pH-getriggerter Ferritin-Nanocarrier ermöglicht kontrollierte Resveratrol-Freisetzung für zielgerichtete Tumorchemotherapie

Zusammenfassung

In diesem Bericht präsentieren wir ein pH-induziertes reversibles Assembliesystem (PIRAS) basierend auf Ferritin (Ft) für zielgerichtete Tumortherapie. Es wurde entwickelt, um das Antikrebsmedikament Resveratrol (RV) basierend auf der natürlichen pH-Empfindlichkeit und der einzigartigen hohlen Kavität von Ft einfach zu laden und freizusetzen. Ein tumorspezifisches Targeting-Peptid Arg-Gly-Asp (RGD) wurde auf die Oberfläche von RV-beladenem Ft (RV@Ft) konjugiert, um biokompatible Nanopartikel (RV@Ft-RGD) zu bilden. Die pH-Empfindlichkeit von Ft ermöglicht dessen Denaturierung in eine hohle poröse Nanosphäre unter sauren Bedingungen und Renaturierung in eine versiegelte hohle Nanosphäre unter neutralen Bedingungen. Mittels pH-Manipulation zeigte RV@Ft-RGD mit ~21 nm Durchmesser eine hohe RV-Beladungsrate von 79,6 %. Die pH-getriggerte RV-Freisetzung wurde bei pH 5,0 über 24 h mit einem Verhältnis von 50,3 % gemessen. Unter neutralen Bedingungen zeigte RV@Ft-RGD über 20 Tage hervorragende Stabilität. Konfokalmikroskopie zeigte, dass RV@Ft-RGD eine hohe zelluläre Aufnahmerate und Colokalisation mit dem Lysosom aufwies, hauptsächlich aufgrund des RGD-vermittelten Targetingeffekts. Basierend auf hoher Arzneimittelbeladung, pH-getriggerter Freisetzung und Tumorzell-Targeting zeigte RV@Ft-RGD große Zelltötungsfähigkeit in vitro und in vivo. Die Biokompatibilität in vitro und in vivo war ebenfalls exzellent, ohne systemische Toxizität. Das Designkonzept von PIRAS basierend auf Ft hemmt Tumorwachstum signifikant und erweitert gleichzeitig die Anwendung von Ft in der Nanomedizin.

Einleitung

Lungenkrebs ist eine der tödlichsten soliden Malignome beim Menschen. Mit zunehmender Umweltverschlechterung und anderen Faktoren steigt die Inzidenz von Lungenkrebs jährlich, und die 5-Jahres-Überlebensrate beträgt nur 17,4 %. Derzeit sind zwar traditionelle klinische Behandlungen wie chirurgische Resektion, Strahlentherapie und Standard-Erstlinien-Chemotherapie verfügbar, doch die mediane Gesamtüberlebensrate von Lungenkrebspatienten muss noch verbessert werden. Daher müssen dringend wirksamere und sicherere Behandlungen entwickelt werden, um diese tödliche Krankheit zu heilen. Gegenwärtig haben zwar geringe Targeting-Effekte und hohe Nebenwirkungen vieler chemotherapeutischer Medikamente deren Nutzen in der Chemotherapie begrenzt, doch neue chemotherapeutische Wirkstoffe werden ständig entwickelt, insbesondere im aufstrebenden Bereich der Nanomedikamente. Resveratrol (RV) ist ein Extrakt natürlicher Pflanzen wie Trauben und Sojabohnen, der in klinischen Umgebungen weit verbreitet zur Förderung der Thrombozytenaggregation, Hemmung der Vasodilatation, Reduktion der Blutviskosität usw. eingesetzt wird. In jüngerer Zeit wurde auch eine starke antikrebswirksame Wirkung entdeckt. Als potenzielles Kleinmolekülmedikament hat RV jedoch auch Nachteile wie andere Erstlinien-Chemotherapeutika – wie schlechte Löslichkeit, kurze Halbwertszeit im Blutkreislauf und fehlende Tumorselektivität. RV-basierte Nanomedikamente wurden in jüngerer Zeit entwickelt, um diese Mängel zu überwinden und die therapeutische Wirkung zu verstärken. Verschiedene Nanocarrier wurden verwendet, um RV zu beladen, einschließlich Liposomen, Serumalbumin, Kohlenstoffmaterialien, zweidimensionale Übergangsmetalldichalkogenide (2D-TMDs) und andere. Obwohl diese Nanocarrier berichtet wurden, die therapeutischen Effekte von RV effizient zu steigern, zeigen sie dennoch einige Mängel – wie hoheffiziente aktive Auslöse-Freisetzungskapazität für Liposomen und Serumalbumin, und potenzielle langfristige systemische Toxizität für Kohlenstoffmaterialien und 2D-TMDs. Daher besteht weiterhin Bedarf an qualifizierteren Nanocarriern.

