Optimierung der Imaging-Flusszytometrie zur Quantifizierung der HEK293T-Extrazellulären-Vesikel-Aufnahme

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nanoskalige Lipiddoppelschicht-gebundene Vesikel, die von den meisten Zelltypen als Kommunikationsmechanismus natürlich sezerniert werden, um Proteine, Lipide und genetisches Material zu liefern. Trotz des therapeutischen Potenzials von EVs gibt es begrenzte Informationen zu EV-Aufnahmekinetik und -spezifität. Hier optimierten wir eine auf Imaging-Flusszytometrie (IFC) basierende Plattform, um Dosis-, Zeit- und Empfängerzellspezifitätseffekte auf die Internalisierung menschlicher embryonaler Nierenzellen (HEK293T) EVs quantitativ in hochdurchsatzfähiger Weise zu bewerten. Wir fanden, dass die HEK293T-EV-Aufnahme ein aktiver, dosis- und zeitabhängiger Prozess ist. Weiterhin wurde die Selektivität der EV-Aufnahme in vitro quantifiziert, und wir fanden, dass HEK293T-EVs in höheren Mengen von Zellen derselben Herkunft internalisiert wurden. Schließlich internalisierten neuronale Stammzellen signifikant mehr HEK293T-EVs als reife Neuronen, was darauf hindeutet, dass Stammzellen oder Vorläuferzellen, die metabolisch aktiver sind als terminal differenzierte Zellen, höhere Raten aktiver EV-Internalisierung aufweisen könnten. Die Charakterisierung der EV-Aufnahme, insbesondere Spezifität, Dosis- und Zeitabhängigkeit sowie kinetische Assays, wird helfen, gezielte und effiziente EV-basierte Therapeutika zu entwickeln.

Einleitung

Die Extrazelluläre-Vesikel-Forschung ist ein aufstrebendes Feld aufgrund des therapeutischen und diagnostischen Nutzens natürlicher und modifizierter extrazellulärer Vesikel (EVs). EVs reichen von 50 bis 1000 nm im Durchmesser, werden von allen Zelltypen produziert und sind angereichert mit Transmembranproteinen, einschließlich CD63, CD81 und CD9; Lipiden; Proteinen; und DNA, RNA, mRNA und microRNA [1–5]. EV-Inhalt, insbesondere aktives mRNA und miRNA, wurde in die Modulation von Empfängerzellen über de-novo-Translation und posttranslationale Regulation von Zielzellen involviert [4,6]. Das Verständnis und die anschließende Modifikation kinetischer EV-Aufnahme und Internalisierung wird schließlich zu optimierter Lieferung von EV-Inhalten an Zielzellen mit ausreichend hohen Konzentrationen für therapeutischen Nutzen führen.

Einst als „Müll der Zellen“ betrachtet, wurden EVs als Alternative zu Zelltherapien genutzt aufgrund vieler Vorteile: Biokompatibilität, niedrige Immunogenität und Toxizität, Möglichkeit wiederholter Dosierung, verschiedene Verabreichungswege und Potenzial zur Lieferung von Medikamenten und Gentherapien [3]. Unsere Gruppe berichtete zuvor positive Effekte neuraler Stammzell-abgeleiteter EVs bei Schlaganfall und traumatischer Hirnverletzung. In murinen und porzinen Schlaganfallmodellen verbesserten EVs Gewebe- und funktionelle Erholung nach Schlaganfall [3,7,8]. Wir zeigten auch, dass EVs neuroprotektiv mit funktionellen Vorteilen in einem Nagetiermodell traumatischer Hirnverletzung sind [9]. Trotz dieser beobachteten Effekte und zukünftigem Potenzial gibt es wenig Verständnis für EV-Aufnahmespezifität und -kinetik, was die Translation von EV-Therapeutika in die Klinik behindern könnte.

EVs wurden auch als Transfervektoren konstruiert und mit therapeutischen Agenten beladen, einschließlich Gentherapien und chemischen Verbindungen als Alternative zu Nanopartikel-Therapeutika und -Liefervektoren [4,10–12]. HEK293T-Zellen wurden aufgrund ihrer schnellen Proliferation, hohen EV-Ausbeute und einfachen genetischen Manipulierbarkeit häufig als EV-Produzentenzellen verwendet [13–17]. HEK293T-EVs lieferten Gentherapien einschließlich miRNA-Therapeutika bei Brustkrebs [12] und wurden verwendet, um Chemotherapeutika und therapeutische Proteinkonstrukte in einem Schwannom-Modell zu liefern [18]. Ähnlich wie synthetische Nanopartikel-Studien zur Bewertung der Zytotoxizität in vitro zeigten MTT-Toxizitätstests niedrige Toxizität unbehandelter HEK293T-EVs und anschließende hohe Zytotoxizität bei Beladung mit Chemotherapeutika [10,18–21]. Aufgrund dieser umfangreichen Nutzung von HEK293T-EVs analysierten wir ihre Kinetik und Spezifität in dieser Studie.

