Kinetik und Spezifität der extrazellulären Vesikelaufnahme von HEK293T mittels bildgebender Durchflusszytometrie

Einführung

Die Forschung an extrazellulären Vesikeln ist aufgrund des therapeutischen und diagnostischen Nutzens natürlicher und technisch hergestellter extrazellulärer Vesikel (EVs) ein aufstrebendes Gebiet. EVs haben einen Durchmesser von 50 bis 1000 nm, werden von allen Zelltypen produziert und sind mit Transmembranproteinen, einschließlich CD63, CD81 und CD9, angereichert; Lipide; Proteine; und DNA, RNA, mRNA und microRNA [1,2,3,4,5]. Der EV-Gehalt, insbesondere aktive mRNA und miRNA, wurde mit der Modulation von Empfängerzellen über de novo-Translation und posttranslationale Regulation von Zielzellen in Verbindung gebracht [4, 6]. Das Verständnis und die anschließende Modifizierung der kinetischen EV-Aufnahme und Internalisierung wird schließlich zu einer optimierten Abgabe von EV-Gehalten an die Zielzellen mit ausreichend hohen Konzentrationen führen, um einen therapeutischen Nutzen zu erzielen.

Früher galten EVs als „Müll der Zellen“ und wurden aufgrund vieler Vorteile als Alternative zu Zelltherapien genutzt, darunter ihre Biokompatibilität, geringe Immunogenität und Toxizität, die Möglichkeit zur wiederholten Verabreichung, verschiedene Verabreichungswege und das Potenzial, Medikamente zu verabreichen und Gentherapien [3]. Unsere Gruppe hat zuvor über positive Auswirkungen von aus neuralen Stammzellen gewonnenen EVs bei Schlaganfällen und traumatischen Hirnverletzungen berichtet. Sowohl in Maus- als auch in Schweine-Schlaganfallmodellen verbesserten EVs das Gewebe und die funktionelle Erholung nach einem Schlaganfall [3, 7, 8]. Wir haben auch gezeigt, dass EVs neuroprotektiv mit funktionellen Vorteilen in einem traumatischen Hirnverletzungsmodell von Nagetieren sind [9]. Trotz dieser beobachteten Effekte und des zukünftigen Potenzials von EVs gibt es wenig Verständnis für die Spezifität und Kinetik der EV-Aufnahme, was die Übertragung von EV-Therapeutika in die Klinik behindern könnte.

EVs wurden auch als Übertragungsvektoren konstruiert und mit therapeutischen Wirkstoffen beladen, einschließlich Gentherapien und chemischen Verbindungen als Alternative zu Nanopartikel-Therapeutika und Abgabevektoren [4, 10, 11, 12]. HEK293T-Zellen wurden aufgrund ihrer inhärenten schnellen Proliferation, ihrer hohen EV-Ausbeute und ihrer einfachen genetischen Manipulation häufig als EV-produzierende Zellen verwendet [13,14,15,16,17]. HEK293T-EVs lieferten Gentherapien, einschließlich miRNA-Therapeutika für Brustkrebs [12] und wurden verwendet, um Chemotherapeutika und therapeutische Proteinkonstrukte in einem Schwannommodell zu liefern [18]. Ähnlich wie in Studien mit synthetischen Nanopartikeln zur Bewertung der Zytotoxizität in vitro zeigten MTT-Toxizitätsassays eine geringe Toxizität von ungeladenen HEK293T-EVs und eine anschließende hohe Zytotoxizität, wenn sie mit Chemotherapeutika beladen wurden [10, 18, 19, 20, 21]. Aufgrund dieser reichlichen Verwendung von HEK293T-EVs haben wir in dieser Studie ihre Kinetik und Spezifität analysiert.

Die selektive oder spezifische Aufnahme bezieht sich auf die natürliche Fähigkeit eines EV, auf bestimmte Zelltypen abzuzielen. Es gibt zahlreiche Belege für die Mechanismen der EV-Internalisierung mit wenig Konsens über die Aufnahmespezifität [22]. EVs zeigen häufig eine selektive Aufnahme durch ähnliche Empfängerzellen wie ihre Elternzellen, Epithelzellen internalisieren mehr epitheliale EVs als andere Empfängerzellen [23, 24] und mesenchymale Stammzellen (MSC) internalisieren eine signifikant größere Menge von MSC-derivierten EVs im Vergleich mit anderen Zelllinien in vitro [24]. Andere Studien fanden jedoch heraus, dass EVs von allen Zelltypen internalisiert werden und eine nicht-selektive Bioverteilung aufweisen, wenn sie in vivo verabreicht werden [22, 25]. Trotz des immensen therapeutischen Potenzials und Interesses von EVs besteht ein Mangel im Verständnis der Spezifität der EV-Aufnahme. Durch ein besseres Verständnis der Spezifität der EV-Aufnahme können wir EV-Produzentenzellen, die selektiv von den interessierenden Empfängerzellen internalisiert werden, entsprechend auswählen und so die therapeutische Anwendbarkeit von EVs verbessern.