Ferritin ist ein natürliches Nanokäfigprotein mit einem Lumen von ca. 8 nm, gebildet durch Interaktion und Assemblierung von 24 Untereinheiten schwerer und leichter Ketten. Da es ein endogenes Protein ist, besitzt Ferritin hervorragende Biokompatibilität und Sicherheit. Zudem gibt es Berichte, dass Ferritin ein natürlich pH-sensitives Protein ist, das reversibel denaturiert und reassembliert werden kann, wenn sich seine Umgebung von sauer zu alkalisch ändert. Bei saurem pH erholten sich die disassemblierten stäbchenförmigen Oligomere nur zur kopfhörerförmigen Struktur, und die disassemblierten kopfhörerförmigen Intermediate erholten sich nur zur hohlen kugelförmigen Struktur. Dieses einzigartige pH-getriggerte Assemblierungs- und Disassemblierungsverhalten macht Ferritin zu einem idealen Drug-Delivery-System. Kürzlich berichteten Zhang et al., dass Doxorubicin (DOX)-Moleküle in Ferritin eingekapselt und durch pH-Regulation für Tumortherapie erfolgreich freigesetzt werden können.

In dieser Studie zielten wir darauf ab, ein Ferritin-basiertes pH-induziertes reversibles Assembliesystem (PIRAS) zu entwickeln, um RV-Beladung und -Freisetzung für verbesserte tumorzielgerichtete Chemotherapie zu kontrollieren. Die Oberfläche der Ferritinsphäre wurde mit dem Tumor-Targeting-Peptid RGD verknüpft. Das resultierende Nanomedikament RV@Ft-RGD erwies sich als stabil in neutralen und alkalischen Umgebungen (pH > 7,4) und gab RV nur in sauren Umgebungen (pH < 7,4) frei. Bei weiterer Charakterisierung zeigte RV@Ft-RGD folgende Vorteile in vitro und in vivo: (1) RV@Ft-RGD zielte auf Tumorzellen ab und akkumulierte im Lysosom (saure Umgebung), was die Freisetzung von mehr RV in das Zytoplasma erleichterte; (2) der Ferritin-Carrier verlängerte die Blut-Halbwertszeit von freiem RV erheblich, was die Arzneimittelretention im systemischen Kreislauf verbesserte und die Akkumulation von Medikamenten an Tumorstellen erleichterte; (3) die architektonische Stabilität von Ferritin verhinderte RV-Burst-Leckage während der Delivery; (4) RV@Ft-RGD zeigte hervorragende in vitro und in vivo Biokompatibilität. Daher zeigte RV@Ft-RGD aufgrund dieser Vorzüge hervorragende antitumorale therapeutische Eigenschaften, was großes Potenzial für zukünftige klinische Translationen aufweist.

Materialien und Methoden

Materialien

Ferritin, Resveratrol (RV, ≥99 %) stammten von Sigma-Aldrich. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), N-Hydroxysuccinimid (NHS) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) wurden von Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd (Shanghai, China) bezogen. NH₂-PEG₂₀₀₀-RGD wurde von Hunan Huateng Pharmaceutical Co., Ltd (Hunan, China) gekauft. DMEM-Zellmedien, fetales Kälberserum (FBS) und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) bezogen. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) wurde von Dojindo Laboratories (Japan) geliefert.