Selektive oder spezifische Aufnahme bezieht sich auf die natürliche Fähigkeit eines EVs, spezifische Zelltypen anzusprechen. Es gibt zahlreiche Beweise zu Mechanismen der EV-Internalisierung, aber wenig Konsens zur Aufnahmespezifität [22]. Oft zeigen EVs selektive Aufnahme durch ähnliche Empfängerzellen wie ihre Elternzellen: Epithelzellen internalisieren mehr epithelial-abgeleitete EVs als andere Empfängerzellen [23,24], und mesenchymale Stammzellen (MSC) internalisieren signifikant mehr MSC-abgeleitete EVs im Vergleich zu anderen Zelllinien in vitro [24]. Andere Studien fanden jedoch, dass EVs von allen Zelltypen internalisiert werden und bei In-vivo-Verabreichung eine nicht-selektive Biodistribution zeigen [22,25]. Trotz des immensen therapeutischen Potenzials und Interesses an EVs besteht ein Mangel an Verständnis der EV-Aufnahmespezifität. Durch besseres Verständnis der EV-Aufnahmespezifität können wir EV-Produzentenzellen適切選択, die selektiv von interessierenden Empfängerzellen internalisiert werden, und so die therapeutische Anwendbarkeit von EVs verbessern.

Ein potenzieller Grund für widersprüchliche EV-Aufnahmeergebnisse ist der Mangel an Standardisierung in Messplattformen, einschließlich Analysen von Dosis- und Zeiteffekten. Kürzlich veröffentlichte eine Expertengruppe der International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) ein Positionspapier, das die Notwendigkeit der Analyse von Dosis und Zeit sowie anderer Störfaktoren auf EV-Aufnahme betonte [26]. Die Gruppe stellte fest, dass „eine Dosis nicht für alle passt“ und dass Dosis die EV-Aufnahme oder -Selektivität beeinflussen kann [26]. Erhöhte Dosen von HEK293T-EVs verschieben das Biodistributionsmuster in vivo [27]. Aufnahmerprofile von serumabgeleiteten EVs wurden signifikant durch Dosis verändert [28]. Zusätzlich können Co-Inkubationszeiten von EVs mit Empfängerzellen von 15 min bis 48 h [24,29–33] die Aufnahmemessungen verändern. Wenn von EV-Forschern und Industrie übernommen, könnte ein quantifizierbarer und zuverlässiger Prozess zur Bestimmung standardisierter Dosis-Zeit-Kurven zur Identifizierung der minimalen wirksamen Dosis zu robusteren und nützlicheren Studien führen.

Bisher nutzten Forscher Standard-Flusszytometrie zusammen mit verschiedenen Formen niedrigdurchsatziger Mikroskopie einschließlich Konfokalmikroskopie zur Analyse der EV-Aufnahme [32–34]. Diese Technologien haben jedoch mehrere Einschränkungen. Konfokalmikroskopie kann zeitaufwändig und subjektiv sein. Traditionelle Flusszytometer sind für biologische Partikel im zellulären Bereich konzipiert, können EV-Schwärme oder Koinzidenzen nicht unterscheiden und haben erhöhtes Rauschen durch Triggerung [35–37]. Wie von der ISEV-Gruppe erwähnt, gibt es wachsendes Bewusstsein für die physikalischen Limitationen traditioneller Flusszytometrie und die Forderung nach spezialisierter Flusszytometrie mit Detektionsgrenzen im 100-nm-Bereich [26,38]. Imaging-Flusszytometrie (IFC) kombiniert den hochdurchsatzfähigen quantitativen Charakter der Flusszytometrie mit Fluoreszenzbildgebungstechnologie, die inhärent kleine fluoreszierende Partikel bis 100 nm Durchmesser auflösen kann [38]. IFC-Fähigkeiten führen zu geringem Rauschen/Hintergrund, verringertem Schwarmverhalten und CCDs für Bildklarheit [37,39]. Diese Eigenschaften unterstützen die Entwicklung einer Gating-Strategie zur Charakterisierung von EVs und Aufnahme mit visueller Bestätigung in hochdurchsatzfähiger Weise als genaue und quantifizierbare EV-Aufnahmeplattform [36,37,40].

In dieser Studie wurden CD63-eGFP-exprimierende HEK293T-Zellen als Spenderzelllinie für die EV-Produktion aufgrund ihrer häufigen Verwendung in der therapeutischen Entwicklung genutzt. Die isolierten fluoreszierenden EVs wurden mit Empfängerzelllinien einschließlich neuraler und endothelialer Zellen ko-kultiviert. Die Aufnahme wurde mittels IFC quantifiziert, was zu einer standardisierten Plattform zur Messung wichtiger kinetischer EV-Aufnahme- und Internalisierungsmerkmale für in-vitro-Zellsysteme führte. Weiterhin liefern wir Daten zu einem Prozess zur Quantifizierung der Aufnahme fluoreszierender EVs unter unterschiedlichen Bedingungen und kultivierten Zelllinien, um selektive EV-Aufnahme zu elucidieren.

Materialien und Methoden

Zellkultur

Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293T) wurden von ATCC bezogen und in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin kultiviert. Menschliche neurale Stammzellen (hNSC), SH-SY5Y-Neuronenzellen, C3A-Leber-Epithelzellen, menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC) und Neuronen wurden alle unter Standardbedingungen bei 37 °C, 5% CO₂ vor EV-Aufnahmeassays kultiviert.