Ein möglicher Grund für widersprüchliche Ergebnisse zur EV-Aufnahme ist die fehlende Standardisierung der Messplattformen, einschließlich der Analyse von Dosis- und Zeiteffekten. Vor kurzem veröffentlichte eine Expertengruppe der International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) ein Positionspapier, in dem neben anderen Störfaktoren für die EV-Aufnahme die Notwendigkeit einer Analyse von Dosis und Zeit betont wurde [26]. Die Gruppe gab an, dass „eine Dosis nicht für alle reicht“ und dass diese Dosis die Aufnahme oder Selektivität von EV beeinflussen kann [26]. Erhöhte Dosen von HEK293T-EVs verschieben das Bioverteilungsmuster in vivo [27]. Die Aufnahmeprofile von Serum-abgeleiteten EVs wurden durch die Dosis signifikant verändert [28]. Darüber hinaus können Koinkubationszeiten von EVs mit Empfängerzellen im Bereich von 15 min bis 48 h [24, 29,30,31,32,33] die Aufnahmemessungen verändern. Wenn ein quantifizierbarer und zuverlässiger Prozess zur Bestimmung von Standarddosis- und Zeitkurven zur Ermittlung der minimalen effektiven Dosis von EV-Forschern und der Industrie übernommen wird, kann dies zu robusteren und nützlicheren Studien führen.

Zuvor haben Forscher die Standard-Durchflusszytometrie zusammen mit verschiedenen Formen der Mikroskopie mit niedrigem Durchsatz, einschließlich der konfokalen Mikroskopie, verwendet, um die EV-Aufnahme zu analysieren [32,33,34]. Diese Technologien haben jedoch mehrere Einschränkungen. Konfokale Mikroskopie kann zeitaufwendig und subjektiv sein. Herkömmliche Durchflusszytometer wurden entwickelt, um biologische Partikel im zellulären Bereich zu messen, können EV-Schwärme oder Koinzidenz nicht unterscheiden und haben aufgrund der Triggerung ein erhöhtes Rauschen [35,36,37,38]. Wie von der ISEV-Gruppe erwähnt, wächst das Bewusstsein für die physikalischen Grenzen der traditionellen Durchflusszytometrie und unterstreicht die Nachfrage nach einer spezialisierten Durchflusszytometrie mit Nachweisgrenzen im 100-nm-Bereich [26, 38]. Die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) kombiniert die quantitative Hochdurchsatz-Natur der Durchflusszytometrie mit der Fluoreszenz-Bildgebungstechnologie, die von Natur aus kleine fluoreszierende Partikel mit einem Durchmesser von bis zu 100 nm auflösen kann [38]. IFC-Fähigkeiten führen zu geringem Rauschen/Hintergrund, verringertem Schwärmen und geladenen gekoppelten Geräten für Bildklarheit [37, 39]. Diese Eigenschaften helfen bei der Entwicklung einer Gating-Strategie zur Charakterisierung von EVs und der Aufnahme mit visueller Bestätigung im Hochdurchsatz als genaue und quantifizierbare Plattform für die EV-Aufnahme [36, 37, 40].

In dieser Studie wurden CD63-eGFP-exprimierende HEK293T-Zellen aufgrund ihrer häufigen Verwendung in der therapeutischen Entwicklung als Spenderzelllinie für die EV-Produktion verwendet. Die isolierten fluoreszierenden EVs wurden mit Empfängerzelllinien einschließlich neuraler und endothelialer Zellen kokultiviert. Die Aufnahme wurde mit IFC quantifiziert, was zu einer standardisierten Plattform zur Messung der wichtigen kinetischen EV-Aufnahme- und Internalisierungsmerkmale für in vitro-Zellsysteme führte. Darüber hinaus stellen wir Daten zu einem Verfahren zur Quantifizierung der Aufnahme der fluoreszierenden EV-Aufnahme unter verschiedenen Bedingungen und kultivierten Zelllinien zur Verfügung, um die selektive EV-Aufnahme aufzuklären.

Materialien und Methoden

Zellkultur

Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293T) wurden von ATCC gekauft und in DMEM kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum, 100 µE/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin enthielt. Humane neurale Stammzellen (hNSC), SH-SY5Y-Neuralzellen, C3A-Leberepithelzellen, menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC) und Neuronen wurden alle unter Standardbedingungen bei 37 °C, 5 % CO_{2 vor extrazellulären Vesikelaufnahmetests.}

EV-Kennzeichnung und Isolierung

CD63-eGFP-Plasmid-DNA wurde von Addgene (#62964) erhalten. CD63-pEGFP C2 war ein Geschenk von Paul Luzio (Addgene-Plasmid #62964). HEK293T-Zellen wurden in 10-cm-Schalen bis zu einer Konfluenz von 70 % kultiviert und 10 µg Plasmid-DNA wurde mit Lipofectamine 2000 gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Medien gegen Standard-HEK293T-Medien ohne fötales Rinderserum ausgetauscht und an 3 aufeinanderfolgenden Tagen gesammelt. Wie zuvor beschrieben [3], wurden HEK293T-Medien durch einen 0,22-μm-Filter gefiltert und durch Ultrafiltration unter Verwendung von 100-kDa-Amicon-Zentrifugalfiltereinheiten aus regenerierter Cellulose angereichert und zweimal mit PBS++ gewaschen. EVs wurden auf 1 µl konzentriert und Konzentrations- und Größenverteilungen wurden auf Nanosight NS300 nach dem Protokoll des Herstellers (Malvern, UK) gemessen. EVs wurden aus verschiedenen HEK293T-Kulturgefäßen isoliert, wobei jedes Gefäß als separate biologische Replikate betrachtet wurde, mit drei technischen Replikaten in jedem biologischen Replikat (mindestens neun Proben insgesamt für jede Bedingung).

