Biokompatibilität von gegradeten Nano-Glas/Zirkonia-Dentalmaterialien nach Alterung

Zusammenfassung

Ein gegradetes Nano-Glas/Zirkonia-System (G/Z) wurde durch Infiltration von Nano-Glas in eine Nano-Zirkonia-Oberfläche hergestellt, wodurch die Kern-Verblend-Haftfestigkeit erhöht wurde. Da Alterung ein kritisches Problem für yttrium-stabilisierte tetragonale Zirkonia-Polykristalle (Y-TZP) darstellt, ist es essenziell zu bewerten, wie Alterung die Biokompatibilität von G/Z-Systemen vor klinischem Einsatz beeinflusst. Humane Gingiva-Fibroblasten (HGFs) wurden auf ungealterten und gealterten G/Z- und Y-TZP-Proben für 2–72 h ausgesät. Tests umfassten Mundschleimhaut-Reizung, Zelllebensfähigkeit, Adhäsion und oxidativen Stress. Die metabolische Aktivität nahm in gealtertem G/Z und Y-TZP nach 72 h signifikant ab (P < 0,00001). Kein signifikanter Unterschied in der Lebensfähigkeit wurde zwischen G/Z und Y-TZP zu allen Zeitpunkten, vor oder nach Alterung, beobachtet. ROS-Produktion stieg nach 72 h für gealtertes G/Z und Y-TZP an, aber die Unterschiede waren nicht signifikant (P > 0,05). Adhäsionsraten stiegen nach Alterung für beide Materialien, doch G/Z und Y-TZP zeigten vergleichbare Adhäsion (P > 0,05). Makroskopische und mikroskopische Reizwerte für beide gealterten und ungealterten G/Z waren 0, was auf keine Reizung hinweist.

Schlussfolgerungen

Das G/Z-System demonstriert exzellente Biokompatibilität und birgt Potenzial für zukünftige klinische Anwendungen.

Hintergrund

Dental-Zirkonia-Keramiken, insbesondere 3 mol% yttrium-stabilisierte tetragonale Zirkonia-Polykristalle (3Y-TZP), werden für ihre hohe Festigkeit und Bruchzähigkeit durch Transformationszähigungsmechanismen geschätzt, was sie in Prothesen verbreitet macht [1]. Allerdings versagt Verblendporzellan auf Zirkonia-Kernen oft durch Absplitterung oder Delamination, primär wegen missmatchter thermischer Ausdehnungskoeffizienten und Elastizitätsmoduln zwischen Kern und Verblendung [2–4]. Um dies zu adressieren, führten wir zuvor ein gegradetes Nano-Glas/Zirkonia-System (G/Z) ein, das niedrigmoduliges Nano-Glas in eine gesinterte Nano-Zirkonia-Oberfläche infiltriert und Haftfestigkeiten dreimal höher als konventionelle Systeme erreicht [4].

Alterung von Y-TZP – ausgelöst durch Feuchtigkeit, mechanische Belastung und niedrige Temperaturen – induziert Oberflächenrauheit, Mikrorisse und eine tetragonale-zu-monokline (t-m) Phasenumwandlung, die mechanische Eigenschaften beeinträchtigen kann [5–9]. Da Oberflächenchemie und -rauheit die Biokompatibilität beeinflussen, ist es entscheidend zu evaluieren, wie Alterung die Interaktion des G/Z-Systems mit biologischen Geweben beeinflusst.

Frühere Arbeiten von Zhang et al. demonstrierten die mechanischen Vorteile eines glasinfiltrierten Zirkonia-Komposits [10, 11], doch die Biokompatibilität dieses gegradeten Komposits, besonders nach Alterung, bleibt unbekannt. Diese Studie schließt diese Lücke, indem sie G/Z mit dem klinisch akzeptierten Y-TZP vergleicht und Zelllebensfähigkeit, Morphologie, Adhäsion, oxidativen Stress und Schleimhautreizung vor und nach Alterung bewertet.