EV-Markierung und Isolierung

CD63-eGFP-Plasmid-DNA wurde von Addgene (#62964) bezogen. CD63-pEGFP C2 war ein Geschenk von Paul Luzio (Addgene Plasmid #62964). HEK293T-Zellen wurden auf 70% Konfluenz in 10-cm-Schalen kultiviert, und 10 µg Plasmid-DNA wurde gemäß Herstelleranweisungen mit Lipofectamin 2000 transfiziert. 24 Stunden post Transfektion wurde das Medium auf standard HEK293T-Medium ohne fötales Kälberserum gewechselt und für 3 aufeinanderfolgende Tage gesammelt. Wie zuvor beschrieben [3], wurde das HEK293T-Medium durch einen 0,22-µm-Filter filtriert und durch Ultrafiltration mit 100-kDa-regenerierten Zellulose-Amicon-Zentrifugalfiltern angereichert und zweimal mit PBS++ gewaschen. EVs wurden auf 1 ml konzentriert, und Konzentration und Größenverteilung wurden per Nanosight NS300 nach Herstellerprotokoll (Malvern, UK) gemessen. EVs wurden aus verschiedenen HEK293T-Kultivargefäßen isoliert, jedes Gefäß als separater biologischer Replikat, mit drei technischen Replikaten innerhalb jedes biologischen Replikats (mindestens neun Proben insgesamt pro Bedingung).

Aufnahmeassays

Empfängerzelllinien wurden bei 60% Konfluenz in einer 6-Well-Platte für 24 h unter Standardkulturbedingungen bei 37 °C ausgesät. Standardmedien wurden vor EV-Co-Kultur auf fötales Kälberserum-freie (FBS⁻) Medien gewechselt. GFP-markierte EVs wurden den Zellen in variierenden Dosen und Zeitpunkten verabreicht. Nach Co-Kultur wurden Zellen in 5% Trypsin resuspendiert und auf ca. eine Million Zellen pro 50 µl für Flusszytometrie konzentriert. 37 °C ist Standard für EV-Aufnahmeexperimente in unseren Assays, da es Standard für Zellkultur und in-vitro EV-Aufnahmeplattformen war [31,41–44].

Inhibitorische Assays

Kälte-Assay

EVs wurden bei 4 °C mit Empfängerzellen ko-kultiviert, um Zellwachstum effektiv zu „pausieren“ und aktive Prozesse zu inhibieren [45]. 4 °C inhibiert alle aktiven Formen der EV-Aufnahme [31,41–44].

Fixierungs-Assay

Empfängerzellen wurden 30 min auf Eis in 4% Paraformaldehyd fixiert und sofort mit PBS gewaschen vor Co-Kultur mit EVs, um alle aktiven Formen der EV-Aufnahme zu inhibieren.

ImageStreamX-Akquisition

Akquisition erfolgte auf dem ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer (Luminex Corporation, Seattle, Washington) mit INSPIRE-Software. Mindestens 5000–10.000 Zellereignisse wurden akquiriert. Jedes biologische Sample wurde in drei technischen Replikat-Wellen repliziert und einzeln auf dem ISX akquiriert. Hellfeldbilder wurden auf Kanal 1 und Seitenstreuung (785 nm) auf Kanal 6 gesammelt. Grünes fluoreszierendes Protein (GFP) wurde durch 488-nm-Argonlaser bei 200 mW angeregt, Fluoreszenz wurde auf Kanal 2 (480–560 nm) gesammelt. Eine Vergrößerung von 60× wurde bei jeder Probe zusammen mit niedriger Akquisitionsrate für hohe Sensitivität verwendet.

IDEAS-Analyse

Daten- und Bildanalysen wurden mit IDEAS-Software (Luminex) durchgeführt. Die Gating-Strategie ist wie folgt:

1. Fokus-Gate wurde bestimmt, um Zellen zu eliminieren, die nicht im Fokusfeld lagen, unter Verwendung des Gradient-RMS-Werts.
2. Fokussierte Zellen wurden gegatet, um Dubletten und Debris zu eliminieren, mittels Flächen-Hellfeld vs. Aspektverhältnis-Hellfeld. Gegatete Daten wurden verwendet, um Histogramme zu erstellen und statistische Referenzen zu generieren, die Fluoreszenzintensität (Summe aller Pixel in einem Bild), maximale Pixelintensität (Intensität der hellsten Pixel) sowie Spot-Count-Werte über interne Algorithmen für jede Probe messen. Spot-Count-Merkmale wurden mit den entsprechenden IDEAS-Wizards generiert. Spot-Count, mittlere Intensität und maximales Pixelverhältnis werden durch die Formel (Ausgabewert mit EVs / Ausgabewert ohne EVs) berechnet.

Statistik

Alle quantitativen Daten wurden mit GraphPad Prism 8.1.2 (San Diego, Kalifornien) analysiert und in Triplikaten durchgeführt. Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Statistische Signifikanz wurde mittels ungepaartem T-Test oder einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey- oder Dunnett-Mehrfachvergleich post hoc im Vergleich zu Kontrollen bestimmt, falls appropriate. p < 0,05 wurde als signifikant betrachtet.

