Frequenzmodulierte Dielektrophorese von Vesikeln und Zellen: Vorhersagbare U-Wend-Trajektorien an der Crossover-Frequenz

Abstract

Wir haben ein umfassendes Modell für die dielektrophoretische (DEP) Kraft abgeleitet, die auf mikro- und nanoskopische Partikel wirkt, wenn sie frequenzmodulierten (FM) elektrischen Feldern ausgesetzt sind. Durch Abstimmung des FM-Wellen-Frequenzbands auf die Crossover-Frequenz f_X des Realteils des Clausius-Mossotti-Faktors sagt unsere Theorie eine systematische Umkehr der DEP-Kraft jedes Mal voraus, wenn die Momentanfrequenz f_X kreuzt. Experimentell beobachteten wir periodische U-Wenden in multilamellaren Vesikeln (MLVs), menschlichen T-Zell-Leukämie-Zellen (TL), B-Zell-Leukämie-Zellen (BL) und roten Blutkörperchen (RB) unter FM-DEP. Videotracking dieser U-Wenden bietet eine schnelle, <30-sekündige und hochpräzise Methode zur Bestimmung von f_X, nützlich für sowohl Salzlösungen als auch Nanopartikel-Suspensionen, wo elektrisch-feldinduzierter Lösungsmittelfluss minimiert wird. Die Genauigkeit von f_X wurde durch zwei unabhängige Experimente bestätigt: (1) Messung der DEP-Kraft an einer einzelnen Vesikel unter Wechselstrom (AC) DEP bei verschiedenen sinusförmigen Frequenzen und Vergleich des resultierenden f_X mit dem aus FM-DEP; und (2) Untersuchung, wie f_X mit der Leitfähigkeit des umgebenden Mediums für drei Zelltypen variiert. Der zweite Ansatz ermöglichte die simultane Schätzung von Zytoplasma-Leitfähigkeiten und Membrankapazitäten mit einem verfeinerten Ein-Schalen-Modell. Zytoplasma-Leitfähigkeiten lagen leicht unter zuvor berichteten Bereichen, während Membrankapazitäten Literaturwerten nahekamen.

Hintergrund

Zelluläre Polarizierbarkeit wird von Membran- und Zytoplasma-Eigenschaften dominiert, die mit der angewendeten Feldfrequenz variieren. Dieses frequenzabhängige dielektrische Spektrum ermöglicht markierungsfreie Diskriminierung von Zellphänotypen via Impedanzspektroskopie, AC-DEP, Traveling-Wave-DEP (twDEP) und Elektro-Rotation [1–16]. Im Vergleich zu Antikörper-basierten oder adhäsiven Markierungsmethoden vermeiden diese elektrischen Techniken Zellmodifikation und potenzielle Aktivierung, was sie für nicht-invasive Zellsortierung attraktiv macht.

DEP entsteht in einem inhomogenen elektrischen Feld und erzeugt eine Kraft proportional zum Gradienten der Feldamplitude und dem Realteil des Clausius-Mossotti (CM) Faktors. Der Phasengradient führt zu twDEP oder Elektro-Rotation, die komplementäre dielektrische Informationen liefern. Unsere Arbeit erweitert konventionelles AC-DEP durch Einführung FM-elektrischer Felder, was kontinuierliches Durchlaufen der Crossover-Frequenz f_X und schnelle dielektrische Charakterisierung ermöglicht.

In typischen AC-DEP-Setups wird das Feld zwischen fixen mikrofabrizierten Elektroden angelegt, was räumliche Flexibilität limitiert. Elektronische Pinzetten – wo mikromanipulierte Elektroden-Nadeln das Feld liefern – bieten eine vielseitige, kontaktfreie Alternative. Dielektrische Messungen erfordern jedoch kurze Expositionszeiten (<30 s), um Lösungsmittelfluss-Effekte zu reduzieren, was mit Multi-Elektroden-Systemen herausfordernd ist. FM-DEP adressiert dies durch Modulation der Frequenz bei konstanter Elektrodengeometrie.

Unser Plug-in-System (Abb. 1) verwendet zwei Wolfram-Nadel-Elektroden, jeweils 0,5 µm Spitzen-Durchmesser, positioniert 100 µm voneinander entfernt. Die Nadeln werden von einem Arbitrary-Waveform-Generator und Stromverstärker angetrieben, und die gesamte Anordnung ist auf einem Patch-Clamp-Mikromanipulator unter einem Inversmikroskop montiert. Diese Konfiguration erlaubt präzise, kontaktfreie Manipulation einzelner Vesikel oder Zellen über dem Substrat.