Synthese von RV@Ft-RGD

Die RV-Beladung wurde gemäß vorherigem Bericht mit Modifikationen hergestellt. Zunächst wurde NH₂-PEG₂₀₀₀-RGD (10 mg) in die Ft-Lösung (1,5 mg/ml) unter Anwesenheit von 20 µl EDC (5 mg/ml) und 20 µl NHS (20 mg/ml) dispersiert. Die Mischung wurde 2 h bei 4 °C unter leichtem Rühren reagiert und durch Dialyse gegen destilliertes Wasser (MW cut-off = 5 kDa) über Nacht gereinigt, was Ft-RGD-Nanopartikel ergab. Anschließend wurde wasserunlösliches RV in DMSO auf 2 mg/ml gelöst und der Ft-RGD-Lösung mit einer Endkonzentration von 1,5 mg/ml zugegeben. Der pH der Mischung wurde auf pH = 5 eingestellt, um die Polypeptiduntereinheiten zu disassemblieren. Danach wurde der pH der Mischung langsam mit Natriumhydroxid (1 M) auf 7,4 eingestellt, um die Polypeptiduntereinheiten wieder zu assemblieren. Die resultierende Lösung wurde über Nacht in destilliertem Wasser dialysiert, um freie RV-Moleküle zu entfernen, was das Endprodukt (RV@Ft-RGD) ergab. Die Menge des beladenen RV wurde mit UV-Vis-Spektrophotometer (UV3100, Shimadzu, Japan) durch Überwachung des Absorptionspeaks bei 306 nm detektiert. RV-Beladungsverhältnis war (A_a − A_b)/A_c, wobei A_a, A_b und A_c das Gewicht des initialen, unbehandelten RV und Ft-RGD darstellen.

Charakterisierungen

Dynamische Lichtstreuung (DLS, BI-9000AT, Brookhaven, USA) wurde verwendet, um Größe und Zeta-Potenzial der Nanopartikel zu detektieren. Die Morphologie der Nanopartikel wurde mit Transmissionelektronenmikroskopie (TEM, JEM-100S, JEOL, Japan) beobachtet. Fluoreszenzspektren wurden mit Perkin-Elmer LS50B Lumineszenzspektrophotometer detektiert. Zelluläre Fluoreszenzsignale wurden mit kommerziellem Laserscanningmikroskop (LSM 510, Zeiss, Deutschland) und Durchflusszytometrie (FCM, EPICS XL, Beckman, USA) aufgezeichnet.

RV-Freisetzungsstudie

500 µl RV@Ft-RGD-Lösung wurde in ein D-Röhrchen (MWCO 6–8 kDa, Novagen) gegeben, und die Lösung wurde über verschiedene Puffer auf unterschiedliche pH-Werte eingestellt. Die Lösung wurde bei 37 °C dialysiert. Nach unterschiedlichen Inkubationszeiten wurden 1 ml Aliquote des Dialysats entnommen und durch 1 ml frisches Medium ersetzt. Das zu verschiedenen Inkubationszeiten freigesetzte RV wurde mit UV-Vis-Spektrophotometer bestimmt. Zusätzlich wurde RV@Ft-RGD in einer Spüllösung mit unterschiedlichen pH-Bedingungen (pH 5, 6,5, 7,4, 8,5) gelöst. Nach Inkubation bei 37 °C für 24 h wurde die Nanopartikelgröße mittels DLS charakterisiert.

Zellkultur

Menschliche Lungenkrebszellen A549 und NCI-H358 wurden von der Zellsammlung der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) bezogen und in DMEM-Medium mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin (PS) in feuchter Atmosphäre mit 5 % CO₂ bei 37 °C kultiviert.

Zelluläre Aufnahme und Lokalisation von RV@Ft-RGD

Als gängige Methode wurde FITC zur Markierung der Nanopartikel verwendet. FITC wurde in Ethanol-Lösung (2,0 mg/ml) gelöst und mit RV@Ft und RV@Ft-RGD wässriger Lösung (1,0 mg/ml) unter 4-stündigem Rühren in dunkler Umgebung bei Raumtemperatur gemischt. Die Mischung wurde über Nacht in destilliertem Wasser dialysiert, um überschüssiges FITC und Ethanol zu entfernen, was FITC-markierte RV@Ft und RV@Ft-RGD-Lösung ergab. Zur Bestätigung der Organell-Lokalisation der Nanopartikel in vitro wurden die mit FITC-markierten RV@Ft und RV@Ft-RGD für 5 h behandelten Zellen mit lysosomspezifischem Farbstoff Lyso Tracker Red (Invitrogen) gefärbt. Anschließend wurde die zelluläre Internalisierung von RV@Ft und RV@Ft-RGD mit einem CLSM beobachtet. Kurz gesagt, A549-Zellen wurden mit FITC-markierten RV@Ft und RV@Ft-RGD (gleiche FITC-Konzentration) für 5 h inkubiert. Dann wurden die Zellen mit Lyso Tracker Red-Lösungen (100 nM) bei 37 °C für 30 min behandelt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit einem kommerziellen Laserscanningmikroskop beobachtet. ImageJ-Software wurde verwendet, um die Fluoreszenzintensität der Zellen zu analysieren.

