Neuer dualer mitochondrialer und CD44-Rezeptor, der auf Nanopartikel für die Redox-Stimuli-getriggerte Freisetzung abzielt

Hintergrund

Um eine wirksame Krebsbehandlung zu erreichen, wurden in den letzten Jahren viele Wirkstoffabgabesysteme [1] untersucht, um multifunktionale Polymer-Wirkstoffträger mit Makromolekülen mit strukturellen Modifikationen herzustellen, die viele Vorteile bringen könnten, wie z. B. die Verbesserung der Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen durch Verringerung ihrer Abbaurate , verbessert die zelluläre Aufnahme, ermöglicht eine gezielte und kontrollierte Wirkstofffreisetzung und reduziert Nebenwirkungen [2, 3].

Curcumin (Cur), eine diphenolische Verbindung, wurde aus der traditionellen chinesischen Medizin Curcuma longa . isoliert . Im Vergleich zu allgemeinen Anti-Tumor-Medikamenten hatte Cur breite Anti-Tumor-Wirkungen auf viele Tumore wie Prostata-, Brust- und Dickdarmkrebs und eine relativ geringere Zytotoxizität [4]. Aber seine unzureichende Löslichkeit, Instabilität und schlechte Bioverfügbarkeit schränken seine klinische Anwendung extrem ein [5, 6]. Um die Löslichkeit und Bioverfügbarkeit hydrophober Medikamente zu verbessern, wurden viele gut gestaltete Nanomaterialien durch Einbau hydrophober Medikamente und hydrophiles Material oligomere Hyaluronsäure (oHA) hergestellt [7]. Wir entwarfen eine Art amphipathischer Polymer-Wirkstoff-Konjugate als Nanocarrier, indem wir Curcumin über Selbstorganisation in Polymermizellen geladen haben, die eine gute Stabilität aufweisen und die Halbwertszeit des Wirkstoffs im Blutkreislauf verlängern können. Mizellen mit kleiner Partikelgröße können sich durch den EPR-Effekt der Tumorangiogenese passiv an soliden Tumoren anreichern, um einen besseren Behandlungseffekt zu erzielen [8, 9].

oHA, ein kleines Molekül, das aus dem Abbau von HA gewonnen wird, besitzt einzigartige Eigenschaften, wie gute Hydrophilie, Biokompatibilität, Stabilität im Plasma und Ausrichtung auf den CD44-Rezeptor in der Zelloberfläche [7, 10, 11], während CD44-Rezeptoren überexprimiert werden in Lungenkrebszellen und Brustkrebszellen, verglichen mit einer geringeren Expression in den normalen Zellen [12]. Die Tumorzellen haben die einzigartigen zellulären Signale, einschließlich Glutathion (GSH, 2–10 mM), niedrigen pH-Wert und einige Enzyme, im Gegensatz zu normalen menschlichen Zellen [13,14,15,16,17,18,19,20 ], während Disulfidbrücken eine Reduktionsempfindlichkeit aufweisen und unter der Einwirkung von reduziertem GSH im Zytoplasma brechen können [21, 22].

Mitochondrien sind die lebenswichtigen Organellen für das Überleben von Zellen und spielen eine wichtige Rolle bei der Energieproduktion und den apoptotischen Signalwegen [23,24,25,26,27]. Daher wurden Mitochondrien in früheren Berichten lange Zeit als subzelluläre Ziele für die Krebsbehandlung angesehen [28]. Aufgrund des höheren Membranpotentials der Mitochondrien unter den Zellorganellen können Triphenylphosphin, Triphenylmethylphosphonium und andere Arten von lipophilen Kationen durch ihre hydrophile Barriere der Lipiddoppelschicht leicht in den Mitochondrien angereichert werden [29, 30].

