vorsichtig mit PBS gewaschen. Einhundert Mikroliter CCK-8-Arbeitslösung (10 % CCK-8 + 90 % DMEM) wurden dann in jede Vertiefung gegeben und 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Absorptionswerte bei 450 nm wurden unter Verwendung eines Mikroplatten-Spektrophotometers (Multiskan FC, Thermo Scientific) gemessen. Fotografien jeder Zellgruppe wurden mit einem optischen Mikroskop (Olympus) betrachtet.

Verschiedene Konzentrationen von freiem RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD und RV@Ft-RGD + RGD (0, 10, 20, 30 und 40 µg/ml RV-Äquivalente) wurden mit A549-Zellen behandelt. Nach 24 h Inkubation wurde die Lebensfähigkeit der behandelten Zellen durch den CCK-8-Assay analysiert. In der Zwischenzeit wurden diese behandelten Zellen mit einem Apoptose-Nachweiskit (Annexin VFITC/PI) doppelt gefärbt und durch FCM analysiert.

Zirkulationszeit von RV@Ft-RGD im Blut

Freies RV oder RV@Ft-RGD (6 mg/kg RV-Äquivalent) wurde gesunden Balb/c-Nacktmäusen (n =5 pro Gruppe). Nach der Injektion wurde das venöse Blut der Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt und in ein Heparin enthaltendes Blutsammelröhrchen gegeben, und dann wurde das Plasma abgetrennt. Die RV-Konzentration im Plasma wurde mit angesäuertem Isopropanol-Reagens extrahiert und dann wurde seine Extinktion bei 306 nm Anregung gemessen, um die RV-Konzentration zu bestimmen.

Tiermodell und In-vivo Tumor-Chemotherapie

Balb/c-Mäuse (4–6 Wochen alt), die in dieser Arbeit verwendet wurden, wurden von Charles River Laboratories (Beijing, China) bezogen. Alle tierexperimentellen Tätigkeiten erfolgen streng nach den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren. Die Leitlinie wurde vom Animal Care and Use Committee der Zhengzhou University genehmigt. Um ein subkutanes Tumormodell von A549 zu erstellen, 2 × 10 ⁶ A549-Zellen wurden subkutan in den Rücken der Mäuse injiziert. Anschließend wurden sie für 7 bis 9 Tage im Tierstall untergebracht. Die Berechnungsformel für das Tumorvolumen lautet Länge × Breite ² /2.

Mäuse mit A459-Tumoren wurden nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen eingeteilt. Jede Gruppe bestand aus fünf Mäusen. Die spezifischen Gruppierungen sind Kontrolle (Kochsalzlösung), RV, RV @Ft und RV@Ft-RGD. Zu Beginn der Behandlung wurde die Probe an drei aufeinanderfolgenden Tagen einmal täglich durch die Schwanzvene injiziert. Das Tumorvolumen und das Körpergewicht der Maus wurden alle 5 Tage aufgezeichnet. Nach 45 Tagen Behandlung wurden Tumoren jeder Gruppe gesammelt. Tumorgewebe wurden in 10 % Formalinlösung fixiert, geschnitten und dann einer Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung unterzogen.

In-vivo-Biokompatibilität

Zweihundert Mikroliter RV@Ft-RGD wurden gesunden Balb/c-Mäusen über die Schwanzvene injiziert (RV-Dosis betrug 15 mg/kg). Gesunde Mäuse, denen auf dieselbe Weise physiologische Kochsalzlösung injiziert wurde, wurden als Blindkontrollgruppe verwendet. An den Tagen 0, 10 und 45 nach der Injektion wurde Mausblut zur Bewertung der Zellzahlen einschließlich weißer Blutkörperchen (WBC), roter Blutkörperchen (RBC), Hämoglobin (HGB) und des mittleren Blutplättchenvolumens (MPV) gesammelt. , mittleres Hämoglobin der roten Blutkörperchen (MCH), Hämatokrit (HCT), mittlere Hämoglobinkonzentration der roten Blutkörperchen (MCHC), mittleres Volumen der roten Blutkörperchen (MCV) und Thrombozyten (PLT). Darüber hinaus wurden am 45. Tag Herz-, Leber-, Milz-, Lungen- und Nierengewebe jeder Gruppe für die H&E-Färbung gesammelt.

Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (s.d.) dargestellt. Die statistische Analyse der Proben wurde mit Student's t . durchgeführt testen und p <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung von RV@Ft-RGD

Die RV-Beladung und -Freisetzung aus RV@Ft-RGD erfolgte über den pH-induzierten reversiblen Abbau und Wiederzusammenbau von Ft (Abb. 1). Zunächst wurde Ferritin mit dem Tumor-Targeting-Peptid RGD konjugiert, um Ft-RGD zu bilden. Dieses wurde dann in einem Acetatpuffer (pH =5) wieder aufgelöst, um die Polypeptid-Untereinheiten zu zerlegen und eine hohle poröse Kugel zu bilden. RV-Moleküle wurden dann zugegeben und in die Kavität eintreten gelassen, wonach die Lösung langsam auf pH 7,4 eingestellt wurde, um Ft wieder zusammenzusetzen und die RV-Moleküle in der versiegelten Ft-Kavität einzufangen. Wenn der pH-Wert des Puffers dann auf ~~5 gesenkt wurde, öffneten sich die Nanopartikelporen reversibel und setzten ihre RV-Moleküle frei. Abbildung 2a und zusätzliche Datei 1:Abbildung S1 zeigt die REM- und TEM-Bilder des zusammengesetzten RV@Ft-RGD, das eine kugelförmige Struktur zeigte. Laut DLS-Analyse hatten RV@Ft-RGD-Partikel größere Durchmesser (~ 22,5 nm) im Vergleich zu rohen Ft-Nanopartikeln (~ 11,8 nm) (Abb. 2b) und hatten ähnliche Zeta-Potentiale wie rohe Ft-Nanopartikel (− 29,6 mV) (Abb. .2c). Nach 20 Tagen zeigte der Polydispersitätsindex (PDI) von RV@Ft-RGD in Wasser, FBS, Zellmedium und PBS keine signifikante Änderung (Fig. 2d), was darauf hindeutet, dass RV@Ft-RGD eine bemerkenswerte kolloidale Stabilität aufwies. Abbildung 2e zeigt die Absorptionsspektren von freiem RV, Ft-RGD und RV@Ft-RGD. Wie zu sehen ist, zeigte das Absorptionsspektrum von RV@Ft-RGD im Vergleich zu dem von RV und Ft-RGD einen neuen Peak bei 306 nm (von RV ausgehend), was auf die erfolgreiche Beladung mit RV hinweist. Darüber hinaus zeigte RV@Ft-RGD eine ähnlich signifikante Emissionsfluoreszenz wie freies RV bei 400 nm, wenn es mit einem 325-nm-Laser angeregt wurde (Abb. 2f).

Eine schematische Darstellung der RV@Ft-RGD-Präparation und der tumorgerichteten Chemotherapie

a Das TEM-Bild von RV@Ft-RGD. b , c Die Größenverteilung und Zetapotentialverteilung von Ft-RGD und RV@Ft-RGD. d Die PDI-Änderung des RV@Ft-RGD in Wasser, FBS, Zellmedium und PBS über 20 Tage. e Die Absorptionsspektren von freiem RV, Ft-RGD und RV@Ft-RGD. f Die Absorptionsspektren von freiem RV und RV@Ft-RGD

