Gastrointestinaler Piperlongumin-freisetzender Stent unter Verwendung reaktiver Sauerstoffspezies-empfindlicher Nanofasermatten zur Hemmung von Cholangiokarzinomzellen

Hintergrund

Das Cholangiokarzinom (CCA), das normalerweise aus der Gallengangsregion stammt, gilt als eine der aggressivsten Krebsarten [1,2,3]. Der Grund für die Karzinogenese und der Anstieg der Inzidenzrate sind noch unklar, obwohl die Inzidenzrate weltweit zunimmt [1]. Da die meisten CCA-Patienten häufig im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert werden, sind nur sehr wenige Fälle der CCA-Patienten einer chirurgischen Resektion zugänglich [2]. Zur Behandlung von CCA-Patienten wurden verschiedene Behandlungsoptionen wie Strahlentherapie, Chemotherapie, Metallstentverdrängung und immunadjuvante Therapie ausprobiert [3,4,5,6,7,8,9]. Da der Gallengang durch Tumorwachstum oder Entzündung blockiert ist, wird bei den oben genannten Behandlungen häufig eine Stentverschiebung eingesetzt, um einen Verschluss des Gallengangs zu verhindern und die Überlebensfähigkeit des Patienten zu verlängern [10, 11]. Metallstents haben jedoch keine heilende Funktion und eine Tumorüberwucherung im Inneren des Stents induziert normalerweise eine Gallenwegsobstruktion. Um diese Probleme zu lösen, haben viele Wissenschaftler medikamentenfreisetzende Stents (DES) untersucht [12,13,14,15]. Zum Beispiel untersuchte die Lee-Gruppe in den letzten zehn Jahren Paclitaxel-freisetzende gastrointestinale (GI) Stents [12,13,14,15]. Obwohl Paclitaxel-freisetzende Stents im Vergleich zu einem beschichteten Metallstent kaum Unterschiede in der Stentdurchgängigkeit und Überlebensfähigkeit des Patienten aufweisen, wurde die Akzeptanz von Paclitaxel-freisetzenden Stents in Machbarkeits- und Sicherheitsstudien beim Schwein beobachtet [13,14,15]. Kimet al. untersuchten DES mit Sorafenib, einem Tyrosin-Proteinkinase-Inhibitor, gegen HuCC-T1-CCA-Zellen unter Verwendung von tierischen Tumor-Xenotransplantatmodellen, und Sorafenib-eluierende Stents haben die Wirksamkeit, das Tumorwachstum im Tier-Tumor-Xenotransplantat-Modell zu hemmen [16]. Kwaket al. berichteten, dass ein Histon-Deacetylase (HDAC)-Inhibitor (Vorinostat) eluierender Stent die Expression von HDAC effektiv hemmt, acetyliertes Histon (Ac-Histon) induziert und dann das Tumorwachstum im CCA-Zell-tragenden Mäusemodell hemmt [17]. DES mit neuartigem Antikrebsmittel oder molekularem Zielwirkstoff ist immer noch eine attraktive Option, um die Überlebensfähigkeit von Patienten zu verlängern. Darüber hinaus wurden reizempfindliche Nanofasermatten oder Nanomaterialien auch speziell untersucht, um das Antikrebsmittel zu liefern [18, 19, 20]. Nanofasern auf Basis wärmeempfindlicher Polymere wie Poly(di(ethylenglykol)methylethermethacrylat) (PDEGMA) oder Poly(N -Isopropylacrylamid)-Poly(NIPAM)-Copolymere können bei der temperaturempfindlichen Wirkstofffreisetzung an lokalen Krankheitsherden eingesetzt werden [18, 19]. Bellat et al. berichteten, dass sich selbstorganisierende Peptid-Nanofasern in ausgezeichnetem Tumor-Targeting mit reduziertem RES-Einfang gezeigt haben [20].

Das Ungleichgewicht zwischen der Produktion von ROS und dem zellulären antioxidativen Abwehrsystem bei Krankheiten wurde im biomedizinischen Bereich umfassend untersucht [21,22,23,24]. Insbesondere oxidativer Stress bei Krebserkrankungen wurde auch umfassend untersucht und in redoxsensitiven Wirkstoffabgabesystemen angewendet [23,24,25]. Zum Beispiel können Thioethergruppen im Polymerrückgrat der Nanopartikel von hydrophob zu hydrophil geändert werden, wenn es ROS ausgesetzt war, und ROS-schaltbare Nanopartikel können bei Krankheiten mit ROS-reicher Umgebung eingesetzt werden [25, 26]. Yuet al. berichteten, dass eine spezifische endosomale Zufuhr in Krebszellen durch ROS-responsive Polymermizellen erreicht werden kann, dh Copolymere können in einer ROS-reichen Umgebung von hydrophob in hydrophil umgewandelt werden, und dieses Phänomen induzierte eine schnelle Freisetzung von Krebsmedikamenten nach einer höheren Antikrebsaktivität [27] . Wir haben zuvor auch berichtet, dass Redox-responsive Nanophotosensibilisatoren spezifisch Photosensibilisatoren mit Glutathion (GSH)-Reaktionsfähigkeit freisetzen und dann im Vergleich zu Photosensibilisatoren selbst eine höhere ROS-Erzeugung induzieren [28]. In neueren Studien ist bekannt, dass Polymermizellen mit Diselenidbindung eine ROS-ausgelöste Wirkstofffreisetzung durch den Zerfall von Diseleniumbindungen aufweisen und eine ROS-spezifische Antikrebsaktivität zeigen [29]. ROS-getriggerte Nanopartikel gelten als vielversprechende Plattform für die Chemotherapie gegen Krebs.