Ergebnisse

Eigenschaften CD63-eGFP-markierter HEK293T-Extrazellulärer Vesikel

Um fluoreszierend markierte EVs für die Analyse der Kinetik und Aufnahme extrazellulärer Vesikel zu generieren, wurden HEK293T-Zellen mit einem Plasmid transfiziert, das CD63-eGFP-Fusionsprotein trägt. CD63 ist ein Tetraspanin-Protein, das häufig in der Membran von Exosomen angereichert ist, was es zu einem optimalen Ziel für EV-fluoreszente Markierung macht [46,47]. Verbrauchtes Medium wurde aus HEK293T-Zellkultur gesammelt, und EVs wurden wie zuvor berichtet isoliert [8]. Wir verglichen Größe und Verteilung von EVs, isoliert aus CD63-eGFP-transfizierten HEK293T-Zellen, mit nicht-transfizierten HEK293T-Zellen. Kontroll- und CD63-eGFP-transfizierte HEK293T-EVs zeigten einen durchschnittlichen Mediandurchmesser von 110,28 nm bzw. 103,616 nm, gemessen per Nanotracking-Software (Abb. 1a), konsistent mit berichteten Größen von HEK293T-EVs [13,15,27,48]. Keine signifikanten Unterschiede im Mediandurchmesser (p = 0,1615) und Verteilung (p = 0,4225) von EVs aus nicht-transfizierten und CD63-eGFP-transfizierten HEK293T-Zellen wurden beobachtet. eGFP-Markierung veränderte die Größe der HEK293T-EVs nicht (Abb. 1b).

Charakterisierung von HEK293T EVs mit CD63-eGFP-Tag. EVs isoliert aus HEK293T (Kontrolle) und HEK293T exprimierend CD63-eGFP Zellkulturmedien. a Repräsentative EV-Größenverteilung via Nanotracking-Software. b Quantifizierung der mittleren Durchmesserverteilung transfiziert vs. nicht-transfiziert HEK293T EVs. c IFC-Bilder von negativen Kontrollperlen, HEK293T Kontroll-EVs und CD63-eGFP-getaggten EVs. BF = Hellfeld, GFP = grünes fluoreszierendes Protein (488 nm Anregungslaser), SSC = Seitenstreuung. Positives eGFP im GFP-Kanal bedeutet fluoreszierende HEK293T EVs. d Flusszytometrie-basierte MACSPlex-Oberflächenmarker-Expression von nicht-transfizierten HEK293T EVs und HEK293T CD63-eGFP EVs. Beide EV-Quellen sind positiv für CD29, CD9, CD63 und CD81, gemessen in relativer Fluoreszenz (X für positiv). Balken: Mittelwert ± SEM; N = 3; ungepaarter T-Test. n.s. = p > 0,05.

IFC-Assay wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob CD63-eGFP mit EVs assoziiert ist. Als fluoreszierender Negativkontroll dienten 1,34 µM Perlen in Pufferlösung (Abb. 1c, oben), die bei 488-nm-Anregung keine Fluoreszenz zeigten, aber in Hellfeld (BF) und Seitenstreuung (SSC) sichtbar waren. Unmarkierte HEK293T-EVs waren in BF, GFP und SSC negativ, was auf kleine Größe unter BF-Schwellenwert und Fehlen von Fluoreszenz hindeutet (Abb. 1d, Mitte). Das Fehlen in BF deutet auf EV-Größe < 300 nm hin, was minimales Schwarmverhalten suggeriert. Schließlich sind CD63-eGFP-getaggte EVs in BF negativ und im GFP-Kanal positiv, was positive Fluoreszenz der HEK293T-EVs anzeigt (Abb. 1c, unten). Das positive Signal im GFP-Kanal kann auf ein einzelnes EV oder eine Gruppe fluoreszierender EVs hinweisen. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass isolierte HEK293T-EVs Standardgröße und Proteinmarkerprofile aufweisen, konsistent mit früheren Berichten zu HEK293T-Exosomen, und eGFP-Markierung die Größe nicht verändert [5,27].

Mit einer kommerziell verfügbaren flusszytometriebasierten Methode zur Messung gängiger EV-Marker bestimmten wir das gesamte EV-Tetraspanin-Profil [5]. Isolierte HEK293T-EVs aus Kontroll- und CD63-eGFP-exprimierenden HEK293T-Zellen waren positiv für Standard-EV-Marker einschließlich CD9, CD63 und CD81, gemessen in relativer Fluoreszenz (Abb. 1d). Wie zuvor berichtet, wurde CD29 auch auf der Oberfläche von HEK293T-EVs und CD63-eGFP-transfizierten HEK293T-EVs gefunden [5]. Diese Ergebnisse zeigen, dass Isolierungs- und Markierungsmethoden für HEK293T-EVs EVs mit gängigen HEK293T-Exosomen-Markern ergeben.