Aufnahmetests

Empfängerzelllinien wurden bei 60 % Konfluenz in einer 6-Well-Platte für 24 h unter Standardkulturbedingungen bei 37 °C ausgesät. Standardmedien wurden vor der Co-Kultur der extrazellulären Vesikel gegen fötales Rinderserum-freies (FBS–) Medium ausgetauscht. Grün fluoreszierendes Protein (GFP)-markierte EVs wurden den Zellen in unterschiedlichen Dosen und zu unterschiedlichen Zeitpunkten verabreicht. Nach der Co-Kultur wurden die Zellen in 5% Trypsin resuspendiert und für die Durchflusszytometrie auf etwa eine Million Zellen pro 50 µl konzentriert. 37 Grad Celsius ist der Standard für EV-Aufnahmeexperimente in unseren Assays, da er sowohl für Zellkultur- als auch für In-vitro-EV-Aufnahmeplattformen verwendet wurde [31, 41, 42, 43, 44].

Hemmtests

Kalttest

EVs wurden mit Empfängerzellen bei 4 °C cokultiviert, um das Zellkulturwachstum effektiv zu „pausieren“ und aktive Prozesse zu hemmen [45]. Vier Grad Celsius hemmen alle aktiven Formen der EV-Aufnahme [31, 41, 42, 43, 44].

Fester Assay

Empfängerzellen wurden in 4% Paraformaldehyd 30 Minuten lang auf Eis fixiert und unmittelbar vor der Co-Kultur mit EVs mit PBS gewaschen, um alle aktiven Formen der EV-Aufnahme zu hemmen.

ImageStreamX-Akquisition

Die Aufnahme wurde auf dem ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer (Luminex Corporation, Seattle, Washington) unter Verwendung der INSPIRE-Software durchgeführt. Es wurden mindestens 5000–10.000 Zellereignisse erfasst. Jede biologische Probe wurde in drei technischen Replikat-Wells repliziert und einzeln auf dem ISx erfasst. Auf Kanal eins wurden Hellfeldbilder und auf Kanal sechs Seitenstreuung (785 nm) aufgenommen. Grün fluoreszierendes Protein (GFP) wurde durch einen 488 nm Argonlaser bei 200 mW angeregt, und die Fluoreszenz wurde auf Kanal zwei (480-560 nm) gesammelt. Bei jeder Probe wurde eine 60-fache Vergrößerung verwendet, zusammen mit einer niedrigen Erfassungsrate für eine hohe Empfindlichkeit.

IDEAS-Analyse

Daten- und Bildanalysen wurden mit der IDEAS-Software (Luminex) durchgeführt. Die Gating-Strategie ist die folgende:

1. 1.

   Focus Gate wurde bestimmt, um Zellen zu eliminieren, die sich nicht im Fokusbereich befanden, indem der Gradient RMS-Wert verwendet wurde.

2. 2.

   Die fokussierten Zellen wurden gegattert, um Dubletts und Debris zu eliminieren, wobei Flächenhellfeld vs. Aspektverhältnis Hellfeld verwendet wurde. Gated-Daten wurden verwendet, um Histogramme zu erstellen und statistische Referenzen zu generieren, die die Fluoreszenzintensität (Summe aller Pixel in einem Bild), die maximale Pixelintensität (Intensität der hellsten Pixel in einem Bild) zusammen mit Punktzahlwerten über interne Algorithmen für jede Probe messen. Punktzählfunktionen wurden mit den entsprechenden IDEAS Wizards generiert. Punktzahl, mittlere Intensität und maximales Pixelverhältnis werden nach der Formel berechnet (Ausgabewert mit EVs/Ausgabewert ohne EVs).