Methoden

Probenpräparation

Y-TZP-Proben, für klinische Nutzung zugelassen, dienten als Kontrolle. Alle Proben waren einheitliche Platten (1,5 × 1,5 × 0,2 cm) gemäß ISO 13356 Standards für Biegebalken mit polierten Oberflächen.

Präparation der G/Z-Proben

Glaspulver wurden mit einem Emax-Mahlgerät auf Nanometergröße vermahlen. Die Infiltrationsglas-Zusammensetzung ist in Tabelle 1 detailliert [4]. Y-Zirkonia-Pulver (5,18 Gew% Y₂O₃, TZ-3Y-E-Grad, Tosoh) wurden bei 150 MPa für 2 min uniaxial gepresst, bei 1350 °C für 2 h teilgesintert und auf 200 Mesh kugelgemahlen. Substratproben wurden bei 1200 °C für 2 h vorgesintert, um ein poröses Netzwerk zu bilden. Geschmolzene Glassuspensionen wurden auf die Oberflächen aufgebracht und bei 1350 °C für 2 h infiltriert, wodurch gleichzeitig Infiltration und Densifizierung erreicht wurden.

Präparation der Y-TZP-Proben

Y-TZP-Rohlinge wurden gefräst und mit einem CAD/CAM-System (Zenostar, Weiland Dental) auf Volldichte gesintert.

Zellkultur

HGFs wurden in DMEM/F-12 mit 10% fötalem Kälberserum, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% L-Glutamin und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren bei 37 °C, 5% CO₂ kultiviert. Medien wurden alle 3 Tage gewechselt. Zellen wurden mit PBS und Trypsin-EDTA abgelöst und auf jedes Substrat mit 1 × 10⁵ Zellen/mL für alle Assays ausgesät.

Alterung

Mechanische Alterung simulierte Kauverhältnisse: Proben wurden in künstlichem Speichel bei 37 °C platziert, einer Dreipunkt-Biegebelastung von 80 N bei 2 Hz für 10⁵ Zyklen ausgesetzt, gemäß Protokollen [12, 13].

Zelllebensfähigkeit

Lebensfähigkeit wurde nach 2, 24, 48 und 72 h mittels alamarBlue®-Assay (10% in DMEM) bewertet. Nach Inkubation wurden 500 µL Farbstoff zugegeben, 4 h inkubiert und Fluoreszenz gemessen (Anregung 530 nm, Emission 580 nm) auf einem Synergy™ H4 Mikroplatten-Spektrophotometer (BioTek). Experimente wurden in Triplikaten über drei Durchläufe durchgeführt. Lebensfähigkeit (%) = (Absorption behandelter Wells) / (Absorption Kontrollwells).

Oxidativer Stress

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) wurden via Chemilumineszenz mit dem Reactive Oxygen Species Assay Kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) quantifiziert.

Zelladhäsion

HGFs wurden 2 h auf Probenoberflächen vor und nach Alterung kultiviert. Nach Fixierung wurden Kerne mit DAPI (Yeasen) gefärbt und mit einem Carl Zeiss LSM 510 invertierten Fluoreszenzmikroskop abgebildet. Adhäsionsraten wurden als anhaftende Zellen / gesamte ausgesäte Zellen über fünf zufällige 450 µm × 450 µm Felder bei 200-facher Vergrößerung berechnet.

Zellmorphologie

Nach 2 h Inkubation wurden Zellen auf G/Z-Oberflächen fixiert und für F-Aktin mit Rhodamin-Phalloidin (1:100 in 3% BSA) gefärbt. Bilder wurden mit einem Zeiss LSM 510 aufgenommen. Morphologie wurde auch per REM (Philips XL-30 ESEM) untersucht. Proben wurden auf Deckgläsern montiert und mit DAPI gegengefärbt.

Mundschleimhaut-Reiztest

Zehn männliche Wistar-Mäuse erhielten gealtertes G/Z in eine Backentasche und ungealtertes G/Z in die kontralaterale Seite, gemäß YY/T 0127.13-2009 Standards. Nach 2 Wochen wurden Taschen makroskopisch inspiziert und die Backenschleimhaut histologisch via H&E-Färbung untersucht. Reizindizes wurden durch Subtraktion der Kontrollwerte von den Testwerten berechnet.