Um die Löslichkeit von Cur und die Spezifität für Krebszellen zu verbessern, wurden in dieser Arbeit Polymer-Wirkstoff-Konjugate, bestehend aus oHA, TPP, Disulfidbrücken und Cur, entwickelt und synthetisiert, die spezifisch auf den CD44-Rezeptor und die Mitochondrien abzielen . Es hatte auch eine Reduktionsempfindlichkeit und kann als Fluoreszenzmarker verwendet werden. Dieser multifunktionale neuartige Nanocarrier wurde nach (5-Carboxypentyl)triphenylphosphoniumbromid, oligomerer Hyaluronsäure, Disulfidbindung und Curcumin (TPP-oHA-S-S-Cur) benannt. Cur wurde durch Selbstorganisation in Wasser in TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen geladen [1, 31]. Die polymeren TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen, in denen Cur verkapselt ist (im Folgenden als Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen bezeichnet) könnten die therapeutische Wirksamkeit und die Arzneimittelbeladung von Curcumin verstärken sowie die Nebenwirkungen verringern. Nachdem die Cur/TPP-oHA-SS-Cur-Mizellen gezielt auf das Tumorgewebe eingedrungen waren, drangen sie durch CD44-vermittelte Endozytose in die Zellen ein schnelle Freisetzung des Arzneimittels (Abb. 1). Hier können wir eine Hypothese aufstellen, dass diese neuartigen mitochondrialen und CD44-Rezeptoren, die auf Redox-sensitive multifunktionale Nanopartikel mit dualem Targeting ausgerichtet sind, eine neue Plattform für ein auf Tumore ausgerichtetes Wirkstoffabgabesystem darstellen. Nach der Vorbereitung der Micellen wurden in dieser Studie einige Voruntersuchungen zu den Eigenschaften der Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Micellen durchgeführt.

Schematische Darstellung von mitochondrialen und CD44-Rezeptor-Dual-Targeting-redoxsensitiven Nanopartikeln

Methoden

Materialien

Curcumin (Cur, Shanghai Zhanyun Chemical Co. Ltd); oligomere Hyaluronsäure (oHA, Mn =10 kDa, Shandong Freda Biological Engineering Co. Ltd.); 3,3'-Dithiodipropionsäure wurde von Adamas Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China) bereitgestellt. (5-Carboxypentyl)triphenylphosphoniumbromid (TPP), wasserfreies Tetrahydrofuran (THF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Triethylamin (TEA), 1-Ethyl-(3-zwei Methylaminopropyl) karbonisiertes Carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) wurden von Aladdin Chemistry Co. Ltd. bezogen. Alle anderen Reagenzien waren von analytischer Qualität und wurden von Sinopharm Group Chemical Reagent Corp. geliefert.

Synthese und Charakterisierung von TPP-oHA-S-S-Cur

Die multifunktionalen Nanoträger wurden in drei Schritten synthetisiert, wie in Abb. 2 gezeigt.

Syntheseroute von TPP-oHA, S-S-Cur und TPP-oHA-S-S-Cur

Schritt 1

TPP wurde mit oHA über eine Esterbindung unter Verwendung einer zuvor beschriebenen Methode kombiniert [32]. Zuerst wurden TPP, EDC und DMAP in DMSO gelöst, um 1 h lang bei 60 °C zu reagieren. Dann wurde oHA in DMSO:H₂ . gelöst O (v /v = 1:1) und fügte die obige Reaktion 8 h bei Raumtemperatur hinzu. Die Reaktionsmischung wurde mit einem Dialysebeutel (MWCO 2000 Da) in entionisiertem Wasser 48 h lang dialysiert, um die Verunreinigungen zu entfernen, und lyophilisiert, um TPP-oHA-Polymere zu erhalten.

Schritt 2

Kurz gesagt wurde 3,3'-Dithiodipropionsäure in THF gelöst und durch Oxalylchlorid aktiviert. Dann wurde die Mischung mit Cur, katalysiert durch TEA, umgesetzt. Das erhaltene Produkt wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie isoliert, um das reine Produkt S-S-Cur zu erhalten.

Schritt 3

S-S-Cur, EDC und DMAP wurden in DMSO gelöst und 2 h bei 60 °C aktiviert, und dann wurde TPP-oHA in die obige Lösung gegeben und 24 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Mischung wurde in destilliertem Wasser mit einem Dialyseschlauch (MWCO 2000 Da) 48 h lang dialysiert, gefolgt von einer Lyophilisierung, um das Endprodukt TPP-oHA-S-S-Cur zu erhalten.

Die Strukturen von TPP-oHA, S-S-Cur und TPP-oHA-S-S-Cur wurden mit ¹ . bestätigt HNMR (Advance Bruker 400M; Switzerland Bruker Company, Madison, WI, USA) unter Verwendung von deuteriertem DMSO-d₆ , CD₃ Cl und DMSO-D₆ :D₂ O (DMSO-d₆ :D₂ O = 1:1, v /v ) jeweils als Lösungsmittel.