In vitro Tumorchemotherapie und Apoptosestudie

Zunächst wurde die Zytotoxizität des Carriers Ft-RGD durch einen standardisierten CCK-8-Test (Bestbio, China) bewertet. A549- und NCI-H358-Zellen (1 × 10⁵ Zellen/ml, 0,5 ml) wurden in 96-Well-Platten gesät und 24 h kultiviert. Nach Entfernen des alten Mediums wurden frische Medien mit 0, 0,01, 0,1, 0,5 und 1 mg/ml Ft-RGD 24 h mit A549- und NCI-H358-Zellen inkubiert. Die Zellen wurden dreimal vorsichtig mit PBS gewaschen. 100 µl CCK-8-Arbeitslösung (10 % CCK-8 + 90 % DMEM) wurde dann jedem Well zugegeben und 30 min bei 37 °C inkubiert. Absorptionswerte bei 450 nm wurden mit einem Mikroplatten-Spektrophotometer (Multiskan FC, Thermo Scientific) gemessen. Fotografien jeder Zellgruppe wurden mit einem optischen Mikroskop (Olympus) beobachtet.

Verschiedene Konzentrationen von freiem RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD und RV@Ft-RGD + RGD (0, 10, 20, 30 und 40 µg/ml RV-Äquivalente) wurden mit A549-Zellen behandelt. Nach 24 h Inkubation wurde die Vitalität der behandelten Zellen durch CCK-8-Test analysiert. Gleichzeitig wurden diese behandelten Zellen dual mit Apoptose-Nachweiskit (Annexin V-FITC/PI) gefärbt und per FCM analysiert.

Zirkulationszeit von RV@Ft-RGD im Blut

Freies RV oder RV@Ft-RGD (6 mg/kg RV-Äquivalent) wurde intravenös in gesunde Balb/c-Nacktmäuse (n = 5 pro Gruppe) injiziert. Nach der Injektion wurde das venöse Blut der Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und in ein blutentnahmeröhrchen mit Heparin gegeben, dann wurde das Plasma separiert. Die RV-Konzentration im Plasma wurde mit säurehaltigem Isopropanol-Reagenz extrahiert, und die Absorption bei 306 nm Anregung wurde gemessen, um die RV-Konzentration zu bestimmen.

Tiermodell und In vivo Tumorchemotherapie

Balb/c-Mäuse (4–6 Wochen alt) wurden von Charles River Laboratories (Beijing, China) bezogen. Alle tierexperimentellen Operationen erfolgen streng gemäß den Richtlinien für Pflege und Verwendung von Labortieren. Die Richtlinie wurde vom Tierpflege- und -nutzungsausschuss der Zhengzhou-Universität genehmigt. Zur Etablierung eines subkutanen Tumormodells von A549 wurden 2 × 10⁶ A549-Zellen subkutan in den Rücken der Mäuse injiziert. Sie wurden dann 7 bis 9 Tage im Tierhaus gehalten. Die Tumvolumenberechnungsformel ist Länge × Breite²/2.

Mäuse mit A549-Tumoren wurden zufällig in fünf Gruppen aufgeteilt. Jede Gruppe bestand aus fünf Mäusen. Die spezifischen Gruppierungen sind Kontrolle (Kochsalzlösung), RV, RV@Ft und RV@Ft-RGD. Zu Behandlungsbeginn wurde die Probe einmal täglich über den Schwanzvenen für drei aufeinanderfolgende Tage injiziert. Tumvolumen und Körpergewicht der Mäuse wurden alle 5 Tage aufgezeichnet. Nach 45 Tagen Behandlung wurden Tumore jeder Gruppe entnommen. Tumorgewebe wurden in 10 % Formalinlösung fixiert, geschnitten und dann Hämatoxylin-Eosin-(H&E)-Färbung unterzogen.