Piperlongumin (PL), eine natürliche Chemikalie aus Piper longum , hat vielversprechende Antikrebsaktivitäten mit geringer Zytotoxizität gegen normale Zellen [30]. Rajet al. berichteten, dass die krebszellselektive Toxizität von PL auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass PL selektiv ROS in Krebszellen im Vergleich zu normalen Zellen produziert; PL induziert DNA-Schäden und Veränderungen der Morphologie/Funktion der Mitochondrien in Krebszellen [30]. Die Antikrebsaktivität von PL gegen verschiedene Krebszellen wurde untersucht [31,32,33,34,35]. Xionget al. berichteten, dass PL die ROS merklich erhöhte und dann primäre myeloische Leukämiezellen durch Induktion apoptotischer Proteine ​​wirksam hemmte [35]. Obwohl PL eine geringe Toxizität gegenüber normalen Zellen und Organen hat, hat es einige nachteilige Auswirkungen auf die Niere [36, 37]. Darüber hinaus muss auch die kurze Halbwertszeit von PL im Blutkreislauf verbessert werden [38].

In dieser Studie stellten wir einen Redox-responsiven Nanofaser-beschichteten Stent her und PL wurde in die Nanofasermatten geladen. Für Redox-Reaktionsfähigkeit wurde LEse-Blockcopolymer mit Diselenidbindung synthetisiert und verwendet, um Nanofasermatten für DES herzustellen. Der erhöhte ROS-Gehalt in der Tumorregion kann die Wirkstofffreisetzungsrate beschleunigen und den ROS-vermittelten Krebszelltod fördern.

Materialien und Methoden

Materialien

PL wurde von LKT Labs gekauft. Co., (Minnesota, USA). Poly(L-lactid) (PLA, PLA-0005, M.W. = 5000 g/mol aus den Herstellerangaben) wurde von Wako Pure Chem. bezogen. Co. Ltd. (Osaka, Japan). Methoxypoly(ethylenlykol)succinimidylglutarat (MePEG-NHS, M.W.  =5000 g/mol) wurde von Sunbio Co. Ltd. (Seoul, Korea) bezogen. Ein mit einer Silikonmembran bedeckter Stent für Gallenwege wurde von M.I. Technik. (Pyeongtaek, Korea). Poly(ε-caprolacton) (PCL, zahlenmittleres MW = 80.000 g/mol), N-Hydroxysuccinimid (NHS), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDAC), Tetrahydrofuran (THF), Chloroform , Dimethylsulfoxid (DMSO), 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) und Selenocystamindihydrochlorid wurden von Sigma-Aldrich Chemical Co., (St. Louis, MO&sub2; , VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA). Die Dialysemembran oder Dialysevorrichtung (M.W. Cutoff-Größe (MWCO) 1000 µg/mol und 8000 µg/mol) wurde von Spectrum/Por Lab., Inc. (CA, USA) bezogen. Alle organischen Lösungsmittel und anderen Chemikalien wurden als Reinstqualität verwendet. Zellkulturmaterialien wie RPMI1640-Medien und fötales Rinderserum (FBS) wurden von Life Tech bezogen. Inc. (Grand Island, NY, USA). Alle verwendeten Reagenzien und organischen Lösungsmittel waren HPLC-Qualität.

Synthese von LEse-Blockcopolymer

MePEG-Selenocystamin-Konjugate

MePEG-NHS (500 mg) wurde in 20 ml DMSO gelöst. Mehr als fünf Äquivalente Selenocystamin wurden separat in 15 ml entionisiertem Wasser gelöst und mit 5 ml DMSO vermischt. Danach wurde die Selenocystaminlösung langsam in die MePEG-NHS-Lösung getropft und dann 24 h lang magnetisch gerührt. Anschließend wurden Reaktanden in ein Dialyseröhrchen (MWCO 1000 µg/mol) gegeben und dann 2 Tage gegen viel Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde 2 Tage lang lyophilisiert. Ein lyophilisierter Feststoff wurde verwendet, um Blockcopolymer zu synthetisieren.

Blockcopolymersynthese

PLA (500 µg) wurde in 20 µl DMSO mit einer äquivalenten Menge an EDAC und NHS gelöst. Diese Lösung wurde 12 h magnetisch gerührt. Zu dieser Lösung wurde mPEG-Selenocystamin-Feststoff (530 mg) gegeben und weitere 2 Tage gerührt. Anschließend wurden Reaktanden in ein Dialyseröhrchen (MWCO:8000 µg/mol) gegeben und dann 2 Tage gegen viel Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde 2 Tage lang lyophilisiert. Lyophilisierte Produkte wurden in Methanol ausgefällt, um noch einmal nicht umgesetztes mPEG-Selenocystamin zu entfernen. Die Endausbeute war höher als 94 %. Ausbeute = [(Gewicht des lyophilisierten Feststoffs)/(Gewicht von PLA + Gewicht von mPEG-Selenocystamin)] × 100.