Herstellung und Charakterisierung von Mizellen

Die TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen und die oHA-Cur-Mizellen wurden beide durch Dialyseverfahren hergestellt [33]. Zunächst wurden TPP-oHA-S-S-Cur (10 mg) und Curcumin (1,5 mg) in Formamid (6 ml) gelöst. Dann dialysierte die Mischung in entionisiertem Wasser mit einem Dialysebeutel (MWCO 2000 Da) im Dunkeln für 24 h, um die organischen Lösungsmittel zu entfernen. Danach wurde die dialysierte Lösung bei 2500 U/min für 10 Minuten zentrifugiert, um unbeladenes Cur zu entfernen. Schließlich wurde die Micellensuspension durch 0,45 µm Spritzenfiltermembranen filtriert. Die einzelnen funktionellen oHA-Cur-Mizellen wurden nach dem gleichen Verfahren erhalten.

Die Teilchengröße, das Zetapotential und der Polydispersitätsindex (P.I.) von Cur-beladenen Micellen wurden von Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.) beobachtet. Die Morphologie von Cur-beladenen Micellen wurde durch ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM, H-600; Hitachi, Tokyo, Japan) überwacht. Die Stabilität von Cur-beladenen Micellen wurde in PBS mit 20 % FBS von Delsa Nano C durchgeführt.

Die Einschlusseffizienz (EE) und die Wirkstoffbeladung (DL) wurden durch das Membranfiltrationsverfahren gemessen. Nach dem Filtern durch eine 0,45 μm-Membran wurde die erhaltene Lösung durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC, Agilent Technologies) bei 425 nm gemessen, um EE und DL zu erhalten. Die Gleichungen zur Berechnung von EE und DL der Micellen waren wie folgt:

In-vitro-Wirkstofffreisetzung in Gegenwart von GSH

Die intrazelluläre GSH-Redox-Reaktionsfähigkeit von Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen wurde unter Verwendung der Dialysemethode bewertet. Vier Milliliter der Cur/TPP-oHA-SS-Cur-Mizellensuspensionen (50 μg Curcumin/ml) wurden in einen Dialysebeutel (MWCO 7000 Da) gegeben und gegen 45 ml PBS (pH 7,4, enthaltend 45 % fötales Rinderserum) dialysiert und 0,5 % Tween 80) mit unterschiedlichen GSH-Werten (0, 10, 2 und 10 mM). Die Proben in Zentrifugenröhrchen wurden bei 37 °C in einem Schüttelinkubator (BS-2F, Changzhou, China) mit 100 U/min aufbewahrt. In vordefinierten Zeitintervallen (0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 und 120 h) wurden 2 ml Freisetzungsmedium aus den Zentrifugenröhrchen entnommen und mit einem gleichen Volumen von . aufgefüllt entsprechende frische Medien und die Konzentrationen von Cur wurden durch HPLC analysiert. Jedes Experiment wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt.

Zellkultur

Menschliche MDA-MB-231-Brustkarzinomzellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Hyclone), das 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthielt, kultiviert. CD44-Rezeptoren wurden in MDA-MB-231-Zellen stark exprimiert, daher wurden MDA-MB-231-Zelllinien ausgewählt und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ . kultiviert Atmosphäre ergänzt.

In-vitro-Zytotoxizitäts-Assays

Der In-vitro-Zytotoxizitätstest von TPP-oHA-S-S-Cur wurde mit der MTT-Methode bewertet [32]. MDA-MB-231-Zellen (hochexprimierter CD44-Rezeptor) wurden in einer Dichte von 1 × 10 ⁴ . kultiviert Zellen/Well in 96-Well-Platten. Einhundert Mikroliter freies Cur, Cur/oHA-Cur-Mizellen und Cur/TPP-oHA-SS-Cur-Mizellen, einschließlich verschiedener Konzentrationen von Cur (0,5, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 und 40 μg/ml) waren verschiedenen Wells zugesetzt, während PBS als Kontrolle zugegeben wurde. Nach 24 h Inkubation wurden 100 μl MTT-Lösung (5 mg/ml) in jede Vertiefung gegeben und dann 4 h inkubiert. Dann wurde MTT durch 100 μL DMSO ersetzt und in einen Schüttelinkubator gegeben, um den Formazan-Kristall aufzulösen. Nach 20 Minuten Inkubation wurde die Extinktion mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA) bei 570 nm gemessen.