Laden und Freigeben von Medikamenten

Es wurde festgestellt, dass die maximale Belastbarkeit von Ft-RGD 252,6 % beträgt, wahrscheinlich aufgrund des großen Hohlraums im Inneren des hohlen Ft-RGD. Da Ft pH-sensitiv ist, konnten wir die RV-Belastbarkeit unter verschiedenen pH-Bedingungen charakterisieren. Wie in 3a gezeigt, nahm die RV-Beladungseffizienz mit dem Anstieg des pH von 5,0 auf 8,5 dramatisch ab. Die RV-Freisetzung aus dem Komplex wurde auch bei verschiedenen pH-Werten von 5,0 bis 8,5 charakterisiert. Aus diesen Daten wurde ein pH-Wert- und zeitabhängiges RV-Freisetzungsprofil erstellt, das in Abb. 3b dargestellt ist. Das maximale Wirkstofffreisetzungsverhältnis (51,6%) trat bei pH =5,0 für 24 Stunden auf, was höher war als bei pH =6,5, 7,4 und 8,5. Entsprechenden Berichten zufolge sind pH-Werte von 5,0, 6,5 und 7,4 diejenigen, die typischerweise in Zelllysosomen, Tumorgewebe, Blut bzw. der normalen physiologischen Umgebung gefunden werden [31]. Unter physiologischen Bedingungen (pH 7,4) blieb der RV-Wirkstoffgehalt von RV@Ft-RGD auch nach 50 h hoch (Abb. 3c), was darauf hindeutet, dass der RV in RV@Ft-RGD stabil ist und nicht leicht austritt. Darüber hinaus haben wir die Durchmesseränderung von RV @ Ft-RGD unter verschiedenen pH-Bedingungen untersucht. Nach 12-stündiger Inkubation bei 37 °C zeigte die DLS-Analyse, dass der Durchmesser von RV@ Ft-RGD mit etwa 23 nm bei pH 8,5 und 7,4 nahezu konstant war. Wenn der pH-Wert auf 6,5 und 5,0 gesenkt wurde, nahm der Durchmesser von RV @ Ft-RGD auf 25 nm bzw. 28,6 nm zu (Abb. 3d). Diese Ergebnisse bestätigen das Verhalten der pH-induzierten reversiblen Zerlegung und Wiederzusammenfügung von RV@Ft-RGD, was für die kontrollierbare Wirkstoffbeladung in vitro und die Wirkstofffreisetzung im Tumorgewebe von Vorteil ist.

a Beladungseffizienz von Ft-RGD unter verschiedenen pH-Bedingungen. b RV-Freisetzungsprofil von RV@Ft-RGD bei verschiedenen pH-Bedingungen von 5,0 bis 8,5. c Der permanente RV in RV@Ft-RGD im physiologischen Zustand. d Die durchschnittliche Größenänderung von RV@Ft-RGD bei verschiedenen pH-Bedingungen von 5,0 bis 8,5

In-vitro-zelluläre Aufnahme und Lokalisierung

Anschließend wurde die zelluläre In-vitro-Aufnahme und -Lokalisierung von RV@Ft-RGD evaluiert. Zunächst wurden RV@Ft und RV@Ft-RGD durch FITC über Wasserstoffbrücken-Wechselwirkung und physikalische Absorption markiert. Wie in 4a gezeigt, zeigten freie FITC-behandelte Zellen vernachlässigbare zytoplasmatische Fluoreszenzsignale. Im Gegensatz dazu zeigten RV@Ft-RGD-behandelte Zellen eine intensive grüne FITC-Fluoreszenz, die höher war als die von RV@Ft-behandelten Zellen. Bemerkenswerterweise zeigten sowohl RV@Ft-RGD-behandelte als auch RGD-vorbehandelte Zellen eine geringe grüne Fluoreszenz. Aus diesen Ergebnissen können wir schließen, dass RV@Ft-RGD in großen Mengen von Zellen aufgenommen wurde, wahrscheinlich durch einen RGD-vermittelten aktiven Zieleffekt. Diese behandelten Zellen wurden auch durch FCM analysiert, deren Ergebnisse in Fig. 4b gezeigt sind. Die statistischen Ergebnisse der zellulären Fluoreszenzintensität legen eine ähnliche Schlussfolgerung nahe.