Statistik

Alle quantitativen Daten wurden mit GraphPad Prism 8.1.2 (San Diego, Kalifornien) analysiert und in dreifacher Ausfertigung erstellt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mit einem ungepaarten T . bestimmt Test oder eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukeys oder Dunnetts multiplem Vergleich post hoc im Vergleich zu Kontrollen, falls angebracht. p < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Ergebnisse

CD63-eGFP-markierte HEK293T-extrazelluläre Vesikeleigenschaften

Um fluoreszenzmarkierte EVs zur Analyse der Kinetik und Aufnahme extrazellulärer Vesikel zu erzeugen, wurden HEK293T-Zellen mit einem Plasmid transfiziert, das das CD63-eGFP-Fusionsprotein trägt. CD63 ist ein Tetraspanin-Protein, das häufig in der Membran von Exosomen angereichert ist, was es zu einem optimalen Ziel für die EV-Fluoreszenzmarkierung macht [46, 47]. Verbrauchte Medien wurden aus HEK293T-Zellkulturen gesammelt und EVs wurden wie zuvor berichtet isoliert [8]. Wir verglichen die Größe und Verteilung von EVs, die aus CD63-eGFP-transfizierten HEK293T-Zellen isoliert wurden, mit nicht-transfizierten HEK293T-Zellen. Kontroll- und CD63-eGFP-transfizierte HEK293T-EVs zeigten einen durchschnittlichen medianen Durchmesser von 110,28 nm bzw. 103,616 nm, gemessen mit Nanotracking-Software (Abb. 1a), was mit der berichteten Größe von HEK293T-EVs übereinstimmt [13, 15, 27 , 48]. Keine signifikanten Unterschiede im Mediandurchmesser (p = 0,1615) und Verteilung (p = 0,4225) von EVs, die aus nicht-transfizierten und CD63-eGFP-transfizierten HEK293T-Zellen isoliert wurden, wurden beobachtet. Die eGFP-Markierung veränderte die Größe von HEK293T-EVs nicht (Abb. 1b).

Charakterisierung von HEK293T-EVs, die mit CD63-eGFP markiert sind. EVs wurden aus HEK293T (Kontrolle) und HEK293T isoliert, die CD63-eGFP-Zellkulturmedien exprimieren. a Repräsentative EV-Größenverteilung, aufgezeichnet über Nanotracking-Software. b Quantifizierung der mittleren Durchmesserverteilung von transfizierten vs. nicht-transfizierten HEK293T-EVs. c IFC-Bilder von Negativkontrollkügelchen, HEK293T-Kontroll-EVs und CD63-eGFP-markierten EVs. BF bedeutet Hellfeld, GFP bedeutet grün fluoreszierendes Protein (488 nm Anregungslaser) und SSC bedeutet Seitenstreuung. Positives eGFP im GFP-Kanal bedeutet fluoreszierende HEK293T-EVs. d Durchflusszytometrie-basierte MACSPlex-Oberflächenmarkerexpression von nicht transfizierten HEK293T-EVs und HEK293T-CD63-eGFP-EVs. Beide EV-Quellen sind positiv für CD29, CD9, CD63 und CD81, gemessen in der relativen Fluoreszenz (bezeichnet durch X für positiv). Balken repräsentieren den Mittelwert  ± SEM; N = 3; ungepaarter T-Test. k.A. bedeutet p> 0,05

Es wurde ein IFC-Assay durchgeführt, um zu bestimmen, ob das CD63-eGFP mit EVs assoziiert war. Als fluoreszierende Negativkontrolle fehlte 1,34 µM Kügelchen in Pufferlösung (Abb. 1 c, oben) die Fluoreszenz, wenn sie der Anregungswellenlänge von 488 nm ausgesetzt wurden, waren aber im Hellfeld (BF) und Seitenstreuung (SSC) sichtbar. Nicht markierte HEK293T-EVs waren im BF, GFP und SSC negativ, was auf eine geringe Größe unterhalb der BF-Schwelle und fehlende Fluoreszenz hindeutet (Abb. 1d, Mitte). Das Fehlen von BF bedeutet eine EV-Größe von weniger als 300 nm, was auf ein minimales Schwärmen von EVs hindeutet. Schließlich sind CD63-eGFP-markierte EVs im BF negativ und im GFP-Kanal positiv, was eine positive Fluoreszenz der HEK293T-EVs bedeutet (Abb. 1c, unten). Das positive Signal im GFP-Kanal kann auf ein einzelnes EV oder eine Gruppe von fluoreszierenden EVs hinweisen. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die isolierten HEK293T-EVs Standardgrößen- und Proteinmarkerprofile aufweisen, die mit früheren Berichten über HEK293T-Exosomen übereinstimmen, und die eGFP-Markierung die Größe von HEK293T-EVs nicht verändert [5, 27].

Mit einer kommerziell erhältlichen, auf Durchflusszytometrie basierenden Methode zur Messung üblicher EV-Marker haben wir das gesamte EV-Tetraspanin-Profil bestimmt [5]. Isolierte HEK293T-EVs aus Kontroll- und CD63-eGFP-exprimierenden HEK293T-Zellen waren positiv für Standard-EV-Marker, einschließlich CD9, CD63 und CD81, gemessen in relativen Fluoreszenzeinheiten (Fig. 1d). Wie bereits berichtet, wurde CD29 auch auf der Oberfläche von HEK293T-EVs und CD63-eGFP-transfizierten HEK293T-EVs gefunden [5]. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Isolierungs- und Tagging-Methoden für HEK293T EV zu EVs mit gemeinsamen HEK293T-Exosomenmarkern führen.