In-vitro-zelluläre Aufnahme und die mitochondriale Lokalisation

Qualitative Analysen der zellulären Aufnahme von Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen und Cur/oHA-Cur-Mizellen wurden unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie (Eclipse E400; Nikon Corporation, Tokio, Japan) beobachtet. MDA-MB-231-Zellen wurden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 5000 Zellen pro Well ausgesät und mit DMEM (1 ml) mit 10 % FBS inkubiert und dann 24 h bei 37 °C in 5 % CO _{. kultiviert 2} . Danach wurde frisches Kulturmedium (1 ml) mit arzneimittelbeladenen Mizellen (Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen und Cur/oHA-Cur-Mizellen) in jede Vertiefung gegeben. Zellen wurden mit freiem Cur kultiviert, das als Kontrolle diente; die endgültige Cur-Konzentration betrug 20 μg/ml. Darüber hinaus wurden die Zellen für unterschiedliche Zeitintervalle mit Wirkstoff inkubiert. Dann wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und 15 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert.

Um die CD44-Targeting-Fähigkeit von Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen zu bewerten, wurde dem Medium zusätzlich HA (2 mg/ml) als Kontrollgruppe hinzugefügt, um an die CD44-Rezeptoren zu binden.

Um die Zellmitochondrien zum Auffinden von Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Micellen und Cur/oHA-Cur-Micellen innerhalb der Zellen zu markieren, wurden die Zellen außerdem 15 min lang mit einem mitochondrialen Tracker (Mito-tracker Red CMXROS) inkubiert. Schließlich wurden die Zellen dreimal gewaschen und durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet.

Durchflusszytometrie

Die quantitativen Analysen wurden mittels Durchflusszytometrie gemessen. MDA-MB-231-Zellen wurden in einer Dichte von 10 ⁵ . in Sechs-Well-Platten ausgesät Zellen/Vertiefung in 2 ml Medium mit 10 % FBS und wie oben beschrieben behandelt. Nach Inkubation mit Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen und Cur/oHA-Cur-Mizellen (20 μg Cur/ml) für verschiedene Zeitintervalle wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und mit 0,25% Trypsin trypsiniert. Dann wurden die Zellen bei 1500 U/min für 5 Minuten zentrifugiert. Nach Resuspension in PBS (0,5 ml) wurden die Zellen durch Durchflusszytometrie (EPICS XL, Beckman, USA) analysiert.

Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwerte ± SD (n = 3). Darüber hinaus wurde SPSS-Software (Ver. 20, USA) verwendet; die Daten wurden auf signifikante Unterschiede bei Wahrscheinlichkeiten von *p . analysiert < 0,05 (signifikant) mit Einweg-Variationsanalyse (ANOVA).

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung von Trägermaterialien TPP-oHA-S-S-Cur

Die Synthesewege von TPP-oHA, S-S-Cur und TPP-oHA-S-S-Cur sind in Abb. 2 dargestellt.

Außerdem ist die ¹ HNMR-Spektren von oHA, TPP-oHA, S-S-Cur und TPP-oHA-S-S-Cur sind in Abb. 3 zu sehen. TPP-oHA wurde durch TPP und oHA synthetisiert. Charakteristische Peaks von drei Benzolringen in TPP wurden bei 7,570–7,717 ppm in der ¹ . beobachtet HNMR-Spektrum von TPP-oHA, das bestätigte, dass TPP-oHA erfolgreich synthetisiert wurde. Außerdem wurde S-S-Cur von 3,3'-Dithio-dipropionsäure und Cur synthetisiert. Darüber hinaus wurde TPP-oHA-S-S-Cur von TPP-oHA und S-S-Cur synthetisiert. Der TPP in TPP-oHA-S-S-Cur wurde im Bereich zwischen 7,570 und 7,717 ppm beobachtet. Die charakteristischen Spitzen von Cur wurden in der ¹ . beobachtet HNMR-Spektrum von S-S-Cur und TPP-oHA-S-S-Cur bei 6,795–7,467 ppm und der Protonenpeak (-CH₂ -S-S-CH₂ -) von 3,3-Dithiodipropionsäure wurde bei 2,502 ppm gemäß TPP-oHA-S-S-Cur beobachtet. Diese Ergebnisse bestätigten die erfolgreiche Synthese von TPP-oHA-S-S-Cur.