Charakterisierung von Polymeren

Um die Polymersynthese zu überwachen, ¹ Es wurde H-Kernmagnetresonanz-(NMR)-Spektroskopie verwendet. Polymere wurden in DMSO-d-Form gelöst und mit ¹ . gemessen H-NMR-Spektroskopie (500 MHz supraleitendes FT-NMR-Spektrometer, UnityInova 500, Varian Inc. Agilent Tech., CA, USA).

Das Molekulargewicht der Polymere wurde mit Gelpermeationschromatographie (GPC, Waters GPC System, MA 01757, USA) gemessen:Waters 1515 HPLC Lösungsmittelpumpe, ein Waters 2414 Brechungsindexdetektor und drei Waters Styragel High Resolution Säulen (HR4, HR2, HR1 ). Polymere wurden in extra reinem THF gelöst, das 0,1 µN LiBr als Elutionsmittel enthielt (Flussrate 1,0 µl/min). Polystyrole wurden verwendet, um eine Kalibrierungskurve zu erstellen.

PL-beladene Nanofasermatten und beschichtet auf dem GI-Stent

PL-beladene Nanofasermatten

Vorinostat (100 mg) wurde in 10 ml Acetonlösung gelöst. Zu dieser Lösung wurden dann LEse (100–400 mg) und PCL (600–900 mg) zugegeben und 2 h lang magnetisch gerührt. Diese Lösung wurde verwendet, um Nanofasermatten herzustellen und mit einer Elektrospinnmaschine (EBS ES-Biocoater; Nano NC, Seoul, Südkorea) auf den mit Silikonmembran bedeckten Stent zu beschichten. Die Elektrospinnmaschine besteht aus einem Hochspannungsnetzteil, einer Spritzenpumpe, einem X-Y-Robotersystem und einem Trommelkollektor. Die Polymer-/Arzneimittellösung in einer Spritze (NanoNC, 24G) wurde auf den mit Silikonmembran bedeckten Metallstent (Durchmesser 1 cm, Länge 10 cm, Rollgeschwindigkeit 500 U/min, Sprührate 100 µl/Minute, Spannung 15 kV) gesprüht auf den Rollkollektor gelegt. Der Stent wurde mit einer PL-beladenen Nanofasermembran beschichtet. Um verbleibendes Lösungsmittel zu entfernen, wurde ein mit PL beladener, mit Nanofasern beschichteter Stent in einem Vakuumtrockenschrank über 24 Stunden getrocknet. PL-beladene, mit Nanofasern beschichtete Stents wurden bei 4 °C bis zur folgenden Studie gelagert.

PL-beladene Nanofasermatten wurden für die Wirkstofffreisetzung und Tierstudien sorgfältig vom Stent getrennt. Eine leere Nanofasermembran wurde in Abwesenheit von PL mit einem ähnlichen Verfahren hergestellt.

Der Wirkstoffgehalt wurde wie folgt gemessen:5 mg PL-inkorporierte Nanofasermatten wurden 2 h in DMSO gelöst. Ein UV-Spektrophotometer (UV-1601, Shimadzu Co. Ltd. Osaka, Japan) wurde verwendet, um die Wirkstoffkonzentration bei 325 nm zu messen. Leere Nanofasermatten wurden ebenfalls in DMSO gelöst und für den Blindtest verwendet.

Die Arzneimittelfreisetzungsstudie wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 0,01 µM, pH 7,4) in vitro durchgeführt. Nanofasermatten wurden in Scheiben geschnitten, und 10 mg der Scheiben wurden in 40 ml PBS (0,01 ml, pH 7,4) in einem konischen 50 ml-Röhrchen eingetaucht. Dieser wurde in einen Schüttelinkubator bei 100 U/min (37 °C) gestellt. Ganze Medien wurden entnommen, um die Konzentration von freigesetztem PL aus Nanofasermatten in bestimmten Zeitintervallen zu messen. Die PL-Konzentration im Medium wurde mit einem UV-Spektrophotometer (325 nm) gemessen. Leere Nanofasermatten wurden auch als Blindtest verwendet. In der Freisetzungsstudie wurde den Freisetzungsmedien Wasserstoffperoxid zugesetzt, um die Wirkung von ROS auf die Freisetzungsrate des Arzneimittels zu untersuchen.

Morphologie

Die Morphologie von Nanofasermatten wurde mit einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop (S-4800; Hitachi, Tokio, Japan) bei 25 kV beobachtet.

Zellkultur

Humane CCA-Zelllinien wie SNU478, SNU245 und SNU 1196 CCA-Zelllinien wurden von der Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea) erhalten. Die humane CCA-Zelllinie HuCC-T1 wurde von der Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan) erhalten. Alle Zellen wurden in RPMI1640, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin, bei 37 °C in einem 5 % CO₂ . kultiviert Inkubator.