Aktive Aufnahme von HEK293T-Elektrofahrzeugen

Es wurden zwei inhibitorische Internalisierungsassays durchgeführt. HEK293T EVs wurden mit Empfängerzellen bei 4 °C (kalt) oder mit zuvor mit Paraformaldehyd fixierten Empfängerzellen (fixiert) kokultiviert. Die Behandlungen verringerten die Anwesenheit von eGFP-markierten EVs in den Empfängerzellen im Vergleich zu Empfängerzellen, die unter physiologischen Bedingungen mit EVs cokultiviert wurden ( 2a ). Kalte und fixierte Hemmtests reduzierten die Anzahl der Flecken (kalt:p = 0.0127, behoben:p = 0,0078), Intensität (kalt:p = 0.0105, behoben:p = 0.0374) und maximale Pixel (kalt:p = 0.0159, behoben:p =  0,0149) der Fluoreszenzsignale in Empfängerzellen ohne Behandlungen, was eine Hemmung der EV-Aufnahme anzeigt. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die eGFP-Lokalisierung und der Anstieg der Output-Parameter bedeuten, dass HEK293T-EVs für die folgenden Aufnahmeassays internalisiert werden.

EV-Internalisierungsinhibitionsassays. HEK293T-Zellen wurden mit HEK293T-EVs unter verschiedenen Bedingungen kokultiviert. Die Kontrolle (37 °C) bezieht sich auf die Co-Kultur in einer physiologischen Umgebung von 37 °C. Kälte bezieht sich auf Co-Kultur in einer Umgebung von 4 °C. Fixierte Hemmung bezieht sich auf einen Assay, bei dem Empfängerzellen vor der Co-Kultur PFA-fixiert wurden. a Repräsentative IFC-Bilder von Empfängerzellen. Spalte 1, BF, bedeutet Hellfeld. Spalte 2, GFP, bedeutet grün fluoreszierendes Protein (488 nm Anregungslaser) und Spalte 3 bedeutet eine Verschmelzung von BF und GFP. Die Kontrolle zeigt positives GFP, das eine EV-Internalisierung darstellt. b –d Quantifizierung von Inhibitionsassays im Vergleich zu Kontrollen über Spotzählung, mittlere Fluoreszenzintensität und maximale Pixel. Balken repräsentieren den Mittelwert  ± SEM; N = 3; Es folgte eine Einweg-ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test im Vergleich zur Kontrolle. *p <0,05; ***p < 0.01

Dosisabhängige HEK293T-EV-Aufnahme

Um eine Standarddosiskurve für die IFC-Plattform zu entwickeln, wurden HEK293T-EVs mit HEK293T-Empfängerzellen in steigenden Dosen im Bereich von 0 bis 20.000 EVs pro Zelle bei 37 °C cokultiviert. Repräsentative IFC-Bilder zeigten einen visuellen Anstieg der eGFP-Fluoreszenz bei erhöhten EV-Dosen (Abb. 3a). Die niedrigste Anzahl von EVs, die nachgewiesen werden konnte, betrug 6000 EVs pro co-kultivierter HEK293T-Zelle. Auf dieser Ebene Spotzählung (p = 0,0012), Intensität (p = 0,0075) und maximale Pixel (p = 0,0005) waren signifikant höher als bei Empfängerzellen ohne EVs (Abb. 3b–d). Daher sind Dosen von 6000 HEK293T EVs die untere Schwelle für die Aufnahme unter unseren experimentellen Bedingungen. In ähnlicher Weise hatten Dosen von 10.000 und 20.000 EVs eine höhere Punktzahl (10.000:p = 0,0009; 20.000:p < 0,0001), Intensität (10.000:p < 0,0001; 20.000:p < 0,0001) und maximale Pixel (10,000:p < 0,0001; 20.000:p < 0,0001) im Vergleich zu Zellen ohne EVs. Im Vergleich zwischen den höheren Dosen gibt es keine signifikanten Unterschiede in der Punktzahl (6000 vs. 10.000:p = 0,999, 10.000 vs. 20.000:p = 0,0927), Intensität (6000 vs. 10.000:p = 0,8482, 10.000 vs. 20.000:p = 0,999) und maximale Pixelanzahl (6000 vs. 10.000:p = 0,6056, 10.000 vs. 20.000:p = 0,5281) zwischen 6000 und 10.000, zusammen mit 10.000 vs. 20.000. Ebenso gibt es beim Vergleich zwischen 6000 und 20.000 keinen statistischen Unterschied in der Punktzahl (p = 0,0787) und Intensität (p = 0,8083). Es gibt einen signifikanten Unterschied in der maximalen Pixelzahl zwischen 6000 und 20.000 (p =0,0140). Insgesamt zeigt die Ertragskurve eine signifikante Dosisabhängigkeit in allen Parametern (Spot, Intensität, max. Pixel, p < 0,0001). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aufnahme von HEK293T EV dosisabhängig ist, mit einem Mindestschwellenwert von 6000 HEK293T EVs pro Zelle.