¹ HNMR-Spektren von oHA, TPP-oHA, S-S-Cur und TPP-oHA-S-S-Cur

Vorbereitung und Bewertung von TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen

Die Partikelgröße, der Polydispersitätsindex, die Zetapotentiale, DL und EE der arzneistoffbeladenen Micellen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die durchschnittlichen Größen der Cur/oHA-Cur-Micellen und Cur/TPP-oHA-SS-Cur-Micellen betrugen 145,5 ± 2,1 bzw. 122,4 ± 4,6 nm. Dies könnte daran liegen, dass TPP die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Oberfläche von Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Micellen veränderte, was zu den Unterschieden von zwei Micellen führte. Und die DL und EE von Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen waren höher als die der gewöhnlichen Micellen, die durch TPP-oHA hergestellt wurden. Darüber hinaus hatten die Cur/TPP-oHA-SS-Cur-Mizellen ein stärkeres negatives Zetapotential (− 21,56 ± 1,46 mV) als die Cur/oHA-Cur-Mizellen (− 19,17 ± 0,55 mV), was auf eine verbesserte Stabilität von TPP-oHA . hindeutet -SS-Cur aufgrund der Aggregation von Mizellen, die hauptsächlich durch die Anwesenheit von TPP verursacht wird.

Darüber hinaus wurden das Aussehen, die Partikelgrößenverteilung, das Zetapotential und die TEM-Bildcharakterisierung von TPP-oHA-SS-Cur-Mizellen in Abb. 4 gezeigt. Die Ergebnisse zeigten, dass Cur/TPP-oHA-SS-Cur-Mizellen ungefähr kugelförmig waren ( Abb. 4d), homogen verteilt (Abb. 4b) und hatte einen durchschnittlichen Durchmesser von ungefähr 122,4 ± 4,6 nm. Darüber hinaus war der Polydispersitätsindex der Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Micellen 0,132 kleiner als 0,2, was auf die Einheitlichkeit der Micellengröße hinweist, die mit TEM übereinstimmt (Abb. 4c).

Aussehen (a ), Partikelgrößenverteilung (b ), Zetapotential (c ) und TEM-Bild (d ) Charakterisierung von TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen

Wie in Tabelle 1 gezeigt, war die Partikelgröße von Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen in PBS kleiner als in PBS, die FBS enthielten. Von 2 bis 24 h hatte sich die Größe in PBS mit FBS von 133,45 ± 6,8 auf 160,27 ± 7,1 nm geändert. Dieses Phänomen zeigte, dass Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen eine bessere Stabilität in vivo aufrechterhalten könnten.

Studie zur In-vitro-Medikamentenfreisetzung von Mizellen

Die Redox-Sensibilität von TPP-oHA-S-S-Cur wurde an Mizellen in verschiedenen GSH-Konzentrationen untersucht. Die Cur-Freisetzung aus Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen in Gegenwart oder Abwesenheit von GSH wurde durchgeführt, um die Tumorumgebungen zu simulieren. Wie in Abb. 5 gezeigt, wurden im Medium ohne GSH innerhalb von 120 h nur 32,5 % Cur aus dem TPP-oHA-SS-Cur freigesetzt, und die Zugabe von 10 μM GSH zum Medium führte nur zu einem leichten Anstieg (37 %) . Im Gegensatz dazu betrug die Wirkstofffreisetzung von Gruppen mit 2 mM GSH und 10 mM GSH 57,5 ​​bzw. 75,3 %. Dabei wurde nachgewiesen, dass die Wirkstofffreisetzung mit der GSH-Konzentration gesteigert wurde. Dieses Ergebnis wurde der Unterbrechung der Disulfidbindung von TPP-oHA-S-S-Cur zugeschrieben, was darauf hinwies, dass die Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Micellen eine Reduktionsempfindlichkeit aufwiesen.

