Demonstration eines flexiblen Graphen-basierten Biosensors für den empfindlichen und schnellen Nachweis von Eierstockkrebszellen

Einführung

Eierstockkrebs ist der zweithäufigste gynäkologische Krebs und weist die höchste Mortalität unter den gynäkologischen Krebsarten auf [1, 2]. Bisher werden die Eierstockkrebspatientinnen aufgrund der unspezifischen Symptome des Eierstockkrebses und des Fehlens wirksamer Früherkennungsmethoden in der Regel sehr spät diagnostiziert. Die Bildgebung in Kombination mit dem Kohlenhydrat-Antigen CA125 kann zur Erkennung und Diagnose von Rezidiven nach Operationen oder Chemotherapien verwendet werden. CA125 ist kein einzelner genauer Marker für Eierstockkrebs, da es von zahlreichen Faktoren beeinflusst wird und einen hohen falsch-positiven Vorhersagewert hat. Die Sensitivität eines erhöhten CA125 (>   35 U/mL), das wir bei der Diagnose des Rezidivs von Eierstockkrebs verwendet haben, beträgt weniger als 70 % [3]. Auch die Ultraschalluntersuchung und die radiologische Untersuchung weisen keine ausreichende Sensitivität und Spezifität in der Früherkennung und Rezidivdiagnostik auf. Die 5-Jahres-Überlebensraten des Ovarialkarzinoms im Stadium I und II betragen 90 % bzw. 70 % getrennt [4]. Trotz der Fortschritte in der chirurgischen Behandlung und adjuvanten Therapie beträgt die 5-Jahres-Überlebensrate des Ovarialkarzinoms im fortgeschrittenen Stadium weniger als 30 % [4]. Die Früherkennung von Eierstockkrebs hängt mit der offensichtlich höheren 5-Jahres-Überlebensrate zusammen, und die Früherkennung eines Rezidivs ist ebenfalls wichtig. Mehrere neue Ansätze wie der TP53-Autoantikörper, DNA-Methylierungsassays, microRNA-Algorithmen, Pap-ähnliche zytologische Analysen wurden berichtet, um die Sensitivität der Früherkennung von Eierstockkrebs zu verbessern [5]. Es ist jedoch dringend, aber immer noch schwierig, eine neue Nachweismethode mit höherer Empfindlichkeit für alle Stadien von Eierstockkrebs zu entwickeln.

Kürzlich fanden Forscher heraus, dass die Tumoren im Frühstadium in Krebszellen in den Blutkreislauf übergehen und Metastasen verursachen können [6]. Zellen gelangen durch Intravasation von Primärtumoren, Rezidiven oder Metastasen in den peripheren Blutkreislauf, die als zirkulierende Tumorzellen bezeichnet werden und als diagnostische oder prognostische Biomarker für solide Tumoren verwendet werden können [7]. Die CTCs sind im peripheren Blut selten und die Nachweismethoden erfordern eine hohe Sensitivität und Spezifität. In den letzten Jahren wurde über immunomagnetische Trennung, mikrofluidische Trennung, filterbasierte Methoden und Ligand-gezielte PCR beim Nachweis von CTC berichtet [8,9,10,11]. Bis heute ist das Zellsuchsystem von Janssen Diagnostics die einzige von der US Food and Drug Administration (FDA) zugelassene CTC-Nachweismethode, die zur Überwachung von Patienten mit metastasiertem Brust-, Dickdarm- und Prostatakrebs verwendet werden kann [12,13,14]. Der Nachweis von CTC bei Eierstockkrebs stellt eine nichtinvasive diagnostische Methode dar und ist von Vorteil, wenn eine Biopsie schwierig ist. Die Erkennungsrate von CTC im Frühstadium von Eierstockkrebs ist jedoch noch gering. Die neuen Methoden zum Nachweis von CTC mit höherer Sensitivität werden weiterhin benötigt. Wenn wir CTC bei Patientinnen mit Eierstockkrebs leicht erkennen können, kann dies sowohl bei der Tumorfrüherkennung als auch bei der Überwachung des Wiederauftretens und des Behandlungseffekts nützlich sein.