a Fluoreszenzbilder von A549-Zellen nach Inkubation mit freiem FITC und FITC-markiertem RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD bzw. RV@Ft-RGD. Maßstabsbalken =60 μm. b FCM-Messung der zellulären FITC-Fluoreszenzintensitäten in A549-Zellen nach Inkubation mit freiem FITC und FITC-markiertem RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD bzw. RV@Ft-RGD. c Kolokalisationskoeffizient der Zellfluoreszenz von FITC und Lyso Tracker Red. **P <0,01, jeweils im Vergleich zu anderen Gruppen

Um die Organellen-Lokalisierung von RV@Ft-RGD zu untersuchen, wurde ein lysosomspezifischer Färbefarbstoff (Lyso Tracker Red) verwendet, um die mit den Nanopartikeln inkubierten Zellen zu färben. Wie in Abb. 4a zu sehen ist, zeigte das Zytoplasma in allen Gruppen eine starke rote Fluoreszenz. Nach der Fusion mit der grünen FITC-Fluoreszenz zeigte RV@Ft-RGD unter diesen Gruppen eine intensivste gelbe (grüne + rote) Fluoreszenz im Zytoplasma. Basierend auf einer statistischen Analyse hatte die mit RV@Ft-RGD behandelte Gruppe den höchsten Kolokalisationskoeffizienten zwischen FITC und Lyso Tracker Red-Fluoreszenz ( 4c ). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass RV@Ft-RGD aktiv in Zellen eindringen und dann in die saure Umgebung des Lysosoms (pH ≈ 5,0) transferiert werden kann. Diese Vorzüge verleihen RV@Ft-RGD zusammen mit der pH-abhängigen Wirkstofffreisetzung viele potenzielle Anwendungen für die In-vivo-Tumortherapie.

In-vitro-Biokompatibilität und Tumortherapie

Vor der Untersuchung der Antitumoreigenschaften von RV@Ft-RGD wurde die Zytotoxizität des Ft-RGD-Trägers untersucht. Wie in Abb. 5a und Zusatzdatei 1:Abb. S2 und S3 gezeigt, zeigte Ft-RGD keine offensichtliche Suppression der Lebensfähigkeit gegenüber Lungenkrebs-A549-Zellen und NCI-H358-Zellen bei Konzentrationen bis zu 1 mg/ml. Die Zellmorphologie zeigte auch keine signifikante Veränderung, wenn die mit 1 mg/ml behandelten Zellen mit den Kontrollgruppen verglichen wurden (Fig. 5b), was eindeutig darauf hindeutet, dass Ft-RGD als Träger eine ausgezeichnete Biokompatibilität aufwies. Wie in Fig. 6a, b gezeigt, töten freies RV, RV@Ft und RV@Ft-RGD alle die Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise ab. RV@Ft-RGD-behandelte Zellen zeigten eine stärkere Abnahme der Lebensfähigkeit und hatten nur 11,2 % Zelllebensfähigkeit in den 40-μg/ml-Gruppen, was niedriger war als bei RV@Ft- und RV@Ft-RGD + RGD-vorbehandelten Gruppen. Eine vorläufige Studie mit FCM zeigte ferner, dass entweder mit RV allein, RV@Ft oder RV@Ft-RGD der Großteil des Zelltodes über Apoptose vermittelt wurde ( 6c ). Diese Ergebnisse zeigen, dass die tumorzelltötende Wirkung von RV durch die Beladung mit Ft-RGD stark verstärkt wurde, hauptsächlich aufgrund der erhöhten Akkumulation von RV@Ft-RGD im Lysosom, wo ein saurer pH-Wert eine erhöhte Freisetzung von Apoptose-förderndem RV . auslöste in das Zytoplasma [32, 33].