In-vitro-Freisetzung von Cur-beladenen TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen bei verschiedenen GSH-Konzentrationen (n = 3)

Zytotoxizitätsstudien

Die Zytotoxizität verschiedener Curcumin-Formulierungen in MDA-MB-231-Zellen wurde durch MTT-Assay untersucht. Wie in Abb. 6 gezeigt, hatten unterschiedliche Konzentrationen von Curcumin-Formulierungen nach 24 Stunden unterschiedliche Zelllebensfähigkeit. Die mit Cur beladenen Micellen waren weniger toxisch als das freie Cur, was damit erklärt werden konnte, dass das polymere Material die Zellzytotoxizität stark verringerte. Unterdessen zeigte Fig. 6b ein konzentrationsabhängiges Zelllebensfähigkeitsprofil, während Cur/TPP-oHA-SS-Cur-Mizellen die geringste Zelllebensfähigkeit aufwiesen als Cur/oHA-Cur-Mizellen und andere Formulierungen, was erklärt werden konnte, dass Cur/TPP- oHA-SS-Cur-Mizellen konnten leicht in die Zellen eindringen und den Wirkstoff unter GSH-Wirkung freisetzen. Der IC₅₀ Werte von freiem Cur, Cur/oHA-Cur-Micellen und Cur-TPP-oHA-SS-Cur-Micellen in MDA-MB-231-Zellen betrugen 6,534, 5,092 bzw. 3,871 μg/ml, was eine bessere zelluläre Zytotoxizität von Cur . aufwies -TPP-oHA-SS-Cur-Mizellen in MDA-MB-231-Zellen.

a Zytotoxizität von Curcumin-Formulierungen nach 24-stündiger Inkubation. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD (n = 6). *p < 0,05, verglichen mit dem freien Cur. b Zytotoxizität von Cur-beladenen Mizellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Cur (0,5, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 und 40 μg/ml). Der IC₅₀ Werte von freiem Cur, Cur/oHA-Cur-Mizellen und Cur-TPP-oHA-SS-Cur-Mizellen lagen bei 6,534, 5,092 bzw. 3,871 μg/ml

Darüber hinaus wiesen die leeren Micellen eine gewisse Toxizität auf (Abb. 6), da das Cur durch eine chemische Methode an das Polymer gebunden wurde. Dies würde die Wirkstoffaufnahmekapazität der Mizellen erhöhen und dann die Antitumorwirkung verstärken.

Fluoreszenzmikroskopische Bilder der zellulären Aufnahme

Die zelluläre Aufnahme von freiem Cur, Cur/oHA-Cur-Mizellen und Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen wurde durch Fluoreszenzmikroskop untersucht. Cur selbst war in dieser Arbeit nicht nur ein Krebsmedikament, sondern auch eine grüne Fluoreszenzsonde. Wie in Abb. 7 zu sehen ist, zeigten sowohl Cur/oHA-Cur-Mizellen als auch Cur/TPP-oHA-SS-Cur-Mizellen eine gute zelluläre Aufnahme in Zelllinien und die Fluoreszenzintensität war direkt proportional zur Zeit, während die Fluoreszenzintensität bei . stärker war 4 Std. Unterdessen war die Fluoreszenzintensität der mit Cur/oHA-Cur-Mizellen behandelten Gruppe zu den gleichen Zeitpunkten stärker als die der freien Cur-Gruppe. Dies könnte daran liegen, dass oHA-Cur mit der Fähigkeit, auf den CD44-Rezeptor abzuzielen, den Eintritt von Arzneimitteln in die Zellen förderte. Darüber hinaus, vielleicht dank der redoxsensitiven Fähigkeit von Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen, waren ihre Fluoreszenzsignale offensichtlich höher als die von Cur/oHA-Cur-Mizellen. Durch die Erhöhung der Cur-Akkumulation würde sie durch die Zytotoxizität und Apoptose von Krebszellen induziert, was mit den Ergebnissen von Zytotoxizitätsstudien übereinstimmt.

Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der zellulären Aufnahme von freiem Cur (a ), oHA-Cur/ Cur-Mizellen (b ) und TPP-oHA-S-S-Cur/Cur-Mizellen (c ) zu einer anderen Zeit. d Zellen, die mit TPP-oHA-S-S-Cur/Cur-Mizellen in Gegenwart von freier HA (2 mg/ml) behandelt wurden, zeigen den Abschlusseffekt von HA in MDA-MB-231-Zellen

Darüber hinaus war die Fluoreszenzintensität der Cur/TPP-oHA-SS-Cur-Micellengruppe mit HA geringer als die der ohne HA-Gruppe, höchstwahrscheinlich aufgrund der Tatsache, dass die freien HA-Moleküle die CD44-Rezeptoren besetzten, was weiter die Targeting-Fähigkeit demonstrierte des TPP-oHA-SS-Cur gegen CD44.