Graphen, ein zweidimensionaler Halbleiter, wurde 2004 von Andre Geim und Kostia Novoselov isoliert [15]. In letzter Zeit wurden graphenähnliche 2D-Materialien weit verbreitet in Sensorik und Biosensorik, Energieumwandlung und -speicherung, Katalyse, Verbundwerkstoffen und Beschichtungen, Elektronik und biomedizinischen Bereichen eingesetzt [15]. Der Graphen-Sensor ist aufgrund seiner einzigartigen Struktur und hervorragenden elektrischen Leistung ein vielversprechender Kandidat zum Nachweis von Krebs-Biomarkern, der zum Nachweis von karzinoembryonalem Antigen, Prostata-spezifischem Antigen, Kohlenhydrat-Antigen 19–9 und 15–3 entwickelt wurde [16,17,18,19 ]. Im Vergleich zu herkömmlichen Biosensoren auf Graphenbasis, die auf starrem SiO₂ . hergestellt werden /Si-Substrate durch konventionelle Photolithographie, Elektrodenverdampfung, Lift-off und Sensor-Package-Prozess unter Verwendung wertvoller Einrichtungen, ist es wichtig, einen kostengünstigen und einfachen Ansatz zur Herstellung flexibler Biosensoren auf Graphenbasis mit hoher Empfindlichkeit und schneller Erkennungsgeschwindigkeit zu entwickeln.

Um solche Probleme anzugehen, entwickeln wir hier einen neuartigen und einfachen Ansatz zur Herstellung eines flexiblen Biosensors auf Graphenbasis auf einem PET-Substrat. Zwei Elektroden wurden direkt auf Graphen/PET unter Verwendung von Silberpaste hergestellt, und der Zellpool wurde direkt unter Verwendung von Silikongel aufgebaut; Dieser flexible Biosensor kann in jedem Labor von Hand hergestellt werden, ohne dass ein Fotolithografieprozess und wertvolle Einrichtungen erforderlich sind. Überraschenderweise zeigen unsere flexiblen Biosensoren auf Graphenbasis eine hohe Sensitivität und können Eierstockkrebszellen schnell erkennen. Soweit uns bekannt ist, gibt es noch keine Berichte über flexible Graphen-basierte Biosensoren zum Nachweis von Eierstockkrebszellen.

Materialien und Methoden

Wachstum und Übertragung von Graphenfilm

In dieser Arbeit wurde der Graphenfilm auf der Oberfläche einer Cu-Folie (Alfa Aesar, Nr. 13382) durch chemische Gasphasenabscheidung (CVD) aufgewachsen [20]. Zuerst wurde das Oberflächenoxid der Cu-Folie mit einer 20 %igen Salzsäurelösung für 5 Minuten entfernt; dann wurde die Cu-Folie mehrere Male mit entionisiertem Wasser gereinigt und dann mit Stickstoffstrom getrocknet. Die gereinigte Cu-Folie wurde auf ein Quarzschiffchen gelegt und in das Quarzrohr des CVD-Ofens gegeben. Die Ofenkammer wurde auf 1 × 10 ^–2 . abgepumpt Pa. Die Ofentemperatur wurde für 20 Minuten mit 50 sccm 99,999 % H₂ . auf 1000 °C erhöht , und dann wurden 50 sccm 99,999 % Methan in das Röhrchen eingeführt, um einen großflächigen Graphenfilm für 20 Minuten wachsen zu lassen. Schließlich wurde der CVD-Ofen mit CH₄ . auf Raumtemperatur abgekühlt /H₂ Gasfluss.

Die großflächige Graphen/Cu-Folie wurde in viele gewünschte Stücke geschnitten. Dann wurde das PMMA auf die Oberfläche der Graphen/Cu-Folie schleuderbeschichtet, wodurch die Sandwich-ähnliche Struktur aus PMMA/Graphen/Cu gebildet wurde. Anschließend wurde die darunterliegende Cu-Folie mit 1 M FeCl₃ . geätzt Lösung. Das PMMA/Graphen wurde 30 Minuten in DI-Wasser gereinigt und dann auf das PET-Substrat übertragen. Schließlich wurde das PMMA mit Aceton entfernt und eine Graphen/PET-Probe entnommen.

Herstellung von Graphen-basierten Biosensoren

Das Herstellungsverfahren von Graphen-basierten Biosensoren wird wie folgt beschrieben. Zuerst wurde ein Graphenfilm von etwa 1 cm  × 2 cm auf einer Cu-Folie auf ein 1 cm  × 2 cm großes PET-Substrat durch ein PMMA-unterstütztes Nassübertragungsverfahren übertragen. Dann wurden zwei Elektroden in der Nähe des Zentrums des Graphen/PET-Films unter Verwendung von Silberpaste hergestellt. Um schließlich die elektrische Reaktion der Krebszelllösung zu testen, wurde am Elektrodenrand ein Zellpool mit mehreren Millimetern Länge und Breite und etwa 1 mm Höhe aus Silikongel aufgebaut. Nachdem das Silikongel des Zellpools vollständig verfestigt ist, kann mit dem Agilent 4155B Halbleiteranalysator überprüft werden, ob der Graphen-Biosensor normal funktionieren kann.