Statistische Analysen

Einfaktorielle ANOVA (SPSS 22.0) wertete gepoolte Daten für Lebensfähigkeit, oxidativen Stress und Adhäsion aus. Signifikanzniveau war P < 0,05.

Ergebnisse

Struktur der gegradeten Schicht

Die Dicke der gegradeten Schicht betrug im Durchschnitt 0,9–1,0 mm. REM-Bilder (Abb. 1a, b) zeigen eine Oberfläche aus Restglas, glasbeschichteten Zirkonia-Körnern und intergranulären Hohlräumen – Merkmale, die starke Kern-Verblend-Haftung begünstigen. EDX-Mapping (Abb. 1c) zeigt einen Gradienten: Zr-Konzentration nimmt tiefer im Material zu, während Si, Al und La abnehmen, was den beabsichtigten kompositionellen Gradienten bestätigt [4].

Physikalische und chemische Eigenschaften von G/Z. a Strukturelles Diagramm. b REM-Bild. c EDX-Analyse der funktionell gegradeten Schicht.

Zelllebensfähigkeit

Die metabolische Aktivität nahm in gealtertem G/Z und Y-TZP nach 72 h signifikant ab (P < 0,00001) (Abb. 2a). Kein signifikanter Abfall wurde nach 2, 24 oder 48 h für beide Materialien beobachtet. Die Lebensfähigkeit von G/Z und Y-TZP unterschied sich zu keinem Zeitpunkt, vor oder nach Alterung (P > 0,05). Die Daten sind in Abbildung 2a zusammengefasst.

Biokompatibilität von G/Z und Y-TZP vor und nach Alterung. Daten repräsentieren Mittelwert ± SD, n = 5. a Zelllebensfähigkeit von gealterten und ungealterten Proben-behandelten HGF. b ROS-Produktion von gealterten und ungealterten Proben-behandelten HGF. c Zelladhäsionsraten von gealterten und ungealterten Proben-behandelten HGF. Signifikanz vs. Kontrollgruppe: #P < 0,01; *P < 0,05.

Oxidativer Stress

Gealtertes G/Z und Y-TZP zeigten einen signifikanten ROS-Anstieg nach 72 h (P < 0,00001). Keine signifikanten Unterschiede wurden zu früheren Zeitpunkten festgestellt (P > 0,05). G/Z und Y-TZP produzierten vergleichbare ROS-Werte während der gesamten Studie, sowohl vor als auch nach Alterung (P > 0,05).

Zelladhäsion

Adhäsionsraten stiegen für beide G/Z und Y-TZP nach Alterung (Abb. 2c). Kein signifikanter Unterschied bestand zwischen den beiden Materialien vor oder nach Alterung (P > 0,05). Repräsentative Bilder der Zelladhäsion auf Y-TZP und G/Z vor und nach Alterung sind in Abbildung 3 gezeigt.

Zelladhäsion an G/Z und Y-TZP vor und nach Alterung. a Gealtertes G/Z. b Ungealtertes G/Z. c Gealtertes Y-TZP. d Ungealtertes Y-TZP.

Zellmorphologie

Fluoreszenz-Bildgebung zeigte, dass Zellen an sowohl gealtertem als auch ungealtertem G/Z hafteten, mit verbesserter Ausbreitung und Abflachung auf gealterten Oberflächen (Abb. 4a–c). REM bestätigte gut ausgebreitete, polygonale Zellen mit umfangreichen Mikrovilli auf beiden Oberflächen (Abb. 5a, b).

Anheftung, Ausbreitung und Morphologie von HGF auf G/Z vor und nach Alterung, beobachtet mit Fluoreszenzmikroskopie. a, b Gealtertes G/Z. c Ungealtertes G/Z. Zellen wurden 72 h auf Substraten kultiviert und dann für filamentöses Aktin (F-Aktin, rot) und Kerne (blau) fixiert und gefärbt.

REM-Mikrographien der HGF-Morphologie auf G/Z vor und nach Alterung 72 h post Kultur. a Gealtertes G/Z. b Ungealtertes G/Z. Originalvergrößerung: ×2000.