Die Aufnahme von HEK293T EV hat einen Dosiseffekt mit einer Mindestschwelle von 6000 EVs. HEK293T-Zellen wurden mit HEK293T EVS in steigenden Dosen von 0 bis 20.000/Zelle kokultiviert. a Repräsentative IFC-Bilder von Empfängerzellen mit entsprechenden EV-Dosen. Die GFP-Lokalisierung bedeutet die Aufnahme von HEK293T EV. b –d Quantifizierung der Dosisassays im Vergleich zu Kontrollen und jeder Gruppe über die Punktzahl, die mittlere Fluoreszenzintensität und die maximalen Pixelverhältnisse. Balken repräsentieren den Mittelwert  ± SEM; N = 3; Es folgte eine Einweg-ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test. *p <0,05; ***p < 0.01

Zeitliche Aufnahme von HEK293T EV

Unter Verwendung von 6000 EVs pro Zelle wurden HEK293T-EVs mit HEK293T-Zellen über längere Zeiträume vor der IFC kokultiviert, die von 5 min bis 24 h reichen. Die Dauer der EV-Exposition spielte eine Schlüsselrolle bei der Menge der sichtbaren Fluoreszenz in den Empfängerzellen, die nach 12 h abnahm (Abb. 4a). Anfänglich zeigten 30 min Co-Kultur einen signifikanten Anstieg der Fleckzahl (p = 0,0081), was auf einen möglichen Trend zur EV-Aufnahme hindeutet, jedoch nicht bei anderen Aufnahmeparametern (Intensität:p = 0.3073, maximale Pixel:p = 0,0952) (Abb. 4b–d). Nach 2 Stunden Co-Kultur signifikant höhere Punktzahl (p = 0,0028), Intensität (p = 0.0420) und maximale Pixel (p =  0,0006) wurden im Vergleich zu den Empfängerzellen ohne EVs aufgezeichnet. Auch hier waren nach 4 Stunden Co-Kultur alle Parameter höher als bei den Kontrollen (Punktzahl:p = 0,0003, Intensität:p < 0,0001, maximale Pixel:p < 0,0001). Intensität und maximale Pixel waren nach 4, 12 und 24 h Co-Kultur weiterhin höher als bei den Kontrollen. Es gab keine Unterschiede in irgendwelchen Aufnahmeparametern zwischen 4  und 12 h Kokultur (Punkt:p = 0,999, Intensität:p =0,5797; maximale Pixel:p = 0,2489). Intensität (p = 0.0191) und maximale Pixel (p =0,0027) nahm zwischen 12 und 24 h der Co-Kultur ab (Fig. 4 c,d). Ähnlich der Dosiskurve ist die EV-Aufnahme von HEK293T zeitabhängig mit einer konsistenten EV-Aufnahme nach 4 h Inkubation und einem Peak nach 12 h. Insgesamt wurde eine Dosis von 6000 EVs pro ausgesäter Zelle und eine Co-Kultur von 4 h für die folgenden Aufnahmeassays standardisiert.

Die Aufnahme von HEK293T EV ist zeitabhängig. HEK293T-Zellen wurden mit 6000 HEK293T-EVs/Zelle für längere Zeit kokultiviert. a Repräsentative IFC-Bilder von Empfängerzellen. Die GFP-Lokalisierung bedeutet eine erhöhte Aufnahme von HEK293T EV. b –d Quantifizierung von Zeitverlauf-Assays im Vergleich zu Kontrollen und jeder Gruppe über Spot-Zählung, mittlere Fluoreszenzintensität und maximale Pixelverhältnisse. Balken repräsentieren den Mittelwert  ± SEM; N = 3; Es folgte eine Einweg-ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test. *p <0,05; ***p < 0.01

Vergleichende Aufnahme von HEK293T-EVs durch mehrere Zelllinien

Die Hypothese, dass die EV-Aufnahme ein selektiver Prozess ist, bei dem EVs bevorzugt von Zellen ihrer eigenen Herkunft aufgenommen werden, wurde mit IFC getestet. HEK293T-EVs wurden mit HEK293T-Zellen oder anderen Zelllinien kokultiviert:epithelial (C3A-Leberzellen), endothelial (humane Nabelvenen-Endothelzellen) und neural (SH-SY5Y-Glioblastom-Zellen). Die eGFP-Fluoreszenz ist in HEK293T-Zellen im Vergleich zu den anderen Zelltypen häufiger (Fig. 5a). Im Vergleich zu C3A und HUVECs hatten HEK293T-Zellen eine signifikant höhere Fluoreszenzintensität (C3A:p = 0,0321; HUVEC:p = 0,0055) (Fig. 5c), wenn mit HEK293T EVs kokultiviert. Darüber hinaus hatten HEK293T-Zellen ein höheres maximales Pixel (C3A:p =0,0221; HUVEC:p = 0,0079; SH-SY5Y:p =0,0486) (Fig. 5d) im Vergleich zu allen anderen Empfängerzelllinien (Fig. 5b). Hinsichtlich der Intensität waren SH-SY5Y-Zellen signifikant höher als HUVECs, wenn sie mit HEK293T EVs kokultiviert wurden (p = 0,0304). Diese Ergebnisse unterstützen die selektive Aufnahme von HEK293T EV durch HEK293T-Zellen im Vergleich zu anderen Zelllinien in vitro.