In vivo Biokompatibilität

200 µl RV@Ft-RGD wurde über den Schwanzvenen in gesunde Balb/c-Mäuse injiziert (RV-Dosis 15 mg/kg). Gesunde Mäuse, die auf gleiche Weise mit physiologischer Kochsalzlösung injiziert wurden, dienten als Blankokontrollgruppe. An den Tagen 0, 10 und 45 nach Injektion wurde Mäuseblut zur Auswertung von Zellzahlen einschließlich weißer Blutkörperchen (WBC), roter Blutkörperchen (RBC), Hämoglobin (HGB), mittlerem Thrombozytenvolumen (MPV), mittlerem erythrozytärem Hämoglobin (MCH), Hämatokrit (HCT), mittlerer erythrozytärer Hämoglobinkonzentration (MCHC), mittlerem erythrozytärem Volumen (MCV) und Thrombozyten (PLT) entnommen. Zusätzlich wurden Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere gesunder Mäuse jeder Gruppe am 45. Tag für H&E-Färbung entnommen.

Statistische Analyse

Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (s.d.) dargestellt. Statistische Analyse der Proben wurde mit Student's t-Test durchgeführt, und p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung von RV@Ft-RGD

RV-Beladung und -Freisetzung aus RV@Ft-RGD erfolgte über die pH-induzierte reversible Disassemblierung und Reassemblierung von Ft (Abb. 1). Zunächst wurde Ferritin mit dem Tumor-Targeting-Peptid RGD konjugiert, um Ft-RGD zu bilden. Dies wurde dann in Acetatpuffer (pH = 5) redissolviert, um die Polypeptiduntereinheiten zu disassemblieren und eine hohle poröse Sphäre zu bilden. RV-Moleküle wurden dann hinzugefügt und durften in die Kavität eindringen, wonach die Lösung langsam auf pH ≈ 7,4 eingestellt wurde, um Ft wieder zu assemblieren und die RV-Moleküle im versiegelten Ft-Hohlraum einzuschließen. Wenn der pH des Puffers dann auf ~5 verringert wurde, öffneten sich die Nanoporen reversibel und gaben ihre RV-Moleküle frei. Abbildung 2a und Zusatzdatei 1: Abbildung S1 zeigen SEM- und TEM-Bilder des assemblierten RV@Ft-RGD, das eine kugelförmige Struktur aufwies. Laut DLS-Analyse hatten RV@Ft-RGD-Partikel größere Durchmesser (~22,5 nm) im Vergleich zu rohen Ft-Nanopartikeln (~11,8 nm) (Abb. 2b) und ähnliche Zeta-Potenziale wie rohe Ft-Nanopartikel (−29,6 mV) (Abb. 2c). Nach 20 Tagen zeigte der Polydispersitätsindex (PDI) von RV@Ft-RGD in Wasser, FBS, Zellmedium und PBS keine signifikante Änderung (Abb. 2d), was darauf hinweist, dass RV@Ft-RGD bemerkenswerte kolloidale Stabilität besaß. Abbildung 2e zeigt die Absorptionsspektren von freiem RV, Ft-RGD und RV@Ft-RGD. Wie zu sehen ist, wies das Absorptionsspektrum von RV@Ft-RGD im Vergleich zu RV und Ft-RGD einen neuen Peak bei 306 nm (stammend von RV) auf, was die erfolgreiche Beladung von RV anzeigte. Zudem zeigte RV@Ft-RGD eine ähnliche signifikante Emissionsfluoreszenz wie freies RV bei 400 nm bei Anregung mit 325 nm Laser (Abb. 2f).