Studie zur Krebsbekämpfung

Verschiedene CCA-Zellen (1 × 10 ⁴ ), die in 96-Well-Platten ausgesät wurden, wurden verwendet, um die Antikrebsaktivität von PL selbst, von PL-inkorporierten Nanofasermatten oder von PL, die von Nanofasermatten freigesetzt wurden, zu bewerten. Die Zellen wurden über Nacht in einem 5 % CO₂ . gehalten Inkubator bei 37 °C. Für die PL-Behandlung wurden in DMSO (10&supmin;&sup4; mg PL/ml DMSO) gelöste PL mit RPMI1640-Medium verdünnt. Die Endkonzentration von DMSO war niedriger als 0,5%. Zur Behandlung von PL, das aus Nanofasermatten freigesetzt wurde, wurden Nanofasermatten mit eingebautem PL in 40 ml PBS in einem konischen 50 ml-Röhrchen eingetaucht. An Tag 5 und Tag 15 wurde die PL-Konzentration mit einem UV-Spektrophotometer wie oben beschrieben gemessen und zur Behandlung von Zellen verwendet. Zum Vergleich wurde auch leere Nanofaser an das Freisetzungsexperiment angepasst. Zellen wurden PL selbst oder PL, das von Nanofasermatten freigesetzt wurde, 2 Tage lang ausgesetzt. Die Lebensfähigkeit von CCA-Zellen wurde mit einem MTT-Proliferationsassay bewertet. Dreißig Mikroliter MTT-Lösung (5 mg/ml PBS, pH 7,4) wurden in die Vertiefungen gegeben, und dann wurden die Zellen 4 h in 5% CO₂ . inkubiert Inkubator bei 37 °C. Das Medium wurde verworfen und mit 100 µl DMSO versetzt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät bei 570 nm (Infinite M200 Pro Mikroplatten-Lesegerät, Tecan, Mannedorf, Schweiz) analysiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde als Mittelwert ± Standardabweichung von acht Vertiefungen ausgedrückt.

ROS-Messung

Die ROS-Erzeugung in CCA-Zellen wurde durch das DCFH-DA-Verfahren untersucht. CCA-Zellen (1 × 10 ⁴ Zellen), die in einer 96-Well-Platte ausgesät wurden, wurden mit verschiedenen Konzentrationen von PL selbst oder PL, das aus Nanofasermatten freigesetzt wurde, in phenolrot-freiem RPMI-Medium mit DCFH-DA (Endkonzentration 20 µM) behandelt. Sechs Stunden oder 12 Stunden später wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und durch 100 µl frisches phenolrotfreies RPMI-Medium ersetzt. Der ROS-Gehalt in den Zellen wurde anhand der Fluoreszenzintensitätsänderungen mit dem Infinite M200 pro Mikroplatten-Lesegerät (Anregungswellenlänge 485 nm, Emissionswellenlänge 535 nm) analysiert.

Western Blotting

Western-Blotting von CCA-Zellen wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [31]. Zellen wurden PL selbst oder PL, das von Nanofasermatten freigesetzt wurde, 24 Stunden lang ausgesetzt. Danach wurden die Zellen durch Trypsinierung geerntet, mit kaltem PBS gewaschen und durch Zentrifugation gesammelt. Die Pellets wurden in Lysepuffer mit 50 µM Tris, 150 µM NaCl, 1 % NP-40, 0,5 % Desoxycholsäure, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) mit Phenylmethylsulfonylfluorid und einem Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) lysiert ). Diese Lösung wurde für 30 min bei 4 °C zentrifugiert (14.000×g ); die Zelllysate (Überstand) wurden dann verwendet, um die Proteinkonzentration unter Verwendung des BCA Protein Assay Kits (Pierce, Rockford, IL, USA) zu messen. Protein (50 µg) wurde in SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) geladen, auf eine Polyvinyldifluorid-(PVDF)-Membran übertragen, mit 5% Magermilch in TBS-T blockiert, mit einem geeigneten primären Antikörper sondiert und dann behandelt mit einem sekundären HRP-konjugierten Antikörper für 1 h. Die Immunoblots wurden durch Chemilumineszenz nachgewiesen und dann mit digitalen Analysen unter Verwendung des Softwareprogramms ImageJ quantifiziert.