Kultur von SKOV3-Eierstockkrebszellen

SKOV3-Eierstockkrebszellserien (bereitgestellt vom öffentlichen Labor des Second Affiliated Hospital of West China) wurden in RPMI-1640 (Transgene, Frankreich) Komplettmedium mit 10 % Kälberserum (MRC, USA) unter der Bedingung von 5 % CO . kultiviert ₂ und 37 °C.

Vorbereitung der Zelllösung und elektrische Messung

Die Krebszellen wurden mit Zellkulturmedium auf eine bestimmte Konzentration verdünnt. 50μL Zelllösung mit einer Pipette zur Messung in die Rille geben. Das elektrische Signal wurde mit dem Halbleiteranalysator Agilent 4155B aufgezeichnet.

Ergebnisse und Diskussion

Das Foto von 10 × 10 cm ² ein großflächiger CVD-gewachsener Graphenfilm auf einer Cu-Folie ist in Abb. 1 a gezeigt. Aus Abb. 1a kann man erkennen, dass die Farbe von Graphen/Cu im Vergleich zu blanker Cu-Folie mit heller Metallfarbe etwas dunkler ist. Das entsprechende Raman-Spektrum von Graphen/Cu ist in Abb. 1b gezeigt. Wie in Abb. 1b gezeigt, liegt der Raman-Peak bei 1580 cm ⁻¹ und 2680 cm ⁻¹ entsprechen den G- und 2D-Peaks des Graphenfilms. Um die Qualität des Graphenfilms weiter zu überprüfen, haben wir das Raman-Spektrum eines einschichtigen Graphenfilms gemessen, der auf SiO₂ . übertragen wurde /Si-Substrat, wie in Abb. 1c gezeigt. Man kann beobachten, dass das Verhältnis zwischen I _G und ich _2D kleiner als 0,5 ist, was bestätigt, dass die Dicke des Graphens eine Monoschicht ist; man kann auch beobachten, dass der D-Peak sehr niedrig ist und fast nicht beobachtet werden kann, was darauf hindeutet, dass die Qualität des Graphenfilms sehr hoch ist und die Defekte sehr gering sind.

a Foto von blanker Cu-Folie (linkes Bild) und auf Cu-Folie aufgewachsenem Graphen (rechtes Bild), b Raman-Spektrum von Graphen/Cu und c Raman-Spektrum von Graphen/SiO₂ /Si

Die Fotografien von flexiblen Graphen-Biosensoren auf PET-Substraten sind in Abb. 2 gezeigt. Die Krebszelllösung kann in den Zellpool gegeben werden, und das elektrische Signal des Graphen-Biosensors kann von zwei Silberpastenelektroden erhalten werden. Die elektrische Reaktion auf Zellkulturmedium und CTC-Lösung wurden gemessen.

Foto von Graphen/PET-Biosensor

Die Zeitabhängigkeit der Stromantwort für solche Flüssigkeiten wird bei einer festen Spannung von 0,01 V vor und nach dem Einbringen in den Zellenpool aufgezeichnet. Wie in Fig. 3 gezeigt, kann man beobachten, dass der Strom vor dem Eintauchen einer solchen Flüssigkeit konstant bleibt; Wenn solche Flüssigkeiten in den Zellpool gegeben wurden, nimmt der Strom schnell ab und hält dann langsam ein neues Gleichgewicht. Die Antwort ist definiert als η = (ich ₀ − Ich )/Ich ₀ *100 %, wobei ich ₀ ist der Strom kurz vor dem Eintauchen der Flüssigkeit, und I maximaler (oder minimaler) Wert ist, nachdem die Flüssigkeit zu einem bestimmten Zeitpunkt eingetaucht wurde. Man kann sehen, dass nach dem Einbringen solcher Flüssigkeiten der Widerstand von Graphem zunimmt. Die elektrische Reaktion für das Kulturmedium nackter Zellen und die CTC-Lösung vor und nach dem Eintauchen der Lösung 200 s beträgt 2,96 % bzw. 37,04 %. Offensichtlich ist die elektrische Reaktion der CTC-Lösung selbst bei 30 Zellen/ml im Vergleich zu Kulturmedium mit bloßen Zellen sehr signifikant, was darauf hindeutet, dass der flexible Biosensor auf Graphenbasis sehr empfindlich für die Erkennung von Krebszellen ist.

a Elektrische Reaktion für Kulturmedium mit bloßen Zellen und b Krebslösung mit 30 Zellen