Arzneimittelbeladung und -freisetzung

Die maximale Beladungskapazität von Ft-RGD betrug 252,6 %, wahrscheinlich aufgrund der großen Kavität im hohlen Ft-RGD. Da Ft pH-sensitiv ist, konnten wir die RV-Beladungskapazität unter verschiedenen pH-Bedingungen charakterisieren. Wie in Abb. 3a gezeigt, nahm die RV-Beladungseffizienz mit steigendem pH von 5,0 auf 8,5 drastisch ab. Die RV-Freisetzung aus dem Komplex wurde ebenfalls unter verschiedenen pH-Werten von 5,0 bis 8,5 charakterisiert. Ein pH-wert- und zeitabhängiges RV-Freisetzungsprofil wurde aus diesen Daten erstellt und in Abb. 3b dargestellt. Die maximale Arzneimittelfreisetzungsrate (51,6 %) trat bei pH = 5,0 für 24 h auf, was höher war als bei pH = 6,5, 7,4 und 8,5. Laut entsprechenden Berichten entsprechen pH-Werte von 5,0, 6,5 und 7,4 typischerweise Zelllysosomen, Tumorgewebe, Blut und normaler physiologischer Umgebung. Unter physiologischen Bedingungen (pH 7,4) blieb der RV-Arzneimittelgehalt von RV@Ft-RGD sogar nach 50 h hoch (Abb. 3c), was darauf hindeutet, dass das RV in RV@Ft-RGD stabil ist und nicht leicht ausläuft. Zusätzlich untersuchten wir die Durchmesseränderung von RV@Ft-RGD unter verschiedenen pH-Bedingungen. Nach Inkubation bei 37 °C für 12 h zeigte DLS-Analyse, dass der Durchmesser von RV@Ft-RGD bei pH 8,5 und 7,4 nahezu konstant bei ~23 nm blieb. Bei Absenkung des pH-Werts auf 6,5 und 5,0 stieg der Durchmesser auf 25 nm bzw. 28,6 nm (Abb. 3d). Diese Ergebnisse bestätigen das Verhalten der pH-induzierten reversiblen Disassemblierung und Reassemblierung von RV@Ft-RGD, was für kontrollierbare Arzneimittelbeladung in vitro und Arzneimittelfreisetzung im Tumorgewebe vorteilhaft ist.

In vitro zelluläre Aufnahme und Lokalisation

Die in vitro zelluläre Aufnahme und Lokalisation von RV@Ft-RGD wurde dann bewertet. Zunächst wurden RV@Ft und RV@Ft-RGD durch Wasserstoffbrückenbindung und physikalische Adsorption mit FITC markiert. Wie in Abb. 4a gezeigt, zeigten Zellen, die mit freiem FITC behandelt wurden, vernachlässigbare zytoplasmatische Fluoreszenzsignale. Im Gegensatz dazu zeigten RV@Ft-RGD-behandelte Zellen intensive grüne FITC-Fluoreszenz, die höher war als die von RV@Ft-behandelten Zellen. Bemerkenswert war, dass RV@Ft-RGD-behandelte und RGD-vorbehandelte Zellen beide geringe grüne Fluoreszenz zeigten. Aus diesen Ergebnissen können wir schließen, dass RV@Ft-RGD in hoher Menge von Zellen aufgenommen wurde, wahrscheinlich durch einen RGD-vermittelten aktiven Targetingeffekt. Diese behandelten Zellen wurden auch per FCM analysiert, die Ergebnisse sind in Abb. 4b gezeigt. Statistische Ergebnisse der zellulären Fluoreszenzintensität deuten auf einen ähnlichen Schluss hin.

Um die Organell-Lokalisation von RV@Ft-RGD zu untersuchen, wurde ein lysosomspezifischer Färbstoff (Lyso Tracker Red) verwendet, um die mit Nanopartikeln inkubierten Zellen zu färben. Wie in Abb. 4a zu sehen, zeigte das Zytoplasma in allen Gruppen starke rote Fluoreszenz. Nach Überlagerung mit grüner FITC-Fluoreszenz zeigte RV@Ft-RGD die intensivste gelbe (grün + rot) Fluoreszenz im Zytoplasma unter diesen Gruppen. Basierend auf statistischer Analyse hatte die RV@Ft-RGD-behandelte Gruppe den höchsten Colokalisationskoeffizienten zwischen FITC- und Lyso Tracker Red-Fluoreszenz (Abb. 4c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass RV@Ft-RGD aktiv in Zellen eintreten und dann in die saure Umgebung des Lysosoms (pH ≈ 5,0) transportiert werden kann. Diese Vorzüge, zusammen mit der pH-responsiven Arzneimittelfreisetzung, verleihen RV@Ft-RGD viele potenzielle Anwendungen für in vivo Tumortherapie.