In-vivo-Studie mit Tumor-Xenograft-Modell

HuCC-T1-tragende Mäuse (BALB/c Nacktmaus, 5 Wochen alt, männlich, 18–23 g Gewicht; Orient, Seongnam, Südkorea) wurden verwendet, um die in vivo Antitumoraktivität von PL-inkorporierten Nanofaser-Stents zu bewerten. 1 × 10 ⁶ HuCC-T1-Zellen in 100 μl PBS wurden subkutan (s.c.) auf den Rücken von Nacktmäusen verabreicht. Scheiben aus PL-inkorporierter Nanofaser und leerer Nanofaser wurden unter den soliden Tumor implantiert, als der solide Tumor einen Durchmesser von ungefähr 4 bis 5 mm erreichte. Die PL-Dosis betrug 10 mg PL/kg. Zum Vergleich wurde PL in Cremophor EL®/Ethanol-Mischlösung (0,5% v /v Cremophor EL® und 0,5 % v /v Ethanol in PBS (pH 7,4, 0,01 M)). Kontrollgruppen wurde PBS neben dem Tumorgewebe subkutan injiziert. Für PL-inkorporierte Nanofasern und leere Nanofasergruppen wurden Nanofaserscheiben wie folgt hergestellt; Nanofaser-Wafer mit gleichem Gewicht wurden in runde Scheiben geschnitten und dann wurde die Rückseite der Haut der Maus vorsichtig herausgeschnitten (0,5 cm lang). Anschließend wurden Nanofaser-Wafer vorsichtig unter das feste Tumorgewebe implantiert. Um einen gleichen Zustand zu erreichen, wurde bei Mäusen mit Kontrollbehandlung und PL-Injektion auch Haut neben dem Tumor (0,5 cm Länge) herausgeschnitten. Jede Gruppe bestand aus fünf Mäusen. Das Tumorvolumen wurde in Abständen von 5  Tagen gemessen, und der erste Tag der Nanofaserimplantation wurde als Tag 0 festgelegt. Das Tumorvolumen wurde anhand der folgenden Gleichung berechnet:V = (a × [b ] ² )/2. a :größter Durchmesser; b :kleinster Durchmesser.

Alle Tierstudien wurden sorgfältig gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Pusan ​​National University (PNUIACUC) durchgeführt. Das in dieser Studie verwendete Tierprotokoll wurde von der PNUIACUC streng auf ihre ethischen Verfahren und wissenschaftlichen Sorgfalt überprüft und genehmigt (Zulassungsnummer:PNU-2017-1608).

Immunhistochemie

Tumorgewebe wurden 30 Tage später isoliert. Dann wurden Tumorgewebe in 4% Formaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und zur Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung in Scheiben geschnitten. Eine immunhistochemische Färbung wurde mit Apoptose-verwandten Proteinen wie Caspase-3- und Caspase-9-Antikörpern durchgeführt. Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1:100 oder 1:200 verwendet, und dann wurde die Färbung mit einem Envision-Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

Statistische Analyse

Statistische Analysen der Daten von behandelten und unbehandelten Zellen wurden mit dem Student's t . durchgeführt Prüfung. Ein p Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Charakterisierung von Polymeren

Um PL-eluierenden GI-Stents herzustellen, wurde LEse-Blockcopolymer wie in Fig. 1 gezeigt synthetisiert. MePEG-NHS wurde mit Selenocystamin umgesetzt und dann wurde die terminale Amingruppe mit der Carboxylendgruppe von PLA konjugiert. Nicht umgesetztes Selenocystamin aus MePEG-Selenocystamin-Konjugaten wurde durch ein Dialyseverfahren entfernt. Darüber hinaus wurden auch nicht umgesetzte MePEG-Selenocystamin-Konjugate aus synthetisierten Blockcopolymeren durch Dialyseverfahren und Fällung in Methanol entfernt. Spezifische Peaks von Selenocystamin wurden bei 1,7 ppm bzw. 2,9 ppm bestätigt, während der spezifische Peak von MePEG auch bei 3,5~3,7 ppm bestätigt wurde. Wenn PLA konjugiert wurde, wurde die Methylgruppe von PLA bei 1,4 ppm bestätigt. PCL-Homopolymer und LEse-Blockcopolymer-Mischung wurden gemischt, um Nanofasermatten herzustellen. MW und Zusammensetzung von LEse-Blockcopolymer und PCL-Homopolymer wurden mit ¹ . gemessen H-NMR-Spektroskopie und GPC. Die Ergebnisse der MW-Schätzung sind in Tabelle 1 gezeigt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde das MW von LEse-Blockcopolymer basierend auf dem MW von PEG unter Verwendung von ¹ . geschätzt H-NMR-Spektroskopie als 9760 µg/mol. GPC-Messungen zeigten, dass das LEse-Blockcopolymer 8210 µg/Mol Mn, 9530 µg/Mol Mw bzw. 1,16 aufweist.

Syntheseschema von LEse-Blockcopolymer

Charakterisierung des Piperlongumin-inkorporierten Nanofaser-beschichteten GI-Stents