Aktive Aufnahme von HEK293T-EVs

Zwei inhibitorische Internalisierungsassays wurden durchgeführt. HEK293T-EVs wurden bei 4 °C (kalt) oder mit zuvor paraformaldehyd-fixierten Empfängerzellen (fixiert) ko-kultiviert. Die Behandlungen verringerten das Vorhandensein von eGFP-markierten EVs in Empfängerzellen im Vergleich zu physiologischen Bedingungen (Abb. 2a). Kälte- und Fixierungs-Inhibitionsassays reduzierten Spot-Count (kalt: p = 0,0127, fixiert: p = 0,0078), Intensität (kalt: p = 0,0105, fixiert: p = 0,0374) und maximales Pixel (kalt: p = 0,0159, fixiert: p = 0,0149) der Fluoreszenzsignale in Empfängerzellen ohne Behandlung, was Inhibition der EV-Aufnahme anzeigt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eGFP-Lokalisation und Erhöhung der Ausgabeparameter bedeuten, dass HEK293T-EVs für die folgenden Aufnahmeassays internalisiert werden.

EV-Internalisierungs-Inhibitionsassays. HEK293T-Zellen wurden unter verschiedenen Bedingungen mit HEK293T-EVs ko-kultiviert. Kontrolle (37 °C) = Co-Kultur in physiologischer 37 °C-Umgebung. Kalt = Co-Kultur in 4 °C-Umgebung. Fixierte Inhibition = Assay, bei dem Empfängerzellen vor Co-Kultur PFA-fixiert wurden. a Repräsentative IFC-Bilder der Empfängerzellen. Spalte 1: BF (Hellfeld). Spalte 2: GFP (grünes fluoreszierendes Protein, 488 nm Anregung). Spalte 3: Merge von BF und GFP. Kontrolle zeigt positives GFP für EV-Internalisierung. b–d Quantifizierung der Inhibitionsassays im Vergleich zu Kontrollen via Spot-Count, mittlerer Fluoreszenzintensität und maximalem Pixel. Balken: Mittelwert ± SEM; N = 3; einseitige ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test vs. Kontrolle. *p < 0,05; ***p < 0,01.

Dosisabhängige HEK293T-EV-Aufnahme

Um eine Standard-Dosis-Kurve für die IFC-Plattform zu entwickeln, wurden HEK293T-EVs mit HEK293T-Empfängerzellen bei steigenden Dosen von 0 bis 20.000 EVs pro Zelle bei 37 °C ko-kultiviert. Repräsentative IFC-Bilder zeigten eine visuelle Zunahme der eGFP-Fluoreszenz mit erhöhten EV-Dosen (Abb. 3a). Die niedrigste nachweisbare EV-Anzahl betrug 6000 EVs pro ko-kultivierter HEK293T-Zelle. Auf diesem Niveau waren Spot-Count (p = 0,0012), Intensität (p = 0,0075) und maximales Pixel (p = 0,0005) signifikant höher als Empfängerzellen ohne EVs (Abb. 3b–d). Daher ist eine Dosis von 6000 HEK293T-EVs die untere Nachweisgrenze in unseren experimentellen Bedingungen. Ähnlich zeigten Dosen von 10.000 und 20.000 EVs höhere Spot-Count (10.000: p = 0,0009; 20.000: p < 0,0001), Intensität (10.000: p < 0,0001; 20.000: p < 0,0001) und maximales Pixel (10.000: p < 0,0001; 20.000: p < 0,0001) im Vergleich zu Zellen ohne EVs. Vergleiche zwischen höheren Dosen zeigten keine signifikanten Unterschiede in Spot-Count (6000 vs. 10.000: p = 0,999; 10.000 vs. 20.000: p = 0,0927), Intensität (6000 vs. 10.000: p = 0,8482; 10.000 vs. 20.000: p = 0,999) und maximalem Pixel (6000 vs. 10.000: p = 0,6056; 10.000 vs. 20.000: p = 0,5281). Auch zwischen 6000 und 20.000 gab es keinen statistischen Unterschied im Spot-Count (p = 0,0787) und Intensität (p = 0,8083). Ein signifikanter Unterschied im maximalen Pixel zwischen 6000 und 20.000 (p = 0,0140) bestand. Insgesamt zeigt die Ertragskurve signifikante Dosisabhängigkeit in allen Parametern (Spot, Intensität, max Pixel, p < 0,0001). Dies deutet darauf hin, dass HEK293T-EV-Aufnahme dosisabhängig ist mit einer minimalen Schwelle von 6000 HEK293T-EVs pro Zelle.

HEK293T-EV-Aufnahme hat einen Dosis-Effekt mit minimaler Schwelle von 6000 EVs. HEK293T-Zellen wurden mit HEK293T-EVs bei steigenden Dosen von 0 bis 20.000/Zelle ko-kultiviert. a Repräsentative IFC-Bilder der Empfängerzellen mit jeweiligen EV-Dosen. GFP-Lokalisation bedeutet HEK293T-EV-Aufnahme. b–d Quantifizierung der Dosis-Assays im Vergleich zu Kontrollen und Gruppen via Spot-Count, mittlerer Fluoreszenzintensität und maximalen Pixel-Verhältnissen. Balken: Mittelwert ± SEM; N = 3; einseitige ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test. *p < 0,05; ***p < 0,01.