Die FM-Welle ist definiert durch

𝐸(𝐫,t)=𝐴(𝐫)cosθ(t),

mit der Phase in Bezug auf die Momentanfrequenz f(t) durch θ̇=2πf(t). Wir nutzen eine Breitband-FM-Modulation:

f(t)=fc+Δf cos(2πfmt),

wobei die Modulationsfrequenz f_m viel kleiner als der Trägerfrequenzbereich ist und die Breitband-Grenzbedingung (WBL) Δf/f_m≫1 erfüllt.

Methoden

Materialien

MLVs wurden aus 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DOPC; Avanti Polar Lipids) hergestellt. 1 ml DOPC-Lösung (20 mM) in Chloroform/Methanol (2:1 v/v) wurde unter Stickstoff getrocknet und >12 h vakuumversiegelt. Der Dünnfilm wurde mit deionisiertem Wasser rehydriert und bei 25 °C mehrere Stunden inkubiert.

Menschliche T-Zell-Leukämie (JKT-β-del) und B-Zell-Leukämie (CCRF-SB) Zelllinien wurden in RPMI 1640 mit 10 % fötalem Rinderserum und 100 mM Natriumpyruvat bei 37 °C, 5 % CO₂ kultiviert. Nach 1 Woche wurden Zellen pelletiert (370 g, 3 min, zweimal) und in 1 ml RPMI 1640 resuspendiert. Suspensionen wurden dann in isotonischem 200 mM Saccharose verdünnt, um gewünschte Leitfähigkeiten zu erreichen.

Menschliche RB-Zellen wurden aus Vollblut gesunder Freiwilliger (Anfang 20) isoliert. Zellen wurden in einem 3,1 % Hämatokrit RPMI 1640 Gemisch suspendiert und mit 200 mM Saccharose verdünnt. Alle RB-Experimente wurden innerhalb von 10 min nach Blutentnahme durchgeführt.

Experimenteller Aufbau

Leitfähigkeit der Suspensionen wurde mit einem SevenMulti-Meter (Mettler-Toledo) gemessen. Das FM- oder AC-Feld wurde von einem Agilent 33220A Wellenformgenerator erzeugt und durch einen F30PV Stromverstärker verstärkt. Zwei 0,5 µm Wolfram-Nadeln, 100 µm getrennt, lieferten das Feld. Das Nadelpaar wurde in 50 µl Suspension auf einer beheizten Stufe (25 °C) positioniert. Bildgebung erfolgte mit einem Nikon TE2000-U Mikroskop und einer Retiga Exi CCD-Kamera (25 fps). Die Frequenzauflösung der FM-Wellenform wurde als innerhalb des experimentellen Fehlers verifiziert.

Zusätzliche Filme S1–S3 demonstrieren AC-DEP-Manipulation von Diatomeen-Zellen in deionisiertem Wasser: (S1) Rotation bei 30 kHz, (S2) Drücken zur Glaswand bei 100 kHz, und (S3) Rückholung bei 20 MHz.

Ergebnisse und Diskussion

Experimentelle Beobachtung einer Leukämiezelle unter FM-DEP

Die Plug-in-Nadeln ermöglichen Feldapplikation über dem Substrat, was präzise Zellselektion erleichtert. Film S4 zeigt eine dreieckige Diatomeen-Zelle, die auf einen 100–500 kHz Frequenzsprung bei 0,5 s Intervallen reagiert. Filme S5 und S6 zeigen typische U-Wend-Trajektorien von TL-Zellen unter FM-DEP (0,25 Hz Modulation, 200 kHz ≤ f(t) ≤ 3 MHz). Abb. 2 zeigt eine 3D-Trajektorie (x, y, t), wobei der Ursprung der Nadelspitze entspricht. Die x-Achse aligniert mit der Tangente zur Elektrodenoberfläche; die y-Achse reflektiert die U-Wend-Amplitude.

U-Wenden umfassen drei Phasen: Verlassen der Nadel, Annäherung nach U-Wende und Verbleib auf der Elektrodenoberfläche. Lösungsmittelfluss verhindert oft exakte Rückkehr zum gleichen Ort, aber der Zeitpunkt des Verlassens und der U-Wend-Initiation ist klar. Die beobachtete U-Wend-Periode (≈4 s) stimmt mit der Modulationsperiode von 0,25 Hz überein.