Wie in Abb. 2 und Tabelle 2 gezeigt, wurden verschiedene Verhältnisse von PCL und LEse-Blockcopolymer verwendet, um Nanofasern herzustellen und den GI-Stent zu beschichten. PCL-Homopolymer führte zu feinen und dünnen Nanofasermatten mit minimierter aggregierter Form. Bei Zugabe von LEse-Blockcopolymer wurde ein Teil der aggregierten Form wie Körnchen und Partikel beobachtet, wie in Abb. 2 gezeigt. Bei einem höheren LEse-Verhältnis (75/25 und 60/40) zeigten Nanofasermatten eine dickere und unregelmäßige Form von Faser Struktur. Bei einem Anteil von mehr als 50 % LEse in ihrem Inhalt wurden Polymere signifikant aggregiert und Matten zeigten starke Unregelmäßigkeiten (Daten nicht gezeigt). Eine Nanofaserstruktur wurde kaum aus LEse-Blockcopolymer allein erhalten. Daher kann eine Nanofaserstruktur durch Mischen mit PCL-Homopolymer erreicht werden. Der Wirkstoffgehalt in den hergestellten Nanofasermatten mit integriertem PL entsprach fast dem theoretischen Wert, wie in Tabelle 2 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigten, dass Nanofasermatten mit PL-inkorporiert erfolgreich aus PCL-Homopolymer- und LEse-Blockcopolymer-Mischungen hergestellt und dann auf GI-Stents beschichtet wurden.

a PL-inkorporierter Nanofaser-bedeckter GI-Stent. b FE-REM-Foto von Nanofasern mit eingebautem PL

Abb. 3 zeigt die Kinetik der Wirkstofffreisetzung aus Nanofasermatten. Wie in Abb. 3a gezeigt, wurde PL über 25 Tage kontinuierlich aus Nanofasermatten freigesetzt. Eine platzende Freisetzung von PL aus Nanofasermatten wurde bis 4 Tage beobachtet, und dann wurde PL kontinuierlich aus Nanofasermatten bis zum 25. Tag freigesetzt. Höhere Gehalte an LEse-Blockcopolymer in Nanofasermatten führten zu einer schnelleren Freisetzung von PL aus Nanofasermatten. Da LEse-Blockcopolymer weniger hydrophob ist als PCL-Homopolymer, müssen PCL/LEse-Nanofasermatten mit einem höheren Gehalt an LEse-Blockcopolymer stärker gequollen werden als PCL-Homopolymer. Dann führten Nanofasermatten mit einem höheren Gehalt an LEse-Blockcopolymer zu einer schnelleren Wirkstofffreisetzung. Darüber hinaus kann die PL-Freisetzungsrate in Gegenwart von ROS beschleunigt werden, da die Diselenidbindung im LEse-Blockcopolymer durch ROS wie H₂ . zersetzt werden kann O₂ , und dann induzieren diese Faktoren eine redoxresponsive Desintegration von Nanofasermatten (Abb. 3c~e). Nanofasermatten aus PCL-Homopolymer reagierten nicht signifikant auf die Zugabe von H₂ O₂ , d. h. PCL wird nicht stark von H₂ . beeinflusst O₂ Zusatz; auf der anderen Seite, wenn LEse-Blockcopolymer eingemischt wurde, wurde die PL-Freisetzung aus Nanofasermatten signifikant beschleunigt, da H₂ O₂ wurde hinzugefügt . Insbesondere ein höheres LEse-Blockcopolymer-Verhältnis in den Nanofasermatten induzierte eine schnellere Kinetik der Wirkstofffreisetzung, wie in Fig. 3c, d und e gezeigt. Diese Ergebnisse zeigten, dass PL-inkorporierte Nanofasermatten ein redoxresponsives Wirkstofffreisetzungspotenzial in der biologischen Umgebung aufweisen. PL-inkorporierte Nanofasermatten, hergestellt mit PCL/LEse-Blockcopolymer (60/40), wurden nach in-vitro-Zellkulturen und in-vivo-Tierstudien verwendet.

a PL-Freisetzung aus Nanofasern mit verschiedenen Zusammensetzungen. Das Gewichtsverhältnis PCL/Lese betrug 100/0, 90/10, 75/25 bzw. 60/40. b Die Wirkung von Wasserstoffperoxid auf die PL-Freisetzung aus Nanofasermatten (PCL/Lese-Gewichtsverhältnis 100/0). c Die Wirkung von Wasserstoffperoxid auf die PL-Freisetzung aus Nanofasermatten (PCL/Lese-Gewichtsverhältnis war 90/10). d Die Wirkung von Wasserstoffperoxid auf die PL-Freisetzung aus Nanofasermatten (PCL/Lese-Gewichtsverhältnis 75/25). e Die Wirkung von Wasserstoffperoxid auf die PL-Freisetzung aus Nanofasermatten (PCL/Lese-Gewichtsverhältnis war 60/40)