a In-vitro-Zytotoxizität gegen A549-Zellen, die 24 h mit unterschiedlicher Konzentration von Ft-RGD behandelt wurden. b Das Mikroskopbild von A549-Zellen nach 24 h Behandlung mit 1 mg/ml Ft-RGD

a Zelllebensfähigkeit verschiedener Konzentrationen von RV-behandelten A549-Zellen. b Zelllebensfähigkeit von Zellen, die mit RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD und RV@Ft-RGD mit verschiedenen RV-Konzentrationen behandelt wurden. c Zellapoptose von A549-Zellen, die mit PBS (Kontrolle), RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD und RV@Ft-RGD durch Durchflusszytometrie behandelt wurden. **P <0,01, jeweils im Vergleich zu anderen Gruppen

Blut-Halbwertszeit von RV@Ft-RGD

Die RV-Konzentration im Blutplasma zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion wurde in den mit freiem RV bzw. RV@Ft-RGD behandelten Gruppen untersucht. Wie in 7a gezeigt, betrug die Bluthalbwertszeit von RV@Ft-RGD 5,1 ± 0,23 h. Freies RV wurde schneller aus dem Kreislauf ausgewaschen, mit einer Bluthalbwertszeit von nur 0,43 ± 0,11 h. Die deutlich verlängerte Halbwertszeit von RV@Ft-RGD im Blut trägt zur Verbesserung der Wirkstoffretention im systemischen Kreislauf bei und erleichtert die Ansammlung von Wirkstoffen an Tumorstellen.

a Zirkulationszeit von freiem RV und RV@Ft-RGD im Blut. b Das Wachstumsprofil von A549-xenotransplantierten Tumoren nach dreimaliger intravenöser Injektion von Kochsalzlösung (Kontrolle), RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD und RV@Ft-RGD. Der rote Pfeil zeigt den Injektionszeitpunkt an. **P <0,01, jeweils im Vergleich zu anderen Gruppen. c Körpergewicht tumortragender Mäuse nach verschiedenen Behandlungen. d Mikroskopische Aufnahmen von H&E-gefärbten Tumorschnitten, die nach dem Ende der Behandlung von verschiedenen Gruppen von Mäusen gesammelt wurden. Maßstabsbalken sind 50 μm

In-vivo-Antitumorwirkung und systemische Toxizität von RV@Ft-RGD

7b zeigt das Tumorwachstumsprofil von tumortragenden Mäusen mit unterschiedlicher Behandlung, das als relatives Tumorvolumen ausgedrückt wurde. Das Tumorwachstum wurde bei Behandlung mit RV@Ft bis zu einem gewissen Grad gehemmt, wahrscheinlich aufgrund der geringen Aufnahme von RV@Ft. In der mit RV@Ft-RGD behandelten Gruppe war das Tumorwachstum jedoch im Vergleich zu den anderen Gruppen (Kontrolle, RV, RV@Ft und RV@Ft-RGD + RGD) signifikant unterdrückt. Während der Behandlung gab es in keiner Versuchsgruppe einen merklichen Verlust an Körpergewicht (Abb. 7c), was auf die hohe Biosicherheit von RV@Ft-RGD hinweist. Nach Beendigung des Behandlungsverlaufs wurde in diesen Gruppen eine H&E-Färbung von Tumorgewebe durchgeführt, um die chemotherapeutische Wirkung zu untersuchen. Wie in 7d gezeigt, wurde bei Tumoren, die mit RV@Ft-RGD behandelt wurden, ein großer Apoptosebereich beobachtet, der in signifikantem Gegensatz zu nur einem kleinen Apoptosebereich bei Tumoren steht, die mit freiem RV, RV@Ft und RV@ behandelt wurden. Ft-RGD + RGD. Darüber hinaus wurde die systemische Toxizität von RV@Ft-RGD auch bei normalen Mäusen untersucht. Vollblutproben von mit Kochsalzlösung und RV@Ft-RGD behandelten gesunden Mäusen wurden 0, 10 und 45 Tage nach der Injektion zur Blutanalyse entnommen. Wie in Abb. 8a, b gezeigt, zeigten die vollständigen Blutbilder (WBC, RBC, HGB, MPV, MCH, HCT, MCV, PLT und MCHC) von RV@Ft-RGD-injizierten Mäusen keine signifikanten Unterschiede von 0 Tag bis 45 Tage. Die Hauptorgane von gesunden Mäusen, die mit Kochsalzlösung und RV@Ft-RGD behandelt wurden, wurden auch nach 45 Tagen für die H&E-Färbung gesammelt. In diesen Geweben wurden keine offensichtlichen Nebenwirkungen gefunden ( 8c ), was auf eine vernachlässigbare nachteilige Langzeittoxizität schließen lässt. Alle diese Ergebnisse zeigen das vielversprechende Potenzial von RV@Ft-RGD für eine verbesserte Krebs-Chemotherapie in vivo.