Mundschleimhaut-Reiztest

Sowohl makroskopische als auch mikroskopische Reizwerte waren 0 für gealtertes und ungealtertes G/Z, was auf keine Reizung hinweist. Histopathologie bestätigte das Fehlen von Schleimhautveränderungen (Abb. 6a, b).

Pathologische Untersuchung der mit gealtertem G/Z (a) und ungealtertem G/Z (b) behandelten Schleimhaut.

Diskussion

Metall-Keramik-Legierungen weichen zunehmend metallfreien Alternativen aufgrund von Bedenken über Metallionenfreisetzung [14–18]. Während viel Forschung auf Keramikverbesserungen fokussiert, bietet das G/Z-System einen vielversprechenden Weg, Zirkonias Leistung ohne Metallkomponenten zu verbessern. Diese Studie zeigt, dass G/Z Biokompatibilität vergleichbar mit Y-TZP beibehält, selbst nach Alterung, die realistische orale Bedingungen simuliert.

Alterung verringerte die Zellproliferation nach 72 h für beide Materialien, was mit mancher Literatur übereinstimmt, die reduzierte Biokompatibilität post-Alterung berichtet [20], und im Kontrast zu anderen steht, die Verbesserung feststellen [21]. Variationen stammen wahrscheinlich von unterschiedlichen Alterungsprotokollen. Unser Protokoll – 80 N Last, 2 Hz, 10⁵ Zyklen in künstlichem Speichel bei 37 °C – spiegelt klinische Beißkräfte und Temperaturen wider und liefert eine realistische Bewertung der Alterungseffekte [22].

Der beobachtete Rückgang der Lebensfähigkeit und der Anstieg der ROS können Ionendiffusion und lokalen Stress durch die t-m-Transformation widerspiegeln, die die Zellintegrität beeinträchtigen können [6, 23].

Interessanterweise erhöhte Alterung die Adhäsion für beide G/Z und Y-TZP ohne die relativen Adhäsionsraten zu ändern. Die raueren, hydrophileren Oberflächen post-Alterung fördern wahrscheinlich Proteinadsorption und damit bessere Zellanhaftung [27–29]. Die vergleichbare Adhäsion deutet darauf hin, dass G/Zs Oberflächeneigenschaften nach Alterung günstig bleiben.

In-vivo-Reiztests zeigten keine histopathologischen Veränderungen, was die Sicherheit von G/Z für Schleimhautkontakt unterstützt. Die moderate Menge an monokliner Phase, die während der Infiltration eingeführt wird, bewahrt wahrscheinlich die mechanische Integrität bei gleichzeitiger Biokompatibilität, wie in früheren Arbeiten zu Al₂O₃-infiltriertem Y-TZP gezeigt [30].

Andere Glas-Zirkonia-Komposite zeigten gute Biokompatibilität und Bioaktivität in vitro und in vivo [31–33]. Unsere Ergebnisse erweitern diese Evidenz auf das gegradete Nano-Glas/Zirkonia-System und bieten ein Material, das mechanische Festigkeit, Ästhetik und biologische Sicherheit balanciert.

Schlussfolgerungen

Biokompatibilitätsbewertungen – einschließlich Zelllebensfähigkeit, Adhäsion, Morphologie, oxidativem Stress und Schleimhautreizung – demonstrieren, dass G/Z vor und nach Alterung auf Augenhöhe mit Y-TZP performt. Diese Ergebnisse positionieren G/Z als vielversprechenden Kandidaten für Dentalprothesen. Weitere umfassende In-vitro- und In-vivo-Studien sind geboten, um diese vorläufigen Befunde zu bestätigen.

Abkürzungen

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid

F-Aktin:

Filamentöses Aktin

FGM:

HAp-Al₂O₃-ZrO₂

G/Z:

Gegradetes Nano-Glas/Zirkonia

REM:

Rasterelektronenmikroskopie

t-m:

Tetragonal zu monoklin

Y-TZP:

Yttrium-stabilisierte tetragonale Zirkonia-Polykristalle