In-vitro-Antikrebsaktivität

Anti-Krebs-Eigenschaften von PL-inkorporierten Nanofasermattenbeschichteten Stents wurden mit verschiedenen CCA-Zellen bewertet. Zum Vergleich wurde aus Nanofasermatten freigesetztes PL an Tag 5 und Tag 15 während des Freisetzungsexperiments extrahiert und mit intaktem PL verglichen. Wie in Abb. 4 gezeigt, änderte sich die Antikrebsaktivität auf freigesetztem PL von Tag 5 und Tag 15 im Vergleich zu PL selbst bei allen HuCC-T1-Zellen (Abb. 4a), SNU1196-Zellen (Abb. 4b), SNU478-Zellen ( Abb. 4c) und SNU245-Zellen (Abb. 4d). Sie haben ein fast ähnliches Hemmpotential in Bezug auf die Lebensfähigkeit der Zellen, obwohl PL selbst bei einer Konzentration von mehr als 10 µg/ml zu einer höheren Antikrebsaktivität führte. Tabelle 3 zeigt den IC₅₀ Wert von PL selbst und freigesetztes PL aus Nanofasermatten. Ebenso wie PL selbst, behielt die freigesetzte PL von Tag 5 und Tag 15 die Antikrebsaktivität bis zu den 15 Tagen des Wirkstofffreisetzungsexperiments bei und zeigte einen angemessenen IC₅₀ Wert bei allen CCA-Zelllinien, obwohl diese Werte bei PL von Tag 5 und Tag 15 im Vergleich zu PL selbst allmählich erhöht wurden. Freigegebene PL ab Tag 4 und Tag 15 in Gegenwart von H₂ O₂ behielt auch die Antikrebsaktivität sowie PL selbst bei. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Antikrebsaktivität von PL während des Nanofaserherstellungsprozesses und der Wirkstofffreisetzungsperiode in der biologischen Umgebung aufrechterhalten wurde. Darüber hinaus erzeugte freigesetztes PL aus Nanofasermatten eine ROS-Erzeugungskapazität bis zu 15 Tagen nach der Wirkstofffreisetzung, ähnlich wie bei PL selbst (Abb. 5). Wie in den Abbildungen 5a und b gezeigt, produzierte PL selbst signifikant mehr ROS bei einer höheren Rate als 5 µg/ml. Freigesetztes PL von Tag 5 und Tag 15 produzierte ebenfalls ROS, obwohl die ROS-Produktion durch freigesetztes PL von Tag 15 leicht verringert wurde, was darauf hindeutet, dass in PL-inkorporierte Nanofasermatten die intrinsischen Antikrebseigenschaften von PL während der Wirkstofffreisetzungszeit beibehalten wurden.

Die Wirkung von PL und freigesetztem PL aus Nanofasermatten auf die Lebensfähigkeit verschiedener CCA-Zellen. a HuCC-T1, b SNU1196, c SNU478 und d SNU245-Cholangiokarzinom-Zellen. 2 × 10 ⁴ Zellen in 96-Well-Platten wurden PL ausgesetzt oder PL aus Nanofasern für 2 Tage freigesetzt. Zur Behandlung von freigesetztem PL wurden Nanofaserscheiben mit eingebautem PL in PBS eingetaucht und dann ein Freisetzungsexperiment für 5 und 15  Tage mit oder ohne 10 mM H₂ . durchgeführt O₂ . Das Medium wurde wie bei der Arzneimittelfreisetzungsstudie bis zu 3 Tage ausgetauscht. Danach wurde das Medium zwischen 5 und 15 Tagen des Freisetzungsexperiments geerntet. Diese Lösung wurde verwendet, um den Vergleich der Antikrebsaktivität von PL selbst und freigesetztem PL zu untersuchen

Die Wirkung von PL und freigesetztem PL aus Nanofasermatten auf die ROS-Generation von HuCC-T1-Zellen (a ) und SNU245-Zellen (b ). PL selbst und freigesetzter PL wurden wie in Abb. 3 beschrieben behandelt

Abbildung 6 zeigt die Expression des Apoptoseproteins in HuCC-T1-CCA-Zellen. Freigesetztes PL (5 Tage) hat eine ähnliche Aktivität bei der Induktion der Apoptose von HuCC-T1-Zellen im Vergleich zu PL selbst, dh die Expression von BAX, Caspase-3, 7 und 9 und die Spaltung von gespaltenem PARP wurde durch Behandlung von veröffentlichte PL (5 days) sowie PL selbst. Diese Ergebnisse zeigten auch, dass freigesetztes PL eine angemessene Antikrebsaktivität sowohl gegen CCA-Zellen als auch gegen PL selbst hat.

Western-Blot-Analyse der Apoptose von HuCC-T1-Zellen. Zellen wurden PL selbst behandelt oder PL aus Nanofasern für 1 Tag freigesetzt und dann Western-Blot-Analyse durchgeführt

In-vivo-Antikrebsaktivität gegen das HuCC-T1-Tumor-Xenotransplantat-Modell

HuCC-T1-tragende Nacktmäuse wurden präpariert, um die Antikrebsaktivität von PL-inkorporierten Nanofaser-beschichteten Stents in vivo zu beurteilen, wie in den Fig. 1 und 2 gezeigt. 7 and 8. As shown in Fig. 7, the volume of HuCC-T1 tumor was gradually increased over 1 month. Growth of tumor volume in the treatment of empty nanofiber was almost similar with control treatment. PL injection properly inhibited tumor growth, compared to control treatment or empty nanofiber treatment. Especially, tumor growth was significantly inhibited by the treatment of PL-incorporated nanofiber, i.e., tumor mass in the treatment of PL-incorporated nanofiber was one third of control treatment. These results indicate that PL-incorporated nanofiber mats have superior potential in inhibition of tumor growth of CCA cells. Furthermore, the expression of caspase-3 and 9 was also increased in tumor tissues as shown in Fig. 8, indicating that released PL from nanofiber mats properly inhibited the growth of the tumor and induced apoptosis of tumor cells. Also, PL-incorporated nanofiber-coated stent has potential to inhibit CCA cells in vitro and in vivo.