HEK293T-EV zeitliche Aufnahme

Mit 6000 EVs pro Zelle wurden HEK293T-EVs mit HEK293T-Zellen für steigende Zeiträume vor IFC ko-kultiviert, von 5 min bis 24 h. Die Dauer der EV-Exposition spielte eine Schlüsselrolle für die Menge sichtbarer Fluoreszenz in Empfängerzellen, die nach 12 h abnahm (Abb. 4a). Initial zeigte 30 min Co-Kultur signifikanten Anstieg im Spot-Count (p = 0,0081), was einen möglichen Trend zur EV-Aufnahme andeutete, aber nicht in anderen Parametern (Intensität: p = 0,3073, max Pixel: p = 0,0952) (Abb. 4b–d). Bei 2 h Co-Kultur wurden signifikant höherer Spot-Count (p = 0,0028), Intensität (p = 0,0420) und maximales Pixel (p = 0,0006) im Vergleich zu Zellen ohne EVs aufgezeichnet. Wiederum bei 4 h waren alle Parameter größer als Kontrollen (Spot-Count: p = 0,0003, Intensität: p < 0,0001, max Pixel: p < 0,0001). Intensität und maximales Pixel blieben höher als Kontrollen bei 4, 12 und 24 h Co-Kultur. Keine Unterschiede in Aufnahmemerkmalen zwischen 4 und 12 h (Spot: p = 0,999, Intensität: p = 0,5797, max Pixel: p = 0,2489). Allerdings nahmen Intensität (p = 0,0191) und maximales Pixel (p = 0,0027) zwischen 12 und 24 h ab (Abb. 4c,d). Ähnlich wie die Dosiskurve ist HEK293T-EV-Aufnahme zeitabhängig mit konstanter Aufnahme bei 4 h Inkubation und Peak bei 12 h. Zusammenfassend wurde eine Dosis von 6000 EVs pro Zelle und eine Co-Kultur von 4 h für folgende Aufnahmeassays standardisiert.

HEK293T-EV-Aufnahme ist zeitabhängig. HEK293T-Zellen wurden mit 6000 HEK293T EVs/Zelle für steigende Zeiträume ko-kultiviert. a Repräsentative IFC-Bilder der Empfängerzellen. GFP-Lokalisation bedeutet erhöhte HEK293T-EV-Aufnahme. b–d Quantifizierung der Zeitverlauf-Assays im Vergleich zu Kontrollen und Gruppen via Spot-Count, mittlerer Fluoreszenzintensität und maximalen Pixel-Verhältnissen. Balken: Mittelwert ± SEM; N = 3; einseitige ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test. *p < 0,05; ***p < 0,01.

Vergleichende Aufnahme von HEK293T-EVs durch mehrere Zelllinien

Die Hypothese, dass EV-Aufnahme ein selektiver Prozess ist, bei dem EVs bevorzugt von Zellen ihrer eigenen Herkunft aufgenommen werden, wurde mit IFC getestet. HEK293T-EVs wurden mit HEK293T-Zellen oder anderen Zelllinien ko-kultiviert: epithelial (C3A Leberzellen), endothelial (HUVEC), neural (SH-SY5Y Glioblastomzellen). eGFP-Fluoreszenz war in HEK293T-Zellen reichlicher als in anderen Zelltypen (Abb. 5a). Im Vergleich zu C3A und HUVECs hatten HEK293T-Zellen signifikant höhere Fluoreszenzintensität (C3A: p = 0,0321; HUVEC: p = 0,0055) (Abb. 5c), wenn sie mit HEK293T-EVs ko-kultiviert wurden. Zusätzlich hatten HEK293T-Zellen höheren maximalen Pixel (C3A: p = 0,0221; HUVEC: p = 0,0079; SH-SY5Y: p = 0,0486) (Abb. 5d) im Vergleich zu allen anderen Empfängerzelllinien (Abb. 5b). Bezüglich Intensität waren SH-SY5Y-Zellen signifikant höher als HUVECs bei Co-Kultur mit HEK293T-EVs (p = 0,0304). Diese Ergebnisse unterstützen die selektive Aufnahme von HEK293T-EVs durch HEK293T-Zellen im Vergleich zu anderen Zelllinien in vitro.

HEK293T-EVs zeigen Aufnahmepräferenz für HEK293T-Zellen. HEK293T-EVs wurden mit HEK293T-Zellen, C3A-Epithelzellen, HUVEC und SY5Y-Neuralzellen ko-kultiviert. a Repräsentative IFC-Bilder der Empfängerzellen ko-kultiviert mit HEK293T-EVs. b–d Quantifizierung der EV-Aufnahmepräferenz-Assays im Vergleich zu Kontrollen und untereinander via Spot-Count, mittlerer Fluoreszenzintensität und maximalen Pixel-Verhältnissen. Balken: Mittelwert ± SEM; N = 3; einseitige ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test. *p < 0,05; ***p < 0,01.