HEK293T-EVs zeigen eine Aufnahmepräferenz gegenüber HEK293T-Zellen. HEK293T-EVs wurden zusammen mit HEK293T-Zellen, C3A-Epithelzellen, menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC) und SY5Y-Neuralzellen kultiviert. a Repräsentative IFC-Bilder von Empfängerzellen, die mit HEK293T EVs kokultiviert wurden. b –d Quantifizierung der EV-Aufnahmepräferenz-Assays im Vergleich zu Kontrollen und untereinander über die Punktzahl, die mittlere Fluoreszenzintensität und die maximalen Pixelverhältnisse. Balken repräsentieren den Mittelwert  ± SEM; N = 3; Es folgte eine Einweg-ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test. *p <0,05; ***p < 0.01

Differenzierungsstatus neuronaler Zellen und HEK293T EV Internalisierung

Da EVs für Therapie- und Abgabezwecke bei neuralen Erkrankungen impliziert wurden, wurden menschliche neurale Stammzellen (hNSCs) und reife menschliche Neuronen als Empfängerzelllinien in unserem System verwendet, um zu untersuchen, ob der Differenzierungsstatus der Empfängerzelle eine Rolle bei der selektiven Aufnahme spielt von Elektrofahrzeugen. Repräsentative Bilder von IFC zeigten visuelle Hinweise auf die Aufnahme in beiden Zelltypen, jedoch mit der größten eGFP-Lokalisierung in hNSCs (Abb. 6a). hNSCs, die mit HEK293T EVs kokultiviert wurden, haben eine höhere Punktzahl (p = 0,0082) und maximale Pixel (p =0,0083) im Vergleich zu reifen Neuronen. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass der Differenzierungsstatus neuraler Zellen die Aufnahme von HEK293T-EVs beeinflusst.

Der neurale Differenzierungsstatus beeinflusst die Aufnahme von HEK293T EV. HEK293T-EVs wurden zusammen mit reifen menschlichen Neuronen und menschlichen neuralen Stammzellen kultiviert. a Repräsentative IFC-Bilder von Empfängerzellen, die mit HEK293T EVs kokultiviert wurden. b –d Quantifizierung der EV-Aufnahmepräferenz-Assays im Vergleich zu Kontrollen und untereinander über die Punktzahl, die mittlere Fluoreszenzintensität und die maximalen Pixelverhältnisse. Balken repräsentieren den Mittelwert  ± SEM; N = 3; ungepaart T Prüfung. *p <0,05; ***p < 0,01 im Vergleich zu 0 EVs (Kontrolle)

Diskussion

EV in vitro Aufnahme-Standardisierungsprozess

Eine Gruppe internationaler Experten für EVs betonte die Notwendigkeit, die minimale effektive Dosis von EVs für Aufnahmeassays effektiv zu bestimmen, und hier haben wir ein System entwickelt, das effektiv von der Praxis übernommen werden kann [26]. Es gibt Herausforderungen bei der Analyse der EV-Aufnahme. Wie wir und andere beobachtet haben, können die Ergebnisse beispielsweise abweichen, wenn die EV-Dosis und die Belichtungszeit geändert werden [26]. Wir adressierten die HEK293T EV-Dosis und -Konzentration als kinetische Variable. Außerdem kann eine minimal wirksame In-vitro-Dosis die In-vivo-Bioverteilung von EVs einheitlicher vorhersagen und verwendet werden, um konsistentere In-vivo-Dosierungsparameter für EV-Therapeutika und -Verabreichung zu entwickeln. In einer In-vivo-Maus-EV-Bioverteilungsstudie führte eine Erhöhung der Dosis von HEK293T-EVs zu einer Verschiebung der relativen EV-Verteilung in den Organen [27]. Ähnlich wie in einer früheren In-vitro-Studie mit Blasenkrebs-EVs [39] zeigten HEK293T-EVs in unserer Studie eine starke Dosisabhängigkeit mit einer minimal wirksamen Dosis von 6000 EVs. Wir sind die ersten, die Partikel pro Zelle als sensitive Dosismessung in vitro verwenden, was besser mit In-vivo-Modellen mit Partikeln pro Körpergewicht korreliert. Unsere Daten deuteten auch auf eine Dosissättigungsgrenze nach 6000 EVs hin, was möglicherweise als Grundlage für zukünftige In-vivo-Dosisbereichsstudien dient, da sie darauf hindeuten, dass höhere Dosen möglicherweise nur begrenzte Vorteile haben.