a Blutanalyse von gesunden Mäusen, die 45 Tage mit RV@Ft-RGD behandelt wurden. b Bilder von H&E-gefärbten Hauptorganen gesunder Mäuse, die 45 Tage mit RV@Ft-RGD behandelt wurden. c Die HE-Färbung bildet Hauptorgane in Kontroll- und RV@Ft-RGD-behandelten Gruppen ab. Maßstabsbalken sind 50 μm

Schlussfolgerung

Zusammenfassend haben wir erfolgreich ein pH-induziertes reversibles Montagesystem (PIRAS) mit pH-kontrollierbarer Beladung und Freisetzung des Antitumor-RV-Wirkstoffs für eine verbesserte Tumor-Targeting-Chemotherapie entwickelt. Unter sauren Bedingungen (pH =5,0) kann das System zerlegen und RV laden oder freisetzen, während unter neutralen Bedingungen (pH =7,4) RV@Ft-RGD sehr stabil ist und ein vernachlässigbares Arzneimittelleck zeigt. Durch den RGD-vermittelten Zieleffekt kann RV@Ft-RGD in hohen Konzentrationen von A549-Zellen aufgenommen werden und sich im Lysosom anreichern, was für die RV-Freisetzung sowohl in vitro als auch in vivo von Vorteil ist. Aufgrund der Akkumulation von RV@Ft-RGD im Lysosom und der pH-auslösenden Freisetzung von RV in das Zytoplasma des sauren Lysosoms zeigte RV@Ft-RGD im Vergleich zu freiem RV eine ausgezeichnete tumorzelltötende und apoptosefördernde Wirkung. Darüber hinaus zeigte RV@Ft-RGD nach dem Laden von RV in Ft-RGD eine viel längere Bluthalbwertszeit als die von freiem RV. In-vivo-Ergebnisse zeigen, dass RV@Ft-RGD eine bemerkenswerte Tumorsuppression und keine merkliche systemische Toxizität zeigt. Diese Studie legt nahe, dass Ft-basiertes PIRAS bei der Wirkstoffbeladung und -freisetzung für eine verbesserte Krebstherapie hocheffizient ist.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Schlussfolgerungen in diesem Manuskript basieren auf den Daten, die alle in diesem Papier präsentiert und gezeigt werden.

Abkürzungen

BSA:

Rinderserumalbumin

CCK-8:

Zellzähl-Kit-8

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid

FBS:

Fötales Rinderserum

FITC:

Fluoresceinisothiocyanat

Ft:

Ferritin

HCT:

Hämatokrit

HGB:

Hämoglobin

MCH:

Mittleres korpuskulares Hämoglobin

MCHC:

Mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration

MCV:

Mittleres Korpuskularvolumen

MPV:

Mittleres Thrombozytenvolumen

NHS:

N-Hydroxysuccinimid

PIRAS:

pH-induziertes reversibles Montagesystem

PLT:

Blutplättchen

RBC:

Rote Blutkörperchen

RGD:

Arg-Gly-Asp

RV:

Resveratrol

WBC:

Weiße Blutkörperchen