In vitro Biokompatibilität und Tumortherapie

Vor Untersuchung der antitumorale Eigenschaften von RV@Ft-RGD wurde die Zytotoxizität des Ft-RGD-Carriers untersucht. Wie in Abb. 5a und Zusatzdatei 1: Abb. S2 und S3 gezeigt, zeigte Ft-RGD keine offensichtliche Vitalitätsunterdrückung bei Lungenkrebs-A549- und NCI-H358-Zellen bei Konzentrationen bis zu 1 mg/ml. Die Zellmorphologie zeigte ebenfalls keine signifikante Veränderung, wenn 1 mg/ml behandelte Zellen mit Kontrollgruppen verglichen wurden (Abb. 5b), was klar darauf hindeutet, dass Ft-RGD als Carrier hervorragende Biokompatibilität besaß. Wie in Abb. 6a, b gezeigt, töteten freies RV, RV@Ft und RV@Ft-RGD alle Zellen in konzentrationsabhängiger Weise. RV@Ft-RGD-behandelte Zellen zeigten stärkere Vitalitätsabnahme und hatten nur 11,2 % Zellvitalität in der 40 µg/ml-Gruppe, was niedriger war als bei RV@Ft- und RV@Ft-RGD + RGD-vorbehandelten Gruppen. Eine vorläufige FCM-Studie zeigte weiter, dass mit entweder RV allein, RV@Ft oder RV@Ft-RGD die Mehrheit der Zelltode über Apoptose vermittelt wurde (Abb. 6c). Diese Ergebnisse demonstrieren, dass der tumorzelltötende Effekt von RV durch Beladung in Ft-RGD stark verstärkt wurde, hauptsächlich aufgrund der erhöhten Akkumulation von RV@Ft-RGD im Lysosom, wo saure pH-Bedingungen eine erhöhte Freisetzung von apoptoseförderndem RV in das Zytoplasma auslösten.

Blut-Halbwertszeit von RV@Ft-RGD

Die RV-Konzentration im Blutplasma zu verschiedenen Zeitpunkten nach Injektion wurde in freiem RV- und RV@Ft-RGD-behandelten Gruppen untersucht. Wie in Abb. 7a gezeigt, betrug die Blut-Halbwertszeit von RV@Ft-RGD 5,1 ± 0,23 h. Freies RV hatte einen schnelleren Clearance aus dem Kreislauf mit einer Blut-Halbwertszeit von nur 0,43 ± 0,11 h. Die signifikant verlängerte Halbwertszeit von RV@Ft-RGD im Blut ist vorteilhaft für die Verbesserung der Arzneimittelretention im systemischen Kreislauf und erleichtert die Akkumulation von Medikamenten an Tumorstellen.