Differenzierungsstatus neuraler Zellen und HEK293T-EV-Internalisierung

Da EVs für therapeutische und Lieferzwecke bei neuralen Erkrankungen impliziert sind, wurden menschliche neurale Stammzellen (hNSCs) und reife menschliche Neuronen als Empfängerzelllinien verwendet, um zu prüfen, ob der Differenzierungsstatus der Empfängerzelle eine Rolle bei der selektiven EV-Aufnahme spielt. Repräsentative IFC-Bilder zeigten visuelle Evidenz für Aufnahme in beiden Zelltypen, aber mit größter eGFP-Lokalisation in hNSCs (Abb. 6a). hNSCs, ko-kultiviert mit HEK293T-EVs, hatten höheren Spot-Count (p = 0,0082) und maximales Pixel (p = 0,0083) im Vergleich zu reifen Neuronen. Zusammen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Differenzierungsstatus neuraler Zellen die Aufnahme von HEK293T-EVs beeinflusst.

Neuraler Differenzierungsstatus beeinflusst HEK293T-EV-Aufnahme. HEK293T-EVs wurden mit reifen menschlichen Neuronen und menschlichen neuralen Stammzellen ko-kultiviert. a Repräsentative IFC-Bilder der Empfängerzellen ko-kultiviert mit HEK293T-EVs. b–d Quantifizierung der EV-Aufnahmepräferenz-Assays im Vergleich zu Kontrollen und untereinander via Spot-Count, mittlerer Fluoreszenzintensität und maximalen Pixel-Verhältnissen. Balken: Mittelwert ± SEM; N = 3; ungepaarter T-Test. *p < 0,05; ***p < 0,01 vs. 0 EVs (Kontrolle).

Diskussion

EV In-vitro-Aufnahme-Standardisierungsprozess

Eine internationale Expertengruppe für EVs betonte die Notwendigkeit, die minimal wirksame Dosis von EVs für Aufnahmeassays effektiv zu bestimmen, und hier haben wir ein System entwickelt, das effektiv vom Fachgebiet übernommen werden kann [26]. Es gibt Herausforderungen bei der Analyse der EV-Aufnahme. Wie wir und andere beobachteten, können Ergebnisse abweichen, wenn EV-Dosis und Expositionszeit verändert werden [26]. Wir adressierten HEK293T-EV-Dosis und -Konzentration als kinetische Variable. Auch eine in-vitro-minimal wirksame Dosis könnte die in-vivo-Biodistribution von EVs einheitlicher vorhersagen und zur Entwicklung konsistenterer in-vivo-Dosierungsparameter für EV-Therapeutika und -Lieferung verwendet werden. In einer in-vivo-Maus-EV-Biodistributionsstudie führte eine Erhöhung der HEK293T-EV-Dosis zu einer Verschiebung der relativen EV-Verteilung in Organen [27]. Ähnlich wie in einer früheren in-vitro-Studie mit Blasenkrebs-EVs [39] zeigten HEK293T-EVs starke Dosisabhängigkeit mit minimal wirksamer Dosis bei 6000 EVs in unserer Studie. Wir sind die ersten, die Partikel pro Zelle als sensitives Dosismaß in vitro verwendeten, was besser mit in-vivo-Modellen korreliert, die Partikel pro Körpergewicht verwenden. Unsere Daten zeigten auch eine Dosissättigungsgrenze nach 6000 EVs, was zukünftige in-vivo-Dosisfindungsstudien informieren könnte, indem es anzeigt, dass höhere Dosen begrenzte Vorteile haben könnten.

Eine weitere Störvariable bei der Messung der EV-Aufnahme sind potenzielle zeitliche Effekte. In unserem System fanden wir starke Zeitabhängigkeit mit Aufnahme ab 2 h und potenziellem Abfall zwischen 12 und 24 h. Ähnlich wurde Zeitabhängigkeit in wenigen Studien mit Blasenkrebszellen, Tumorzellen und anderen mit Aufnahme ab 15 min bis 24 h berichtet [29,30,31,32,33,39,43,49]. Wie bei HEK293T-EVs gesehen, könnten die niedrigeren Werte bei 24 h Co-Kultur auf Zellteilung oder Recycling/Degradation früher internalisierter EVs zurückzuführen sein [50]. Spezifisch, da EVs internalisiert und dann abgebaut oder nach 24 h wieder freigesetzt wurden, können längere Inkubationen ungenaue Internalisierungsauslesungen erzeugen [31,50]. Unsere Studie ist die erste, die IFC nutzt, um visuelle und quantitative Evidenz einer zeitabhängigen Ertragskurve bei HEK293T-EV-Aufnahme zu liefern.

Wie das ISEV-Positionspapier nahelegt, kann die Wahl eines EV-Labels die Aufnahme beeinflussen, was weniger disruptive Techniken wie die in unserer Studie verwendete GFP-Tagging-Methode notwendig macht. Speziell behaupten 72% der an einer Umfrage teilnehmenden Forscher, dass Lipidfarbstoff-Experimente unzuverlässig sind, es sei denn, ordnungsgemäße Kontrollen werden verwendet [26]. EV-Farbstoffe korrelieren nicht zuverlässig mit kleinem EV-Inhalt und können sogar die Vesikelgröße erhöhen. Kontamination durch falsch markierte Lipoproteine und Proteingehalt sowie Farbstoffaggregation trugen zu False-Positives bei [51,52]. Daher fusionierten wir CD63 mit eGFP, um HEK293T-EVs zu markieren. Ähnlich wie andere Berichte über Protein-Tagging waren HEK293T-EVs GFP-positiv ohne beobachtete Unterschiede im Durchmesser und behielten die Standard-EV-Oberflächenproteinzusammensetzung [38,46]. Trotz dessen ist zu beachten, dass die Markierung von EVs mit spezifischen EV-Proteinen das Tracking auf nur wenige Subtypen von EVs, die die jeweiligen Marker exprimieren, beschränken kann. Weitere potenzielle Limitationen sind, dass die Fluoreszenzintensität vom Proteinexpressionsniveau, der Effizienz der EV-Membranmarkierung und der Anregungsstärke der Lichtquelle abhängt [53]. IFC ist jedoch empfindlich, detektiert niedrige Fluoreszenzintensität mit genauer Visualisierung von CD63-GFP-Partikeln im 100-nm-Bereich [38,54].