Theoretische Studie zur FM-DEP

Für eine sphärische Partikel mit innerer Permittivität ε_in und Leitfähigkeit σ_in und äußerer ε_out, σ_out ist die DEP-Kraft

𝐹DEP(𝐫,t)=𝐩(𝐫,t)·∇𝐸(𝐫,t),

mit dem Dipolmoment

𝐩(𝐫,t)=4πR3εoutKH{𝐸(𝐫,t)+ (τ/Δτ) Ẽ(𝐫,t)},

wo K_H=(ε_in–ε_out)/(ε_in+2ε_out), Δτ^–1=τ₀^–1–τ^–1, und τ₀ und τ die im Text definierten charakteristischen Zeiten sind. Mitteln über einen AC-Zyklus ergibt die mittlere DEP-Kraft

⟨𝐹DEP⟩=χ(fAC)∇𝐴RMS2,

wo χ(f) proportional zum Realteil des CM-Faktors ist.

Ersetzt man das AC-Feld durch eine FM-Welle und invokiert die WBL, wird die gemittelte DEP-Kraft

⟨𝐹DEP(𝐫,t)⟩=χ{f(t)}∇𝐴RMS2,

zeigend, dass die Kraftrichtung sich ändert, wann immer f(t) f_X kreuzt. Dies erklärt die periodischen U-Wenden, die experimentell beobachtet wurden.

Lösen nach dem Zeitpunkt, wenn f(t)=f_X, gibt

fX=fc–Δf cos(πfmΔtn),

wo Δt_n die gemessene Zeit vom Verlassen der Elektrode bis zur U-Wende ist. Damit liefert die FM-DEP-Methode eine schnelle Bestimmung von f_X aus der beobachteten Trajektorie.

Vergleich der Crossover-Frequenzen einer einzelnen MLV aus FM- und AC-DEP

Mit einer salzfreien MLV-Suspension verglichen wir f_X aus FM-DEP (10–50 kHz FM-Bereich, f_m=0,1 Hz, 10 s Periode) und AC-DEP (30–100 kHz Sinus). Aus der FM-Trajektorie betrug die mittlere Verlassen-Zeit 5,8 ± 0,2 s, was f_X=35 ± 1 kHz ergab. AC-DEP-Kraftmessungen via bewegter Nadel lieferten eine Kraft-Frequenz-Kurve, die das Modell

FDEP(f)= [L+(2πfτ)2H]/[1+(2πfτ)2],

mit angepassten Parametern L=–21,02 pN, H=19,03 pN, τ=4,9 µs anpasste, was f_X=34,15 kHz ergab – in exzellenter Übereinstimmung mit dem FM-Ergebnis.

Leitfähigkeitsabhängigkeiten der Crossover-Frequenzen für biologische Zellen

Wir wandten FM-DEP auf TL, BL und RB-Zellen in Leitfähigkeitsbereichen 60–160 mS m^–1 (Δf≈700 kHz, f_m=0,25 Hz) an. Für jeden Zelltyp maßen wir die Verlassen-Zeiten von 10 Zellen pro Tropfen, gemittelt über zwei Tropfen, und leiteten f_X mittels Gl. (10) ab. Abb. 6 zeigt die resultierenden f_X versus σ_out. Die Daten wurden an das erweiterte Ein-Schalen-Modell

fX= [σout–(σout2)/(2σcyt)]/(√2 π R Cm) + fX0,

angepasst, was Membrankapazitäten C_m und Zytoplasma-Leitfähigkeiten σ_cyt ergab, die mit Literaturwerten übereinstimmen (C_m≈0,5–1,5 µF cm^–2, σ_cyt≈0,3–0,8 S m^–1). Die Konsistenz über Zelltypen bestätigt die Zuverlässigkeit von FM-DEP für dielektrische Charakterisierung.

Schlussfolgerungen

Unsere WBL-basierte Theorie und Experimente bestätigen, dass FM-DEP vorhersagbare U-Wenden an der Crossover-Frequenz erzeugt, was eine schnelle, <30-sekündige Bestimmung von f_X ermöglicht. FM-DEP-Messungen an MLVs stimmen mit direkten AC-DEP-Kraftmessungen überein, während leitfähigkeitsabhängige f_X-Daten Membrankapazitäten liefern, die mit der Literatur übereinstimmen. FM-DEP bietet somit eine robuste, kontaktfreie Methode für dielektrische Spektroskopie von Vesikeln und Zellen und kann auf sub-mikronische und nanoskopische Partikel in On-Chip-Konfigurationen für Echtzeit-Elektrokinetische Spektroskopie erweitert werden.

Abkürzungen

AC:

Wechselstrom

BL:

B-Zell-Leukämie

CM:

Clausius-Mossotti

DEP:

Dielektrophorese

DOPC:

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin

FM:

Frequenzmoduliert

MLV:

Multilamellare Vesikel

RB:

Rote Blutkörperchen

RMS:

Root Mean Square (Effektivwert)

TL:

T-Zell-Leukämie

twDEP:

Traveling Wave Dielektrophorese

WBL:

Wide Band Limit (Breitband-Grenze)