In vivo Antitumor-Effekt und systemische Toxizität von RV@Ft-RGD

Abbildung 7b zeigt das Tumowachstumsprofil tumorbelasteter Mäuse mit verschiedenen Behandlungen, ausgedrückt als relatives Tumovolumen. Tumowachstum wurde in gewissem Grad gehemmt bei Behandlung mit RV@Ft, wahrscheinlich aufgrund der geringen Aufnahme von RV@Ft. In der mit RV@Ft-RGD behandelten Gruppe wurde das Tumowachstum im Vergleich zu den anderen Gruppen (Kontrolle, RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD) signifikant unterdrückt. Während der Behandlung gab es in keiner Experimentgruppe einen nennenswerten Körpergewichtsverlust (Abb. 7c), was die hohe Biosicherheit von RV@Ft-RGD anzeigt. Nach Behandlungsende wurde H&E-Färbung von Tumorgewebe in diesen Gruppen durchgeführt, um die chemotherapeutischen Effekte zu untersuchen. Wie in Abb. 7d gezeigt, wurde ein großer Apoptosebereich in Tumoren beobachtet, die mit RV@Ft-RGD behandelt wurden, was im signifikanten Kontrast zu nur kleinen Apoptosebereichen in Tumoren steht, die mit freiem RV, RV@Ft und RV@Ft-RGD + RGD behandelt wurden. Zusätzlich wurde die systemische Toxizität von RV@Ft-RGD an normalen Mäusen bewertet. Vollblutproben von Kochsalzlösung- und RV@Ft-RGD-behandelten gesunden Mäusen wurden an Tagen 0, 10 und 45 nach Injektion für Blutanlyse entnommen. Wie in Abb. 8a, b gezeigt, zeigten die vollständigen Blutbilder (WBC, RBC, HGB, MPV, MCH, HCT, MCV, PLT, MCHC) von RV@Ft-RGD-injizierten Mäusen keine signifikanten Unterschiede von Tag 0 bis Tag 45. Die Hauptorgane gesunder Mäuse, die mit Kochsalzlösung und RV@Ft-RGD behandelt wurden, wurden ebenfalls am 45. Tag für H&E-Färbung entnommen. In diesen Geweben wurden keine offensichtlichen Nebenwirkungen gefunden (Abb. 8c), was vernachlässigbare langfristige Toxizität nahelegt. All diese Ergebnisse demonstrieren das vielversprechende Potenzial von RV@Ft-RGD für verbesserte Krebschemotherapie in vivo.

Fazit

Zusammenfassend haben wir erfolgreich ein pH-induziertes reversibles Assembliesystem (PIRAS) mit pH-kontrollierbarer Beladung und Freisetzung des Antitumormedikaments RV für verbesserte tumorzielgerichtete Chemotherapie entwickelt. Unter sauren Bedingungen (pH = 5,0) kann das System disassemblieren und RV beladen oder freisetzen, während es unter neutralen Bedingungen (pH = 7,4) hochstabil ist und vernachlässigbares Arzneimittelleck aufweist. Durch den RGD-vermittelten Targetingeffekt kann RV@Ft-RGD in hoher Konzentration von A549-Zellen aufgenommen werden und im Lysosom akkumulieren, was für RV-Freisetzung sowohl in vitro als auch in vivo vorteilhaft ist. Aufgrund der Akkumulation von RV@Ft-RGD im Lysosom und der sauren lysosomalen pH-getriggerten Freisetzung von RV in das Zytoplasma zeigte RV@Ft-RGD exzellente tumorzelltötende und apoptosefördernde Effekte im Vergleich zu freiem RV. Zusätzlich zeigte RV@Ft-RGD nach Beladung von RV in Ft-RGD eine viel längere Blut-Halbwertszeit als freies RV. In vivo Ergebnisse demonstrieren, dass RV@Ft-RGD bemerkenswerte Tumorsuppression und keine nennenswerte systemische Toxizität aufweist. Diese Studie legt nahe, dass Ft-basiertes PIRAS hocheffizient in Arzneimittelbeladung und -freisetzung für verbesserte Antikrebs-Therapie ist.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die in diesem Manuskript gezogenen Schlussfolgerungen basieren auf den Daten, die alle in diesem Papier präsentiert und gezeigt werden.

Abkürzungen

BSA:

Bovines Serumalbumin (Bovine serum albumin)

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

DLS:

Dynamische Lichtstreuung (Dynamic light scattering)

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid

FBS:

Fetales Kälberserum (Fetal bovine serum)

FITC:

Fluoresceinisothiocyanat (Flourescein isothiocyanate)

Ft:

Ferritin

HCT:

Hämatokrit (Hematocrit)

HGB:

Hämoglobin (Hemoglobin)

MCH:

Mittleres korpuskuläres Hämoglobin (Mean corpuscular hemoglobin)

MCHC:

Mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration (Mean corpuscular hemoglobin concentration)

MCV:

Mittleres korpuskuläres Volumen (Mean corpuscular volume)

MPV:

Mittleres Thrombozytenvolumen (Mean platelet volume)

NHS:

N-Hydroxysuccinimid (N-hydroxysuccinimide)

PIRAS:

pH-induziertes reversibles Assembliesystem (pH-induced reversible assembly system)

PLT:

Thrombozyten (Platelet)

RBC:

Rote Blutkörperchen (Red blood cells)

RGD:

Arg-Gly-Asp

RV:

Resveratrol

WBC:

Weiße Blutkörperchen (White blood cell)