Selektive Aufnahme

EVs zeigen Proteine und andere Signale, die selektive Aufnahme vermitteln können [22,23,55]. Da der erste Schritt der EV-Biogenese die Einstülpung der Plasmamembran ist, enthält die EV-Membran ähnliche Proteine, Rezeptoren, Adhäsionsmoleküle und Integrine wie die Spenderzellmembran [22,24,55]. Die Lipidzusammensetzung und Tetraspanin-Proteine auf EV-Membranen, reguliert durch Spenderzellen, können zu EV-Tropismen mit Empfängerzellen beitragen [23,34,56]. MSC-EVs transportierten Inhalte selektiv in MSCs, trotz größerer Nähe zu Monozyten [24]. Im Gegensatz dazu berichten andere, dass natürliche EVs gleichmäßig von jedem Zelltyp aufgenommen werden, unabhängig von EV-Herkunft [11,22,25,57] bei Nutzung von Imaging oder funktionalen Knockdown-Assays. Mit der IFC-Plattform fanden wir, dass HEK293T-Extrazelluläre Vesikel in größeren Mengen von HEK293T-Zellen als anderen berichteten Zelllinien aufgenommen werden, was eine inhärente EV-Aufnahmespezifität suggeriert. Durch dieses Ergebnis und die Vielseitigkeit von IFC können EV-Quellen angemessen ausgewählt und für das Targeting spezifischer Empfängerzellen analysiert werden. Unseres Wissens ist dies die erste Studie, die Imaging-Flusszytometrie zur Analyse der Spezifität von HEK293T-EVs nutzt.

Zusätzlich zur Selbstselektivität wurde vermutet, dass der Differenzierungsstatus der Empfängerzellen eine Rolle bei der EV-Aufnahme spielt [32,58,59]. Wie unsere Gruppe und andere gezeigt haben, haben EVs therapeutische Effekte im zentralen Nervensystem und modulieren Zellfunktionen in neuronaler Entwicklung und bei Erwachsenen [3,7–9,60]. Hier zeigen wir erstmals, dass der Differenzierungsstatus von Neuronen die EV-Aufnahme beeinflusst, wobei menschliche neurale Stammzellen signifikant größere Aufnahme von HEK293T-EVs im Vergleich zu reifen Neuronen aufwiesen. Unreife hNSCs internalisieren exogene EVs aktiver als ruhende reife Neuronen. Da hNSCs hochproliferative Zellen in Kultur sind, könnten sie unspezifisch Nährstoffe und EVs internalisieren. Ähnlich internalisierten unreife dendritische Zellen EVs auf höheren Ebenen als reife dendritische Zellen [32,59]. Eine andere Studie mit myeloischen Vorläuferzellen fand jedoch, dass reife dendritische Zellen und Makrophagen mehr EVs internalisierten als unreife dendritische Zellen und Monozyten [58]. Die beobachteten Unterschiede können auf die phagozytäre Aktivität weiter differenzierter myeloider Zellen zurückgeführt werden. Aufgrund der in-vitro-Evidenz für selektive Aufnahme können HEK293T-EVs verwendet werden, um undifferenzierte Neuronen in zukünftigen therapeutischen Anwendungen zu modulieren.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend haben wir eine quantitative und hochdurchsatzfähige Plattform zur Quantifizierung der HEK293T-EV-Aufnahmekinetik weiterentwickelt. Diese Plattform kann auf andere Spender-EVs und Empfängerzelltypen sowie Assays für Liposome und synthetische Nanopartikel-Liefervektoren erweitert werden. Signifikant ist, dass wir fanden, dass HEK293T-EV-Aufnahme ein selektiver Prozess ist, mit Spezifität für HEK293T-Zellen. Die hier entwickelten IFC-Assays können verwendet werden, um Parameter für in-vivo-Dosiseskalierung und Biodistributionsstudien besser zu definieren und instrumentelle Informationen für ein prädiktives Modell von EV-Aufnahmeergebnissen in vivo zu liefern.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf angemessene Anfrage beim korrespondierenden Autor verfügbar.

Abkürzungen

EV:

Extrazelluläre Vesikel

HEK293T:

Menschliche embryonale Nierenzelllinie

IFC:

Imaging-Flusszytometrie

hNSC:

Menschliche neurale Stammzelle

GFP:

Grünes fluoreszierendes Protein

BF:

Hellfeld

SSC:

Seitenstreuung

ISEV:

International Society of Extracellular Vesicles