Darüber hinaus wurde die mitochondriale Lokalisation von TPP-oHA-S-S-Cur in MDA-MB-231-Zelllinien durch Färbung mit Mito-Tracker Red CMXRos bestätigt (Abb. 8). Die Bilder zeigten, dass die grüne Fluoreszenz der Cur/TPP-oHA-SS-Cur-Mizellen die rote Fluoreszenz des mitochondrialen Trackers gut überlappte, was darauf hindeutete, dass sich das Medikament in den Mitochondrien der Krebszellen und des TPP-oHA-SS . anreichern könnte -Cur hatte mitochondriales Targeting.

Mitochondriale Lokalisation. Die mitochondriale Lokalisation wurde durch Färbung mit mitochondrialen Trackern in MCF-7-Zellen unter Behandlung mit freiem Cur bestimmt (a ), oHA-Cur (b ) und TPP-oHA-S-S-Cur (c ); Maßstabsleiste:100 μm

Durchflusszytometrie

Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) wurde mit Durchflusszytometrie gemessen. Wie in Fig. 9 zu sehen ist, war der MFI von MDA-MB-231-Zellen, die mit Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen und Cur/oHA-Cur-Mizellen inkubiert wurden, direkt proportional zur Verabreichungszeit. In Übereinstimmung mit konfokaler mikroskopischer Beobachtung war der MFI von Zellen, die mit Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Micellen behandelt wurden, zu den gleichen Zeitpunkten signifikant höher als die der Cur/oHA-Cur-Micellen-Gruppe (p < 0.05).

Fluoreszenzintensität von MDA-MB-231-Zellen, die mit verschiedenen Cur-Formulierungen (20 μg Cur/ml) inkubiert wurden. Daten dargestellt als Mittelwert ± SD (n = 3). *p < 0,05, einfache ANOVA

Schlussfolgerungen

Um in dieser Studie die Löslichkeit und Behandlungswirkung von Cur zu verbessern, die Nebenwirkungen der traditionellen Therapie zu reduzieren und das Tumor-Targeting des Medikaments zu verbessern, haben wir Redox-responsive Disulfidbindungen als Verbindungsarm genommen und ein mitochondriales und CD44-Rezeptor-Dual-Targeting aufgebaut Redox-responsive Polymer-Wirkstoff-Konjugate (TPP-oHA-SS-Cur). Das TPP zielte auf die Mitochondrien ab, das Antitumor-Medikament Cur diente als hydrophobe Einheit und der CD44-Rezeptor, der auf oHA abzielte, fungierte als hydrophile Einheiten. Cur wurde als Modellarzneimittel in das amphiphile Blockcopolymer geladen und bildete durch Selbstorganisation Micellen.

Dieses Arzneimittelabgabesystem, das Cur durch ein chemisches Verfahren und ein physikalisches Verfahren einkapselt, verbessert nicht nur seine DL/EE, sondern erhöht auch seine Stabilität und Blutzirkulationszeit und könnte ein besseres Tumor-Targeting erreichen. In-vitro-Medikamentenfreisetzungstests zeigten, dass die Disulfidbindung von TPP-oHA-SS-Cur durch die Wirkung von hohem GSH (2–10 mM) in den Tumorzellen gebrochen wurde, gefolgt von der schnellen Freisetzung des Medikaments und dann deren Reduzierung. empfidlich. Die Ergebnisse der zellulären Aufnahme, der mitochondrialen Lokalisation und der Zytotoxizität zeigten, dass die Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Micellen CD44-Rezeptor-Targeting-Fähigkeiten und mitochondriale Targeting-Fähigkeiten aufwiesen. Im nächsten Schritt werden wir die Antitumoraktivität von Cur/TPP-oHA-S-S-Cur-Mizellen in vivo bewerten.

Darüber hinaus zeigte diese intelligente multifunktionale Nanoträgerplattform, die in dieser Studie entwickelt wurde, das Potenzial, für hydrophobe Medikamente mit deutlich verbesserter Löslichkeit, Stabilität und therapeutischer Wirksamkeit verwendet zu werden. Inzwischen lieferte diese Methode eine neue Idee für die Tumorbehandlung.

Abkürzungen

oHA:

Oligomere Hyaluronsäure

S-S-Cur:

Dithiodipropionsäure-Curcumin

TPP:

(5-Carboxypentyl)triphenyl-phosphoniumbromid