The effect of PL solution, empty nanofiber mats or PL-incorporated nanofiber mats on the growth of HuCC-T1 tumor (a ) and the body weight changes (b ). HuCC-T1 (1 × 10 ⁶ cells) cells were implanted to the back of mice. PL dose was adjusted to 10 mg/kg. One hundred microliters of PBS or PL solution was s.c. injected beside the tumor tissue for control treatment and PL solution treatment, respectively. For empty nanofiber and vorinostat nanofiber implantation, wafers of the same weight were cut and then implanted under the tumor tissue. *p < 0,001; **p < 0.01

Immunohistochemical staining (× 400) of HuCC-T1 tumor tissues. Each tumor tissues were stained with BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP-1

Discussion

Abnormal accumulation of ROS in tumor epithelial cells induces carcinogenesis and affects surrounding cells or tissues which constitute tumor microenvironment [39]. Then, abnormal tumor microenvironment is the key player in proliferation, migration, angiogenesis, and metastasis of cancer cells [39,40,41]. An elevated level of ROS in tumor microenvironment induces oxidative stress and causes DNA damage [39]. Also, ROS is also correlated with cholangiocellular proliferation and oncogenic transformation [42]. Paradoxically, increased accumulation of intracellular ROS over toxic level induces apoptosis of cancer cells and tumor suppression [39,40,41,42]. For example, Thanee et al. reported that sulfasalazine as a cystine-glutamate transporter-target drug increased intracellular ROS level and then induced cell death [43]. They also argued that therapeutic efficacy of anticancer drug can be improved by blocking the mechanism of the cell’s ROS defensive system. Also, many research groups investigated ROS-producing small molecules such as melatonin, luteolin, chloroqine, and PL to suppress CCA growth rate by increasing intracellular ROS [44,45,46,47]. Thongsom et al. reported that PL stimulates ROS accumulation in CCA cells and induces cell death by activation of caspase-3 and PARP [47]. We also observed that PL increases the accumulation of intracellular ROS in various CCA cells as shown in Fig. 5. Increased ROS level induced apoptosis signals such as BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP (Fig. 6). The ROS-producing capability of piperlongumine was slightly decreased on day 5 and 15 as shown in Fig. 5. These results might be due to that piperlongumine is unstable in physiological solution, and then ROS-producing capability might have been slightly decreased. Additionally, physicochemical properties of piperlongumine may be affected during the fabrication process of the nanofiber. However, our results showed that ROS-producing capacity of piperlongumine was still maintained during the 15 days of drug release experiment.

Local treatment can be applied for patients with an advanced stage or unresectable stage of CCA [48]. Among various treatment options, DES is a promising candidate for unresectable CCA patients. However, conventional DES for GI tract has no tumor-targetable drug release function, and cytotoxic agent can be eluted in all areas of polymer membrane on the stent. Chemical, physical, or biological stimuli have been applied to induce altered drug delivery in the local region [49,50,51,52]. For example, Wang et al. used a magnitude of applied tensile strain to control drug release rate on the esophageal stent, i.e., increased drug release in a specific region was observed by propagating patterned crack of multilayered coating on the stent [49]. Thin film or nanoporous devices having stimuli-responsiveness such as pH and ionic strength were also investigated for application in DES [50, 51]. Chen and Huang reported that chitosan/poly(vinyl alcohol) hybrid nanofiber membrane was crosslinked with ally disulfide to endow reductant-responsiveness, and then hybrid nanofiber membrane showed favorable biological/material features [52]. We synthesized LEse deblock copolymer and fabricate redox-responsive nanofiber mats for local application in CCA tumors. PCL/LEse-blended nanofiber mats showed increased drug release behavior with responsiveness against H₂ O₂ , indicating that drug release kinetics can be controlled by ROS level in cancer cells or tumor tissues. Furthermore, ROS-dependent drug release from nanofiber mats can be accelerated in tumor since PL is a ROS-producing agent. PL in the tumor may synergistically increase ROS level and then accelerate drug release from nanofiber mats. After all, ROS-dependent release of PL from nanofiber-coated stent synergistically inhibits CCA cells in vitro and in vivo.

Conclusion

We fabricated ROS-sensitive nanofiber mats-coated GI stent using PCL/LEse block copolymer blend. PL was incorporated in nanofiber mats by electrospinning technique. PL release from nanofiber mats was accelerated by addition of H₂ O₂ , indicating that PL-incorporated nanofiber membranes have ROS-responsiveness. PL released from nanofiber mats at 5 days and 15 days showed appropriate anticancer activity even though its anticancer activity was slightly decreased compared to PL itself. As well as PL itself, PL released from nanofiber mats induced ROS generation and apoptosis of CCA cells. Furthermore, PL-incorporated nanofiber mats properly inhibited the growth of HuCC-T1 tumor in mice. We suggest PL-incorporated nanofiber mats prepared by PCL/LEse block copolymer blend as a promising candidate for local treatment of CCA cells.