Die Zeitabhängigkeit des elektrischen Signals für bloßes Zellkulturmedium und CTC-Lösung mit 30 Krebszellen/ml wird weiter aus Abb. 3 analysiert. Wie in Abb. 4 gezeigt, kann man beobachten, dass im Vergleich zu dem von nacktem Zellkulturmedium die elektrische Reaktion auf CTC-Lösung (sogar als 30 Zellen/ml) ist sehr empfindlich und schnell. Nach dem Eintauchen der Zelllösung dauert es nur 2,1, 2,0, 4,5, 7,5, 10,5, 28,5 s, um eine Reaktion von 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 % zu erreichen, während die Reaktion der entsprechenden Zellkultur mittel steigt nur von 0,15 auf 1,3 %. Das bedeutet, dass sich der flexible Graphen-Biosensor sehr gut für eine schnelle und empfindliche Detektion innerhalb von 5 s eignet.

Zeitabhängigkeit der elektrischen Antwort für Zellkulturmedium und CTC-Lösung

Wir untersuchten weiter die elektrische Reaktion für zwei Arten von CTC-Krebszellen (SUDHL8-Zellen und OCILYS-Zellen) mit gleichen Konzentrationen von 10.000 (10 K)/ml. Wie in Abb. 5 gezeigt, die Zeitabhängigkeit des Stroms für zwei verschiedene Krebszellen mit etwas unterschiedlichem Trend und einem großen Unterschied in der elektrischen Reaktion. Das bedeutet, dass der Graphen-Biosensor vielversprechend ist, um verschiedene Krebszellen zu identifizieren.

Zeitabhängigkeit der elektrischen Reaktion für verschiedene Krebszellen:a SUDHL8 und b OCILYS

Die Zeitabhängigkeit von elektrischem Strom und Ansprechen für SUDHL 8-Krebszelllösung mit verschiedenen Zellkonzentrationen von 10.000 (10 K)/ml und 100 K/ml wurde ebenfalls untersucht. Wie in Abb. 6 gezeigt, kann man beobachten, dass eine Lösung mit einer niedrigeren Krebszellkonzentration einen höheren Strom zeigt, was darauf hindeutet, dass die Krebszelle dazu neigt, isolierend zu sein und viele weitere Zellen nicht leitfähig sind. Die Zeitabhängigkeit der Reaktion für zwei konzentrierte Lösungen zeigt ähnliche Änderungstrends und die Reaktion für Lösungen mit niedrigerer Konzentration ist etwas höher als die von Lösungen mit höherer Konzentration. Diese Ergebnisse zeigen, dass Biosensor verwendet werden kann, um Krebslösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen zu identifizieren.

Zeitabhängigkeit des elektrischen Stroms (a ) und Antwort (b ) für SUDHL8-Krebszellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von 10 K und 100 K Zellen/ml

Wie oben erwähnt, zeigen die Ergebnisse, dass ein billiger und flexibler Biosensor auf Graphenbasis unterschiedliche Reaktionen auf Zellkulturmedium und Krebslösung, verschiedene Krebszellen und Krebszelllösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen zeigt, was darauf hindeutet, dass ein solcher flexibler Biosensor auf Graphenbasis vielversprechend ist verwendet, um CTC-Ovarialkrebszellen zu erkennen und zu identifizieren.

Schlussfolgerung

Um eine effiziente Früherkennungsmethode speziell für Eierstockkrebs zu entwickeln, entwickeln wir einen sehr einfachen Graphen-basierten flexiblen Biosensor auf PET-Substrat. Dieser flexible Biosensor besteht aus einem Zellpool und zwei Elektroden und vergleicht das elektrische Signal vor und nach der Zugabe von Zelllösung, was eine hohe Empfindlichkeit und schnelle Erkennungsgeschwindigkeit zeigt. Es zeigt offensichtlich unterschiedliche Reaktionen für Zellkulturmedium und Krebslösung, verschiedene Krebszellen und Krebszelllösung mit unterschiedlichen Konzentrationen. Unsere Arbeit zeigt, dass ein flexibler Biosensor auf Graphenbasis vielversprechend ist, um CTC-Ovarialkrebszellen empfindlich und schnell zu erkennen/zu identifizieren.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Autoren können bestätigen, dass alle relevanten Daten in dem Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten sind.

Abkürzungen

CA:

Kohlenhydrat-Antigen

CTC:

Zirkulierende Tumorzelle

PET:

Polyethylenterephthalat

FDA:

Food and Drug Administration

Lebenslauf:

Chemische Gasphasenabscheidung