Eine weitere verwirrende Variable bei der Messung der EV-Aufnahme sind die möglichen zeitlichen Auswirkungen auf die EV-Aufnahme. In unserem System fanden wir eine starke Zeitabhängigkeit mit Aufnahme bereits ab 2 h mit einer potentiellen Abnahme zwischen 12 und 24 h. Ähnlich wie bei unseren Ergebnissen wurde in wenigen Studien über eine Zeitabhängigkeit berichtet, bei denen Blasenkrebszellen, Tumorzellen und andere mit einer Aufnahme von 15 min bis 24 h verwendet wurden [29, 30, 31, 32, 33, 39, 43, 49]. Wie bei HEK293T-EVs zu sehen ist, können die niedrigeren Werte nach 24 h Kokultur auf Zellteilung oder Recycling/Abbau von EVs, die zu frühen Zeitpunkten internalisiert wurden, zurückzuführen sein [50]. Da gezeigt wurde, dass EVs internalisiert, dann abgebaut oder internalisiert und dann nach 24 Stunden freigesetzt werden, können längere Inkubationen zu ungenauen Internalisierungsanzeigen führen [31, 50]. Unsere Studie ist die erste, die IFC verwendet, um visuelle und quantitative Beweise für eine zeitabhängige Renditekurve der HEK293T-EV-Aufnahme zu liefern.

Wie das ISEV-Positionspapier nahelegt, kann die Wahl eines EV-Labels die Aufnahme beeinflussen, was weniger störende Techniken wie die in unserer Studie verwendeten GFP-Tagging-Methoden erfordert. Insbesondere 72% der an einer Umfrage teilnehmenden Forscher behaupten, dass Lipidfarbstoffexperimente unzuverlässig sind, wenn keine geeigneten Kontrollen verwendet werden [26]. EV-Farbstoffe korrelieren nicht zuverlässig mit einem kleinen EV-Gehalt und können sogar die Vesikelgröße erhöhen. Contamination of mislabeled lipoproteins and protein content and dye aggregation contributed to false positives [51, 52]. Therefore, we fused CD63 with an eGFP to label the HEK293T EVs. Similar to other reports of protein tagging, HEK293T EVs were GFP positive with no observed differences in diameter and maintained standard EV surface protein composition [38, 46]. Despite this, it is important to note that labeling EVs with specific EV proteins may limit the tracking to only a few subtypes of EVs expressing the respective markers. Other potential limitations may be that the fluorescence intensity is dependent on protein expression level, the efficiency of EV membrane labeling, and excitation strength of the light source [53]. However, IFC is sensitive, detecting low fluorescence intensity with accurate visualization of CD63-GFP particles at the 100-nm range [38, 54].

Selective Uptake

EVs display proteins and other signals that may confer selective uptake [22, 23, 55]. Since the first step of EV biogenesis is the invagination of the plasma membrane, the EV membrane contains similar proteins, receptors, adhesion molecules, and integrins when compared with the donor cell membrane [22, 24, 55]. The lipid composition and tetraspanin proteins on EV membranes regulated by donor cells may contribute to EV tropisms with recipient cells [23, 34, 56]. MSC EVs selectively transported contents into MSCs, despite closer proximity to monocytes [24]. In contrast, others report that natural EVs were taken up equally by any cell type, regardless of EV origin [11, 22, 25, 57] when utilizing imaging or functional knockdown assays. Using the IFC platform, we found that HEK293T extracellular vesicles are taken up at greater quantities by HEK293T cells than other reported cell lines, thus suggesting an inherent EV uptake specificity. Through this outcome and the versatility of IFC, EV sources can be appropriately selected and analyzed for targeting specific recipient cells. To our knowledge, this is the first study utilizing imaging flow cytometry to analyze the specificity of HEK293T EVs.

In addition to self-selectivity, differentiation status of recipient cells has been hypothesized to play a role in uptake of EVs [32, 58, 59]. As our group and others have shown, EVs have therapeutic effects in the central nervous system and are known to modulate cell functions in neuronal development and adults [3, 7,8,9, 60]. Here for the first time, differentiation status of neurons affected EV uptake, where human neural stem cells had significantly greater uptake of HEK293T EVs compared to mature neurons. Immature hNSCs more actively internalize exogenous EVs than quiescent mature neurons. Since hNSCs are highly proliferative cells in culture, they may nonspecifically internalize nutrients and EVs. Similarly, immature dendritic cells internalized EVs at higher levels than mature dendritic cells [32, 59]. However, another study with myeloid precursor cells found that the mature dendritic cells and macrophages internalized more EVs than immature dendritic cells and monocytes [58]. The observed differences can be attributed to the phagocytic activity of further differentiated myeloid cells. Due to the in vitro evidence supporting selective uptake, HEK293T EVs can be used to modulate undifferentiated neurons in future therapeutic applications.

Schlussfolgerungen

In summary, we have further developed a quantitative and high-throughput platform for quantifying HEK293T EV uptake kinetics. This platform can be extended to other donor EVs and recipient cell types and assays for liposomes and synthetic nanoparticle delivery vectors. Significantly, we found that HEK293T EV uptake is a selective process, with specificity towards HEK293T cells. The IFC assays developed here can be used to better define parameters used in in vivo dose escalation and biodistribution studies and provide instrumental information for a predictive model of EV uptake outcomes in vivo.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

The datasets generated and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

Abkürzungen

EV:

Extracellular vesicles

HEK293T:

Human embryonic kidney cell line

IFC:

Imaging flow cytometry

hNSC:

Human neural stem cell

GFP:

Green fluorescent protein

BF:

Hellfeld

SSC:

Side scatter

ISEV:

International Society of Extracellular Vesicles